vacinas de nova geração para rotavirus ciência em portugal – ciência 2007 a5 – biologia,...
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Vacinas de nova geração para
Rotavirus
Ciência em Portugal – Ciência 2007
A5 – Biologia, Biotecnologia, Bioquímica Lisboa, 13/Abril/2007
Paula Alves
Laboratório de Tecnologia de Células Animais
RotavirusRotavirus Causa de ~ 40% das hospitalizações devidas a Gastroenterites agudas Aprox. 600.000 mortes/ano em 111 millhões de episódios de diarreia aguda
em crianças com idades inferiores a 5 anos)
Vacinas para ROTAVIRUS (no mercado desde 2006)
Virus atenuados em cultura
RotaTeqTM (aprovada pela FDA)
RotarixTM (aprovada pela EMEA)
VPVP22
VP4
VPVP66
VPVP77
VP3
VP1
98 nm
Reoviridae Family
VACINAS DE NOVA GERAÇÃOVACINAS DE NOVA GERAÇÃO
VLP (Virus Like Particles) – Partículas Semelhantes a Vírus
i. Eficazes - mimetizam particulas virais nativas (conformação e apresentação dos antigénios ao sistema imunitário)
ii. Seguras (não contêm material genético – ADN e ARN)
iii. Custos reduzidos (após optimização dos processos de produção)
VLP’s (VLP’s (VVirus irus LLike ike PParticles) – Partículas Semelhantes a Vírusarticles) – Partículas Semelhantes a Vírus
VLP’s já no mercado:VLP’s já no mercado:
Hepatite B (desde 1986)
2006 - Virus do Papiloma Humano (HPV) :
Gardasil® e Cervarix®
Primeira vacina no mercado contra o cancro cervicalPrimeira vacina no mercado contra o cancro cervical
VLP’s com VLP’s com UMA únicaUMA única proteína viral
VP6
(44.9 kDa)
VP2
(102.7 kDa)
60 dimers
780monomers
260trimers
~12000 kDa
~29000 kDa
~35000 kDa
2/6 VLP
(~47000 kDa)
2/6/7 VLP
(~76000 kDa)
~ 7
5 n
m~ 6
4nm
VP7
(37.2 kDa)
Rotavirus-Like Particles
VLP para PPV (irá ser comercializada pela Ingenasa Ingenasa (Espanha)
VLP candidata para HIV (utilizada em testes de diagnostico pela Innogenetics Innogenetics (Bélgica)
@ Lab TCA
VLP para ROTAVÍRUS
Desenvolvimento Desenvolvimento de Bioprocessos de Bioprocessos para produção de para produção de
Rota Rota VLPs VLPs
Formação das VLP’s
Estatisticada infecção
Expressãodas proteínas
“Re-desenhar” o genoma do Baculovirus(a nível dos
promotores dos genes das proteinas
recombinantes)
“Re-desenhar” estratégias de
infecção(MOI and TOI)
Monomeros das proteínas virais nas proporções e nos
tempos ideais(Estequiometria e termodinâmica)
OBJECTIVO
Membrana Nuclear
Membrana Celular
Infecção com 3 Baculovirus Recombinantes(transportam genes que codificam as
proteínas vp2, vp6 e vp7)
vp2 gene
vp6 gene
vp7 gene
1
H+ H+H+
H+
H+
H+
H+ H+
H+
H+
H+
H+
2
vDNA
3
4
VP2
VP7
VP6
mRNA
5
6
Monomers of VP7
Particulas duplas 2/6 VLP
Monomeros de VP7
Trimeros de VP6
Partículas 2/6/7 VLP (triplas)7
Infecção
Caracterização das cinéticas de infecção dos baculovirusTráfego viral na célula hospedeira
Purificação
VLPs Purificação
Montagem VLPs
Montagem em partículas formadas correctamente (três camadas)Estratégias de assembly/disasembly/reasembly
Replicação do transADN (vp2, vp6 and vp7)Transcrição - mARN (vp2, vp6 and vp7)Produção das proteínas recombinantes (VP2, VP6 and VP7)
Expressão dos genes
Gradientes de CsCl (ultracentrif.)Filtração GelChromatografiaUltrafiltração
Western blot, HPLC, Proteína totalELISAEspect. de massaMicroscopia
Q-PCRRT-Q-PCRWestern blot, HPLC, Proteína total
Técnicas analíticas
MODELAÇÃO DA PRODUÇÃO DE VLP’s PARA ROTAVIRUS
j
Colaboração com grupo Rui Oliveira
Cinéticas de Infecção do Baculovirus e tráfego viral
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
0 24 48 72 96 120 144
Time (hpi)
0
1,5
3,0
4,5
6,0
7,5
9,0
Ni(C
ell.m
l-1)
106
V(V
irus
.ml-1
)10
6
Sintese do mARN
0
2
4
6
8
10
12
RN
A7
(Cop
iesD
NA
.cel
l-1)
103
0 24 48 72 96 120 144
Time (hpi)
Protein ProductionProdução de Proteinas
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
0 24 48 72 96 120 144
Time (hpi)
VP 7
(AU
.ml-1
)10
3
Expressão dos genes
Replicação ADN
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
DN
A6T
(Cop
iesD
NA
.cel
l-1)
104
0 24 48 72 96 120 144
Time (hpi)
Montagem dasVLPs
VL
P (
g.m
l-1)
0
100
200
300
400
500
600
700
bVP2+bVP6+bVP7 bVP2/6/7
Desenvolvimento de Desenvolvimento de Bioprocessos para Bioprocessos para produção de produção de Rota Rota
VLPs VLPs Re-
desenhar o genoma do Baculovirus
“Re-desenhar” estratégias de infecção
Formação das VLP’s
Estatisticada infecção
Expressãodas proteínas
Monomeros das proteínas virais nas
proporções e nos tempos ideais
(Estequiometria e termodinâmica)
1. Antonis AF, Bruschke CJ, Rueda P, Maranga L, Casal JI, Vela C, Hilgers LA, Belt PB, Weerdmeester K, Carrondo MJ, Langeveld JP., 2006. A novel recombinant virus-like particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure. Vaccine, 24(26): 5481-90
2. Vieira, HLA, Estevão, C, Roldão, A, Peixoto, C, Sousa, M, Cruz, PE, Carrondo MJT, Alves, PM (2005) “Triple layered rotavirus VLP assembly: kinetics of vector replication, mRNA stability and recombinant protein production”, Journal of Biotechnology, 120: 72-82
3. Vieira, HLA, Pereira, ACP, Carrondo, MJT, Alves, PM (2006) “Catalase effect on apoptosis for the improvement of recombinant protein production in baculovirus-insect cell system”, Bioprocess Biosystems Engineering., 29, 409-414.
4. Peixoto, C, Sousa, MFQ, Silva, AC, Carrondo, MJT, Alves, PM (2007) “Downstream Processing of Triple-layered Rotavirus Like Particles”, Journal of Biotechnology, 127, 452-461
5. Roldão, A, Vieira HLA, Alves, PM, Oliveira, R, Carrondo, MJT (2007) Intracellular dynamics in Rotavirus-like particles production: Evaluation of multigene and monocistronic infection strategies. Process Biochemistry, 41, 2188-2199.
6. Roldão, A, Vieira, HLA, Charpilienne, A, Poncet, D, Roy, P, Carrondo, MJT, Alves, PM, Oliveira, R (2007) Modeling Rotavirus-Like Particles production: infection kinetics, baculovirus DNA replication, mRNA synthesis and protein production” J Biotechnology, 128(4): 875-894.
Financiamento European Commission (QLRT-2001-
01249)FCT (FCT/POCTI/BIO/55975/2004)SFRH/BPD/14575/2003SFRH/BD/21910/2005
Lab TCA (ITQB/IBET)Equipa RotavirusPaula Alves Manuel J. T. Carrondo Helena Vieira António RoldãoCristina C. Peixoto Claudia IstrateMarcos F.Q. Sousa Catarina EstêvãoRosário Clemente Candida Mellado
FCT-UNL (Portugal)Rui Oliveira
LSHTM (UK)Polly Roy
CNRS (France)Jean CohenDidier PoncetAnnie Charpilienne
Karolinska (Sweden)Lennart Svensson
Hopitaux de Paris (France)Nathalie Parez
RVC (UK)Janice Bridger
CIC Vaccinologie C Pasteur (France)Odile Launay
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