한수지 53(4), 628-636, 2020

628Copyright © 2020 The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815

Korean J Fish Aquat Sci 53(4),628-636,2020

Original Article

서 론

넙치(Paralichthys olivaceus)는 국내 대표적인 양식어류 중 하나로 1980년대 넙치 종묘생산 기술이 도입된 이후로 꾸준하게 생산량이 증가하였으며, 2019년에는 넙치 양식 생산량이 약 41,032톤으로, 국내에서 가장 많이 생산되고 있는 양식 품종 중에 하나이다(KOSIS, 2019). 하지만, 넙치는 양식 과정 중 발생하는 다양한 바이러스나 기생충, 세균성질병으로 인하여 폐사가 지속적으로 발생하고 있으며, 이로 인해 국내 넙치 양식 산업에 큰 피해를 입히고 있다. 특히, 최근 2015년 국내의 넙치 양식장이 밀집된 전남과 제주의 넙치 전체 폐사의 9.76%가 연

쇄구균병으로 인해서 발생하였으며, 그 이후로 피해가 감소하고 있으나 연쇄구균병의 검출률은 오히려 증가하고 있다(Shim et al., 2019). 이러한 피해를 최소화하고자 국내 양식장에서는 연쇄구균병의 치료를 위해서 세균성 질병의 치료 목적으로 사용되는 amoxicillin, florfenicol, oxytetracycline의 지속적인 사용으로 인해서 항생제에 대한 내성이 높은 편이며(Heo et al., 2001; Jeong et al., 2006; Jee et al., 2014), 이로 인한 항생제 남용으로 발생하는 환경문제나 내성균 치료에 대한 어려움으로 인해 다른 대안으로 포르말린으로 사균화시킨 불활화백신(Nam et al., 2014)과 면역보조제(Bennett et al., 1992), 어류의 면역 관련 유전자를 클로닝해서 발현시키는 재조합백신(Kwon

넙치(Paralichthys olivaceus)의 Streptococcus parauberis 인위감염을 위한 공격실험 방법에 관한 연구

김태호·이남실·최혜승·정승희·한현자*

국립수산과학원 병리연구과

An Experimental Study on Artificial Infection of Olive Flounder Paralichthys olivaceus by Streptococcus parauberis Using Different Injection SitesTae-Ho Kim, Nam-Sil Lee, Hye-Sung Choi, Sung-Hee Jung and Hyun-Ja Han*Pathology Division, National Institute of Fisheries Science, Busan 46083, Korea

Streptococcosis in the olive flounder Paralichthys olivaceus can be caused by Streptococcus parauberis. We com-pared three routes of administration for experimental injections of the S. parauberis 19FBSPa0003 strain in the olive flounder. Pathological changes were observed during the experimental infection. Inflammation of the serous mem-brane in the liver, intestine, spleen and heart was the major pathological change found in the infected olive flounder. No mortality was observed in fish that received intraperitoneal (IP) injection at less than 1×104 colony-forming unit (CFU)/fish. The lethal dose 50 for olive flounder, given an intravenous (IV) injection, was 7.94×104 CFU/fish. Fish with a higher concentration of IV injected S. parauberis (1×108 CFU/fish) died within a maximum of two days. However, serious necrosis and bacterial proliferation in ellipsoidal cells of the spleen and heart tissues were found in moribund or dead fish, 1-2 days after IV injection. Similar histopathological signs were observed in olive flounder inoculated by subcutaneous (SC) infected and naturally infected. In addition, SC was also strongly associated with bacteria concen-tration and cumulative mortality rate. Based on these results, SC is the recommended method for artificial infection by S. parauberis in the olive flounder.

Keywords: Olive flounder, Paralichthys olivaceus, Streptococcus parauberis, Subcutaneous injection, Artificial infection

*Corresponding author: Tel: +82. 51. 720. 2474 Fax: +82. 51. 720. 2498E-mail address: hjhan77@korea.kr

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Received 2 March 2020; Revised 26 March 2020; Accepted 18 June 2020저자 직위: 김태호(연구원), 이남실(연구원), 최혜승(연구관), 정승희(연구관),

한현자(연구사)

https://doi.org/10.5657/KFAS.2020.0628Korean J Fish Aquat Sci 53(4), 628-636, August 2020

넙치의 S. parauberis 인위감염 실험 629

et al., 2015)에 관한 다양한 연구가 진행되고 있다. 어류에서 발생하는 연쇄상구균병은 1957년 일본의 무지개송어(Oncorhyn-chus mykiss)에서 처음으로 보고되었다(Hoshina, 1958). 주로 수온이 높은 고수온기인 7월에서 9월 사이 30 cm 이상의 성어에서 많이 발생한다고 보고되지만(Heo et al., 2002; Meyburgh et al., 2017), 해수의 수온이 떨어지기 시작하는 저수온기인 가을철에도 발병률이 유지되는 경향을 보이기도 한다(Cho et al., 2007). 연쇄구균병의 주 원인균으로는 Streptococcus parau-beris, Streptococcus iniae 및 Lactococcus garvieae가 있다고 알려져 있으며(Eldar et al., 1996; Baeck et al., 2006), 연쇄구균에 감염된 병어의 병리학적 증상은 S. iniae는 복부팽만, 복수저류증상, 탈장이 관찰되며, S. parauberis는 체색흑화, 무안측 발적 증상, 피부궤양, 지느러미 출혈, 안구돌출과 충혈, 안구백탁 및 탈장 등의 외부 증상이 나타나며, L. garvieae는 내부 장기 출혈, 전안구염, 염증반응에 의한 섬유증식증, 급성뇌수막염 등의 증상이 나타난다고 보고된다(Eldar and Ghittino, 1999; Chang et al., 2002; Jeong et al., 2006; Kang et al., 2007; Meyburgh et al., 2017).연쇄구균 속에 속하는 S. parauberis는 운동성이 없는 그람양성구균이며 1993년에 터봇(Schophtalmus maximus)에서 발생이 보고되었으며(Domeenech et al., 1996), 연쇄구균 중에서 불완전용혈(alpha-hemolytic agent)을 일으키고 조건혐기성 환경에서 자랄 수 있는 특징이 있다(Toranzo et al., 1994; Nho et al., 2009, 2011). 또한, 세포 표면에 두꺼운 capsule layer를 가지고 있어서 숙주세포의 식작용에 대한 저항성을 보이기 때문에 항원성이 강한 편이다(Yoshida et al., 1997). Kanai et al. (2009)는 S. parauberis를 토끼의 항혈청을 사용해서 serotype I과 II의 2가지 혈청형으로 구분하였으며, 최근에는 기존에 2가지 혈청형으로 구분할 수 없었던 S. parauberis를 serotype III으로 추가 분류함으로써 혈청형에 관한 활발한 연구도 진행되고 있다(Yolanda et al., 2019).본 연구는 넙치에서 질병을 일으키는 S. parauberis를 세 가지 다른 주사 접종 부위로 인위감염 시킨 후 2주 동안 넙치의 생존율을 알아보았으며, S. parauberis에 감염된 넙치의 병리조직학적 검경을 통하여 적절한 인위감염실험방법을 모색하였다.

재료 및 방법

실험어 및 실험균주

본 연구에서 사용한 넙치(Paralichthys olivaceus)는 평균 길이 18.1±0.9 cm, 평균 체중 53.7±8.6 g으로 거제지역 넙치양식장에서 구입하였고 실험 전 3주동안 순치시켰다. 실험어의 건강 상태를 확인하기 위해서 실험 전 감염성질병(바이러스, 세균, 기생충)에 대한 검사를 실시하여 질병이 없는 것을 확인한 후 실험에 사용하였다. 본 연구에 사용할 넙치의 비장과 신장 조직의 일부를 떼어내어 1.5% sodium chloride가 포함된 brain

heart infusion (BHI) (Difco Laboratories, Detroit, MU, USA)와 thiosulfate citrate bile salt sucrose (TCBS) (Difco Labora-tories, Detroit, MI, USA) 평판배지에 25°C에서 24시간 배양 하였으며, 넙치의 조직에서 genomic DNA와 RNA를 추출해서 viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV), viral nervous necrosis virus (VNNV) 및 red sea bream iridovirus (RSIV)의 존재여부를 Seo et al. (2016)의 실험방법으로 확인하였다. 증폭된 PCR product는 1.5% (w/v) agarose gel상에서 확인하였으며 반응조건은 100 V에서 30분간 전기영동을 하였다. 그리고, 넙치의 표피층을 긁어서 멸균한 PBS (phosphate buffer saline) 0.1mL과 섞어서 슬라이드글라스 위에 올려 놓은 후 광학현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 기생충유무를 확인하였다(data not shown). 실험어는 총 288마리를 24개의 수조(250 L)에 동일하게 분배하였다. 사육수는 UltraAqua (Monoray, Aalborg, Denmark)로 UV 처리해서 시간당 약 200 L 해수를 공급하였다. 사육수온은 25.3±0.2°C였고 넙치 상업용 사료를 1일 2회 먹이로 공급하였다.실험에 사용된 균주는 2016년 제주지역에서 S. parauberis에 감염된 넙치로부터 순수분리하여 국립수산과학원 병리연구과 균주은행에서 보관 중이던 S. parauberis 19FBSPa0003 serotype Ib 균주를 사용하였으며, 혈청형 조사는 Kanai et al. (2009)의 방법으로 수행하였다.

병원성 시험

S. parauberis 19FBSPa0003 균주를 1.5% sodium chloride가 포함된 brain heart infusion agar (BHIA) (Difco Laborato-ries, Detroit, MI, USA)에 25°C조건에서 24시간 배양 하였으며, PBS (Invitrogen, USA)에 희석하여 1×102-1×108 CFU/fish로 접종할 균액의 농도를 조정해서 넙치 1마리 당 0.1 mL로 접종하였다. 인위감염실험에 사용한 균액은 4,000 rpm에서 30분간 4°C조건에서 원심분리(LaboGene, Lynge, Denmark)해서 상등액을 버린 후, PBS에 3회 세척하여 사용하였다. 넙치에 접종한 균액의 농도는 S. parauberis를 1×1010 cells/mL까지 배양하였으며 단계희석법으로 넙치에 접종할 균액의 농도를 조정하였다. 정확한 균 접종농도를 확인하기 위하여 인위감염실험에 사용한 균액을 plate dilution method로 희석하여 BHI 평판배지에 25°C조건에서 24시간 배양해서 생균수를 확인하였다.실험구는 S. parauberis 균주를 각 농도별로 3가지 접종방법인 복강주사(intraperitoneal injection, IP; Fig. 1a), 경피주사(subcutaneous injection, SC; Fig. 1b), 정맥주사(intravenous injection, IV; Fig. 1c)로 12마리씩 접종하였으며, 14일간 하루에 2번 실험어의 외부임상증상과 폐사어의 외부 및 내부 임상증상을 확인하였다. 또한, 공격 접종 10일 후 각 실험구 당 2마리를 대상으로 살아있는 실험어의 간, 장, 비장 및 심장 조직을 sampling하였으며, 공격 접종 14일 후에는 각 실험구별로 실험어의 생존율을 산출하였다. 폐사어와 인위감염실험 종료 후 살

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아있는 실험어와 대조구의 비장 및 신장 내부장기조직을 분리하여 BHI 평판배지에 균을 배양하였으며, 인위감염에 의한 조직 내 세균의 존재여부를 확인하였다. S. parauberis 균주를 접종한 실험구와 비교하기 위한 대조구는 실험구와 같은 접종부위인 복강, 경피 및 꼬리정맥에 넙치 1마리당 멸균한 PBS 0.1 mL을 접종하였다.

반수치사농도(LD50)

세 가지 접종 방법의 병원성을 비교하기 위해 S. parauberis를 넙치에 접종 14일 후 실험구별로 폐사한 넙치의 수를 카운

팅하여 반수가 치사되는 균액의 농도를 확인하였다. LD50값은 Finney의 probit analysis program을 사용해서 계산하였으며, Finney’s table의 probits 퍼센트 값을 참고하였다(Randhawa, 2009).

병리조직학적 관찰

폐사어 및 S. parauberis 접종 10일 후 살아있는 실험어의 간, 장, 비장 및 심장 조직의 일부를 떼어내어 10% neutral buffered formalin (Globe Scientific, Mahwah, NJ, USA)용액에 조직을 전고정하였다. 18-24시간 고정된 간, 장, 비장 및 심장 조직의 일부를 각각 세절하여 10% neutral buffered formalin 용액에 재고정하였으며, 수세, 탈수, 투명화 및 파라핀침투의 순차적 과정을 거쳐 paraffin block을 제작하였다. 조직표본 제작을 위해 완성된 paraffin block을 microtome (RM 2235, LEICA, Wetzlar, Germany)으로 박절(4 μm thickness)하고 슬라이드글라스에 부착시켜 45-50°C의 hot plate에서 하룻밤 건조 후, hematoxy-lin and eosin (H&E) 염색하여 봉입제로 봉입 및 건조과정을 거쳐 보관하였다. 조직표본의 관찰은 광학현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하였으며 관찰한 실험구와 대조구의 조직은 ZEN 2.3 lite software를 이용하여 저장하였다.

S. parauberis에 인위감염된 넙치와 자연감염된 넙치의 병리조직상을 비교하기 위해 본 인위감염실험에서 고농도인 1×108 CFU/fish로 IV 접종해서 2일 이내에 빈사상태에 이른 넙치의 조직표본과 2017년 거제지역에서 S. parauberis에 자연감염되어 중증도의 감염을 나타내면서 폐사에 이른 넙치성어(평균체중 1.59±0.5 kg)에서 채취한 비장과 심장 조직표본 및 각 접종방법 별로 1×107 CFU/fish농도로 접종해서 살아있는 실험어의 조직표본을 사용하였다.

결 과

접종방법에 따른 병원성

인위감염을 통한 감염실험에 사용한 S. parauberis 균액의 농도를 plate dilution method로 확인한 결과 실제 접종한 균액의 농도는 1×102-1×108 CFU/fish였다. PBS를 접종한 대조구는 실험 기간 동안 폐사가 발생하지 않았으며, 분리한 비장 및 신장조직은 어떠한 종류의 세균도 자라지 않았다. 실험 중 폐사한 실험어와 공격실험 종료 후 살아있는 실험어의 비장 및 신장조직에서 S. parauberis가 자랐다. 실험구는 S. parauberis 균주를 1×108 CFU/fish 농도로 접종하였을 때 실험어의 생존율이 가장 낮았으며(IP, 50%; SC, 10%; IV, 0%), 접종하는 균의 농도가 낮아질수록 생존율이 높아지는 경향을 보였다. IP 접종한 실험구는 다른 실험구들에 비해서 상대적으로 높은 생존율을 보이며 7일간 폐사가 발생하지 않았다. S. parauberis 균주 IP 접종 14일 후 고농도인 1×108 CFU/fish에서 50%의 누적폐사율을 보였으며 1×107 CFU/fish와 1×106 CFU/fish 농도에서

Fig. 1. Different inoculation sites of olive flounder Paralichthys olivaceus. A, Intraperitoneal (IP) injection; B, Subcutaneous (SC) injection; C, Intravenous (IV) injection; Scale bar, 1 cm.

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40%의 누적폐사율을 보였다. 또한, 1×105 CFU/fish 농도에서 30%의 누적폐사율을 보였으며 1×104 CFU/fish이하의 접종농도에서 폐사어가 발생하지 않았다(Fig. 2a). SC 접종한 실험구는 고농도인 1×108 CFU/fish에서 2일간 폐사가 발생하지 않았으며 접종 14일 후 90%의 누적폐사율을 보였다. 1×107 CFU/fish 농도는 50%의 누적폐사율을 보였다. 1×106 CFU/fish 농도와 1×105 CFU/fish 농도에서 40%의 누적폐사율을 보였으며, 1×104 CFU/fish 농도와 1×103 CFU/fish 및 1×102 CFU/fish 농도에서는 30%의 누적폐사율을 보였다(Fig. 2b). IV 접종한 실험구는 고농도인 1×108 CFU/fish로 접종을 하였을 때, 1일 후 80%가 폐사하였으며 접종 후 2일째에 100%의 누적폐사율을 보였다. 1×107 CFU/fish 농도로 접종하였을 때 70%의 누적폐사율을 보였으며 1×106 CFU/fish와 1×103 CFU/fish 농도에서는 40%의 누적폐사율을 보였다. 1×105 CFU/fish 농도에서는 50%의 누적폐사율을 보였다. 1×104 CFU/fish 농도에서는 20%의 폐사율, 1×102 CFU/fish 농도에서는 10%의 폐사율을 보였다(Fig. 2c).

반수치사농도(LD50)

각 접종방법별로 실험구의 반수치사농도(LD50)는 IP는 2×108 CFU/fish이고 SC는 3.16×105 CFU/fish였으며 IV의 LD50은 7.94×104 CFU/fish였다. IV와 SC는 IP에 비해서 상대적으로 병원성이 강하게 나타났다.

병리조직학적 분석

PBS를 접종한 대조구의 조직표본은 병원체 감염에 의한 조직괴사나 염증반응이 관찰되지 않았다(Fig. 3). S. parauberis를 1×107 CFU/fish 농도로 접종한 실험구 조직표본에서 세균

Fig. 2. Survival rates of olive flounder Paralichthys olivaceus in-oculated with Streptococcus parauberis 19FBSPa0003 serotype Ib strain. A, Intraperitoneal (IP) injection; B, , Subcutaneous (SC) injection; C, Intravenous (IV) injection.

Fig. 3. Non-disease olive flounder Paralichthys olivaceus after 10 days injected with PBS. A, liver; B, intestine; C, spleen; D, heart; Staining, hematoxylin and eosin staining (H&E); PBS, phosphate buffer saline.

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성 병원체의 감염에 의한 부분적 조직괴사와 세포변성이 모든 장기의 조직표본에서 관찰되었으며, 특히 간, 소화관, 비장과 심장을 감싸거나 연결하는 장막에서 염증반응이 주로 관찰되었다(Fig. 4, 5, 6). IV 접종과 SC 접종한 실험어 소화관의 점막고유층(lamina propria)에서 염증성세포의 침윤이 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 5b, 6b). 또한, 2017년 거제지역 S. parauberis 자

연감염어의 심장 조직에서 심막염이 확인되었고(Fig. 7b), 비장 조직에서는 협조직(ellipsoid) 주위로 림프성세포의 침윤을 제외하고 특이적인 세포변성은 없었다(Fig. 7a). 또한, 고농도의

Fig. 4. Experimentally infected olive flounder Paralichthys oli-vaceus after 10 days inoculated with Streptococcus parauberis (1×107 CFU/fish) using intraperitoneal (IP) injection method. A, liver; B, intestine; C, spleen; D, heart; IS, inflammation of serous membrane; P, pericarditis; Staining, hematoxylin and eosin stain-ing (H&E).

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Fig. 5. Experimentally infected olive flounder Paralichthys oli-vaceus after 10 days inoculated with Streptococcus parauberis (1×107 CFU/fish) using intravenous (IV) injection method. A, liver; B, intestine; C, spleen; D, heart; IS, inflammation of serous membrane; Circle, inflammation of lamina propria; P, pericarditis; Staining, hematoxylin and eosin staining (H&E).

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Fig. 6. Experimentally infected olive flounder Paralichthys oliva-ceus after 10 days injection with Streptococcus parauberis(1×107 CFU/fish) using subcutaneous (SC) injection method. A, liver; B, intestine; C, spleen; D, heart; IS, inflammation of serous mem-brane; Circle, inflammation of lamina propria; P, pericarditis; Staining, hematoxylin and eosin staining (H&E).

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Fig. 7. Spleen and heart of dead olive flounder Paralichthys oliva-ceus infected with Streptococcus parauberis. A, Naturally infected spleen; B, Naturally infected heart; C, Experimentally infected spleen after 2 days injection with S. parauberis (1×108 CFU/fish) using intravenous (IV) injection method (circles; cells in hyaline degeneration, arrows; cells in vacuolar degeneration); D, Experi-mentally infected heart after 2 days injection with S. parauberis (1×108 CFU/fish) using IV injection method (circle; congestion); P, pericarditis; Staining, hematoxylin and eosin staining (H&E).

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IV 접종방법(1×108 CFU/fish)으로 접종 후 2일 이내에 빈사상태에 이른 실험어의 비장 조직은 세포변성에 따른 유리질변성(hyaline degeneration)과 액포변성(vacuolar degeneration)이 관찰되었으며(Fig. 7c), 심장 조직에서는 조직 전반에 울혈(congestion), 심근의 위축(atrophy)과 괴사가 나타났다(Fig. 7d).

고 찰

본 연구는 일반적으로 사용하는 3가지 주사 접종 부위로 넙치의 복강, 경피, 꼬리정맥에 S. parauberis를 접종하여(Lee et al., 2007), 생존율과 병리조직검경을 통해 넙치에 인위감염실험으로 가장 적합한 주사방법을 모색하였다. S. parauberis를 주사 접종 후 살아있는 병어의 외부 증상은 눈에 띄게 체색흑화 및 복부팽만 현상을 보였으며, 폐사어는 Kim et al. (2006)의 보고와 같이 안구와 가슴 지느러미, 입 주변에서 출혈이 보였으며 다른 뚜렸한 외부 증상은 나타나지 않았다. 또한, 감염된 병어의 내부 증상은 비장종대, 간 퇴색 및 비대, 심장과 신장에서 염증이 관찰되었다(Domeenech et al., 1996). 대조구의 넙치는 폐사가 발생하지 않았으며 SC와 IP 접종한 실험구는 Lee et al. (2007)의 보고와 같이 점진적으로 폐사가 발생하였다. 반면에, 고농도(1×108 CFU/fish)의 S. parauberis를 IV 접종한 실험구는 접종 후 2일 이내에 100%의 누적폐사율을 보이는 급성 폐사가 발생하였다. 이는 일반적으로 어류에서 세균성 병원체로 인한 자연적인 초기감염이 점진적으로 폐사가 발생한다는 보고와 상반되는 결과로 볼 수 있다(Yanong and Francis-Floyd, 2002). 본 연구에서 IV 접종방법은 S. parauberis를 1×108 CFU/fish농도로 넙치에 접종을 하였을 때 급성 폐사를 일으켰기 때문에, 고농도인 1×108 CFU/fish을 접종한 넙치의 조직표본을 비교하는 것은 자연감염경로를 통해 감염된 넙치의 조직표본과 비교하는 것은 적합하지 않다고 판단된다. S. parauberis를 인위적인 접종방법에 따른 넙치 조직표본의 비교 및 분석은 1×107 CFU/fish 농도로 접종 10일 후 살아있는 실험어의 병리 조직을 사용하였다. 그리고, 자연감염어의 조직샘플은 S. parauberis에 자연감염된 살아있는 넙치표본을 구하는데 어려움이 있어서 중증도의 감염 증상을 보이며 폐사에 이른 넙치의 조직표본을 사용하였으며, 이와 비교하기 위해 IV 접종방법으로 1×108 CFU/fish 농도에서 중증도의 감염 증상을 보이며 빈사상태에 이른 넙치의 조직표본을 사용하였다.세 가지 주사방법 모두 S. parauberis를 고농도인 1×108

CFU/fish로 접종하였을 때 가장 생존율이 낮았으며, 접종하는 병원체의 농도가 낮아질수록 생존율이 높아지는 경향을 보였다(Fig. 2). SC로 주사했을 때, Mori et al. (2010)에서 보고한 다소 낮은 농도인 1×104 CFU/fish에서 100%, 1×103 CFU/fish 농도에서 80%, 1×102 CFU/fish 농도에서 60%의 높은 폐사율을 나타낸다고 하였으나, 본 연구결과는 1×104 CFU/fish 농도와 1×103 CFU/fish 및 1×102 CFU/fish 농도에서 상대

적으로 낮은 30%의 폐사율을 보인 것과는 상반된 결과를 보였다(Fig. 2b). IP로 주사했을 때, 1×108 CFU/fish 농도에서의 폐사율은 50%를 보였으며, 1×107 CFU/fish 농도에서 30%의 폐사율, 1×106 CFU/fish 농도에서 40%의 폐사율이 나타났다(Fig. 2a). Won et al. (2010)에서 보고한 1×108 CFU/fish 농도에서 70%의 폐사율, 1×107 CFU/fish 농도에서 20%의 폐사율을 보인 것과는 차이가 있었으나, Han et al. (2011)에서 보고한 1×108 CFU/fish 50%의 폐사율과 1×107 CFU/fish 과 1×106 CFU/fish에서 30%의 폐사율을 보인 S. parauberis S1735 균주와 거의 비슷한 폐사율을 보였다. 본 실험에서 IV로 넙치에 접종 했을 때 1×104 CFU/fish 농도에서는 20%의 다소 낮은 폐사율을 보였으나 Mori et al. (2010)의 3.2×104 CFU/fish 농도에서 85%의 높은 폐사율을 보인 것과는 차이가 있었다. 이러한 차이는 어류에서 병원성 질병을 일으키는 다양한 요인들로써 숙주생물체의 면역시스템과 병원체와의 상호작용 및 환경적인 부분을 생각했을 때, 실험어의 길이나 체중 및 실험 조건이 다르기 때문에 단순한 방법으로 비교 할 수 없었다(Yanong and Francis-Floyd, 2002). Fortier et al. (1991)은 사람의 야토병의 병원균인 Francisella tularensis를 BALB/c (bagg albino strain C mice) 마우스에 다양한 방법으로 주사 접종하여 비교하였다. 복강주사 후 낮은 농도인 1×102 CFU/mouse에서도 7일 이내에 100%의 폐사율, 정맥주사 후 1×106 CFU/mouse 농도에서 100% 폐사율, 피내주사(intradermal injection) 후 1×106 CFU/mouse 농도에서도 폐사가 발생하지 않았다. 하지만, 본 연구에서 넙치의 복강에 접종하였을 때 상대적으로 낮은 폐사율을 나타내었고, 정맥 및 경피에 접종하였을 때 상대적으로 높은 폐사율을 보인 것과 차이가 있었다. 또한, BALB/c 마우스의 비장과 간 조직에서 심각한 괴사반점과 염증이 나타났고 심장 조직에서는 병원체 침입에 의한 조직변이가 나타나지 않았다고 하였으며, 본 연구에서 넙치의 심장 조직에 심각한 조직괴사와 염증이 보인 것과는 차이가 있었다. 이는 숙주와 병원체의 종류 및 인위감염시 주사접종부위에 따라 폐사율이 다르게 나타나고, 병원체의 전이 양상 또한 다르게 일어날 수 있다는 것으로도 볼 수 있다. 이러한 경향은 S. parauberis에 감염된 넙치의 병리학적 특성을 연구하는데 있어서 일반적으로 동물 임상 실험 중 면역유전학 분야 연구에 주로 사용하는 BALB/c 마우스와는 다른 관점으로 접근해야 된다는 것을 시사한다.

S. parauberis는 어류 뿐만 아니라 소의 유방염의 원인체로도 알려져 있으며, S. uberis 유전형 type II에 속한다(Woo et al., 2006). King (1981)에 따르면 소의 유방조직 이외의 다른 조직에서는 S. uberis가 보균상태로 존재하지만 병증을 나타내지는 않았다. Mori et al. (2010)의 연구는 넙치의 등지느러미와 배지느러미에 SC 접종하였을 때, 접종한 부위의 근육조직보다 주변 피하결합조직 및 지방조직에서 강한 염증성 세포의 침윤이 관찰된다고 하였다. 이러한 염증은 숙주에서 연쇄구균이 감염된 병변부위에서 나타난다. 연쇄구균이 가지고 있는 균체외독소

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에 의한 출혈과 염증에 따른 패혈증을 일으키며, 숙주의 감염된 부위에서는 불완전용혈에 의한 육아종성염증을 일으킨다고 알려져 있다(Ringø and Gatesoupe, 1998). 따라서, S. parauberis는 넙치의 피하조직이 강한 병원성을 나타내는 병변부위로 여겨진다. 본 연구결과도 넙치에 IP 접종한 실험어의 대다수는 내부 장기 조직에서 S. parauberis가 보균상태로 존재하면서 다른 접종방법에 비해서 강한 병원성을 나타내지 않은 것으로 보이며, 넙치의 피하조직에 접종한 SC실험구가 IP 접종한 실험구보다 S. parauberis의 감염이 더 효과적으로 일어난 것으로 보인다.

IP 접종한 실험구의 LD50은 2×108 CFU/fish 농도로 고농도의 균을 접종했을 때 병증을 확인할 수 있었으며, 병원체 감염에 의한 실험어의 간, 소화관, 비장과 심장의 장막에서 염증 반응이 관찰된다. SC 접종한 실험구의 LD50은 3.16×105 CFU/fish 농도로 실험어의 간, 소화관, 비장과 심장에서 염증 반응이 관찰된다. 또한, 피하결합조직 및 피하조직 주변으로 염증 반응이 관찰되었고 실험어의 점막고유층에서 뚜렸한 염증성세포의 침윤이 관찰된다. IV 접종한 실험구의 LD50은 7.94×104 CFU/fish 농도였으며, 실험어의 간, 심장 조직의 장막에서 염증반응이 관찰되며 SC 접종한 실험어와 마찬가지로 점막고유층에서 염증성세포의 침윤이 관찰되었다. Won et al. (2010)은 넙치가 S. parauberis에 감염되면 내부 조직에 심근염과 뇌수막염 및 전안구염 증상이 대표적으로 나타난다고 하였고, Choi et al. (2009)도 S. parauberis 감염된 넙치에서 공통적으로 나타난 심외막염과 심근염 증상이 폐사와 관련이 있을 것이라고 언급하였다. 본 연구결과에서도 인위적인 접종방법으로 감염된 넙치의 조직표본과 거제지역에서 S. parauberis에 자연감염된 넙치의 비장과 심장을 포함한 내부장기의 조직표본에서 공통적으로 병원체 침입에 의한 염증반응이 확인되었다. 이러한 실험어의 조직 전반에 걸쳐서 나타나는 염증반응이 넙치의 폐사와 연관이 있을 것으로 사료된다. 자연감염어의 조직에서도 심막염 및 림프성세포의 침윤이 확인되었고, 1×108 CFU/fish농도로 IV 접종한 넙치의 병리조직학적 소견 또한 이와 유사하여 S. parauberis의 감염에 의한 조직변성이라 판단된다. 하지만, 위와 같이 공통된 염증 소견 이외에 IV는 1×108 CFU/fish농도로 접종 후 2일 이내에 빈사상태에 이른 넙치의 비장 조직에서 심각한 수준의 유리질변성(hyaline degeneration)과 액포변성(vacuolar degenera-tion) (Fig. 7c), 심장 조직에서는 울혈(congestion), 심근위축과 괴사가 나타났다(Fig. 7d). 심장내 울혈과 심근염과 같은 변성은 고농도의 IV 접종이 세균의 급격한 심장내 확산으로 정맥의 협착과 혈전형성 등의 영향을 가져와 울혈, 심근위축 및 괴사와 같은 조직변성을 발생시켰을 것으로 추정된다. 이는 IV 접종한 실험구가 IP나 SC 접종한 실험구보다 강한 병원성을 나타낸 것(LD50=7.94×104 CFU/fish)과 관련이 있을 것으로 생각된다. 일반적으로 정맥 주사는 약물독성시험에 주로 사용하는데 주사액을 정맥에 주입하게 되면 혈장을 통해서 빠르게 확

산되고 장간순환(enterohepaic circulation)의 신진대사를 방해하기 때문에(Morton et al., 2001), 본 연구의 IV 접종한 실험어는 자연감염어 및 SC와 IP 접종한 실험어와 다르게 급격한 연쇄구균의 어체 내 확산으로 인해 신진대사가 저해됨으로써 심각한 조직괴사와 염증이 생긴 것으로 보인다. 또한, 혈관에 직접 S. parauberis를 접종함으로써 혈액 내에서 빠르게 확산이 가능하고, 그 독소에 의한 중독현상으로 발생하는 염증으로 인하여 급성패혈증을 일으켜서 2일 이내에 폐사한 것으로 여겨진다. 본 연구에서 S. parauberis에 감염된 넙치의 각 내부장기조직의 장막에서 공통된 염증세포층이 관찰된다. 병원성이 가장 강했던 IV의 1×107 CFU/fish농도로 접종한 넙치의 소화관과 비장의 장막에서 염증세포층이 나타나지 않았고 간과 심장의 장막에서 상대적으로 얇은 염증세포층이 관찰된다(Fig. 5). 또한, 1×108 CFU/fish 농도에서 중증도의 감염 증상을 보이며 빈사상태에 이른 넙치의 비장과 심장의 장막에서도 염증세포층이 관찰되지 않았다(Fig. 7c, 7d). 병원성이 약했던 IP의 1×107 CFU/fish 농도로 접종한 넙치 조직의 장막(Fig. 4)과 SC의 1×107 CFU/fish 농도의 접종한 넙치조직의 장막(Fig. 6)에서 염증세포층이 뚜렷하게 보이는 것과 대조적이다. 이는 IV로 접종한 넙치는 연쇄구균이 어체 내 급격한 확산으로 인해 염증세포층이 단기간에 형성된 것으로 여겨진다. IP의 염증세포층은 SC나 자연감염어의 염증세포층보다 상대적으로 얇았고, SC는 1×107 CFU/fish 농도로 접종한 넙치 조직의 장막에서 두꺼운 염증세포층이 관찰되었고 자연감염어의 심장 조직의 장막에서 보이는 염증세포층(Fig. 7b)과 비교해도 큰 차이가 없었다. SC 접종한 넙치와 자연감염어의 장막에서 보이는 두꺼운 염증세포층은 어체 내 연쇄구균 감염에 따른 염증이 단기간이 아닌 장기간에 걸쳐 형성된 것으로 보이며, 이러한 만성염증증상에 의한 두꺼운 염증세포층은 연쇄구균에 감염된 넙치의 내부장기조직에서 나타나는 주요한 증상으로 사료된다.

IP 접종방법은 다른 접종방법들에 비해서 비교적 낮은 병원성(LD50=2×108 CFU/fish)을 보였고, 1×104 CFU/fish 이하 농도에서 폐사가 발생하지 않았기 때문에 넙치에서 효과적인 병원체 노출이 일어났다고 보기는 어렵다. 어류에서 IV 접종방법은 강한 병원성(LD50=7.94×104 CFU/fish)을 보였으나 숙련된 기술이 필요하고, 자연계에서 일어나는 병원체의 기회감염적인 경향과 다르게 급성 폐사를 일으켰기 때문에 넙치의 인위감염실험에 적절한 주사법이 아니라고 사료된다. SC 접종방법은 강한 병원성(LD50=3.16×105 CFU/fish)을 보이면서도 급성 폐사가 발생하지 않았고 접종하는 세균량과 폐사율이 높은 연관성을 보였으며(Fig. 2b), 강한 병원성을 보였던 것에 비해서 심각한 수준의 조직변성과 괴사가 나타나지 않았다. 또한, S. parauberis에 자연감염된 넙치의 비장에서 보이는 협조직 주위의 약한 림프성세포의 침윤을 제외하고 자연감염어와 유사한 염증성 조직변이를 보였기 때문에 IP나 IV에 비해서 효과적인 병원체 감염이 일어났다고 여겨진다.

넙치의 S. parauberis 인위감염 실험 635

따라서, 병원체를 인위적인 방법으로 어류에 감염시키기 위한 주사법은 주로 IP 접종방법을 사용하지만, 넙치에서 치료제 및 백신 효능 평가와 S. parauberis의 병리학적 특성을 연구하기 위해서는 SC 접종방법이 더욱 효과적이라고 제안한다.

사 사

이 논문은 국립수산과학원 수산시험연구사업(R2020058)의 연구개발비 지원에 의해 수행되었습니다.

References

Bennett B, Check IJ, Olsen MR and Hunter RL. 1992. A comparison of commercially available adjuvants for use in research. J Immunol Methods 153, 31-40. https://doi.org/10.1016/0022-1759(92)90302-A.

Baeck GW, Kim JH, Gomez DK and Park SC. 2006. Isolation and characterization of Streptococcus sp. from diseased flounder Paralichthys olivaceus in Jeju Island. J Vet Sci 7, 53-58. https://doi.org/10.4142/jvs.2006.7.1.53.

Chang PH, Lin CW and Lee YC. 2002. Lactococcus garvieae infection of cultured rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, in Taiwan and associated biophysical characteristics and his-topathology. Bull Eur Ass Fish Pathol 22, 319-327.

Cho MY, Kim MS, Kwon MG, Jee BY, Choi HS, Choi DL, Park GH, Lee CH, Kim JD, Lee JS, Oh YK, Lee DC, Park SH and Park MA. 2007. Epidemiological study of bacterial diseases of cultured olive flounder, Paralichthys olivaceus from 2005 to 2006 in Korea. J Fish Pathol 20, 61-70.

Choi HJ, Cho MY, Lee JI, Kwon MG, Choi DL, Kim JW, Han MC and Lee DC. 2009. The pathogenicity of Streptococcus parauberis isolated from cultured olive flounder Paralich-thys olivaceus. J Fish Pathol 22, 263-273.

Domeenech A, Derenaaandez-Garayzabal JF, Pascual C, Garcia JA, Cutuli MT, Moreno MA, Collins MD and Dominguez L. 1996. Streptococcosis in cultured turbot, Scopthalmus maxi-mus (L.), associated with Streptococcus parauberis. J Fish Dis 19, 33-38. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.1996.tb00117.x.

Eldar A, Ghittino C, Asanta L, Bozzetta E, Goria M, Prearo M and Bercovier H. 1996. Enterococcus seriolicida is a junior synonym of Lactococcus garvieae, a causative agent of sep-ticemia and meningoencephalitis in fish. Curr Microbiol 32, 85-88. https://doi.org/10.1007/s002849900015.

Eldar A and Ghittino C. 1999. Lactococcus garvieae and Strep-tococcus iniae infections in rainbow trout Oncorhynchus mykiss: similar, but different diseases. Dis Aquat Org 36, 227-231. https://doi.org/10.3354/dao036227.

Fortier AH, Slayter MV, Ziemba R, Meltzer MS and Nacy CA. 1991. Live vaccine strain of Francisella tularensis: infection and immunity in mice. Infect Immun 59, 2922-2928.

Hoshina T. 1958. A Streptococcus pathogenic to fish. J Tokyo

Univ Fish 44, 57-68.Heo MS, Song CB, Lee J, Yeo IK, Jeon YJ, Lee JJ, Chung SC,

Lee KW, Rho S, Choi KS and Lee YD. 2001. Character-istics of β-Streptococcus spp. isolated in cultured flounder Paralichthys olivaceus of Jeju Island. J Korean Fish Soc 34, 365-369.

Heo JH, Jung MH, Cho MH, Kim GH, Lee KC, Kim JH and Jung TS. 2002. The epidemiological study on fish diseases in the Southern Area of Kyeognam. J Vet Clin 19, 14-18.

Han SY, Kang BK, Kang BJ, Shin SP, Soen BH, Kim JM, Kim JH, ChorescaJr CH, Han JE, Jun JW and Park SC. 2011. Prevalence and different characteristics of two serotypes of Streptococcus parauberis isolated from the farmed olive flounder Paralichthys olivaceus (Temminck and Schlegel), in Korea. J Fish Dis 34, 731-739. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2011.01289.x.

Jeong YU, Kang CY, Kim MJ, Heo MS, Oh DC and Kang BJ. 2006. Characterization of Streptococcosis occurrence and molecular identification of the pathogens of cultured floun-der in Jeju Island. Kor J Microbiol 42, 199-204.

Jee BY, Shin KW, Lee DW, Kim YJ and Lee MK. 2014. Moni-toring of the mortalities and medications in the inland farms of olive flounder Paralichthys olivaceus, in South Korea. J Fish Pathol 27, 77-83. https://doi.org/10.7847/jfp.2014.27.1.077.

King JS. 1981. Streptococcus uberis: a review of its role as causative organism of bovine mastitis I. Characteristics of the organism. Br Vet J 137, 36-52. http://doi.org/10.1016/S0007-1935(17)31786-4.

Kim JH, Gomez DK, Baeck GW, Shin GW, Heo GJ, Jung TS and Park SC. 2006. Pathogenicity of Streptococcus parau-beris to olive flounder Paralichthys olivaceus. Fish Pathol 41, 171-173. https://doi.org/10.3147/jsfp.41.171.

Kang CY, Kang BJ, Moon YG, Moon YG, Kim KY and Heo MS. 2007. Characterization of Streptococcus parauberis isolated from cultured olive flounder, Paralichthys oliva-ceus in the Jeju Island. J Fish Pathol 20, 109-117.

Kanai K, Yamada M, Fei M, Takahashi I, Nagano T, Kawakami H, Yamashita A, Matsuoka S, Fukuda Y, Miyoshi Y, Takami I, Nakano H, Hirae T, Shutou K and Honma T. 2009. Se-rological differentiation of Streptococcus parauberis strains isolated from cultured Japanese flounder in Japan. Fish Pathol 44, 33-39. https://doi.org/10.3147/jsfp.44.33.

Kwon MG, Hwang JY, Seo JS and Jung SH. 2015. Effect of olive flounder Paralichthys olivaceus, immune genes stimulation by molecular adjuvant in vitro culture condi-tion. JFMSE 27, 1470-1478. https://doi.org/10.13000/JFMSE.2015.27.5.1470.

KOSIS (Korea Statistical Information Service). 2019. Investi-gation of fisheries aquaculture production. Retrieved from http://kosis.kr/statHtml/statHtml.do?orgId=101&tblId=DT_1EZ0008&conn_path=I2 on Dec 10, 2019.

김태호ㆍ이남실ㆍ최혜승ㆍ정승희ㆍ한현자636

Lee CH, Kim PY, Ko CS, Oh DC and Kang BJ. 2007. Biologi-cal characteristics of Streptococcus iniae and Streptococcus parauberis isolated from cultured flounder, Paralichthys olivaceus, In Jeju. J Fish Pathol 20, 33-40.

Morton DB, Jennings M, Buckwell A, Ewbank R, Godfrey C, Holgate B, Inglis I, James R, Page C, Sharman I, Verschoyle R, Westall L and Wilson AB. 2001. Refining procedures for the administration of substances. Lab Anim 35, 1-41.

Mori K, Fukuda Y, Togo A, Miyoshi Y and Endo M. 2010. Prac-tical inoculation site for experimental infection of Japanese flounder Paralichthys olivaceus with Streptococcus parau-beris. Gyobyo Kenkyu Fish Pathol 45, 37-42. https://doi.org/10.3147/jsfp.45.37.

Meyburgh CM, Bragg RR and Boucher CE. 2017. Lactococcus garvieae: an emerging bacterial pathogen of fish. Dis Aquat Organ 123, 67-79. https://doi.org/10.3354/dao03083.

Nho SW, Shin GW, Park SB, Jang HB, Cha IS, Ha MA, Kim YR, Park YK, Dalvi RS, Kang BJ, Joh SJ and Jung TS. 2009. Phenotypic characteristics of Streptococcus iniae and Streptococcus parauberis isolated from olive flounder Para-lichthys olivaceus. FEMS Microbiol Lett 293, 20-27. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2009.01491.x.

Nho SW, Hikima JI, Cha IS, Park SB, Jang HB, del Castillo CS, Kondo H, Hirono I, Aoki T and Jung TS. 2011. Complete genome sequence and immunoproteomic analyses of the fish bacterial pathogen Streptococcus parauberis. J Bacte-riol 193, 3356-3366. https://doi.org/10.1128/JB.00182-11.

Nam HJ, Park KI and Choi MS. 2014. Effects of propolis ex-tracts on the immune response in cultured flounder, Para-lichthys olivaceus. J Fish Pathol 27, 47-56. https://doi.org/10.7847/jfp.2014.27.1.047.

Randhawa MA. 2009. Calculation of LD50 values from the method of Miller and Tainter, 1944. J Ayub Med Coll Ab-bottabad 21, 184-185.

Ringø E and Gatesoupe FJ. 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture 160, 177-203. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(97)00299-8.

Seo HG, Do JW, Jung SH and Han HJ. 2016. Outbreak of hi-rame rhabdovirus infection in cultured spotted sea bass Lateolabrax maculatus on the western coast of Korea. J Fish Dis 39, 1239-1246. https://doi.org/10.1111/jfd.12513.

Shim JD, Hwang DH, Jang SY, Kim TW and Jeong JM. 2019. Monitoring of the mortalities in olive flounder Paralichthys olivaceus farms of Korea. J Fish Pathol 32, 29-35. https://doi.org/10.7847/jfp.2019.32.1.029.

Toranzo AE, Devesa S, Heinen P, Riaza A, Nunez S and Barja JL. 1994. Streptococcosis in cultured turbot caused by an Enterococcus-like bacterium. Bull Eur Ass Fish Pathol 14, 19-19.

Woo SH, Kim HJ, Kim JW and Park SI. 2006. Pathogenicity and classification of streptococci isolated from cultured ma-rine fished. J Fish Pathol 19, 17-33.

Won KM, Cho MY, Park MA, Kim KH, Park SI, Lee DC, Kwon MG and Kim JW. 2010. Pathological characteristics of olive flounder Paralichthys olivaceus experimentally in-fected with Streptococcus parauberis. Fish Sci 76, 991-998. https://doi.org/10.1007/s12562-010-0287-6.

Yoshida T, Endo M, Sakai M and Inglis V. 1997. A cell capsule with possible involvement in resistance to opsonophagocy-tosis in Enterococcus seriolicida isolated from yellowtail Seriola quinqueradiata. Dis Aquat Org 29, 233-235.

Yanong RP and Francis-Floyd R. 2002. Streptococcal infections of fish. Florida Cooperative Extension Service IFAS Uni-versity of Florida, Florida, FL, U.S.A., 1-5.

Yolanda TC, Clara FA and Ysabel S. 2019. Proteomic and molecular fingerprinting for identification and tracking of fish pathogenic Streptococcus. Aquaculture 498, 322-334. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2018.08.041.