SKRINING BIOAKTIVITAS BAHAN ALAM

DESAIN FARMAKOLOGI BAHAN ALAM EKSTRAK ETANOL

DAUN PEGAGAN (Centella asiatica) SEBAGAI ANTI PERDARAHAN

Oleh:

Made Ari Puji Astuti (0808505013)

I G.A.Mira Semara Wati (0808505016)

Wayan Ria Medisina (0808505030)

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2011

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Perdarahan merupakan hilangnya darah dari sistem peredaran darah yang diakibatkan

karena defisiensi salah satu faktor-faktor pembekuan. Perdarahan dapat terjadi secara internal

maupun eksternal. Penyakit-penyakit hati seperti hepatitis dan sirosis dapat menekan sistem

pembekuan sedemikian kuat sehingga pasien cenderung mengalami perdarahan.

Terapi medis bagi penderita perdarahan yaitu dengan pemberian faktor-faktor pembekuan

darah seperti faktor IV (kalsium) faktor anti hemofilik yang diijeksikan ke dalam tubuh pasien.

Akan tetapi penatalaksanaan terapi ini memiliki kelemahan yaitu pasien rentan tertular penyakit

yang ditularkan melalui darah, disamping biaya yang dikeluarkan untuk terapi sangat mahal.

Alasan inilah yang mendasari penggunaan sumber alami yang bersal dari tumbuhan sebagai

alternatif dalam terapi perdarahan.

Pegagan mengandung kelompok senyawa terpenoid, flavonoid, senyawa polifenol, dan

senyawa poliasetilena. Senyawa yang terpenting dan telah diteliti memiliki efek menyembuhkan

luka atau luka bakar adalah senyawa golongan triterpen saponin dan sapogenin yaitu, asam asiata,

asam madekasat,dan asiatikosid (Suratman,dkk.,1996).

Pegagan atau Centella asiatica merupakan tanaman yang banyak digunakan dalam

pengobatan di dunia. Tanaman pegagan digunakan sebagai antimikroba, antijamur, anti kanker,

anti inflamasi, anti piretik, penyembuh luka, penenang, anti alergi dan hipotensi. Ekstrak etanol

dari tanaman pegagan dapat digunakan sebagai penyembuh luka. Tanaman ini mengandung

triterpenoid, minyak atsiri dan flavonoid (Warnasuriya and Dissanayake, 1999). Pendekatan

taksonomi dilakukan berdasarkan penelitian Zhang (2009) yang dipublikasikan pada Yakugaku

Zasshi (855-859) akar dari Angelica sinesnis (famili Apiaceae) memiliki aktivitas

antipendarahan. Ekstrak minyak esensial dari akar Angelica sinesnis dalam konsentrasi 10 atau

40 mg / kg tidak berpengaruh nyata terhadap waktu koagulasi, termasuk waktu trombloplastin

parsial aktif dan waktu prothrombin pada tikus. Penelitian ini menunjukkank pertama kalinya

kandungan Z-ligustilide (LIG) yang terkandung dalam ekstrak minyak esensial akar Angelica

sinesnis mungkin mengerahkan aktivitas antipendarahan melalui penghambatan agregasi

trombosit, tanpa mempengaruhi waktu pembekuan darah perifer.

Selain memiliki keunggulan, bahan obat tradisional juga memiliki kekurangan salah

satunya adalah efek farmakologis yang lama, bahan baku belum terstandar, bersifat voluminous,

aktivitas farmakologis yang belum diteliti dan mudah terkontaminasi dengan adanya

mikroorganisme. Pegagan ini oleh masyarakat digunakan secara empiris oleh sebab itu, perlu

dilakukannya pengujian aktivitas dari zat aktif dari tanaman tersebut.

1.2. Rumusan Masalah

1. Bagaimanakah metode uji aktivitas anti perdarahan pada Centella asiatica ?

1.3. Tujuan

1. Untuk mengetahui metode yang dilakukan dalam uji aktivitas anti perdarahan pada

ekstrak etanol Centella asiatica.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Darah

2.1.1.Pengertian

Darah merupakan suspensi partikel yang terdapat dalam larutan koloid cair dan

mengandung elektrolit. Darah memiliki fungsi sebagai medium pertukaran antara sel yang

terfiksasi dalam tubuh dan lingkungan luar (Baldy,1994).darah biasanya berwarna merah, warna

merah tersebut tidak selalu tetap, tetapi berubah-ubah karena pengaruh zat yang dikandungnya,

terutama kadar oksigen dan karbondioksida. Volume darah pada manusia adalah 8% berat

badannya. Komponen penyusun darah dapat dibagi menjadi dua yaitu, sel darah dan plasma

darah, dimana tiap komponen darah terdiri dari :

Gambar 1.komponen penyusun darah.

1. Sel darah

a. Sel darah merah

Sel darah merah memiliki ciri-ciri yaitu berukuran 7,5-7,7 μm, berbentuk bikonkaf, tidak

berinti, tidak dapat bergerak bebas yaitu hanya berada pada pembuluh darah, tidak dapat

menembus dinding kapiler, serta berwarna merah (Anonim,tt). Bagian stroma dari sel

darah merah dapat mengandung protein yang terdiri dari antigen A dan B, serta faktor Rh

yang digunakan untuk menentukan golongan darah seseorang. Komponen utama sel

darah merah yaitu protein hemoglobin yang dapat mengangkut oksigen dan

karbondioksida dan hemoglobin juga berfungsi untuk mempertahankan pH normal darah

melalui proses dapar intraseluler. Pembentukan sel darah merah terjadi di sumsum tulang,

dimana pembentukan sel darah akan dirangsang oleh hormon glikoprotein dan

eritropoetin. Pembentukan eritropoetin akan dipengaruhi oleh hipoksia jaringan sehingga,

pembentukan sel darah merah akan dipengaruhi oleh kadar oksigen. Eritropetin ini akan

merangsang sel darah untuk berploriferasi dan juga merangsang pematangan sel darah

merah (Baldy,1994).

b. Sel darah putih

Sel darah putih atau leukosit memiliki ciri-ciri yaitu berukuran 10-12 μm, mempunyai

bentuk yang bervariasi, selnya berinti, dapat bergerak bebas secara ameboid, dan dapat

menembus dinding kapiler (diapedesis). Pembentukan sel darah putih dapat terjadi di

sumsum tulang merah, limpa, kelenjar limpa, dan jaringan retikulo indotel. Sel darah

putih mempunyai fungsi utama untuk melawan kuman yang masuk ke dalam tubuh

dengan cara fagositosis (Anonim,tt). Sel darah putih dapat dibedakan menjadi dua

kelompok yang didasarkan ada tidaknya granula dalam sitoplasmanya yaitu granulosit

dan agranulosit. Sel darah putih bergranulosit dapat dibedakan menjadi tiga berdasarkan

afinitas granula terhadap zat warna tertentu, yaitu :

1. Netrofil

Netrofil bersifat fagosit, plasmanya bersifat netral, bentuk intinya bermacam-

macam seperti batang, berinti banyak, berinti bengkok, dan lain-lain (Anonim,tt).

2. Basofil

Basofil memiliki afinitas zat warna biru, dan plasma basofil bersifat basa. Basofil

akan menbawa heparin (antikoagulan), faktor-faktor pengaktifan histamin dan

platelet dalam granulanya untuk menimbulkan peradangan pada jaringan

(Baldy,1994).

3. Eosinofil

Eosinofil memiliki afinitas eosin yang berwarna merah sampai merah jingga

(Baldy,1994). Eosinofil bersifat fagosit, plasmanya bersifat asam, berbintik-bintik

kemerahan yang jumlahnya akan meningkat bila terjadi infeksi (Anonim,tt).

Sedangkan sel darah putih yang tidak bergranulosit dapat dibedakan menjadi :

1. Monosit

Monosit memiliki satu inti, yang terlipat atau berlekuk, serta sitoplasmanya dapat

menyerap warna biru keabuan. Monosit memiliki fungsi fagositosis , membuang

sel-sel yang cidera dan mati. Setelah monosit meninggalkan sirkulasi maka,

monosit akan mejadi makrofag jaringan dan merupakan bagian monosit makrofag

(Baldy,1994).

2. Limfosit

Limfosit merupakan leukosit mononuklear dalam darah perifer. Sel limfosit berinti

satu dan berbentuk bulat atau oval yang dikelilingi sitoplasma yang berwarna biru.

Limfosit dapat dibedakan menjadi dua yaitu, limfosit T yang dimatangkan di

timus, memiliki umur panjang dan bertanggung jawab atas respon kekebalan

seluler, dan limfosit B yang pembentukan maupun pematangannya terjadi di

sumsum tulang, dimana limfosit B akan bertanggung jawab atas respon kekebalan

humoral (Baldy,1994).

c. Sel darah pembeku (trombosit)

Trombosit atau platelet bukan merupakan sel melainkan adalah pecahan granular sel,

yang berbentuk pipih dan tidak berinti. Trombosit memiliki peranan yang sangat penting

dalam hemostasis dan pembekuan. Trombosit berukuran 1-4 μm dan berumur kira-kira 10

hari. Granula trombosit mengandung serotonin vasokonstriktor yang kuat, faktor agregasi

adenosine difosfat, fibrinogen, faktor 3 dan 4 trombosit (faktor penetral heparin), dan

kalsium (Baldy,1994). Bila trombosit tersentuh benda yang permukaannya kasar, maka

trombosit akan mudah pecah (Anonim,tt).

2. Plasma darah

Plasma darah merupakan bagian cair dari darah, dimana plasma darah terdiri dari 91%

sampai 92% air yang berperan sebagai medium transport, dan 7-9% terdiri dari zat padat seperti

protein, zat anoganik, zat organik (Baldy,1994). Zat yang terlarut dalam plasma dapat

dikelompokan menjadi :

a. Zat makanan dan mineral, seperti glukosa, asam amino, asam lemak, kolesterol dan

garam mineral (Anonim,tt).

b. Zat makanan dan mineral, seperti enzim, hormon, dan antibodi (Anonim,tt).

c. Protein darah yang tersusun atas beberapa asam amino, yaitu :

1. Albumin, berperan dalam mempertahankan volume darah dengan menjaga

tekanan osmotic koloid, pH dan keseimbangan elektrolit serta transport ion-ion

logam, asam lemak, steroid, hormone, dan obat-obatan (Blady,1994).

2. Fibrinogen, jumlahnya hanya 4% dan penting untuk pembekuan darah

(Baldy,1994).

3. Globulin, merupakan 43% dari protein serum, yang dibentuk di hati dan jaringan

limfoid. Globulin bertanggung jawab atas pembentukan antibodi dan

protrombin(Baldy,1994).

4. Zat-zat metabolisme, seperti urea, asam urat, dan lain-lain (Anonim,tt).

5. Gas pernapasan yang larut dalam plasma, seperti oksigen, karbondioksida, dan

nitrogen (Anonim,tt).

2.1.2.Fungsi darah

Di dalam tubuh, darah memiliki fungsi sebagai pengangkut oksigen dan karbondioksida

dari alat pernapasan ke jaaringan dan ke seluruh tubuh; mengangkut sari-sari makanan ke seluruh

tubuh; mengangkut sisa-sisa metabolisme ke alat ekskresi, dan mengedarkan hormon dari

kelenjar hormon ke tempat yang membutuhkan(Anonim,tt).

2.2. Perdarahan

Perdarahan dapat terjadi akibat defisiensi salah satu faktor-faktor pembekuan, misalnya

defisiensi vitamin K, hemofilia (defisiensi faktor VIII), dan defisiensi trombosit.

1. Vitamin K

Vitamin K berfungsi untuk membentuk faktor pembekuan yang penting yaitu

protrombin, faktor VII, faktor IX, faktor X, dan protein. Defisiensi vitamin K dapat

disebabkan karena kegagalan hati dalam mensekresi empedu ke dalam traktus

gastrointestinal dimana kekurangan empedu akan mengakibatkan terjadinya gangguan

pada pencernaan dan absorbsi lemak, sehingga akan menekan absorbsi vitamin K dan

faktor pembekuan tidak akan terbentuk (Guyton and Hall, 1997).

2. Hemofilia / defisiensi faktor VIII

Faktor VIII terdiri dari dua komponen yaitu komponen besar dan komponen kecil.

Komponen kecil ini penting untuk jalur pembekuan intrinsik dan defisiensi komponen

ini akan menyebabkan timbulnya hemofili klasik (Guyton and Hall, 1997).

3. Defisiensi trombosit

Perdarahan akan terjadi jika jumlah trombosit dalam darah kurang dari 50.000 per

mikroliter. Nilai normal trombosit yaitu 150.000 sampai 300.000 dan jika kadarnya

mencapai 10.000 per mikroliter dapat menimbulkan kematian (Guyton and Hall,

1997).

Tabel 1. Faktor-Faktor Pembekuan dalam Darah dan Sinonimnya.

Faktor Pembekuan Sinonim

Fibrinogen Faktor I

Protrombin Faktor II

Faktor jaringan Faktor III; tromboplastin jaringan

Kalsium Faktor IV

Faktor V Proaccelerin; faktor labil; Ac-globulin (Ac-G)

Faktor VII Akselarator konversi protrombin serum (SPCA);

faktor stabil

Faktor VIII Faktor antihemofilik (AHF); globulin

antihemofilik (AHG); faktor A antihemofilik

Faktor IX Komponen tromboplastin plasma (PTC); faktor

Christmas; faktor B

Faktor X Faktor Stuart; faktor Stuart Power

Faktor XI Anteseden tromboplastin plasma (PTA); faktor C

antihemolitik

Faktor XII Faktor Hageman

Faktor XIII Faktor stabilisasi fibrin

Prekalikrein Faktor Fletcher

Kininogen dengan

berat molekul besar

Faktor Fitzgerals; HMWK

Trombosit

(Guyton and Hall, 1997).

2.2.1. Mekanisme pembekuan darah

Hemostasis dan pembekuan darah adalah serangkaian kompleks reaksi yang

mengakibatkan pengendalian perdarahan melalui pembentukan bekuan trombosit dan fibrin pada

tempat cedera. Pembekuan diikuti oleh resolusi atau lisis bekuan dan regenerasi endotel. Pada

keadaan hemostasis, hemostasis dan bekuan akan melindungi individu dari perdarahan massif

sekunder akibat dari terjadinya trauma (Baldy,1994). Secara umum pembekuan darah dapat

melalui tiga langkah utama yaitu:

1. Terjadinya ruptur pada pembuluh darah atau kerusakan darah itu sendiri, yang

melibatkan berbagai faktor pembekuan darah sampai terbentuknya aktivator

protrombin.

2. Aktivator protrombin mengkatalisis reaksi perubahan protrombin menjadi trombin.

3. Trombin yang terbentuk akan bekerja sebagai enzim untuk mengubah fibrinogen

menjadi benang fibrin. Benang-benang fibrin selanjutnya akan merangkai trombosit,

sel darah, dan plasma untuk membentuk bekuan.

(Guyton and Hall, 1997).

2.2.2.Awal proses pembekuan

Mekanisme pembekuan darah diawali dengan terjadinya trauma berupa gangguan fisik

maupun kimia pada dinding pembuluh darah dan jaringan yang berdekatan dengan tempat

terjadinya trauma. Trauma juga dapat terjadi pada sel-sel darah, dimana trauma terjadi jika

darah kontak dengan sel endotel yang rusak atau dengan kolagen atau dengan unsur jaringan

lainnya di luar sel endotel pembuluh darah. Mekanisme tersebut menyebabkan pembentukan

aktivator protrombin. Aktivator protrombin secara umum dapat dibentuk melalui dua cara yaitu

melalui jalur ekstrinsik yang dimulai dengan terjadinya trauma pada dinding pembuluh dan

jaringan sekitarnya, atau melalui jalur intrinsik yang berawal dari sel-sel darah itu sendiri

(Guyton and Hall, 1997).

2.2.3. Mekanisme ekstrinsik

Meknisme ekstrinsik diawali dengan terjadinya cedera pada jaringan. Cedera pada

jaringan akan memicu pelepasan faktor jaringan atau tromboplastin jaringan atau faktor III.

Faktor ini terdiri dari fosfolipid dari membran jaringan dan kompleks lipoprotein yang

mengandung enzim proteolitik. Dengan adanya bantuan dari faktor jaringan, faktor VII akan

teraktivasi menjadi faktor VII yang selanjutnya faktor VIIA akan bergabung dengan kompleks

lipoprotein dari faktor jaringan serta ion Ca2+ yang berfungsi sebagai enzim. Faktor-faktor ini

(faktor VIIA, faktor jaringan , dan ion Ca2+) akan mengaktivasi faktor X menjadi X teraktivasi.

Faktor X teraktivasi akan berikatan dengan fosfolipid jaringan yang berasal dari faktor jaringan

atau fosfolipid tambahan yang dilepaskan dari trombosit, faktor V, serta ion Ca2+ untuk

membentuk aktivator protrombin. Senyawa ini akan memecah protrombin menjadi trombin.

Pada tahap permulaan, faktor V yang terdapat dalam kompleks aktivator protrombin bersifat

inaktif, tetapi jika proses pembekuan dimulai dan trombin mulai terbentuk, maka kerja proteolitik

dari trombin akan mengaktifkan faktor V (Guyton and Hall, 1997)

Gambar 2. Jalur ekstrinsik sebagai awal pembekuan darah (Guyton and Hall, 1997).

2.2.4. Mekanisme intrinsik

Mekanisme intrinsik diawali dengan terjadinya trauma pada darah yang disebabkan

karena, darah kontak dengan kolagen pada dinding pembuluh darah yang rusak sehingga terjadi

perubahan terhadap dua faktor pembekuan yaitu faktor XII dan trombosit. Jika terjadi trauma,

maka faktor XII akan terganggu sehingga faktor XII akan diaktifkan menjadi faktor XII

teraktivasi yang berfungsi sebagai enzim proteolitik. Pada saat yang bersamaan, trauma akan

merusak trombosit dan akan melepaskan fosfolipid trombosit yang mengandung lipoprotein.

Faktor XII teraktivasi akan bekerja secara enzimatik terhadap faktor XI dan mengaktifkannya,

dimana pada proses ini memerlukan kininogen HMW (high molecul weight), dan dipercepat

dengan adanya prekalikrein. Faktor XI yang teraktivasi dan dengan bantuan dari ion Ca2+ akan

bekerja secara enzimatik untuk mengaktifkan faktor IX menjadi faktor IX teraktaktivasi. Faktor

IX yang teraktivasi akan bekerja sama dengan faktor VIII teraktivasi yang diaktifkan oleh faktor

VIII yang dibantu dengan trombin, fosfolipid trombosit, faktor III dari trombosit yang rusak, dan

ion Ca2+ yang selanjutnya akan mengaktifkan faktor X. Faktor X teraktivasi akan bergabung

dengan ion Ca2+, faktor V, dan fosfolipid trombosit untuk membentuk suatu kompleks yang

disebut aktivator protrombin. Aktivator protrombin akan memecah protrombin menjadi thrombin

dengan bantuan dari ion Ca2+ dan fosfolipid trombosit dan selanjutnya trombin akan mengubah

fibrinogen menjadi benang fibrin sehingga perdarahan dapat dihentikan (Guyton and Hall, 1997).

Gambar 3. Jalur intrinsik sebagai awal pembekuan darah (Guyton and Hall, 1997).

2.2.5. Perubahan protrombin menjadi trombin

Aktivator protrombin akan terbentuk akibat pecahnya pembuluh darah atau kerusakan

pada zat-zat aktivator khusus dalam darah, kemudian dengan adanya ion Ca2+ yang cukup, maka

aktivator protrombin akan mengubah protrombin menjadi trombin. Trombin yang terbentuk akan

menyebabkan terjadinya polimerasi molekul fibrinogen menjadi benang fibrin. Protrombin

merupakan suatu protein plasma (α2-globulin) dengan berat molekul 68.700, dan protrombin

merupakan protein yang tidak stabil dan mudah pecah menjadi senyawa kecil seperti trombin

dengan berat molekul 33.700 (Guyton and Hall, 1997).

2.2.6. Perubahan fibrinogen mejadi fibrin

Fibrinogen adalah protein dengan berat molekul 340.000 yang terdapat di dalam plasma

dan dibentuk di hati. Trombin adalah enzim protein dengan kemampuan proteolitik. Trombin

bekerja dengan cara melepaskan empat peptide (BM rendah) dari setiap molekul fibrinogen,

sehingga akan terbentuk fibrin monomer yang memiliki kemampuan berpolimerisasi dengan

molekul fibrin monomer yang lain, sehingga akan terbentuk benang fibrin yang panjang dan

retikulum bekuan (Guyton and Hall, 1997).

Pada tingkat awal polimerisasi ini, molekul fibrin monomer saling berikatan melalui

ikatan hidrogen nonkovalen yang lemah, sehingga bekuan yang dihasilkan tidak kuat dan mudah

dipecah sehingga perlu mengaktifkan faktor stabilisasi fibrin. Faktor stabilisasi fibrin juga

diaktifkan oleh trombin, kemudian faktor ini akan bekerja sebagai enzim untuk menimbulkan

ikatan kovalen antara benang-benang fibrin yang berdekatan, sehingga dapat menambah kekuatan

jaringan fibrin secara tiga dimensi (Gu.yton and Hall, 1997).

Gambar 4. Skema perubahan protrombin menjadi trombin dan polimerisasi

fibrinogen untuk membentuk benang fibrin (Guyton and Hall,

1997).

2.3. Tinjauan pustaka tentang tanaman

Tanaman yang digunakan dalam praktikum ini adalah pegagan (Centella asiatica).

Gambar 5. Tanaman pegagan (Centella asiatica).

2.3.1. Klasifikasi tanaman

Nama latin : Centella asiatica

Nama daerah : Pegaga, Daun kaki kuda, Kaki kuda, Antanan, Paiduh, Sarowati, Bebele, wisu-

wisu, Dogauke (Anonim,1977).

Taksonomi

Kingdom : Plantae

Divisi : Magnoliophyta (tumbuhan berbunga)

Kelas : Magnoliopsida(monokotil)

Ordo : Apiales

Famili : Apiaceae

Genus : Centella

Spesies : Centella asiatica

2.3.2. Morfologi tanaman

Terna atau herba tahunan, tanpa batang tetapi dengan rimpang pendek dan stolon-stolon

yang melata, panjang 10 cm sampai 80 cm. Daun tunggal, tersusun dalam roset yang terdiri dari 2

sampai 10 daun, kadang-kadang agak berambut; tangkai daun panjang sampai 50 mm; helai daun

berbentuk ginjal,lebar, dan bundar dengan garis tengah 1 cm sampai 7 cm, pinggir daun beringgit

sampai beringgit-bergerigi, terutama ke arah pangkal daun. Perbungaan berupa payung tunggal

atau 3 sampai 5 bersama-sama keluar dari ketiak daun kelopak, gagang perbungaan 5 mm sampai

50 mm, lebih pendek dari tangkai daun. Bunga umumnya 3, yang di tengah duduk, yang di

samping bergagang pendek; daun pelindung 2, panjang 3 mm sampai 4 mm, bentuk bundar telur;

tajuk berwarna merah lembayung, panjang 1 mm sampai 1,5 mm, lebar sampai 0,75 mm. Buah

pipih, lebar lebih kurang 7 mm dan tinggi lebih kurang 3 mm, berlekuk dua, jelas berusuk,

berwarna kuning kecoklatan, berdinding agak tebal (Anonim,1977).

2.3.2. Ekologi dan penyebaran

Tumbuh liar di seluruh Indonesia serta daerah-daerah beriklim tropik pada umumnya, dari

dataran rendah hingga ketinggian 2500 m di atas permukaan laut. Tumbuh di tempat yang

terbuka atau sedikit terkena cahaya. Pada tanah yang lembab dan subur seperti di tegalan, padang

rumput, tepi parit, diantara batu-batu, di tepi jalan dan tembok (Anonim,1977).

2.3.3. Kandungan kimia

Kandungan dari pegagan yaitu terdiri dari triterpenoid, minyak atsiri dan flavonoid.

Triterpenoid merupakan senyawa mayor dari pegagan seperti asiatosid, asam asiatik, asam

madecassik, asiaticosid, madicassosid, asam brahmik (Warnasuriya and Dissanayake, 1999).

Senyawa yang berperan dalam pemyembuhan luka adalah triterpenoid golongan saponin dan

sapogenin, yaitu asam asiatik, asam madekasat, dan asiatikosid (Suratman,dkk.,1996).

Gambar 6. Struktur kimia senyawa yang terkandung dalam Centella asiatica

2.3.4. Efek farmakologi

Tanaman pegagan Centella asiatica memiliki efek anti-inflamasi, digunakan dalam

pengobatan peptic ulcer, sebagai antimikroba, agen penyembuh luka, dan digunakan dalam

pengobatan hepatitis (Warnasuriya and Dissanayake, 1999).

BAB III

METODE SKRINING BIOAKTIVITAS

3.1. Uji in vitro

3.1.1. Perlakuan Hewan Coba

Hewan coba dibagi menjadi lima kelompok percobaan, masing-masing kelompok terdiri

dari lima ekor tikus.

Kelompok I (kontrol normal) : hewan diberi CMC-Na 0,5 %.

Kelompok II (kontrol positif) : hewan diberi vitamin K dan CMC-Na 0,5 %.

Kelompok III (kontrol perlakuan) : hewan diberi ekstrak pegagan dengan dosis 50 mg/Kg.

Kelompok IV (kontrol perlakuan) : hewan diberi ekstrak pegagan dengan dosis 122,5

mg/Kg.

Kelompok V (kontrol perlakuan) : hewan diberi ekstrak pegagan dengan dosis 300

mg/Kg.

3.2. Metode Uji

3.2.1.Preparasi sampel

Daun pegagan (Centella asiatica) segar diekstraksi dengan menggunakan etanol 70%

dengan metode ekstraksi panas yaitu metode sokhletasi. Hewan coba pada uji ketiga, keempat

dan kelima diberikan ektrak etanol dengan dosis 50 mg/kg, 122,5 mg/kg, dan 300 mg/kg.

Sebelum tikus diminumkan ekstrak, terlebih dahulu ekstrak dibuat dalam bentuk suspensi dengan

menambahkan CMC-Na sebanyak 0,5%.

Dosis ekstrak pegagan yang diperbolehkan terhadap tikus yaitu tidak lebih dari 350

mg/Kg berat badan, karena pada dosis 350 mg/Kg menunjukan efek yang toksik terhadap tikus.

Dosis ekstrak pegagan yang diberikan kepada tikus yaitu 50-300 mg/Kg, perhitungan dosis ini

didapatkan dengan menggunakan rumus :

F =

F =

F = 2,4495

Sehingga dosisnya menjadi = 50 mg/Kg x 2,4495

= 122,5 mg/Kg.

Dosis ekstrak yang diberikan kepada hewan coba yaitu : 50 , 122,5, dan 300 mg/Kg.

Dosis sediaan ekstrak pegagan yaitu 50; 122,5; dan 300 mg/Kg, sehingga jumlah ekstrak

yang diminumkan kepada hewan uji jika konsentrasi ekstrak yang didapat 5%b/v, yaitu :

Jika dimisalkan berat badan tikus yaitu 100 mg, 150 mg, dan 200 mg dan dosis sediaan

50;122,5 ;300 mg/Kg.

Berat badan tikus 100 mg dan dosis sediaan 50 mg/Kg.

Jumlah ekstrak (mL) =

=

= 0,1 mL.

Dengan cara yang sama, didapatkan hasil sebagai berikut :

Berat Badan Dosis (mg/Kg) Jumlah yang diminum (mL)

100 mg

50 0,1

122,5 0,245

300 0,6

150 mg

50 0,15

122,5 0,3675

300 0,9

200 mg

50 0,2

122,5 0,49

300 1,2

3.2.2. Uji Masa Protrombin (In Vitro)

Disiapkan lima buah tabung reaksi untuk satu kelompok hewan uji, sehingga perlu

disiapkan sebanyak 25 tabung uji untuk pengujian ini. Selanjutnya, masing-masing tabung

ditambahkan 0,1 mL plasma normal yang diambil dari masing-masing kelompok hewan coba,

kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 menit. Setelah proses inkubasi selesai, sampel

ditambahkan dengan 0,2 mL reagen tromboplastin hangat, dan sampel dimasukkan ke dalam

koagulator. Waktu terjadinya pembekuan dicatat pada masing-masing tabung (Anonim a,tt).

3.2.3. Uji Masa Tromboplastin Parsial Aktif (In Vitro)

Kalsium klorida dimasukkan ke dalam tabung reaksi pada suhu 37°C selama 5 menit

sebelum digunakan. Dipipet sebanyak 0,1 mL reagen aPPT ke dalam 2 tabung pembekuan pada

suhu 37°C dan ditambahkan sebanyak 0,1 mL plasma kontrol ke dalam tabung pertama.

Dilakukan pencampuran dan dihitung waktunya dengan menggunakan stopwatch. Pada tabung

kedua ditambahkan sebanyak 0,1 mL plasma kontrol dan dilakukan pencampuran. Setelah waktu

inkubasi terpenuhi, ditambahkan sebanyak 0,1 ml kalsium klorida pada masing-masing tabung

secara bergantian, hitung waktu pada setiap pergantian tabung lain. Dicampur. Dicatat waktu

yang diperlukan untuk pembekuan (Anonim b,tt).

3.3. Skema Kerja

3.3.1.Preparasi Sampel

Dibagi menjadi 5 kelompok

Daun pegagan segar diekstraksi dengan menggunakan etanol 70% dengan metode soxhletasi

25 ekor tikus jantan Sprague Dawley BB 100-200 g, telah diadaptasikan selama 1 minggu dan dipuasakan selama 12-18 jam

Kelompok I (kontrol normal)

Kelompok II (kontrol positif)

Kelompok III (kelompok perlakuan)

Kelompok IV (kelompok perlakuan)

Kelompok V (kelompok perlakuan)

Diukur waktu perdarahan

3.3.2. Uji Masa Protrombin

Masing-masing hewan coba diambil darahnya

3.3.3. Uji Masa Tromboplastin Parsial Aktif

Diambil darah dari masing-masing hewan coba

Disiapkan 25 tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,1 mL plasma normal

Diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 menit

Ditambahkan 0,2 mL reagen tromboplastin dan dimasukkan ke dalam koagulator

Dicatat waktu pembekuan darah

Dimasukkan kalsium klorida ke dalam 25 tabung dan diinkubasi selama 5 menit pada 37°C

Dipipet 0,1mL regen aPPT ke dalam 2 tabung pembekuan pada suhu 37°C

Ditambahkan 0,1 mL plasma normal ke dalam 25 tabung pertama

Kelompok I (kontrol normal)

Kelompok II (kontrol positif)

Kelompok III (kontrol perlakuan)

Kelompok IV (kontrol perlakuan)

Kelompok V (kontrol perlakuan)

3.4. Analisis Hasil

Dari penggunaan secara empiris bahwa pegagan dapat menyembuhkan luka sehingga

ekstrak ini menunjukan efek anti perdarahan yang diuji pada tikus. Pertama dilakukan uji

kehomogenan pengaruh ekstrak terhadap waktu perdarahan. Kehomogenan didapatkan jika

signifikasi p > 0,05. Setelah dilakukan uji kehomogenan, dilanjutkan dengan uji ANOVA dan

LSD. Pengujian dengan ANOVA dan LSD diharapkan memberikan signifikasi p <0,05 yang

menyatakan bahwa data analisis tidak berbeda bermakna dan > 0,05 menyatakan bahwa data

analisis berbeda bermakna.

Diharapkan data yang diperoleh dari uji Protrombin time dan aPPT menunjukkan bahwa,

pada perlakuan dengan menggunakan ekstrak pegagan memberikan waktu pembekuan darah atau

menghentikan perdarahan lebih cepat dibandingkan terhadap hewan kontrol normal (yang hanya

diberikan aquades) dan tidak berbeda bermakna dengan kontrol yang diberikan perlakuan dengan

vitamin K.

Dicampur dan dihitung waktu pembekuan

Pada 25 tabung kedua, ditambahkan plasma kontrol dan dicampur

Ditambahkan sebanyak 0,1 mL kalsium klorida dan dicampur

Dicatat waktu terjadinya pembekuan.

DAFTAR PUSTAKA

Anonym. 1977. Materia Medika Indonesia Jilid I. Jakarta : Depkes RI

Anonim . 2011. Herbarium Bandungense.

Available at : http://www.sith.itb.ac.id/herbarium/index.php?

c=herbs&view=detail&spid=198264

Opened at : 21 Maret 20011

Anonim a. tt. Protrombin Time

Available at :

http://www.wfh.org/2/docs/Publications/Diagnosis_and_Treatment/Lab_M

anual2010/Lab_Manual_Section-12.pdf

Opened at : 18 Maret 2011

Anonim b. tt. Activated Partial Thromboplastin Time

Available at :

http://www.wfh.org/2/docs/Publications/Diagnosis_and_Treatment/Lab_M

anual2010/Lab_Manual_Section-13.pdf

Opened at : 18 Maret 2011

Anonym e .tt. Sistem Peredaran Darah Manusia.

Available at :http://aas07.files.wordpress.com/2009/06/sistem-peredaran-darah-

manusia2.pdf

Opened at : 7 Maret 2011

Baldy, Chaherine M. 1994. Patofisiologi Edisi IV-Gangguan Hematologi. Jakarta :

Penerbit Buku Kedokteran ECG.

Guyton,Arthur C and John E. Hall. 1997. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran Edisi 9. Jakarta

: ECG Penerbit Buku Kedokteran.

Suratman, Sri Adi Sumiwi, dan Dolih Gozali. 1996. Pengarauh ekstrak Antanan dalam

Bentuk Salep, Krim, dan Jelly terhadap Penyembuhan Luka Bakar. Bandung :

Universitas Padjajaran.

Available at : http://jurnal.pdii.lipi.go.id/admin/jurnal/108963136.pdf

Opened at : 14 April 2011

Warnasuriya, Dilmanni and Harshani Dissanayake . 1999. Centella Asiatica.

Available at : http://dl.nsf.ac.lk/bitstream/1/5368/1/NA_217.pdf

Opened at : 21 Maret 2011

Zhang, L., Jun-Rong Du., Jin Wang., Dong-Ke Yu., Ya-Shu Chen., Yao He., Chen-Yuan

Wang. 2009. Z-ligustilide Extracted from Radix Angelica Sinensis Decrease

Platelet Aggregation Induced by ADP Ex Vivo and Arterio-venous Shunt

Thrombisis In Vivo in Rats. Yakugaku Zasshi 129 (7) 855-859 The

Pharmaceutical Society of Japan