ana-maria cristina bololoi a alogues du...
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THESE
en vue de l’obtention du
DOCTORAT DE L’UIVERSITE DE TOULOUSE
délivré par
L’UIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER et
L’UIVERSITE POLITEHICA BUCAREST
Spécialité : CHIMIE MACROMOLECULAIRE ET SUPRAMOLECULAIRE
par
Ana-Maria Cristina BOLOLOI
Ingénieur UPB – Bucarest
OUVEAUX AMPHIPHILES CATAIOIQUES
AALOGUES DU GALACTOSYLCERAMIDE :
CORRELATIO STRUCTURE, PROPRIETES PHYSICO-
CHIMIQUES ET ACTIVITE ATI-VIH
Présentée et soutenue le 19 mai 2008 devant la commission d’examen
Mme. M.J. Stébé, Directeur de recherche CNRS, Nancy Rapporteur
Mlle. L.R. Stan, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Rapporteur
M. B. Pucci, Professeur à la Faculté des Sciences, Avignon Examinateur
M. A. Vigroux, Professeur à l’Université Paul Sabatier, Toulouse Examinateur
Mme. I. Rico-Lattes, Directeur de recherche CNRS, Toulouse Directeur de thèse
M. S.I. Rosca, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Directeur de thèse
Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique, UMR 5623
Université Paul Sabatier – Bât. 2R1, 118 route de 'arbonne, 31062 Toulouse Cedex 04
THESE
en vue de l’obtention du
DOCTORAT DE L’UIVERSITE DE TOULOUSE
délivré par
L’UIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER et
L’UIVERSITE POLITEHICA BUCAREST
Spécialité : CHIMIE MACROMOLECULAIRE ET SUPRAMOLECULAIRE
par
Ana-Maria Cristina BOLOLOI
Ingénieur UPB – Bucarest
OUVEAUX AMPHIPHILES CATAIOIQUES
AALOGUES DU GALACTOSYLCERAMIDE :
CORRELATIO STRUCTURE, PROPRIETES PHYSICO-
CHIMIQUES ET ACTIVITE ATI-VIH
Présentée et soutenue le 19 mai 2008 devant la commission d’examen
Mme. M.J. Stébé, Directeur de recherche CNRS, Nancy Rapporteur
Mlle. L.R. Stan, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Rapporteur
M. B. Pucci, Professeur à la Faculté des Sciences, Avignon Examinateur
M. A. Vigroux, Professeur à l’Université Paul Sabatier, Toulouse Examinateur
Mme. I. Rico-Lattes, Directeur de recherche CNRS, Toulouse Directeur de thèse
M. S.I. Rosca, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Directeur de thèse
Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique, UMR 5623
Université Paul Sabatier – Bât. 2R1, 118 route de 'arbonne, 31062 Toulouse Cedex 04
Avant propos
Avant-propos
REMERCIEMENTS
Ces travaux de thèse ont été réalisés au Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique de l’Université Paul Sabatier à Toulouse, dirigé successivement par Mme Isabelle Rico-Lattes puis par Mme Monique Mauzac. Je tiens à les remercier toutes deux pour leur accueil au sein de cette grande famille des IMRCP et pour leur gentillesse.
Je tiens à remercier encore une fois Mme Isabelle Rico-Lattes, ma directrice de thèse, de
m’avoir donné la possibilité de réaliser cette étude dans les meilleures conditions et de m’avoir suivie tout au long de ce travail. Je vous remercie pour votre rigueur scientifique, votre dynamisme et vos qualités humaines qui m’ont permis d’évoluer aussi bien sur le plan professionnel que personnel.
Je voudrais également remercier M. Sorin Ioan Rosca, mon deuxième directeur de thèse, de m’avoir permis de découvrir la beauté et quelques secrets de la chimie organique, de m’avoir dirigé vers les IMRCP et d’avoir accepté cette thèse en cotutelle. Je vous remercie également pour votre très grande pédagogie qui m’a beaucoup apportée.
Mes sincères remerciements s’adressent à M. Armand Lattes qui m’a accueillie très chaleureusement dans l’univers des IMRCP dont il est le créateur.
Je suis très reconnaissante à Muriel Blanzat et Emile Perez qui ont encadré quotidiennement ces travaux de recherche avec énormément de conseils, de motivation et de force de travail. Merci également pour votre bonne humeur, votre disponibilité et votre gentillesse.
Je voudrais remercier Mme Marie-José Stébé (Directeur de recherche CNRS à Nancy) et Mlle Raluca Stan (Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest) d’avoir accepté de juger ce travail en tant que rapporteurs.
Mes remerciements s’adressent également à M. Alain Vigroux (Professeur à l’Université Paul Sabatier à Toulouse) qui a accepté de présider le jury de cette thèse et à M. Bernard Pucci (Professeur à la Faculté des Sciences à Avignon) pour sa participation en tant qu’examinateur.
Je suis également très reconnaissante à M. Helmuth Möhwald et à M. Gerald Brezesinski de l’Institut Max-Planck à Golm, en Allemagne, de m’avoir accueillie dans leur laboratoire pendant mon stage Marie Curie.
Je tiens également à remercier M. Angelo Valleriani et le programme Marie Curie EST (Early-Stage Research Training) pour le support financier de ces travaux.
Avant-propos
Mes sincères remerciements s’adressent à Mme Anne-Marie Aubertin et à Géraldine Albrecht qui ont réalisé les expériences d’évaluation d’activité antivirale et qui m’ont accueillie très chaleureusement dans leur laboratoire de l’Institut de Virologie INSERM à Strasbourg.
Je suis très reconnaissante à Cédric-Olivier Turrin et à Grégory Spataro de l’équipe de M. Jean-Pierre Majoral (Laboratoire de Chimie de Coordination, Toulouse) pour la synthèse des dendrimères et leur si plaisante collaboration.
Je remercie encore une fois très chaleureusement M. Bernard Pucci et son équipe de
l’Université d’Avignon (Laboratoire de Chimie Bioorganique et des Systemes Moléculaires Vectoriels) pour la synthèse des acides mixtes fluorés/hydrogénés et leur collaboration.
Je souhaite également remercier le Dr. Brigitte Tiersch et le Prof. Dr. Joachim Kötz de l’Université de Potsdam, Allemagne, pour leur collaboration en cryofracture et l’équipe de microscopistes, tout particulièrement, Vincent Collière et Lucien Datas du Service Commun de Microscopie Electronique de l’Université Paul Sabatier (TEMSCAN).
Je voudrais remercier très chaleureusement toute l’équipe : Stéphanie Cassel, Sophie Franceschi, Elodie, Romain, Sabrina, Roland, Roberto, Sergii, Lyuba, Plamen, Hugo, Alex, Cécile, Denis …Merci pour la bonne ambiance que vous avez su créer et pour les moments très agréables passés ensemble.
Je remercie également toutes les personnes des IMRCP pour leur amabilité et leur gentillesse. Un grand merci s’adresse particulièrement à : Lacramioara, Menana, Florence, Javier, Kamil, Waël, Yann, Florence Frechou, Fernanda, Arielle, Jean-Christophe, Sandrine, Charles Louis, Christian...
Un grand merci s’adresse aux amis de tarot : Muriel, Richard, Marlene, Marie, Elisabeth, Vincent, Clément, Kamal, Cosmin, Andreea et Raluca. Merci infiniment pour les moments magnifiques passés ensemble.
Je tiens également à remercier l’équipe de Bucarest : Mme Sanziana Rosca, Cristinel, Raluca, Dienut, Manuc, Andrada, Nico… Merci pour les moments inoubliables.
Diana et Vincent, Raluca et Bassam, Ana et Florin merci de tout cœur de votre amitié, de votre soutien et de votre compréhension.
Enfin, je tiens à remercier mes parents et ma famille pour tout ce que vous m’avez appris et offert.
Alin, merci de tout cœur d’avoir été toujours là pour me soutenir et me redonner la confiance et la force d’aller plus loin. Cette réussite nous appartient à tous les deux. Merci !
Merci à tous.
Avant-propos
LISTE DES ABREVIATIONS
AD : Acide Désoxyribonucléique
AR : Acide Ribonucléique
ARm : Acide Ribonucléique messager
ARV : AIDS Related Virus
AZT : 3’-azido-2’-déoxytimidine
CA : Capside
CAC : Concentration d’Agrégation Critique
CC50 : Concentration Cytotoxique à 50%
CCR : Récepteur de chimiokines non spécifiques (CC)
CD4 : Classe de Différenciation 4 (Récepteur cellulaire du VIH)
CD4+ : Cellules exprimant le CD4
CD4- : Cellules n’exprimant pas le CD4
CEM-SS : Lignée cellulaire lymphocytaire; SS - "syncytial sensitivity"
CXCR : Récepteur de chimiokines spécifiques à une seule protéine (CXC)
DC3 : Dendrimère comportant des chaînes alkyles en C3
DC10 : Dendrimère comportant des chaînes alkyles en C10
FDA: American Food and Drugs Administration
F8 : Acide CF3(CF2)7COOH
GalCer : GalactosylCéramide
GalCer +: Cellules exprimant le GalactosylCéramide
gp : Glycoprotéine
HAART: Highly Active Antiretroviral Treatment
HTLV-III: Human T-Cell Leukemia Virus III
H2F6H4 : Acide CH3(CH2)3(CF2)6(CH2)2COOH
H4F8 : Acide CF3(CF2)7(CH2)4COOH
IC50 : Concentration Inhibitrice à 50%
IP : Inhibiteurs de la Protéase
IR : Infrarouge
IRRAS : Spectroscopie Infrarouge de Réflexion-Absorption
I : Intégrase
ITI : Inhibiteurs Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse
Avant-propos
ITI : Inhibiteurs Non-Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse
ItTI : Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse
IT : Indice Thérapeutique
LAV : Lymphadenopathy Associated Virus
L12 : N-dodécylamino-1-déoxylactitol
L16 : N-hexadécylamino-1-déoxylactitol
L12DC3 : Association catanionique entre le L12 et le dendrimère DC3
L16DC3 : Association catanionique entre le L16 et le dendrimère DC3
L12DC10 : Association catanionique entre le L12 et le dendrimère DC10
L16DC10 : Association catanionique entre le L16 et le dendrimère DC10
L16H13 : Association catanionique entre le L16 et l’acide myristique, CH3(CH2)12COOH
L16H4F8 : Association catanionique entre le L16 et l’acide CF3(CF2)7(CH2)4COOH
L16H2F6H4 : Association catanionique entre le L16 et l’acide CH3(CH2)3(CF2)6(CH2)2COOH
L16F8 : Association catanionique entre le L16 et l’acide CF3(CF2)7COOH
MA : Matrice virale
C : Nucléocapside
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
OUSIDA : Programme Commun des Nations Unies Sur le VIH/SIDA
p17 : Protéines de la matrice
PR : Protéase
RM : Résonance magnétique nucléaire
RCI50 : Concentration Inhibitrice Normalisée
SIDA : Syndrome d’Immunodéficience Acquise
T4
(T CD4+) :
Lymphocytes exprimant le récepteur CD4
TEM : Microscopie Electronique à Transmission
TI : Transcriptase Inverse
TS : Tension Superficielle
V3 : Région variable 3
VIH : Virus d’Immunodéficience Humaine
VIS : Virus de l’Immunodéficience du Singe
Sommaire
Sommaire
SOMMAIRE
ITRODUCTIO GEERALE......................................................................... 1
CHAPITRE I : MISE AU POIT BIBLIOGRAPHIQUE...................................... 7
I ITRODUCTIO ......................................................................................... 11
II GEERALITES SUR LE SIDA..................................................................... 12
III LE VIRUS D’IMMUODEFICIECE HUMAIE (VIH) ............................... 15
III.1 Généralités sur le VIH.......................................................................................... 15
III.2 La structure du VIH-1 .......................................................................................... 16
III.3 Cycle de réplication du VIH................................................................................. 19
IV LA CHIMIOTHERAPIE DU VIH-1 .............................................................. 22
IV.1 Inhibiteurs de l’entrée virale................................................................................ 24
IV.1.1 Inhibiteurs de reconnaissance et de fixation................................................................ 24
IV.1.1.1 Inhibiteurs des récepteurs cellulaires CD4 ......................................................... 25
IV.1.1.2 Inhibiteurs des glycoprotéines virales gp 120 .................................................... 26
IV.1.1.3 Inhibiteurs des corécepteurs du VIH-1 ............................................................... 34
IV.1.1.3.1 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5......................................................... 34
IV.1.1.3.2 Inhibiteurs des corécepteurs CXCR4 ............................................................ 36
IV.1.1.3.3 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5 et CXCR4....................................... 38
IV.1.2 Les inhibiteurs de fusion ............................................................................................. 38
IV.1.2.1 Inhibiteurs ciblant la région NHR de la gp 41................................................... 39
IV.1.2.2 Inhibiteurs ciblant la région CHR de la gp 41. ................................................... 40
IV.1.3 Inhibiteurs de la décapsidation (de la nucléocapside virale) ....................................... 41
IV.2 Inhibiteurs de la transcriptase inverse................................................................. 42
IV.2.1 Structure et activité de la transcriptase inverse ........................................................... 42
IV.2.2 Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse................................................. 42
IV.2.3 Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse. ................................................ 45
IV.2.4 Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse ......................................... 45
IV.3 Inhibiteurs de l’intégrase ..................................................................................... 47
IV.4 Inhibiteurs de transcription (transactivation)...................................................... 50
IV.5 Inhibiteurs de la protéase..................................................................................... 52
IV.6 Polythérapies........................................................................................................ 54
IV.7 Le développement des systèmes de vectorisation pour la thérapie anti-VIH...... 56
IV.8 Inhibiteurs de l’étape de latence du VIH ............................................................. 57
IV.9 Le stade actuel du développement des vaccins anti-VIH ..................................... 58
V COCLUSIOS ........................................................................................... 59
VI BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................ 61
Sommaire
CHAPITRE II : SYTHESE, PROPRIETES BIOLOGIQUES ET PHYSICO-
CHIMIQUES DE OUVEAUX LEURRES DU VIH .................. 69
I ITRODUCTIO ......................................................................................... 73
II ITERET DES DERIVES CATAIOIQUES DEDRITIQUES AALOGUES DU
GALCER .................................................................................................... 74
III SYTHESE DE OUVEAUX TESIOACTIFS CATAIOIQUES DEDRITIQUES
AALOGUES DU GALCER.......................................................................... 79
III.1 Synthèse des dendrimères catanioniques analogues du GalCer.......................... 79
III.2 Analyse structurale par résonance magnétique nucléaire................................... 81
IV ETUDE DE L’ASSOCIATIO DES DEDRIMERES CATAIOIQUES A
L’ITERFACE EAU / AIR............................................................................. 83
IV.1 La technique de la balance de Langmuir ............................................................ 83
IV.2 Etude des monocouches d’amphiphiles catanioniques dendritiques par la
technique de la balance de Langmuir ................................................................. 85
V PROPRIETES BIOLOGIQUES DE OUVEAUX CATAIOIQUES
DEDRITIQUES AALOGUES DU GALCER................................................. 89
V.1 Caractéristiques biologiques................................................................................ 89
V.1.1 Paramètres biologiques ............................................................................................... 89
V.1.2 Lignées cellulaires et souches virales.......................................................................... 90
V.1.3 Présentation de la méthode utilisée ............................................................................. 90
V.2 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des dendrimères catanioniques analogues
du GalCer............................................................................................................ 91
VI ETUDE DE L’ITERACTIO ET DE L’ICORPORATIO DES DEDRIMERES
CATAIOIQUES VIS-A-VIS D’U MODELE MEMBRAAIRE ...................... 96
VII PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES CATAIOIQUES DEDRITIQUES
AALOGUES DU GALCER........................................................................ 107
VII.1 Etude des propriétés tensioactives ..................................................................... 107
VII.2 Etude de la distribution de taille des agrégats................................................... 111
VII.3 Etude de la morphologie des agrégats............................................................... 113
VIII COCLUSIOS ET PERSPECTIVES......................................................... 120
IX BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................... 123
CHAPITRE III : MISE AU POIT DE VECTEURS CATAIOIQUES HYBRIDES
AALOGUES DU GALCER .............................................. 125
I ITRODUCTIO..................................................................................... 129
Sommaire
II MISE AU POIT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES TESIOACTIFS MIXTES
FLUORES / HYDROGEES ...................................................................... 131
II.1 Caractéristiques particulières des chaînes alkyles fluorocarbonées................. 131
II.2 Composés covalents mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés dérivés de sucres132
II.3 Composés catanioniques mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés .................... 135
III MISE AU POIT DE VECTEURS CATAIOIQUES HYBRIDES AALOGUES
DU GALCER .......................................................................................... 136
III.1 Tensioactifs catanioniques pour la délivrance de principes actifs .................... 136
III.2 Synthèse d’analogues catanioniques du GalCer de nature hybride fluorocarboné
/ hydrocarboné .................................................................................................. 138
III.3 Analyse structurale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer............. 142
IV PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES COMPOSES CATAIOIQUES
HYBRIDES FLUORES / HYDROGEES..................................................... 145
IV.1 Etude des propriétés tensioactives ..................................................................... 145
IV.2 Etude de distribution de taille des agrégats....................................................... 148
IV.3 Etude de la morphologie des agrégats............................................................... 151
V ETUDE DE L’ITERACTIO ETRE LES COMPOSES CATAIOIQUES ET
DES MOOCOUCHES DE PHOSPHOLIPIDES ........................................... 157
VI EVALUATIO DES PROPRIETES DE VECTORISATIO SUR CELLULES
IFECTEES PAR LE VIH........................................................................ 162
VI.1 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des associations catanioniques hybrides
analogues du GalCer ........................................................................................ 162
VI.2 Evaluation des propriétés physico-chimiques dans les conditions de vectorisation
........................................................................................................................... 164
VI.3 Formulations de l’AZT avec les tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et
L16F8 .................................................................................................................. 171
VII COCLUSIO ........................................................................................ 174
VIII BIBLIOGRAPHIE.................................................................................... 176
COCLUSIO GEERALE ......................................................................... 179
PARTIE EXPERIMETALE ........................................................................ 185
I PRODUITS COMMERCIAUX UTILISES ...................................................... 189
I.1 Réactifs ............................................................................................................... 189
I.2 Solvants .............................................................................................................. 189
II TECHIQUES DE CARACTERISATIO STRUCTURALE ............................. 190
II.1 RM; ................................................................................................................... 190
II.2 Infrarouge........................................................................................................... 190
Sommaire
II.3 Spectrométrie de masse...................................................................................... 190
II.4 Analyses centésimales ........................................................................................ 191
III SYTHESE ............................................................................................... 191
III.1 ;-dodécylamino-1-désoxylactitol - L12 ............................................................. 191
III.2 ;-hexadécylamino-1-désoxylactitol - L16.......................................................... 193
III.3 Dendrimères catanioniques analogues du GalCer ............................................ 195
III.3.1 Mélanges catanioniques comportant le N-hexadécylamino-1-désoxylactitol : L16DC3
et L16DC10 ................................................................................................................. 195
Mélange catanionique L16DC3 ........................................................................................... 195
Mélange catanionique L16DC10 .......................................................................................... 196
III.3.2 Mélanges catanioniques comportant le N-dodécylamino-1-désoxylactitol : L12DC3 et
L12DC10...................................................................................................................... 197
Mélange catanionique L12DC3 ........................................................................................... 197
Mélange catanionique L12DC10 .......................................................................................... 198
III.4 Associations catanioniques bicaténaires analogues du GalCer ........................ 199
III.4.1 Association catanionique L16H4F8 ............................................................................. 199
III.4.2 Association catanionique L16H2F6H4 ......................................................................... 200
III.4.3 Association catanionique L16F8 ................................................................................. 201
III.4.4 Association catanionique L16H13 ............................................................................... 202
IV TECHIQUES DE CARACTERISATIO PHYSICO - CHIMIQUE................... 203
IV.1 Préparation des solutions de catanioniques ...................................................... 203
IV.2 Mesure de tension de surface ............................................................................. 203
IV.3 Evaluation de la taille et de la distribution de taille des agrégats - Diffusion
quasi-élastique de la lumière (DLS).................................................................. 204
IV.4 Caractérisation des agrégats ............................................................................. 205
IV.4.1 Microscopie électronique par transmission............................................................... 205
IV.4.2 Cryofracture .............................................................................................................. 206
IV.5 Isothermes de compression ................................................................................ 209
IV.6 Spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) .............................. 210
V TESTS BIOLOGIQUES ............................................................................... 212
V.1 Conditions expérimentales d’infection des cellules CEM-SS ............................ 212
V.2 Evaluation de l’activité anti – VIH : incorporation d’uridine tritiée ([3H]-
uridine) .............................................................................................................. 213
V.3 Evaluation de la cytotoxicité : test MTT ............................................................ 213
LISTE DES PRODUITS ............................................................................... 215
Introduction générale
Introduction générale
3
INTRODUCTION GENERALE
L’origine exacte du Virus d’Immunodéficience Humaine (VIH), le virus responsable
du Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA) demeure jusqu’à nos jours inconnue. Une
première évidence de l’infection d’un être humain par ce virus, qui sera dénommé 27 ans plus
tard VIH, provient d’un sérum prélevé en 1959 en Afrique. Ce n’est qu’en 1981 que
l’épidémie de SIDA commence à se manifester comme une maladie inconnue dans les pays
développés et qu’en 1983 que les scientifiques identifient l’action destructrice du VIH sur le
système immunitaire humain comme cause de l’apparition du SIDA. Depuis, le nombre de
personnes infectées par le VIH dans le monde et décédées suite au SIDA est en croissance
continue. Encore aujourd’hui, ce qui semble être le centre épidémiologique, l’Afrique
subsaharienne, reste la région la plus gravement touchée et le SIDA y est toujours la
principale cause de mortalité.
Les importants progrès réalisés dans le domaine médical ont abouti à la mise au point
de régimes polythérapeutiques anti-VIH qui sont capables d’améliorer et de prolonger la vie
des personnes infectées par le VIH. L’efficacité de ces régimes polythérapeutiques est due à
l’utilisation combinée d’au moins trois principes actifs agissant à différentes étapes du cycle
de réplication du VIH : l’entrée virale, la transcription et la maturation du VIH.
De nombreux inhibiteurs de transcription et de maturation du VIH ont été déjà
acceptés pour l’utilisation clinique. Ceux-ci agissent après l’infection, au sein de la cellule,
afin de stopper la multiplication virale et la propagation de l’infection. Le nombre important
des composés de cette classe est justifié par une recherche continue des composés de plus en
plus actifs mais également par la nécessité de leur continue variation au sein des polythérapies
afin d’éviter les effets secondaires et/ou une résistance virale à un certain produit.
En ce qui concerne les inhibiteurs de l’entrée virale, seulement deux principes actifs
ont été agréés pour une utilisation clinique: l’enfuvirtide et le maraviroc. Malgré le rôle
crucial de ces inhibiteurs des étapes précoces de l’infection, qui bloquent la reconnaissance et
l’interaction entre le virus et la cellule, empêchant la pénétration du VIH et la contamination
cellulaire, ils présentent des inconvénients non-négligeables tels: une faible biodisponibilité,
un prix élevé de fabrication et des effets secondaires.
En répondant aux besoins urgents des patients atteints par le VIH en matière de
nouvelles classes d’inhibiteurs de l’entrée virale, le développement des analogues
synthétiques du galactosylcéramide (GalCer – récepteur cellulaire alternatif du VIH) s’est
Introduction générale
4
montré très prometteur. De par leur capacité à interagir et à bloquer les glycoprotéines virales
gp120, par un effet de concurrence avec les récepteurs cellulaires principaux (CD4) du VIH,
les analogues du GalCer empêchent le virus de pénétrer et d’infecter les cellules humaines. De
ce fait, ces composés fonctionnent comme leurres du VIH.
Connaissant la nécessité d’obtention d’antirétroviraux à faible coût, lorsque la plupart
des personnes infectées par le VIH vit dans des pays pauvres, des travaux précédemment
réalisés au laboratoire des IMRCP ont eu comme but de rendre les analogues du GalCer
économiquement attractifs. Ainsi, tout en conservant les impératifs structuraux indispensables
pour mimer le récepteur cellulaire, une nouvelle famille originale d’inhibiteurs de l’entrée
virale a été mise au point: les tensioactifs catanioniques analogues du galactosylcéramide.
Issus d’une réaction acido-basique entre les deux composés constitutifs, ces produits se sont
montrés très prometteurs en se distinguant par de bonnes activités antivirales, une méthode
simple de synthèse et à faible coût.
Ainsi, en nous appuyant sur l’expérience antérieure de notre laboratoire dans ce
domaine, l’étude actuelle aura pour but l’amélioration de l’activité antivirale de nouvelles
associations catanioniques du GalCer. Deux approches différentes seront envisagées.
Dans un premier temps, nous mettrons à profit l’effet de multiplicité de sites actifs afin
d’obtenir une affinité finale leurre multisite - virus supérieure à la somme des interactions
individuelles monosite - virus. Afin d’améliorer la marge de sécurité de ces principes actifs,
l’étude se concentrera également sur la diminution de la toxicité cellulaire de ces nouveaux
analogues du GalCer multivalents. Dans ce sens, une nouvelle famille des composés
catanioniques dendritiques sera synthétisée et étudiée.
Ainsi, la stratégie envisagée pour l’amélioration de l’activité antivirale sera celle d’une
multiplication de sites de reconnaissances. Par ailleurs, la stratégie de diminuer la toxicité
cellulaire impliquera des modifications structurales au sein de l’association catanionique afin
de renforcer l’effet hydrophobe entre les éléments constitutifs pour empêcher une éventuelle
dissociation de l’entité catanionique, dissociation supposée être responsable de la toxicité
cellulaire de ce type de composés.
Concernant la synthèse de ces nouveaux analogues catanioniques du GalCer, certains
facteurs structuraux indispensables pour l’affinité avec le virus seront conservés, à savoir, un
motif galactose, une hydrophobie adéquate, une flexibilité des chaînes alkyles et certaines
configurations stéréochimiques. Ainsi, la simplicité et la souplesse de la méthode de synthèse
Introduction générale
5
utilisée nous permettront d’obtenir des amphiphiles dendritiques catanioniques pouvant se
comporter comme des "clusters" de sites actifs, par simple association acido-basique des N-
alkylamino-1-déoxylactitols (composés comportant les sites actifs) avec des composés acides
dendritiques comportant des chaînes alkyles. Le squelette dendritique aura pour rôle de
supporter les multiples sites actifs et, quant aux chaînes alkyles, elles participeront à la
consolidation de l’entité catanionique ainsi qu’au renforcement de l’affinité avec le VIH.
Une étude des interactions entre ces nouveaux composés vis-à-vis des modèles
membranaires ainsi qu’une étude physico-chimique détaillée nous permettra d’établir une
corrélation entre les propriétés biologiques (activité antivirale et respectivement toxicité
cellulaire) et les caractéristiques structurales de ces associations catanioniques dendritiques.
Ainsi, nous verrons de quelle manière des éléments tels que la structure, l’hydrophobie, la
conformation, et l’organisation supramoléculaire dans une solution aqueuse sont déterminants
pour l’activité et la cytotoxicité de ces produits. L’analyse du mode d’organisation de chaque
produit dans toute la gamme de concentrations utilisées en biologie cellulaire se montrera
également d’une grande importance.
Dans un deuxième temps, nous allons profiter de la présence de la glycoprotéine
gp120 autant à la surface du virus qu’à la surface des cellules infectées par le VIH afin
d’augmenter l’activité antivirale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer par une
stratégie de multiciblage. Cette fois-ci une famille hybride d’analogues catanioniques du
GalCer sera synthétisée et étudiée à la fois pour la capacité d’agir à l’état non agrégé en tant
que leurre du VIH, ainsi qu’en tant que système de délivrance spécifique de principes actifs
anti-VIH, à l’état agrégé.
Nous verrons que de par leur design, cette nouvelle série d’analogues catanioniques
mixtes du GalCer réunit des éléments bien adaptés pour la vectorisation de principes actifs
anti-VIH. Ainsi, leur nature catanionique permet une auto-association en milieu aqueux avec
la formation spontanée d’agrégats vésiculaires. De plus, la présence au sein des associations
catanioniques d’un segment fluoré, plus hydrophobe, a été prévue pour améliorer la stabilité
des vésicules au cours du temps. Aussi, la multiplicité des sites de reconnaissance existant à la
surface des vésicules, engendrant une augmentation de la probabilité d’interaction avec le
virus, pourrait assurer une bonne reconnaissance et spécificité pour la glycoprotéine gp120.
Ainsi, des vésicules stables, formées spontanément par ces composés hybrides dans un milieu
aqueux pourraient agir en tant que transporteurs spécifiques, guidant les principes actifs anti-
VIH incorporés au sein des agrégats vers les cellules humaines infectées par le virus. Cela est
Introduction générale
6
envisageable car, comme nous l’avons déjà mentionné, les analogues du GalCer ont une forte
affinité pour les glycoprotéines virales gp120 qui bourgeonnent à la surface membranaire des
cellules infectées par le VIH.
Concernant leur synthèse, des variations structurales seront réalisées au niveau de la
longueur et de la position d’un segment fluoré au sein de l’association catanionique, tout en
conservant les mêmes éléments structuraux antérieurement décrits pour maintenir l’affinité
avec le virus. Ainsi, la structure du N-alkylamino-1-déoxylactitol sera conservée, car c’est
cette structure qui permettra la reconnaissance avec la gp120, tandis que les modifications
structurales seront réalisées seulement au niveau de l’acide gras fluoré, le deuxième
composant de l’association catanionique.
Une étude des propriétés physico-chimiques et biologiques in vitro de ces nouveaux
assemblages catanioniques nous permettra d’identifier le composé le plus adapté à
l’application envisagée soit, la vectorisation de principes actifs anti-VIH.
Une dernière partie décrira les modes opératoires, les techniques d’analyse employées
ainsi que les caractéristiques des produits préparés au cours de ces travaux.
Chapitre I
Mise au point bibliographique
Chapitre I Mise au point bibliographique
9
I ITRODUCTIO ......................................................................................... 11
II GEERALITES SUR LE SIDA..................................................................... 12
III LE VIRUS D’IMMUODEFICIECE HUMAIE (VIH) ............................... 15
III.1 Généralités sur le VIH.......................................................................................... 15
III.2 La structure du VIH-1 .......................................................................................... 16
III.3 Cycle de réplication du VIH................................................................................. 19
IV LA CHIMIOTHERAPIE DU VIH-1 .............................................................. 22
IV.1 Inhibiteurs de l’entrée virale................................................................................ 24 IV.1.1 Inhibiteurs de reconnaissance et de fixation................................................................ 24
IV.1.1.1 Inhibiteurs des récepteurs cellulaires CD4 ......................................................... 25 IV.1.1.2 Inhibiteurs des glycoprotéines virales gp 120 .................................................... 26 IV.1.1.3 Inhibiteurs des corécepteurs du VIH-1 ............................................................... 34
IV.1.1.3.1 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5......................................................... 34 IV.1.1.3.2 Inhibiteurs des corécepteurs CXCR4 ............................................................ 36 IV.1.1.3.3 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5 et CXCR4....................................... 38
IV.1.2 Les inhibiteurs de fusion ............................................................................................. 38 IV.1.2.1 Inhibiteurs ciblant la région NHR de la gp 41................................................... 39 IV.1.2.2 Inhibiteurs ciblant la région CHR de la gp 41. ................................................... 40
IV.1.3 Inhibiteurs de la décapsidation (de la nucléocapside virale) ....................................... 41 IV.2 Inhibiteurs de la transcriptase inverse................................................................. 42
IV.2.1 Structure et activité de la transcriptase inverse ........................................................... 42 IV.2.2 Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse................................................. 42 IV.2.3 Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse. ................................................ 45 IV.2.4 Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse ......................................... 45
IV.3 Inhibiteurs de l’intégrase ..................................................................................... 47
IV.4 Inhibiteurs de transcription (transactivation)...................................................... 50
IV.5 Inhibiteurs de la protéase..................................................................................... 52 IV.6 Polythérapies........................................................................................................ 54
IV.7 Le développement des systèmes de vectorisation pour la thérapie anti-VIH...... 56
IV.8 Inhibiteurs de l’étape de latence du VIH ............................................................. 57 IV.9 Le stade actuel du développement des vaccins anti-VIH ..................................... 58
V COCLUSIOS ........................................................................................... 59
VI BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................ 61
Chapitre I Mise au point bibliographique
10
Chapitre I Mise au point bibliographique
11
INTRODUCTION
De nos jours, le Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA) provoqué par le
Virus d’Immunodéficience Humaine (VIH) est considéré comme la principale cause de
mortalité dans l’Afrique subsaharienne et la quatrième pathologie mortelle dans le monde. On
estime à 14 000 le nombre de personnes infectées par le VIH chaque jour (soit 5 millions de
personnes par an), dont plus de 95% d’entres elles vivent dans des régions sous-développées
du monde. La mise au point d'un remède contre le SIDA sûr, efficace, facile à administrer et
peu coûteux est donc une urgence.
Ce premier chapitre présentera une mise au point bibliographique sur le Virus de
l’Immunodéficience Humaine (VIH) : l’impact de sa propagation dans le monde, sa structure,
son mécanisme de multiplication et les moyens de lutte développés ces 25 dernières années
contre ce terrible virus.
En suivant les principales étapes du cycle de réplication du VIH, il sera fait une
présentation des diverses stratégies thérapeutiques. Parmi cet "arsenal" anti-VIH riche d’une
très vaste diversité de produits, on va retrouver des composés déjà agréés en chimiothérapie et
d’autres, très prometteurs qui se trouvent encore dans différentes phases d’essais cliniques.
D’une manière générale, cette partie bibliographique veut offrir une image concise des
avancées réalisées dans ce domaine afin de mieux situer l’apport de nos travaux dans la lutte
contre le VIH.
Chapitre I Mise au point bibliographique
12
I GENERALITES SUR LE SIDA
Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) est devenu l’une des épidémies les
plus dévastatrices de l’histoire. Depuis que les scientifiques ont identifié en 1981 le virus VIH
(Virus d’Immunodéficience Humaine), cette épidémie a fait plus de 25 millions de victimes
humaines.
Le SIDA s’installe dans l’organisme humain suite à l’infection par le VIH. Ce virus
attaque les cellules T CD4+ (les lymphocytes T4 et les macrophages) du système
immunitaire humain et réussit à l’affaiblir en quelques années, le rendant inefficace contre des
agents pathogènes externes comme les bactéries, les champignons ou d’autres virus .
Le VIH faisant partie de la famille des Lentivirus (lentus = lent), les symptômes du
SIDA n'apparaissent qu'après une assez longue période d'incubation. Ainsi, l’évolution
typique de l’infection par le VIH peut être divisée en trois phases : la primo-infection, la
phase de latence clinique et la phase SIDA qui précède la mort (Figure 1).
Figure 1: Evolution typique de l’infection par le VIH [1]
.
La première étape s’installe environ 3 – 6 semaines après l’infection et se caractérise
par une importante et rapide augmentation de la charge virale dans le sang, suite à la
multiplication massive du VIH et à la mort de nombreuses cellules T CD4+. Souvent, les
symptômes cliniques caractéristiques comme : fièvre, diarrhée, maux de tête, éruptions
cutanées et léthargie peuvent induire en erreur vers d’autres maladies.
La phase de latence clinique peut durer, en fonction des individus, entre 8 et 12 ans et
se définit par une absence de symptômes cliniques, une fausse période de bonne santé
Chapitre I Mise au point bibliographique
13
résultant de la lutte soutenue du système immunitaire contre le VIH qui n’arrête pas de se
multiplier. Il semble donc que pour un temps, le système immunitaire réussisse à contrôler la
réplication virale. Durant cette période, un grand nombre de virus et de cellules infectées sont
produits et détruits chaque jour afin de maintenir un équilibre entre la réplication virale et la
réponse immunitaire. Des études ont montré que la demi-vie du virus dans le sang est
d’environ 6 heures tandis que pour les cellules infectées, la demi-vie est de seulement 1,5
heures [2, 3].
Après quelques années, l’organisme ne peut plus combattre le VIH en raison d’une
chute prononcée du nombre de lymphocytes T CD4+, la concentration en particules virales
augmente alors rapidement, par exemple à la suite d’une maladie infectieuse et le SIDA
s’installe [4, 5].
Malgré un accès récemment amélioré aux traitements antirétroviraux et à la prise en
charge de la maladie dans de nombreuses régions du monde, en 2006 le nombre total de
personnes vivant avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) a atteint son plus haut
niveau, soit environ 39,5 millions de personnes. L’Afrique subsaharienne reste la plus touchée
avec plus de 24 millions de personnes infectées, et les femmes de cette région géographique
vivant avec le VIH représentant 77% du nombre total de femmes atteintes par le VIH dans le
monde (Figure 2).
Figure 2: Répartition mondiale des personnes vivant avec le VIH
(Source ONUSIDA/OMS – décembre 2006)
Chapitre I Mise au point bibliographique
14
Durant cette même année 2006, plus de 4 millions de personnes ont contracté la
maladie et l’épidémie de SIDA a fait plus de 3 millions de décès, dont plus d’un demi-million
d’enfants. Prenant en considération l’explosion de l’infection dans l’Asie du sud-est, plus
particulièrement en Chine, en Indonésie et au Vietnam, l’ONUSIDA (Le Programme
Commun des Nations Unies Sur le VIH/SIDA) considère que l’épidémie est toujours dans son
stade préliminaire et que sans un traitement efficace le nombre de victimes atteintes par ce
virus va continuer d’augmenter d’une manière inquiétante [6].
La propagation du virus d’une personne à une autre se fait par plusieurs voies : plus
fréquemment lors des relations sexuelles mais aussi par le contact direct avec du sang
contaminé, et par transmission mère – enfant lors de l’accouchement ou de l’allaitement [7].
Aucun être humain n’est a l’abri de ce virus qui ne connait pas de limite d’age, de différences
raciales ou sociales.
Les enjeux sont immenses. A l’échelle mondiale, moins d’une personne sur cinq
exposée au risque d’infection par le VIH peut accéder à des services de prévention de base.
Parmi les personnes vivant avec le VIH, une sur dix seulement a fait un test et sait qu’elle est
infectée.
En dépit de remarquables progrès réalisés en chimiothérapie sur l’efficacité des
traitements modernes qui peuvent diminuer la charge virale au-dessous des limites de
détection du VIH, il subsiste toujours des problèmes, comme la résistance du virus aux
principes actifs, qui entraîne un échec thérapeutique. La réalité est encore plus désolante dans
les pays du tiers monde ou la thérapie anti-SIDA n’est pas accessible dans la plus grande
majorité des cas. Tous ces éléments sont autant de signaux d’alarmes qui mettent en évidence
le besoin urgent de développer de nouveaux principes actifs anti-VIH bons marchés, des
méthodes de prévention et des vaccins efficaces.
Chapitre I Mise au point bibliographique
15
II LE VIRUS D’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH)
II.1 Généralités sur le VIH
Même si les premiers indices sur le VIH ont été consignés dans deux rapports du
Centre de Contrôle des Maladies d'Atlanta, USA, en 1981 indiquant plusieurs jeunes
homosexuels atteints d’une maladie inconnue, le virus a réellement été décrit pour la première
fois en 1983, par les groupes français du Professeur Montagnier et du Docteur Barré-Sinoussi
de l’Institut Pasteur à Paris [8]. Ils ont dénommé le virus LAV (Lymphadenopathy Associated
Virus), et C. Dauguet, leur collaborateur, a été le premier à visualiser ce virus à l’aide de son
microscope électronique.
En 1984, les équipes du Professeur Gallo et du Professeur Levy à San Francisco
isolent indépendamment le virus du SIDA qu’ils appellent HTLV-III (Human T-Cell
Leukemia Virus III) et respectivement ARV (AIDS Related Virus) [9, 10].
Ensuite, la situation dans la littérature spécialisée est devenue assez rapidement
confuse en raison de cette multiplicité de noms (LAV, HTLV-III et ARV) utilisés pour
désigner le même virus. Cette situation a été résolue en 1986, par l’Organisation Mondiale de
Santé qui prend la décision finale d’appeler le virus responsable du SIDA le Virus
d’Immunodéficience Humaine (VIH).
Actuellement dans le monde il y a deux espèces virales du VIH appelées VIH-1 et
VIH-2. Le VIH-2, isolé par le groupe du Professeur Montagnier en 1986 n’a que 40%
d’homologie avec le VIH-1, les différences étant situées surtout au niveau de leur enveloppe
externe. De plus, le VIH-2 a la particularité d’être localisé dans la partie Ouest de l’Afrique,
d’avoir un moindre potentiel infectieux que le VIH-1, d’évoluer plus lentement vers le SIDA
et d’être plus proche du virus de l’immunodéficience du singe (VIS) que le VIH-1 [11].
Les souches de type VIH-1 ont été classées en deux grands groupes: M, et O. Le
groupe M étant divisé en 9 sous-types qui peuvent être corrélés à des zones géographiques: A,
B, C, D, E, F, G, H, et NT (Figure 3). La majorité des mutations créant ces différences se
trouvent dans la région C2-V3 de la glycoprotéine de l’enveloppe virale et dans les protéines
de la capside.
Chapitre I Mise au point bibliographique
16
Figure 3: Répartition géographique mondiale des sous-types du VIH-1
(« Le Monde » 21 mai 2003) Cette extraordinaire variabilité du VIH-1 est le résultat du fait que la transcriptase
inverse (TI) produit une erreur tous les 2000-5000 nucléotides polymérisés [12], auquel
s’ajoute le taux extrêmement élevé de réplication du virus qui atteint environ 1010 de
particules virales produites chaque jour [13, 14].
Etant la source de cette variabilité virale inquiétante et impossible à contrôler, la
transcriptase inverse (TI) est devenue une des principales cibles thérapeutiques anti-VIH.
II.2 La structure du VIH-1
L’étude de la structure du VIH a été une des premières préoccupations des
scientifiques. Comprendre la complexité structurale du VIH et sa pathogenèse a été l’étape
primordiale qui a permis d’envisager et de développer des stratégies thérapeutiques efficaces.
Gelderblom et ses collaborateurs ont été les premiers à établir par microscopie électronique la
morphologie et la structure du VIH-1 [15].
Les virus matures du VIH-1 ont une morphologie sphérique d’un diamètre d’environ
100-120 nm et sont protégés par une membrane d’origine cellulaire formée d’une bicouche
lipidique transpercée de "spicules" composées des glycoprotéines globulaires de surface gp
120 et des glycoprotéines transmembranaires gp 41 (Figure 4). Initialement, le nombre de
Chapitre I Mise au point bibliographique
17
"spicules" a été approximé à 72 par analogie avec le VIS (le Virus de l' Immunodéficience du
Singe) [16] mais des résultats récents ont montré que le VIH dispose d’approximativement 14
± 7 "spicules" Env par virion. [17]
Figure 4: Structure du VIH
(Source : Laboratoire du Pr. Dominique Dormont (CEA, Orsay)) Détail: Structure de la glycoprotéine d’enveloppe du VIH- 1
[18]
La protéine gp 41, insérée dans la membrane phospholipidique virale est liée de façon
non-covalente à la glycoprotéine gp 120 extérieure, principalement par l’association des deux
régions hydrophobes à l’extrémité carboxy-terminale (C-terminale - CHR) et amino-terminale
(N-terminale - NHR) (Figure 4 détail) [19, 20].
Cette glycoprotéine d’enveloppe est une des principales cibles pour les stratégies
thérapeutiques, car la gp 120 est responsable des processus de reconnaissance, co-
reconnaissance et d’ancrage du virus dans la cellule hôte. La gp 41, par son extrémité N-
terminale et une partie de la région centrale qui sont exposées à l’extérieur du virus, détient un
rôle clef dans le processus de fusion virale [21, 22].
Chapitre I Mise au point bibliographique
18
Sous la membrane extérieure, les protéines de la matrice (MA, ou p17) forment une
sous-couche et les protéines de la capside (CA, ou p24) délimitent le cœur du virus, en forme
de cône.
Le VIH-1 appartenant à la famille des rétrovirus, le matériel génétique est constitué
par deux simples brins identiques d’ARN confinés par les protéines de la nucléocapside (NC,
ou p7). Afin d’assurer sa réplication dans les cellules hôtes humaines, le VIH doit convertir
les brins d’ARN en molécules d’ADN viral par le processus de transcription.
Outre le matériel génétique viral, à l’intérieur de la nucléocapside, le VIH possède
trois enzymes essentielles à sa réplication (la transcriptase inverse (TI), l’intégrase (IN) et la
protéase (PR)) ainsi que d'autres protéines virales (p6, Tat, Rev, Vif, Nef, Vpr et Vpu) et
cellulaires (ex. actine).
La transcriptase inverse catalyse la transcription de l’ARN virale simple brin en un
ADN double brin qui va être inséré par l’intégrase dans le génome de la cellule hôte. Le rôle
de la protéase est d’ajuster la longueur de chaque protéine virale synthétisée dans la cellule
hôte, processus appelé maturation virale.
Parce que l’activité de chaque enzyme virale est indispensable à la survie et à la
multiplication du VIH, elles sont devenues des cibles thérapeutiques de choix dans le combat
contre le VIH.
Connaître et comprendre le mécanisme complet du fonctionnement du VIH-1 implique
aussi une bonne compréhension de son génome. Ainsi, les scientifiques qui ont étudié le sujet
ont découvert que le matériel génétique du VIH-1 est constitué, comme pour tous les
rétrovirus, de trois gènes principaux : gag, pol et env et de six gènes supplémentaires codant
pour des protéines dites accessoires assurant différents rôles de régulation : Tat, Rev, Vif,
Nef, Vpu et Vpr.
Le gène gag code pour les protéines structurales : de la matrice, de la capside, de la
nucléocapside. La protéine p6, le gène pol (pour POLymérase) code pour les enzymes
virales : la protéase, la transcriptase inverse et l'intégrase. Le gène env (pour ENVeloppe)
code pour les protéines d'enveloppe, les glycoprotéines transmembranaires et de surface. Le
produit de ces gènes est généré sous la forme de précurseurs (polyprotéines) qui sont rendus
fonctionnels par l’action de clivage de la protéase [23, 24].
Chapitre I Mise au point bibliographique
19
II.3 Cycle de réplication du VIH
Le mécanisme de réplication du VIH peut être résumé en six étapes principales. Ces
étapes, schématisées dans la Figure 5, vont être détaillées dans les paragraphes suivants.
Figure 5 : Cycle de réplication du VIH
1. L’entrée virale est un processus complexe caractérisé par 4 sous-étapes :
reconnaissance, fixation, fusion et décapsidation.
Le VIH-1 cible particulièrement les lymphocytes T CD4+, les macrophages et les
cellules du système nerveux (plus particulièrement les macrophages de la moelle osseuse et
du cerveau et les astrocytes) [25]. La reconnaissance et l’attachement entre le virus et les
cellules visées se réalisent par l’intermédiaire de la glycoprotéine de surface du virus, gp 120,
et des récepteurs présents sur la membrane cellulaire [26]. Les plus connus des récepteurs
cellulaires sont :
5. Traduction
Chapitre I Mise au point bibliographique
20
i) le CD4 – le plus fréquent et le plus important récepteur, qui est présent sur la
membrane cellulaire des lymphocytes T4 et des macrophages [25]. Le site d’interaction du
CD4 avec la gp 120 se trouve dans la dépression formée à l’interface des trois domaines :
interne, externe et le pont central [27] (Figure 6A). La boucle V3 joue également un rôle
important dans ce processus de reconnaissance.
ii) les corécepteurs (récepteurs des chimiokines). Parmi la grande diversité des
corécepteurs des chimiokines existants à la surface des cellules humaines, il y en a deux plus
particulièrement importants, le CXCR4 et le CCR5 qui favorisent l’entrée du VIH-1 dans les
lymphocytes, les monocytes et les macrophages [28]. Agissant après la fixation de la gp 120
sur le récepteur, les corécepteurs interagissent avec la gp120 au niveau de la boucle V3
(Figure 6A et 6B – exemplifié sur le CCR5) afin de renforcer l’interaction virus - cellule.
iii) le galactosylcéramide (GalCer), présent à la surface des cellules nerveuses, des
cellules épithéliales du colon et des fibroblastes [29, 30], est un récepteur glycosphingolipidique
avec une affinité très prononcée pour la même boucle V3 de la gp 120 [31, 32] (Figure 6A).
http://www.theses.ulaval.ca/2005/22933/ch02.html
Figure 6 : Représentation schématique de la gp 120 (composée de cinq régions constantes intercalées entre cinq régions variables (V1 à V5)) et les sites d’interaction avec les récepteurs
et corécepteurs cellulaires
Apres ancrage, la glycoprotéine gp 41 se charge de réaliser la fusion entre la
membrane virale et la membrane cellulaire. Suite à la fusion virus –cellule, la nucléocapside
virale pénètre à l’intérieure de la cellule hôte et se libère par décapsidation.
Connaissant les détails de l’interaction virus – cellule, plusieurs approches
thérapeutiques ont été imaginées afin de bloquer l’infection par le VIH-1 au niveau de son
entrée dans la cellule. Comme nous venons de le voir, la boucle V3 est une cible essentielle
A B
Chapitre I Mise au point bibliographique
21
qui une fois bloquée pourrait stopper l’entrée virale, aussi bien dans les cellules comportant
comme récepteur le CD4 ou le GalCer.
2. Rétrotranscription
Après décapsidation, l’ARN viral est largué dans le cytoplasme cellulaire et forme un
complexe avec la transcriptase inverse qui va catalyser la rétrotranscription de cet ARN
simple brin en ADN complémentaire double brin.
Des études ont montré que la rétrotranscription débute assez rapidement, l’ADN viral
devenant détectable seulement 4 heures après l’infection par le VIH-1 [33]. Cette observation
constitue une raison de plus pour intensifier les efforts thérapeutiques vers le développement
d’inhibiteurs efficaces de l’entrée virale du VIH-1.
3. Intégration
Une fois l’ADN synthétisé, il forme un complexe de preintégration avec l’intégrase et
d’autres protéines virales puis il est transporté dans le noyau cellulaire à travers les pores de la
membrane nucléaire [25]. Dans le noyau, l’intégrase accomplit sa mission et insère l’ADN
viral dans l’ADN de la cellule. De cette manière la cellule hôte est transformée en un
provirus.
4. Transcription
Le génome proviral détient maintenant le contrôle de la machinerie de synthèse
cellulaire et, en s’exprimant par l’intermédiaire de l’ARN polymérase il va détourner tous les
organites cellulaires dans son propre but : la synthèse des protéines nécessaires à sa propre
reproduction.
L’ARNm (messager) une fois synthétisé va être exporté dans le cytoplasme.
5. Traduction
Pendant cette étape commence la synthèse effective des éléments viraux sous le
contrôle de l’ARN messager qui est traduit en polyprotéines (Gag, Gag-Pol et Env) et en
protéines fonctionnelles (Tat, Nef et Rev).
6. Assemblage, maturation et bourgeonnement
L’ARN viral et les protéines virales Gag et Gag-Pol sont assemblés dans des particules
virales immatures au niveau de la membrane cellulaire et partiellement libérés par
Chapitre I Mise au point bibliographique
22
bourgeonnement. Ces particules vont subir un processus de maturation et vont devenir
infectieuses suite à l’action de la protéase sur les protéines Gag et Gag-Pol qui vont être
clivées et transformées dans la capside conique par les enzymes virales actives [34-37].
La maturation se produit durant l’assemblage à la surface de la membrane cellulaire
humaine et/ou après le bourgeonnement des particules virales dans le milieu extracellulaire [38].
Il est important également de souligner que les glycoprotéines virales gp 120
bourgeonnent à la surface des cellules humaines infectées par le VIH. De ce fait, ces cellules
acquièrent une affinité pour les cellules saines comportant des récepteurs CD4 avec lesquelles
fusionnent. Ce processus détériore également les cellules humaines, engendrant la formation
de syncitia [39] - cellules géantes comportant jusqu'à 500 noyaux.
III LA CHIMIOTHERAPIE DU VIH-1
Chacune des étapes du cycle de réplication du VIH offre une cible thérapeutique
potentielle pour le combattre. Actuellement il y a 21 principes actifs agréés par la FDA
(American Food and Drugs Administration) pour une utilisation clinique contre le VIH. En
fonction de leurs structure chimique et de leur mécanisme d’action, ces composés peuvent
être classés en 5 familles : i) inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (au
nombre de 7); ii) inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse (1) ; iii) inhibiteurs
non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (3) ; iv) inhibiteurs de la protéase (8) et v)
inhibiteurs de l’entrée virale (2) [40].
Initialement, le traitement des individus infectés par le VIH a consisté en
l’administration de principes actifs appartenant à une seule classe - la monothérapie. Les
résultats modestes enregistrés et surtout, l’apparition de résistance du virus au principe actif
ont conduit au remplacement de la monothérapie [41, 42] par la polythérapie (HAART – Highly
Chapitre I Mise au point bibliographique
23
Active Antiretroviral Treatment) qui consiste en l’administration de trois ou plusieurs
principes actifs appartenant à deux ou plusieurs classes d’antirétroviraux.
Cette stratégie thérapeutique a conduit à une très importante diminution du nombre des
décès et à une augmentation de l’espérance de vie parmi les personnes infectées par le VIH
car elle diminue et maintient la charge virale plasmatique à un niveau inférieur à la limite de
détection, et ce pour une longue période [43, 44].
Pour le moment, la polythérapie est la meilleure stratégie pour combattre le VIH mais
elle présente aussi un nombre important d’inconvénients : les traitements sont rudes et
toxiques, il y a apparition de réactions secondaires (lipodystrophie, diabète, augmentation des
niveaux de triglycérides et de cholestérol, complications cardiovasculaires) et le plus grave –
la résistance du virus aux médicaments, conséquence de l’élimination incomplète du VIH [45-
47]. Connaissant ces limitations, la recherche de nouveaux traitements plus doux, et plus variés
est cruciale.
Les pages suivantes présenteront une mise au point bibliographique sur la thérapie anti
– SIDA, les principes actifs "classiques" et les nouvelles avancés tout en expliquant leur
mécanisme d’action. Les produits seront présentés en suivant chaque étape du cycle de
réplication du VIH.
Tout d’abord voici la définition de quelques paramètres biologiques importants qui
caractérisent l’activité antivirale in vitro :
- la concentration inhibitrice à 50% (CI50) est définie comme la concentration
minimale en composé nécessaire pour inhiber de 50% l’activité d’un marqueur du virus (ex.
la transcriptase inverse). Plus la valeur de la CI50 est faible, plus le produit est actif.
- la concentration inhibitrice à 90% (CI90) est définie comme la concentration
minimale en composé nécessaire pour inhiber de 90% la réplication du virus.
- la concentration cytotoxique à 50% (CC50) est définie comme la concentration létale
en composé pour 50% des cellules non infectées par le virus. Plus la valeur de la CC50 est
élevée, moins le produit est toxique.
- l’indice thérapeutique (IT) est défini comme le rapport entre la toxicité et l’activité
inhibitrice (CC50 / CI50). Plus la valeur de l’IT est élevée, plus le produit est efficace.
Chapitre I Mise au point bibliographique
24
III.1 Inhibiteurs de l’entrée virale
L’entrée virale est un processus qui se développe en trois étapes : l’adsorption,
l’interaction des corécepteurs et la fusion. La première étape, qui consiste en l’interaction
entre la glycoprotéine virale gp120 et le récepteur cellulaire CD4, produit un changement
conformationel du complexe des deux récepteurs (gp120-CD4) qui permet l’intervention des
corécepteurs (CCR5 ou CXCR4) afin de renforcer le rapprochement virus – cellule. Les
études sur des cellules intestinales humaines HT-29 (CD4- /GalCer+/CXCR4+) ont montré que
dans le cas des cellules dépourvues du récepteur CD4, la gp120 utilise le GalCer et un
corécepteur (le CXCR4 dans le cas présent) afin d’initier cette première étape [48].
Dans l’étape suivante la glycoprotéine gp 41 forme un complexe à six hélices par
interaction entre ses deux régions hydrophobes NHR (N-terminale) et CHR (C-terminale) ce
qui favorise le rapprochement des deux membranes et leur fusion (Figure 7) [49, 50].
Dans les paragraphes suivants nous verrons les principaux inhibiteurs spécifiques à
chacune des étapes de l’entrée virale.
Figure 7: Schéma détaillé de l’entrée virale du VIH
III.1.1 Inhibiteurs de reconnaissance et de fixation
Les inhibiteurs de reconnaissance et de fixation interfèrent soit avec les récepteurs
(CD4, GalCer) ou les corécepteurs (CCR5, CXCR4) cellulaires soit avec les récepteurs viraux
(gp 120) afin d’empêcher l’adsorption du virus sur la cellule humaine.
Chapitre I Mise au point bibliographique
25
III.1.1.1 Inhibiteurs des récepteurs cellulaires CD4
Une stratégie afin d’empêcher la formation du complexe gp 120-CD4 a été de masquer
les récepteurs CD4 avec des anticorps anti-CD4 [51]. Ainsi, l’utilisation d’anticorps
monoclonaux anti-CD4 (mAbs) ont conduit à des résultats prometteurs mais ils n’ont jamais
été considérés comme des principes actifs anti-VIH dû au risque immunosuppressif. Selon le
même concept, un nouvel anticorps anti-CD4 a été mis au point, le TNX-355 [52]. Administré
aux personnes infectées par le VIH, le produit a une bonne capacité à réduire la charge virale
plasmique et il se trouve en phase clinique II. Son avantage réside dans le fait qu’il ne
présente pas de danger immunosuppressif car, par rapport aux anticorps anti-CD4 qui ciblent
le domaine 1 du CD4, le TNX-355 interagit avec le domaine 2 du récepteur sans interférer
avec les fonctions immunologiques de celui-ci.
Une autre molécule capable de bloquer le récepteur cellulaire CD4 et, de cette
manière l’interaction CD4 – gp120, est un pentapeptide modifié par Neffe et Meyer [53]
(Figure 8). Les premiers résultats expérimentaux ont montré que le produit manifeste une
bonne constante de fixation (KD = 39µM) sur le CD4.
Figure 8 : Composé peptido – mimétique capable de bloquer le CD4
Chapitre I Mise au point bibliographique
26
III.1.1.2 Inhibiteurs des glycoprotéines virales gp 120
Une des premières tentatives afin de bloquer la fixation du virus sur la cellule par le
biais de la gp 120, a été l’utilisation de fragments solubles de CD4 (sCD4) [54]. Les
expériences in vitro ont montré une bonne activité de neutralisation virale mais in vivo les
molécules ont présenté une faible efficacité. Dans le but d’améliorer l’affinité de fixation, la
société Progenics a synthétisé une protéine de fusion CD4-immunoglobuline appelé PRO542 [55]. Le produit possède une structure d’immunoglobuline modifiée avec des sites
d’attachement spécifiques aux récepteurs CD4 afin de mieux leurrer les gp 120 du VIH.
Contrairement aux sCD4, le PRO542 possède une très bonne activité anti-VIH-1 in vivo et in
vitro, et il se trouve en deuxième phase des tests cliniques. Toutefois, le principal
inconvénient du PRO542 reste son administration par voie intraveineuse.
Le BMS – 378806, un dérivé de 4-méthoxy-7-azaindole est un très bon inhibiteur de
l’infection par le VIH in vitro et in vivo. Lin et ses collaborateurs [56] ont montré que le
produit interagit avec le site de reconnaissance du CD4 situé sur la gp 120 [57]. Malgré sa
bonne biodisponibilité et ses faibles interactions avec les protéines, les tests cliniques sur le
BMS – 378806 ont été arrêtés en faveur de son analogue plus efficace BMS – 488043 (CI50 =
37nM) [58] qui a déjà dépassé les phases cliniques I et II (Figure 9).
Figure 9: Structures chimiques de deux inhibiteurs de petite masse moléculaire bloquant
l’interaction gp120-CD4
Les dérivés polyanioniques sont d’autres inhibiteurs efficaces de la gp 120. Cette
classe de molécules comprend des polysulfates, polysulfonates, polycarboxylates,
polyphosphates, polyphosphonates, polyoxometalates, etc. Par exemple, voici quelques
représentants parmi les plus connus de cette classe : le carrageenan (Carraguard) - fabriqué à
partir de carragénine, substance tirée des algues rouges, le polymère naphtalène sulfonate -
PRO 2000, l’analogue de cosalane [59], le sulfate de dextrine (D2S), le sulphate de cellulose et
la suramine (Figure 10). La suramine étant le tout premier principe actif anti-VIH identifié [60]
et utilisé dans le traitement clinique [61, 62].
BMS – 378806 BMS – 488043
Chapitre I Mise au point bibliographique
27
Suramine
Figure 10: Exemple d’inhibiteurs polyanioniques de la gp 120
L’activité inhibitrice de ces composées réside dans le blocage des sites chargés
positivement de la boucle V3 de la gp120 par des interactions électrostatiques avec le
polyanion [63, 64] .
En raison d’une certaine toxicité et d’une faible efficacité in vivo, les dérivés
polyanioniques n’ont pas été agréés comme médicaments systémiques anti-VIH, mais en tant
que microbicides, ils se trouvent dans les dernières étapes des tests cliniques pour la
prévention de la transmission sexuelle du VIH [65, 66].
Le FP – 21399 (Figure 10) est un dérivée bis(disulfonaphtalenique) qui, administré par
injection intraveineuse, arrive a stopper l’infection par le VIH par fixation électrostatique au
niveau de la boucle V3 de la gp 120 [67]. La bonne activité antivirale semble être due a
l’accumulation dans les ganglions lymphatiques [68]. Ce produit se trouve dans la première
phase des tests cliniques et mis à part quelques effets secondaires mineurs, il semble très
prometteur [69].
Analogue de Cosalane
FP – 21399
n ~ 20 PRO 2000 D2S (MW 5000 – 50 000)
Chapitre I Mise au point bibliographique
28
Des études sur des cellules épithéliales du colon humain[30, 70, 71] et sur des cellules
d’origines neuronale[72] ont montré que le VIH utilise le galactosylcéramide [29, 73] comme
porte d’entrée dans ces cellules démunies des récepteurs CD4.
De structure glycosphingolipidique, le galactosylcéramide, généralement nommé
GalCer comporte une seule unité de D-galactose fixée par une liaison β-O-glycosidique au
céramide, d’où le nom de Galβ1Cer (Figure 11). Le céramide à son tour, présente une D-
sphingosine liée par une fonction amide à un acide gras en C24 hydroxylé.
Figure 11: Structure chimique du galactosylcéramide (GalCer)
Etant identifié comme récepteur alternatif au VIH-1, en raison de son affinité
prononcée pour la boucle V3[74, 75] de la protéine virale gp 120 et de la reconnaissance
spécifique pour la séquence d’acides aminés 650-685 de la glycoprotéine virale gp41[76], le
galactosylcéramide a ouvert de nouvelles perspectives dans le domaine thérapeutique anti-
VIH. Ainsi, plusieurs groupes de recherche ont synthétisé et testé la capacité des analogues
synthétiques du GalCer à leurrer le VIH, essayant de cette manière de stopper la propagation
de l’infection virale.
Il est très important de souligner que les analogues synthétiques du GalCer, de par leur
capacité à reconnaître et à se fixer sur la boucle V3 de la gp 120, sont capables de neutraliser
l’infection par le VIH à la fois sur les cellules comportant le GalCer à leur surface mais aussi
sur les cellules lymphocytaires comportant le récepteur CD4 [77, 78]. Cette inhibition est
possible car une fois bloquée, par un effet de concurrence d’affinité, la boucle V3 n’est plus
capable d’initier l’interaction avec le récepteur cellulaire CD4, rendant impossible l’infection
virale des lymphocytes. De ce fait, les analogues synthétiques du GalCer représentent des
outils très prometteurs pour la thérapie anti-VIH.
D-galactose céramide
liaison β-O-glycosidique
acide gras en C24 hydroxylé
D-sphingosine
HO
3’
Chapitre I Mise au point bibliographique
29
Le groupe de Bernardski a synthétisé les premiers analogues du GalCer afin de leurrer
le VIH et de l’empêcher d’entrer dans la cellule hôte en lui bloquant compétitivement l’accès
aux récepteurs gp 120. Ces premiers analogues synthétiques comportaient une liaison C- ou
O-glycosidique (Figure 12) et exprimaient une activité inhibitrice de l’étape de
reconnaissance cellulaire caractérisé par une CI50 de 150µM[79].
O
HO
HOOH
OH
O CH2 CH3
NH3
Cl
OH
12
analogue O-glycosidique
NH CH2 CH3
NH3
Cl
O
12
analogue C-glycosidique
O
HO
HOOH
OH
Figure 12: Analogues synthétiques C- ou O-glycosidiques du galactosylcéramide
De nouveaux analogues C- et aza-C- glycosidiques du galactosylcéramide (Figure 13)
ont été synthétisés et testés pour leurs capacités à bloquer la fixation du VIH sur le GalCer.
L’étude a mis en évidence que le dérivé aza-C- glycosidique possède une plus grande affinité
pour la gp120 que le GalCer tandis que le dérivé C- glycosidique possède une affinité
équivalente à celle du GalCer [80].
CH2 CH31O
analogue C-glycosidique
O
HO
HOOH
OH
CH2 CH31O
analogue aza-C-glycosidique
NH
HO
HOOH
OH
Figure 13: Analogues C- et aza-C glycosidique du galactosylcéramide
En respectant encore plus les caractéristiques structurales du GalCer nécessaires au
maintien de l’affinité avec la glycoprotéine gp 120, le groupe d’Isabelle Rico-Lattes a
synthétisé des analogues bicaténaires hydrosolubles du galactosylcéramide. Les tests
biologiques concernant leurs propriétés anti-VIH réalisés en collaboration avec l’équipe de
Jaques Fantini [78] ont montré que l’analogue le plus actif du GalCer était le composé CA52
(Figure 14). Ce produit arrive à inhiber la fixation de la suramine, inhibiteur polyanionique
précédemment décrit, sur la boucle V3 de la gp 120. Une concurrence peut exister entre ces
deux composés du fait que le CA52 se fixe sur la séquence d’acides aminés 318 – 323
(GPGRAF) bloquant partiellement le site de reconnaissance de la suramine (IQRGP-R-F) sur
la boucle V3 (Figure 14). En se fixant lui-même sur la boucle V3 du récepteur viral, le
composé CA52 s’est avéré capable d’inhiber l’entrée du VIH à la fois dans les cellules
Chapitre I Mise au point bibliographique
30
épithéliales du colon HT-29 (qui comportent le récepteur GalCer mais pas le CD4) et dans les
cellules mononucléaires du sang périphérique - PBMC (comportent le récepteur CD4 mais
pas le GalCer). La valeur de la CI50 de 108 µM mesurée sur les cellules PBMC est similaire à
celle obtenue sur les cellules HT-29.
Figure 14: Structure du CA52 et des sites d’interactions caractéristiques
(flèche bleu pour la CA52 et en rouge pour la suramine) sur la boucle V3 de la
gp120 [78]
Après quelques années, dans ce même groupe, une nouvelle classe d’analogues
bicaténaires hydrosolubles du GalCer a vu le jour – les analogues catanioniques du
galactosylcéramide (Figure 15). L’originalité de ces composés consiste en leur simplicité de
synthèse car la liaison covalente entre les deux chaînes alkyles a été remplacée par une liaison
ionique, facilement obtenue par une réaction acido-basique. Même s’ils possèdent des
concentrations inhibitrices dans une large gamme (CI50 = 0,9 – 1000 µM, mesurées sur des
cellules lymphocytaires CEM-SS), ces composés se sont avérés peu efficaces, avec des
indices thérapeutiques faibles en raison de leur cytotoxicité [81] . Cette étude a permis de
vérifier que l’activité inhibitrice et la toxicité de ces composés semblent être directement
proportionnelles à leur hydrophobie. La toxicité de ces dérivés bicaténaires hydrosolubles du
GalCer a été expliquée par leur incorporation dans la membrane plasmique en raison de
l’affinité des chaînes alkyles pour la membrane, ce qui engendre la perturbation des fonctions
cellulaires.
Figure 15: Analogues catanioniques bicaténaires hydrosolubles du galactosylcéramide
Chapitre I Mise au point bibliographique
31
Une autre stratégie adoptée afin d’améliorer l’activité anti-VIH des analogues du
GalCer a été d’augmenter le nombre de sites actifs afin de favoriser et de stabiliser
l’association avec le virus. En partant de cette idée, de nouveaux analogues géminis du
GalCer et des dendrimères catanioniques analogues du GalCer ont été synthétisés comportant
2 et respectivement 6 ou 12 sites actifs (Figure 16).
O
OH
HOOH
OH
OH
HOOH
OH
O NH2
n
C
O
O
10C
O
O
O
OH
OHHO
HO
HO
OHHO
HO
ONH2
n
Figure 16: Analogues catanioniques géminis et analogues catanioniques dendrimères du
galactosylcéramide
Les résultats obtenus ont démontré que la partie hydrophobe de la molécule a une forte
influence sur l’activité anti-VIH de ces composées. Plus particulièrement, le composé Gemini
16 (Figure 16) a montré une excellente activité anti-VIH (CI50 = 0,5 µM, sur des cellules
lymphocytaires CEM-SS) et un bon indice thérapeutique (IT > 200). Cette valeur est
comparable avec celles de l’AZT et du DDI, deux principes actifs anti-VIH déjà utilisés en
chimiothérapie [81].
En ce qui concerne les dérivés dendrimères [82], les tests biologiques réalisés in vitro
ont montré que l’effet de multiplicité de sites actifs augmente considérablement l’activité
antivirale de ces composés (Tableau 1). Ainsi, la concentration inhibitrice du composé
dendritique G12 est de seulement 1,1 µM (testé sur cellules CEM-SS). Malheureusement,
cette bonne activité antivirale est mise en défaut par l’importante cytotoxicité du produit (2,9
µM). Cette cytotoxicité a été associée à la conformation en "chou-fleur" adoptée par ces
Gemini 16 n=12
Dérivé dendritique G12
Dérivé dendritique G6
Chapitre I Mise au point bibliographique
32
produits, forme qui favorise, comme dans le cas des analogues bicaténaires précédemment
présentés, l’incorporation dans les membranes cellulaires.
Il faut cependant souligner que dû à la multiplication des sites actifs, ces composés
dendritiques sont plus actifs in vitro que l’aminolactitol constitutif testé individuellement
(CI50 = 50 µM). Un simple calcul concernant l’activité inhibitrice par site de reconnaissance
(RCI50 - tableau 1), a révélé que l’activité inhibitrice des composés multisites (dendrimères)
est plus efficace par rapport à celle du même nombre de monosites. Toutefois, les valeurs
RCI50 proches (12,6 et 13,2) enregistrées pour les deux dérivés dendritiques comportant
respectivement 6 et 12 sites actifs montrent que pour cette famille des composés l’effet de
multiplicité de sites reste limité par l’encombrement stérique.
Composés CI 50 (µµµµM) CC50 (µµµµM) IT RCI 50 (µµµµM)
(*CI 50)
L16
1
50
70
1,4
50
Dérivé dendritique G6
6
2,1
3,5
1,7
12,6
Dérivé dendritique G12
12
1,1
2,9
2,6
13,2
(N x CI50 = RCI50, représente la concentration inhibitrice normalisée, exprimée comme la concentration inhibitrice du catanionique dendritique multipliée par le nombre de sites actifs, N)
Tableau 1 : Résultats biologiques des analogues catanioniques dendritiques
[83]
Une description plus détaillée de cette famille de dendrimères catanioniques sera faite
dans le deuxième chapitre car ils ont une forte liaison avec les travaux de cette thèse.
Toutes ces études ont permis de déterminer une relation structure – activité biologique
du GalCer et de ses analogues synthétiques :
• les deux éléments constitutifs du GalCer : le sucre, comme partie hydrophile, et les
chaînes hydrophobes sont indispensables [84], l’activité étant perdue en utilisant
individuellement un de ces deux éléments.
• la nature du sucre "galactose" permet une grande spécificité d’interaction avec
l’enveloppe virale, tandis que l’utilisation du glucosylcéramide (GlcCer) mène à une
perte d’affinité [85].
Chapitre I Mise au point bibliographique
33
• la configuration β de la liaison glycosidique est d’une grande importance pour un
ancrage efficace du GalCer à la gp120 [32, 86]. Le remplacement de la liaison β-O-
glycosidique avec une liaison β-C-glycosidique [79, 87] ou β-S-glycosidique [88]
semble minimiser ou annuler respectivement la capacité du galactose à interagir
avec la gp 120. De plus, quelques groupes de recherche ont montré que l’utilisation
d’un espaceur hydrophile placé entre le sucre et le lipide d’ancrage augmente
l’interaction spécifique entre l’hydrate de carbone et le récepteur protéinique [89, 90].
• la partie hydrophobe du GalCer doit être suffisamment longue pour une bonne
efficacité d’ancrage. Le groupe de I. Rico-Lattes a montré que l’effet hydrophobe
joue un rôle primordial dans le processus de reconnaissance [77], la présence d’une
chaîne d’acide gras à 16 atomes de carbone étant optimale. Ces résultats ont été
confirmés par le groupe de Silberger et Bhat [32], qui a démontré qu’en variant la
longueur de la chaîne de l’acide gras du GalCer de 16 à 24 atomes de carbone, la
différence d’efficacité d’ancrage n’était pas significative. Il y a donc un seuil pour la
longueur de cette chaîne d’acide gras à partir de laquelle l’activité des produits ne
peut plus être améliorée.
• l’hydroxyle en position 3’ n’est pas indispensable car sa sulfonation n’altère pas
l’affinité du GalCer pour la gp 120 [72].
• le nombre de sites actifs [82, 83, 85, 91] ainsi que la conformation [81] adoptée par ces
analogues du GalCer sont aussi des facteurs déterminants pour une bonne activité
antivirale.
Chapitre I Mise au point bibliographique
34
III.1.1.3 Inhibiteurs des corécepteurs du VIH-1
En fonction de la nature des corécepteurs cellulaires impliqués lors de la fixation sur
la cellule hôte trois types de VIH-1 peuvent être définis:
i) les virus VIH-1 R5 qui s’attachent aux corécepteurs CCR5 présents sur les
macrophages ;
ii) les virus VIH-1 X4 qui utilisent les corécepteurs CXCR4 existants sur les
lymphocytes T ;
iii) et les virus VIH-1 R5X4 qui peuvent interagir avec les deux corécepteurs
(CCR5 et CXCR4) infectant aussi bien les lymphocytes T que les macrophages.
L’utilisation d’inhibiteurs des corécepteurs empêchant l’interaction de ces derniers
avec le complexe gp 120 – CD4 (ou gp 120 - GalCer) constitue également une stratégie
thérapeutique prometteuse pour combattre l’infection par le VIH.
III.1.1.3.1 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5
Plusieurs grandes entreprises pharmaceutiques se sont lancées dans la recherche
d’inhibiteurs efficaces du CCR5 et ont ainsi pu identifier un nombre important de produits
susceptibles d’inhiber l’interaction gp 120 – CCR5. Parmi les composés les plus efficaces on
peut citer: SCH-C (SCH-351125) (IC90 >1µM) et SCH-D (SCH-417690 ou Vicriviroc) (CI50=
1,2 nM) développés par Schering-Plough [92]; TAK-779, TAK-220 (CI50 = 0,5 – 1,7nM) et
TAK-652 (CI50 = 0,5 – 2,4 nM) appartenant à Takeda Chemicals [93, 94]; UK-427,875
(Maraviroc) - propriété de Pfizer Inc. et GW873140[95] né de la collaboration Ono
Pharmaceutical et GlaxoSmith Kline [49, 96] (Figure 17). Deux de ces composés : Maraviroc et
Vicriviroc sont passés en 2007 en phase clinique III [97]. De plus, le 6 août 2007 le Maraviroc
a été agréé par l’administration américaine des médicaments (FDA) avec toutefois
d’importantes restrictions d’utilisation car il augmente le risque de crise cardiaque. Egalement
à titre indicatif, ce médicament commercialisé sous le nom de Selzentry ® fera partie des
traitements anti-rétroviraux fortement actifs (highly active antiretroviral therapy, HAART).
Même si ces résultats sont plutôt encourageants, l’inhibition des corécepteurs CCR5
peut avoir à long terme de graves répercussions [98]. Ainsi, Le Vicriviroc est déjà suspecté
d’être responsable de l’apparition de tumeurs malignes [99].
Chapitre I Mise au point bibliographique
35
Figure 17 : Exemples de produits chimiques inhibant le corécepteur CCR5
Tous ces composés organiques de faible masse moléculaire ont une bonne
biodisponibilité orale et se trouvent en différentes phases des tests cliniques sauf le SCH - C
et le TAK779 qui ont été retirés en raison de réactions secondaires au niveau cardiaque.
Maraviroc UK-427,875
Vicriviroc SCH-D
GW873140
TAK-779
TAK-220
SCH-C
TAK-652
Chapitre I Mise au point bibliographique
36
III.1.1.3.2 Inhibiteurs des corécepteurs CXCR4
Même si la recherche des inhibiteurs de CXCR4 a été devancée par les études des
inhibiteurs de CCR5, ils ne sont pas moins importants pour la thérapie anti-VIH. Il y a déjà
quelques classes de produits très prometteurs qui agissent comme inhibiteurs de CXCR4.
Deux dérivés peptidiques cationiques T22 [100] (Figure 18) et ALX40-4C [101], ainsi
qu’un produit de faible masse moléculaire, l’AMD3100 (Figure 19), ont été identifiés comme
inhibiteurs du VIH bien avant l’identification des corécepteurs en 1996.
Les inconvénients des dérivés peptidiques cationiques (T22 et ALX40-4C, un
polypeptide formé par neuf résidus d’arginine) sont le manque de biodisponibilité orale et la
complexité de synthèse qui peut conduire à des traitements onéreux.
HO2C - Arg -Arg - Trp - Cys - Tyr - Arg - Lys - Cys - Tyr
H2 - Arg - Cys -Lys - Arg -Tyr - Cys - Tyr
S
S
S
S
Lys
Gly
T 22
Figure 18: Structure du T22 (peptide cationique à 18 acides aminés)
Une classe importante d’inhibiteurs de CXCR4 est la famille des bicyclames [102]
(Figure 19). Le produit le plus performant utilisé pour le développement de ces nouveaux
agents anti-VIH a été le monocyclame AMD1498 qui présente une concentration active de
400 µM. Ultérieurement synthétisés, les bicyclames AMD1657 et AMD2763 se sont avérés
de bons inhibiteurs anti-VIH-1 et VIH-2 à des concentrations micromolaires (CI50 = 0,14 - 1,4
µM.) Des études complémentaires ont montré que les bicyclames liés par un pont aromatique
sont environ 100 fois plus efficaces que les bicyclames connectés par une chaîne
aliphatique[103].
Le composé AMD3100 a longtemps été le composé le plus actif de la série des
bicyclames aromatiques, de par sa capacité à bloquer la réplication du VIH-1 et VIH-2 à des
concentrations actives de 1-10nM [104]. Malgré une considérable activité anti-VIH manifestée
dans les phases cliniques I et II, les études sur l’AMD3100 ont été stoppées due à une
"efficacité sous-optimale". Il a été remplacé par un nouveau dérivé, AMD11070 (ou
AMD070) (CI50 = 1-15 nM sur cellules T) [105] qui présente une bonne biodisponibilité orale.
Chapitre I Mise au point bibliographique
37
Toutefois, en raison d’une importante hépatotoxicité l’AMD 11070 n’a jamais dépassé
la phase II des tests cliniques [106].
Figure 19: Structures chimiques des inhibiteurs de CXCR4
Un autre inhibiteur de CXCR4 est le KRH-1636 (Figure 20) [96], un composé de faible
masse moléculaire qui a une bonne activité anti-VIH autant in vitro qu’in vivo. Les
expériences sur le rat ont montré que ce composé exprime une bonne biodisponibilité orale et
une bonne activité antivirale contre les souches X4 et R5X4 du VIH-1 (CI50 = 1 – 4,2 nM)
mais il n’est pas capable d’agir contre la souche R5 du VIH-1 [107].
Figure 20: Structure chimique du KRH-1636.
AMD1498 AMD2763
KRH-1636
AMD1657
AMD3100 AMD11070
Chapitre I Mise au point bibliographique
38
III.1.1.3.3 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5 et CXCR4
Récemment, le groupe de Schols a présenté le premier inhibiteur qui a la capacité
d’agir à la fois au niveau des corécepteurs CCR5 et des corécepteurs CXCR4. Le produit de
faible masse moléculaire, dénommé AMD3451 est un analogue de N – pyridinylmethyl
cyclame (Figure 21) qui possède la particularité de bloquer l’entrée virale aussi bien pour le
VIH-1 R5 que pour le VIH-1 X4 et ce pour des concentrations inhibitrices variant entre 1,2 et
26,5 µM en fonction de la nature des cellules ciblées [108]. Les études ont montré que le
composé AMD3451 interagit différemment avec le CXCR4 que l’AMD3100, inhibiteur
spécifique de ce corécepteur. Pour le moment, les sites précis d’interaction entre l’AMD3451
et les corécepteurs CCR5 et CXCR4 restent toujours à identifier, mais sa capacité à bloquer
l’infection cellulaire des virus HIV-1 : R5, R5/ X4 et X4 lui offre une place privilégiée car
souvent le malade peut être infecté par un mélange de différents types de VIH-1.
Figure 21: Structure chimique d’un inhibiteur des corécepteurs CCR5/CXCR4
III.1.2 Les inhibiteurs de fusion
La glycoprotéine virale gp 41 est celle qui réalise la fusion entre la membrane virale et
cellulaire [109, 110]. Les deux régions de la gp 41 : la NHR et la CHR (N- et respectivement C-
terminale) peuvent représenter de bonnes cibles pour les inhibiteurs de l’étape de fusion du
VIH-1 (Figure 22).
Figure 22: Représentation schématique de la glycoprotéine virale gp 41 [69]
AMD3451
Chapitre I Mise au point bibliographique
39
III.1.2.1 Inhibiteurs ciblant la région NHR de la gp 41
Pour le moment, le seul inhibiteur de fusion agréé par l’administration américaine des
médicaments (FDA) pour une utilisation clinique est l’enfuvirtide (ENF) connu aussi sous les
noms de : DP-178, T20 ou fuzeon. Le produit développé par les entreprises Trimeris et Roche
est un peptide synthétique comportant 36 acides aminés (Figure 23), dont la séquence a été
synthétisée afin de mimer la région CHR. Cette particularité structurale lui permet de se fixer
de manière compétitive sur la région NHR de la gp 41, empêchant l’ancrage de la région
virale CHR. Ainsi, le complexe à six hélices malformé entre l’enfuvirtide et NHR-gp 41 peut
stopper la fusion virus – cellule [111].
Bien qu’il soit très actif, son prix prohibitif et son manque de biodisponibilité orale,
font que l’enfuvirtide est utilisé seulement dans des cas particuliers pour les personnes
infectées par le VIH qui ne répondent pas ou plus aux polytherapies.
Figure 23: Structure de l’enfuvirtide [50]
Avec des modifications sur certains acides aminés est né le T-1249, une protéine de 39
acides aminés. Cet inhibiteur de fusion de deuxième génération mis au point par Trimeris et
Roche est de 2 jusqu'à 100 fois plus actif que le T20. Il a une demi-vie environ 2 fois plus
longue que le T20 et un profil de résistance virale différent de ce dernier, en étant actif contre
T 20
Chapitre I Mise au point bibliographique
40
les virus résistants à T20. Malgré tous ces avantages, le T-1249 est bloqué dans sa phase II
des tests cliniques en raison de problèmes de formulation [112].
Pour pallier aux deux principaux inconvénients du T20 : son manque de
biodisponibilité orale et son prix trop élevé, le groupe de Jiang [113] a identifié deux dérivés du
pyrrole, le NB-2 et le NB-64 (Figure 24) qui ont l’avantage d’être de petites molécules et de
bloquer la fusion du VIH-1 à des concentrations micromolaires. Ces composés se fixent au
niveau de la poche hydrophobe de la gp 41 par des interactions hydrophobes et ioniques. Des
tests ont montré que l’absence du groupement COOH conduit à une perte d’activité. L’activité
antivirale de ces composés NB-2 et NB-64 n’est malheureusement pas assez importante pour
pouvoir les considérer comme de futurs médicaments, mais comme des pionniers d’une
nouvelle génération d’inhibiteurs de fusion de faible masse moléculaire.
Figure 24: Structures chimiques des dérives du pyrrole : B-2 et B-64
III.1.2.2 Inhibiteurs ciblant la région CHR de la gp 41.
Comme la région NHR de la gp 41, la région CHR peut représenter une cible pour les
inhibiteurs de fusion du VIH-1. Le premier inhibiteur de fusion de la région CHR a été le
DP107 ou T21, un peptide à 38 acides aminés [114, 115]. Ce composé peut bloquer la fusion
entre le VIH-1 et la cellule humaine en se fixant sur la région CHR de la gp 41, et stoppant de
cette manière l’interaction indispensable au processus de fusion entre les deux régions NHR
et CHR.
Un nouvel inhibiteur de fusion de la région CHR, le 5-Helix [116] manifeste un bon
potentiel pour la thérapie anti-VIH. En effet, bien qu’il nécessite une administration par voie
parentérale, cet inhibiteur peut être synthétisé à grande échelle et à moindre coût que le T20.
Même s’il présente quelques avantages, le principal inconvénient de ce composé réside dans
la difficulté à obtenir sa conformation spécifique active [49].
Chapitre I Mise au point bibliographique
41
Le dérivé de l’acide bétulinique RPR 1036011 (Figure 25) est un composé non-
peptidique, de faible masse moléculaire qui a été décrit comme inhibiteur anti-VIH-1 avec
une CI50 de 10nM [117]. Même si le mécanisme exact d’action reste inconnu il y a des indices
qui montrent l’interaction du RPR 103611 avec la gp 41.
Figure 25: Structure chimique de l’inhibiteur de fusion RPR 103611, un dérivé de
l’acide bétulinique
III.1.3 Inhibiteurs de la décapsidation (de la nucléocapside virale)
Des composés comme le 3-nitrosobenzamide (NOBA), le 2,2’-dithiobisbenzamide
(DIBA), et l’azodicarbonamide (ADA) (Figure 26) interfèrent avec les processus de
désassemblage de la nucléocapside virale (NCp7) et le largage des constituants viraux dans la
cellule humaine [118, 119]. Ces études ont montré que ces produits s’amarrent au niveau des
deux domaines nommés "doigts de zinc" de la nucléocapside virale, sans affecter les "doigts
de zinc" des protéines cellulaires humaines.
Figure 26: Structure schématisée de la Cp7 et structure chimique de l’ADA
L’azodicarbonamide (ADA) est le premier composé appartenant à cette classe
d’inhibiteurs de la NCp7 qui a dépassé les deux premières phases d'essais cliniques. Bien que
l’ADA soit un inhibiteur des "doigts de zinc" de la nucléocapside virale, il semble que son
action in vivo soit plus complexe et qu’il puisse interagir avec une multitude de cibles.
RPR 103611
Cp7
Chapitre I Mise au point bibliographique
42
III.2 Inhibiteurs de la transcriptase inverse
III.2.1 Structure et activité de la transcriptase inverse
La transcriptase inverse (TI) du VIH-1 catalyse la synthèse de l’ADN proviral en
utilisant comme référence l’ARN viral. Cette enzyme est composée de deux sous unités
dénommées p66 et p51 (respectivement 66kDa et 51kDa), chacune d’entre elles ayant quatre
sous domaines nommés : "doigts", "paume", "pouce" et "connexion" (Figure 27) [120]. Les
trois premiers sous domaines appartenant au p66 agissent comme une pince qui fixe l’ARN au
site actif de la polymérase (POL sur la Figure 27) qui réalise la synthèse de l’ADN viral. Le
p66 contient un domaine supplémentaire (RNaseH) de 120 acides aminés qui accomplit
l’activité d’endonuclease (la dégradation des intermédiaires ARN-ADN formés pendant
l’activité de la polymérase) [121].
Figure 27: Structure de la transcriptase inverse du VIH-1
Les principes actifs antirétroviraux qui ciblent la transcriptase inverse du VIH-1
peuvent être classés en fonction de leur structure chimique et de leur mécanisme d’action en:
inhibiteurs nucléosidiques (INTI), inhibiteurs nucléotidiques (INtTI) et inhibiteurs non-
nucléosidiques (INNTI).
III.2.2 Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse.
L’ère thérapeutique des inhibiteurs de la TI commence en 1985 par la découverte de
l’activité antirétrovirale de l’azidothymidine (Zidovudine, AZT), un composé synthétisé en
1964 en tant qu’anticancéreux.
Chapitre I Mise au point bibliographique
43
A présent, il y a sept inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI)
agréés pour le traitement contre les infections par le VIH : zidovudine (AZT), didanosine
(ddI), zalcitabine (ddC), stavudine (d4T), lamivudine (3TC), abacavir (ABC) et emtricitabine
((−) FTC) (Figure 28).
Figure 28: Structure des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (ITI)
agréés comme principes actifs anti-VIH
Connus aussi sous le nom d’analogues 2’, 3’-didéoxynucléosidiques, ces inhibiteurs de
la transcriptase inverse doivent subir in vivo, sous l’activité de la nucléoside kinase, trois
étapes de phosphorylation qui transforment le produit successivement en son analogue 5’-
monophosphate, 5’-diphosphate et 5’-triphosphate. Cette forme triphosphate constitue la
forme active qui agit comme inhibiteur compétitif / substrat alternatif pour l’enzyme ciblée, la
transcriptase inverse. Une fois incorporé dans l’ADN, le INTI stoppe inévitablement la
croissance de l’ADN viral en raison de l’absence d’un groupement OH en position 3’ qui est
nécessaire pour la formation d’une liaison ester avec le groupement phosphate du nucléotide
suivant (Figure 29) [122].
Chapitre I Mise au point bibliographique
44
Figure 29: Mécanisme d’action des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase
inverse, en prenant comme exemple le premier représentant de la classe, l’AZT [122]
Quoique les INTI soient très efficaces, pouvant diminuer la charge virale du VIH dans
le plasma jusqu'à une quantité presque négligeable, ils présentent de graves effets secondaires
manifestés principalement par une forte toxicité et l’apparition de résistance du virus aux
médicaments en raison de ses multiples mutations. Ainsi, le plus grand défi pour concevoir de
nouveaux inhibiteurs nucléosidiques actifs réside dans la conception de principes actifs
évitant ces deux grands inconvénients. Il existe déjà un nombre important d’analogues 2’, 3’-
didéoxynucléosidiques qui sont actuellement testés cliniquement. Parmi ces composés se
trouve : le reverset, le SPD 754 ((-) dOTC) et l’amdoxovir (Figure 30). Ces nouveaux INTI
sont actifs contre distincts variants du VIH-1 qui ont acquis une résistance au traitement avec
les inhibiteurs nucléosidiques classiques comme le lamivudine ou l’AZT [123].
Figure 30: Structures de nouveaux ITI
Chapitre I Mise au point bibliographique
45
III.2.3 Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse.
Les inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse ont le même mécanisme
d’action que les inhibiteurs nucléosidiques mais ils comportent un groupement phosphate afin
de diminuer le nombre d’étapes d’activation nécessaires. Au lieu de la triple phosphorylation,
les composés de cette classe exigent seulement deux étapes de phosphorylation qui leur
permettent d’éviter la première étape de mono phosphorylation qui est la plus lente. Pour le
moment le ténofovir est le seul inhibiteur nucléosidique agréé comme principe actif anti-
SIDA. A présent, le ténofovir, utilisé sous sa forme orale de disoproxil fumarate [124] (Figure
31) en combinaison avec 3TC et efavirenz (un inhibiteur non-nucléosidique de la transcriptase
inverse) semble être une des thérapies anti-SIDA les plus efficaces.
Figure 31: Structure chimique du ténofovir disoproxil fumarate
Ces inhibiteurs nucléosidiques et nucléotidiques de la transcriptase inverse se sont
révélés être des composants indispensables à la chimiothérapie du VIH, chaque régime de
traitement polythérapeutique contenant au moins un membre de cette classe de principes
actifs.
III.2.4 Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse
Les inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) sont des
inhibiteurs spécifiques de la réplication virale du VIH-1[125]. Ils interagissent directement avec
une poche allostérique de la transcriptase inverse située à approximativement 15 Å du centre
catalytique de l’enzyme [126]. Par ces interactions de nature hydrophobe [127], les INNTI
produisent un changement conformationnel de l’enzyme dont l’activité catalytique est
diminuée. Donc, les INNTI bloquent de manière non-compétitive l’interaction entre la
transcriptase inverse et le substrat.
Ces inhibiteurs sont actifs seulement sur le VIH-1 dont la transcriptase inverse est
capable de fixer les INNTI et non sur le VIH-2 ou d’autres rétrovirus.
Chapitre I Mise au point bibliographique
46
L’ère des INNTI a commencé dans les années 90 avec la découverte des dérivés du
HEPT et TIBO (Figure 33) [128-130]. Depuis, plus de 30 classes de composés ont été identifiées
comme des INNTI. Parmi cette multitude de produits seulement 3 ont été acceptés par la FDA
pour le traitement anti-VIH : nevirapine, efavirenz et delaviridine [121] (Figure 32).
Figure 32: Structures des ITI agréés comme principes actifs anti-VIH-1
Malheureusement, les études ont montré que le traitement avec ces produits conduit à
l’apparition de la résistance virale. Plus inquiétant a été le fait qu’un seul type de mutation de
la transcriptase inverse engendrait souvent la résistance envers différents inhibiteurs non-
nucléosidiques [131].
Une deuxième génération de INNTI est actuellement développée afin d’éviter les
problèmes liés aux mutations [132, 133]. Des composés comme : l’emivirine, la tivirapine, la
capravirine [132, 134], le tiocarboxanilide [135], l’etravirine [136, 137] et la calanolide A [138] (le seul
inhibiteur non-nucléosidique naturel, extrait d’un arbre tropical – Calophyllum lanigerum)
sont autant de nouveaux candidats pour la thérapie anti-VIH (Figure 33).
HEPT
Emivirine
TIBO
Tivirapine
evirapine Efavirenz Delaviridine
Chapitre I Mise au point bibliographique
47
Figure 33: Structures de nouveaux inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase
inverse
Même si les INNTI décrits ces seize dernières années sont structurellement différents,
ils présentent tous une conformation de type "papillon" avec une partie polaire centrale et
deux "ailes" latérales hydrophobes [139].
Malgré ces inconvénients de résistance virale, les inhibiteurs non-nucléosidiques de la
transcriptase inverse jouent un rôle important en polythérapie intensive en raison de leur
grande sélectivité, leur toxicité relative réduite et une concentration active dans une gamme
nanomolaire [123].
III.3 Inhibiteurs de l’intégrase
L’intégrase (IN) est l’enzyme virale responsable de l’insertion du nouvel ADN double
brin viral dans le génome de la cellule hôte. Dans le cytoplasme cellulaire l’intégrase clive
deux nucléotides terminaux à chaque bout 3’ de l’ADN viral et forme de cette manière un
complexe de preintégration (Figure 34A). Le complexe est ensuite transporté dans le noyau et
les bouts 3’ de l’ADN viral sont directement insérés dans l’ADN cellulaire par des réactions
de transestérification (Figure 34B).
Figure 34: Schéma d’insertion de l’AD viral dans l’AD cellulaire
Capravirine Tiocarboxanilide Etravirine Calanolide A
Chapitre I Mise au point bibliographique
48
Puisque le VIH-1, comme d’autres rétrovirus, ne peut pas se reproduire sans
intégration dans un chromosome hôte et puisque dans l’organisme humain il n’y a pas
d’homologue de l'intégrase, cette enzyme a été considérée comme une cible thérapeutique de
choix.
De nombreux composés ont été décrits comme inhibiteurs de l’intégrase du VIH-1 :
des composés poly-hydroxylés aromatiques (l’acide aurintricarboxylique), des analogues de
cosalane, des flavonones (quercetagetin), et encore plusieurs autres (Figure 35). Les produits
appartenant aux deux premières classes présentent une bonne activité inhibitrice à des
concentrations actives micromolaires malgré une possible interférence avec le complexe
gp120-CD4.
Figure 35: Structures chimiques de premiers inhibiteurs de l’intégrase du VIH
Le problème avec les inhibiteurs de l'intégrase est que même s’ils sont efficaces lors
des tests enzymatiques, leur activité anti-VIH en culture cellulaire peut être masquée par leur
cytotoxicité. Même s’ils expriment une activité antivirale, cela pourrait, au moins dans
quelques cas, être attribué à des actions antivirales qui ont visé d’autres étapes que
l’intégration dans le cycle de réplication du VIH. L’acide L-chicoric est représentatif d’une
telle situation (Figure 36). Cet acide a été rapporté comme inhibiteur de l’intégrase du VIH-1
dans la culture cellulaire mais en fait, des études ultérieures ont démontré qu’il doit son
activité anti-VIH à une interaction avec la boucle polycationique V3 de la gp 120 [140].
Figure 36: Structure chimique de l’acide L-chicoric
acide aurintricarboxylique
cosalane
quercetagetin
Chapitre I Mise au point bibliographique
49
Les acides dicétoniques tel que le L-708,906 et le L-731,988 (Figure 37) se sont
montrés de véritables inhibiteurs de l’intégrase. Ces dérivés sont capables de bloquer
l’insertion des parties terminales 3’ de l’ADN viral dans l’ADN cellulaire [141]. De plus, le L-
708,906 ne perd pas son activité antivirale même s’il est ajouté dans la culture cellulaire 7
heures après l’infection, temps correspondent au début de l’intégration de l’ADN proviral [142].
Le composé S–1360 (Figure 37) a été le premier inhibiteur de l’intégrase ayant passé
les premières étapes des essais cliniques [143]. La concentration active de 20 nM et l’indice
thérapeutique d’environ mille font de ce composé un des meilleurs inhibiteurs de l’intégrase.
Récemment toute une nouvelle classe d'inhibiteurs de l’intégrase du VIH-1 a été
identifiée, celle du 5H-pyrano [2,3-d:-6,5-d '] dipyrimidine. Le composé le plus actif de la
série est le pyranodipyrimidine V-165 (Figure 37) qui arrive a inhiber la réplication du VIH-1
a une concentration active de 8,9 µM [144].
Figure 37: Structures des meilleurs inhibiteurs de l’intégrase
En 2007, Beatriz Grinsztejn [145] et ses collaborateurs ont rapporté qu’un nouvel
inhibiteur de l’intégrase dénommé raltegravir (MK-0518) a dépassé la phase II des tests
cliniques, ce qui en fait probablement le plus prometteur des dérivés de cette classe.
Administré en combinaison avec des principes actifs anti-SIDA (ténofovir et lamivudine) aux
malades ayant une charge virale de 5000 copies d’ARN par ml, le raltegravir arrive à
diminuer cette charge virale, après 24 mois au-dessous de 50 copies d’ARN par ml. Il y a
également peu de temps, le raltegravir dont la structure chimique est représenté ci-dessus [146,
147] a été agréé pour la phase III des tests cliniques. Cet inhibiteur de l’intégrase administré par
voie orale, commercialement connu sous le nom d’ISENTRESS™ (raltegravir), sera peut-être
L-708,906 S–1360
L-731,988
Raltegravir (MK-0518) Pyranodipyrimidine (V-165)
Chapitre I Mise au point bibliographique
50
le premier principe actif de cette classe à être agréé pour le traitement du SIDA. Par rapport
aux autres substances actives anti-VIH, ce composé ne perturbe pas les niveaux de cholestérol
ou de triglycérides mais il manifeste quelques effets secondaires comme : nausées,
vomissements, fatigue, maux de tête et diarrhée.
III.4 Inhibiteurs de transcription (transactivation)
Au niveau de la transcription, l’expression des gènes du VIH-1 peut être inhibée par
des composés qui interagissent avec des facteurs cellulaires comme les protéines virales Tat [148] et Rev. Le rôle principal de la Tat est d’activer la transcription de l’ARN viral et celui de
la Rev de transporter l’ARNm viral du noyau dans le cytoplasme afin qu’il puisse coder pour
les protéines structurales du VIH-1 [149]. Donc, le ciblage de ces deux protéines virales peut
représenter une bonne stratégie d’intervention thérapeutique dans le cas de l’infection par le
VIH.
Une importante variété d’inhibiteurs du processus de transcription (de la Tat) ont déjà
été décrits : des fluoroquinolines (Fluoroquinoline K-37) [150, 151], flavopiridol [152], le
bistriazoloacridone temacrazine [153], neplanocin A, 3-deazaneplanocin A [154] et des analogues
des peptides qui miment différents domaines de la Tat comme le peptide CGP64222.
Toutefois, il semble que ce dernier composé interagisse initialement avec les corécepteurs
CXCR4, fait qui n’est pas surprenant si l’on tient compte de sa similarité structurale avec les
inhibiteurs peptidiques du CXCR4 [155] (Figure 38).
Figure 38: Structures chimiques de quelques inhibiteurs de la protéine virale Tat
Fluoroquinoline K-37 Flavopiridol
Temacrazine
X= : eplanocin A
X=CH : 3-Deazaneplanocin A
CGP64222
Chapitre I Mise au point bibliographique
51
L’activité de la Rev peut être inhibée par la molécule de faible masse moléculaire PKF
050-638 [156], par les dérivés du N-aminoimidazole (NAIMS) dont la structure générale est
présentée ci-dessous et par l’ensemble de trois dérivés d’oxyde de pyridine JPL-32, JPL-88 et
JPL-133 [157, 158] (Figure 39). Les produits appartenant à ces deux dernières classes semblent
avoir un double mécanisme d’action. Ils inhibent le cycle de réplication du VIH en
interagissant autant sur la protéine virale Rev que sur la transcriptase inverse et ce, par le
même mécanisme que les inhibiteurs non-nucléosidiques [157, 159]. Par ailleurs le JPL-32
semble aussi être un inhibiteur de la Tat [149].
Figure 39: Structures chimiques de quelques inhibiteurs de la protéine virale Rev.
PKF 050-638 -aminoimidazole (AIMS)
X1, X
2 : Halogène, Alkyle
R : Alkyle, Aryle
Y : SH, H
Oxydes de pyridine JPL -32, -88 et 133
Chapitre I Mise au point bibliographique
52
III.5 Inhibiteurs de la protéase
Une fois l'ADN viral intégré dans le génome de la cellule hôte, le génome proviral est
copié et traduit par les enzymes cellulaires afin de produire de grandes chaînes de
polypeptides connues sous le nom de polyprotéines Gag et Gag-Pol. La protéase du VIH-1
clive ces polyprotéines en de plus petites protéines structurales et fonctionnelles (la protéase
(p11), la transcriptase inverse (p66 /p51) et l’intégrase (p32)) permettant de cette façon au
virion d’arriver à maturité tout en préservant sa capacité à infecter d’autres cellules [149, 160].
La protéase du VIH-1 est une enzyme dimère formée par deux polypeptides identiques
associés de manière non covalente. Chacun des monomères comprend 99 acides aminés et
contient la séquence Asp-Thr-Gly qui fournit le groupement aspartique nécessaire au clivage
des polyprotéines par hydrolyse (Figure 40). Ce site actif de l'enzyme est localisé à l’interface
des deux monomères [121].
Figure 40: Structure tridimensionnelle de la protéase bloquée par un inhibiteur
spécifique (www.dsch.univ.trieste.it)
Les inhibiteurs de la protéase du VIH-1 interviennent dans cette étape tardive du cycle
de réplication et bloquent la formation de nouvelles particules virales infectieuses. Tous les
inhibiteurs de la protéase (IP) agréés pour le traitement des infections par le VIH : saquinavir,
ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, et atazanavir comportent le même
motif, soit une liaison d’hydroxyle d’éthylène (à la place de la liaison peptidique) qui confère
un caractère non-clivable à la molécule (Figure 41). Ainsi, ces sept IP agissent comme des
inhibiteurs peptidomimétiques de la protéase du VIH-1 [161].
Site catalytique Inhibiteur peptidomimétique
Chapitre I Mise au point bibliographique
53
Figure 41: Structures des inhibiteurs de la protéase agréés pour traiter l’infection par le
VIH-1
Même s’ils sont très actifs, les inhibiteurs peptidomimétiques présentent quelques
inconvénients. L’inconvénient majeur est que le VIH-1 développe une résistance soit envers
un inhibiteur soit envers toute une classe d’inhibiteurs de la protéase [162]. De plus, la grande
majorité de ces principes actifs possèdent une faible biodisponibilité orale, en raison de leur
structure peptidique. Les effets secondaires comme une brusque augmentation du niveau de
cholestérol dans le sang et la lypodystrophie sont aussi inquiétants car il semble que ces
principes actifs interfèrent avec l’acide aspartique de la protéase humaine impliquée dans le
métabolisme des lipides [123]. A tous ces désavantages il faut ajouter que les inhibiteurs
peptidomimétiques ont le pire profil de toxicité de toute la gamme des principes actifs anti-
VIH-1 agréés pour une utilisation clinique.
Tipranavir est le premier composé non peptidique de faible masse moléculaire qui
arrive à inhiber la protéase du VIH-1 et celle du VIH-2. Encore plus important, avec une
concentration active de 30nM, le Tipranavir (Figure 42) est efficace sur 90% des virus VIH-1
résistants aux autres inhibiteurs de la protéase [163, 164]. Actuellement testé cliniquement, il
représente un grand espoir pour la thérapie anti-VIH.
Saquinavir Ritonavir
Indinavir sulfate
elfinavir
Amprenavir Lopinavir
Atazanavir
Chapitre I Mise au point bibliographique
54
Figure 42: Structure du Tipranavir, le premier inhibiteur non peptidique de la protéase
Malgré leur toxicité reconnue, les inhibiteurs de la protéase sont indispensables pour la
polythérapie rétrovirale moderne et des recherches sont en cours pour trouver de nouvelles
molécules actives ciblant d’autres séquences de l’enzyme moins prédisposées à la mutation.
III.6 Polythérapies
La Zidovudine (AZT), le premier inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse
a été le principe actif pionnier utilisé dans la thérapie anti-VIH-1. Les expériences ont montré
qu’à court terme, le traitement précoce de la primo-infection par la zidovudine en
monothérapie permettait un meilleur contrôle de la charge virale, une remontée plus rapide du
taux de lymphocytes T CD4 et une réduction de la fréquence des infections opportunistes [165,
166].
Le développement de la résistance virale du VIH a conduit au remplacement de la
monothérapie qui était devenue inefficace par la polythérapie qui a pour but l’éradication du
VIH en attaquant simultanément différentes étapes du cycle de réplication du virus tout en
essayant d’obtenir la meilleure synergie entre les principes actifs, et en essayant de supprimer
l’émergence de virus résistants.
Actuellement il y a 21 principes actifs antirétroviraux disponibles pour le traitement du
VIH/SIDA. Pour obtenir le meilleur effet thérapeutique, ces substances actives doivent être
combinées en polythérapies efficaces. Cette stratégie connue aussi sous le nom de thérapie
antirétrovirale fortement active (highly active antiretroviral therapy, HAART) consiste en
l’utilisation des deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI) ou un INTI
et un inhibiteur nucléotidique de la transcriptase inverse (INtTI) auxquelles est ajouté un
inhibiteur non-nucléosidique de la transcriptase inverse (INNTI) ou un inhibiteur de la
protéase (IP) (Figure 43) [127].
Tipranavir
Chapitre I Mise au point bibliographique
55
http://www.theses.ulaval.ca/2005/22933/ch02.html
Figure 43: Représentation des cibles thérapeutiques anti-VIH actuellement visées
La tendance actuelle est de commencer la thérapie anti-VIH avec des traitements sans
inhibiteurs de la protéase (IP) qui semblent générer à force d’utilisation prolongée des effets
secondaires tel que la lypodystrophie, le diabète et des problèmes cardio-vasculaires.
Les associations possibles des deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase
inverse qui se sont avérées efficaces et bien tolérées sont: zidovudine (AZT) - didanosine
(ddI), zidovudine (AZT) - zalcitabine (ddC), zidovudine (AZT) - lamivudine (3TC), stavudine
(d4T) - didanosine (ddI) et stavudine (d4T) - lamivudine (3TC) [167].
Afin d’éviter la lourdeur du traitement (un grand nombre de pilules à ingérer ou une
haute fréquence des prises), plusieurs combinaisons d’antirétroviraux se retrouvent
actuellement sous forme d’une pilule unique. C’est le cas de Trizivir (AZT+3TC+ABC
(Abacavir)), Triomune (d4T+3TC+NVP (névirapine (INNTI)) [168], Truvada® (ténofovir plus
emtricitabine) et Atripla® (ténofovir plus emtricitabine plus éfavirenz)[124].
D’autres régimes polythérapeutiques efficaces sont les combinaison : lamivudine
(NRTI) - ténofovir (INtTI) - efavirenz (INNTI), Combivir (zidovudine /lamivudine) /
éfavirenz, mais aussi Trizivir /éfavirenz [169].
Un nouvel espoir dans la polythérapie anti-VIH est l’utilisation de l’enfuvirtide (le
seul inhibiteur de fusion) qui est réservé pour le moment à la thérapie de dernier recours en
raison de son coût de fabrication prohibitif et de son administration sous-cutanée [127].
Chapitre I Mise au point bibliographique
56
III.7 Le développement des systèmes de vectorisation pour la thérapie anti-VIH
Même si l’utilisation de multithérapies antirétrovirales fortement actives (highly active
antiretroviral therapy, HAART) a entraîné une chute significative de la mortalité associée au
VIH/SIDA cette stratégie se heurte à des inconvénients comme : le prix élevé des traitements,
une importante toxicité, des effets secondaires provoqués par une utilisation prolongée de
certains principes actifs, la mutation du virus, etc… [170].
Ces dix dernières années, la recherche de différents systèmes de vectorisation
biologiques ou non-biologiques pour la thérapie anti-VIH a reçu une importante attention. Le
développement de ces systèmes de vectorisation propose la délivrance spécifique au niveau
cellulaire de principes actifs anti-VIH. De cette manière, la dose de principe actif administrée
est réduite tout en améliorant l’efficacité biologique et en diminuant la toxicité du principe
actif [171].
Parmi les transporteurs cellulaires spécifiques non-biologiques on retrouve les
liposomes définis comme des vésicules microscopiques (25nm jusqu’à quelques µm), formés
d’une ou plusieurs bicouches de phospholipides qui entourent un compartiment aqueux. Ils
sont capables d’encapsuler autant des composés hydrophiles solubilisés dans la phase aqueuse
que des produits hydrophobes par incorporation dans la bicouche lipidique. Les études in
vivo sur des rats ont montré que l’administration intraveineuse de l’AZT (Zidovudine -
inhibiteur de la transcriptase inverse du VIH) encapsulé dans la phase aqueuse des liposomes
permet l’obtention d’un relargage continu et une demi-vie du principe actif supérieure à
l’utilisation d’une solution aqueuse d’AZT. De plus, l’administration d’AZT incorporé dans
des liposomes permet une meilleure accumulation du principe actif dans le système
réticuloendothélial (RES) ou le VIH réside et se multiplie [172]. Cet exemple n’est pas unique,
l’administration de la Stavudine (d4T, un autre inhibiteur de la transcriptase inverse du VIH)
encapsulée dans des liposomes a montré une augmentation de la concentration de ce composé
dans les macrophages, d’où une meilleure activité biologique que dans le cas d’utilisation du
principe actif seul [173].
L’encapsulation de principes actifs anti-VIH en utilisant des liposomes semble une
bonne alternative pour la thérapie du SIDA mais, cette technique n’est pas infaillible car les
liposomes ont une faible durée de vie dans le système sanguin. De plus, le faible taux
d’encapsulation et la présence de traces de solvant toxique due à la méthode de préparation
sont d’autres problèmes attachés à ce système de vectorisation [174]. Donc, de nouveaux
Chapitre I Mise au point bibliographique
57
transporteurs cellulaires spécifiques ayant une meilleure stabilité in vitro et in vivo sont de
plus en plus recherchés.
Nous rappelons que les glycoprotéines virales gp 120 bourgeonnent à la surface des
cellules humaines infectées par le VIH, ce qui transforme la gp120 en une cible de choix pour
le développement des thérapies anti-VIH spécifiques [88]. Ainsi, les analogues synthétiques du
GalCer capables de former des vésicules stables, tout en ayant une forte affinité pour la gp
120 pourront être utilisés comme transporteurs spécifiques de principes actifs anti-SIDA
dirigés soit vers le VIH soit vers les cellules déjà infectées.
III.8 Inhibiteurs de l’étape de latence du VIH
Les traitements polythérapeutiques utilisés actuellement permettent de diminuer la
charge virale du VIH-1 dans le sang jusqu'à des niveaux indétectables et de rétablir les
fonctions immunitaires de l’organisme. Pourtant, le virus VIH n’est pas éradiqué. Il reste en
latence dans les lymphocytes T CD4+ inactives, cellules considérées comme des "réservoirs"
du VIH [45, 175]. Comme les lymphocytes, le VIH est lui même "endormi" et ne se multiplie
plus jusqu’à ce que les cellules immunitaires reprennent leur activité [176]. C’est pourquoi la
thérapie intensive anti-VIH n’est pas efficace à ce stade, rendant impossible l’élimination
complète du VIH [177].
Une approche originale pour le développement de médicaments anti-VIH a été réalisée
par Margolis [178] et ses collaborateurs qui ont mis au point une stratégie de réactivation des
cellules T CD4+ latentes afin de permettre au virus de s’exprimer, le rendant ainsi accessible
à un traitement renforcé. Ils ont employé pour cela l’acide valproïque (connu aussi sur le nom
commercial de Depakine) (Figure 44) - un principe actif fréquemment utilisé dans le
traitement de l’épilepsie- pour inhiber l’enzyme HDAC1 (histone déacétylase 1) responsable
de la latence des lymphocytes T CD4+.
(CH3CH2CH2)2CHCOOH
Figure 44: Structure chimique de l’acide valproïque
L’étude a été réalisée sur seulement 4 patients qui se trouvaient sous traitement
antirétroviral intensif depuis au moins 2 ans. Après une période de 3 mois d’intensification de
l’effet de HAART avec enfuvirtide (l’inhibiteur de fusion du VIH-1) et acide valproïque, les
Chapitre I Mise au point bibliographique
58
chercheurs ont observé une diminution moyenne de 75% du nombre des cellules infectées en
dormance chez trois des quatre patients.
Ces tests préliminaires ont indiqué que l’efficacité thérapeutique de l’acide valproïque
ajouté à la polythérapie virale classique semble avoir des effets remarquables sur l’éradication
du VIH. Pourtant, des études supplémentaires sont nécessaires pour comprendre pourquoi le
traitement n’a été que partiellement efficace (seulement 3 des 4 volontaires testés). De plus, il
a été exprimé avec raison que cette stratégie est complètement dépendante de la réussite du
traitement antirétroviral classique et qu’elle n’apporte pas de réponse aux personnes en multi-
échec thérapeutique.
III.9 Le stade actuel du développement des vaccins anti-VIH
Aujourd'hui, le SIDA est la principale cause de mortalité en Afrique subsaharienne et
est considéré comme le quatrième grand tueur dans le monde. Environs 14 mille personnes
sont infectées par le VIH chaque jour et plus de 95% d’entre eux vivent dans des pays sous-
développés. L'espérance de vie dans certains pays d’Afrique du Sud où un quart ou même un
tiers de la population générale est infecté par le VIH-1, est passée de 65 ans dans les années
1985-1990 à 37 ans en 2000–2005. Cette situation montre l'urgence de développer un vaccin
efficace contre le SIDA, facile à administrer et accessible aux plus pauvres.
La première phase clinique concernant un vaccin contre le VIH a été menée aux USA
en 1987. Depuis, plus de 35 vaccins ont été testés en plus de 65 phases cliniques I/II
impliquant plus de 10 mille volontaires humains sains [179]. Seuls trois vaccins ont réussi à
atteindre la phase III des tests cliniques [180, 181]. Cependant, le monde scientifique est encore à
des années du développement d’un vaccin sûr et efficace contre le VIH en raison de multiples
défis restant encore à affronter [182].
Un des obstacles majeurs est la haute variabilité génétique du virus [183] car, comme
nous l’avons déjà précisé, il existe 2 groupes du VIH-1 : M et O, le groupe majoritaire M
pouvant être divisé en 9 sous-types: A, B, C, D, E, F, G, H, et NT. En se multipliant, le VIH
est capable de générer un très grand nombre de mutants chez un même individu, par
conséquent il devient particulièrement difficile de mettre au point un vaccin efficace contre
toutes les souches virales qui en résultent.
Chapitre I Mise au point bibliographique
59
Le développement d'un vaccin efficace est retardé aussi par le manque de
connaissance des réactions immunitaires de protection [184], la difficulté de produire une large
gamme d’anticorps de neutralisation [185], l'absence de modèles animaux adaptés, la
complexité liée à la préparation et la faisabilité des tests cliniques à une grande échelle,
surtout dans les pays en voie de développement [186].
IV CONCLUSIONS
La découverte de la structure du VIH et la compréhension de son cycle de réplication
ont donné aux scientifiques les moyens de développer de nombreuses stratégies
thérapeutiques afin de combattre ce terrible virus.
Même si le VIH est vulnérable à chaque étape de sa réplication virale, pour l’instant
les principes actifs agréés pour l’utilisation clinique ciblent seulement trois de ces étapes :
l’entrée virale, la transcription et la maturation du VIH. Ces principes actifs utilisés en
différentes combinaisons constituent les régimes polythérapeutiques. A l’heure actuelle, la
polythérapie est le seul moyen de diminuer et de contrôler la multiplication virale, en évitant
le plus possible les mutations du VIH.
On doit souligner le fait que malgré le grand nombre de produits synthétisés afin de
stopper l’entrée du VIH dans la cellule humaine, l’Administration Américaine des
Médicaments a approuvé pour l’utilisation clinique seulement deux inhibiteurs de l’entrée
virale : l’enfuvirtide (inhibiteur de fusion) et le maraviroc (inhibiteur des corécepteurs CCR5).
Le premier est utilisé seulement dans la thérapie de dernier recours en raison de son prix élevé
de fabrication et de sa faible biodisponibilité. Quant au deuxième, malgré son efficacité, il
présente des dangers car il augmente le risque de crise cardiaque.
Les recherches qui font le sujet de cette thèse seront consacrées dans un premier temps
au développement de nouveaux inhibiteurs de l’entrée virale. Parmi la multitude des produits
capables de bloquer l’entrée du VIH dans la cellule hôte, nous nous sommes particulièrement
intéressés aux analogues du galactosylcéramide qui, comme nous l’avons présenté, inhibent
l’infection sur cellules CD4+. Les recherches réalisées précédemment dans notre groupe ont
montré que les analogues catanioniques du galactosylcéramide sont des leurres chimiques du
VIH très efficaces, présentant des activités antivirales prometteuses.
Chapitre I Mise au point bibliographique
60
Ainsi, en s’appuyant sur l’expérience antérieure de notre laboratoire dans ce domaine,
l’étude actuelle aura pour but la synthèse et l’étude de nouveaux assemblages catanioniques
dendritiques, analogues du galactosylcéramide qui, par un effet de multiplicité de sites seront
utilisés comme leurres multivalents pour le VIH. Afin de diminuer leur toxicité cellulaire, due
à une éventuelle dissociation de l’entité catanionique, nous allons renforcer l’effet
hydrophobe entre les éléments constitutifs par ajout de chaînes alkyles sur le dendrimère.
L’étude des propriétés physico-chimiques, les tests biologiques ainsi que l’étude des
interactions et de l’incorporation de ces composés dendritiques catanioniques dans des
modèles membranaires nous permettrons d’établir une corrélation entre la structure,
l’hydrophobie, la conformation et l’activité biologique de ces produits.
Dans un deuxième temps, nous profiterons de la présence de la gp120 sur les cellules
infectées pour mettre au point une méthode de vectorisation spécifique à l’aide de vésicules
formées par une nouvelle famille d’analogues catanioniques du GalCer – les dérivés
bicaténaires mixtes fluorés / hydrogénés. L’étude des propriétés physico-chimiques et
biologiques nous aideront à déterminer les caractéristiques structurales optimales afin
d’obtenir un système efficace de vectorisation de principes actifs anti-VIH.
Chapitre I Mise au point bibliographique
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Chapitre I Mise au point bibliographique
68
Chapitre II
Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du
VIH
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
71
I ITRODUCTIO ......................................................................................... 73
II ITERET DES DERIVES CATAIOIQUES DEDRITIQUES AALOGUES DU
GALCER .................................................................................................... 74
III SYTHESE DE OUVEAUX TESIOACTIFS CATAIOIQUES DEDRITIQUES
AALOGUES DU GALCER.......................................................................... 79
III.1 Synthèse des dendrimères catanioniques analogues du GalCer.......................... 79
III.2 Analyse structurale par résonance magnétique nucléaire................................... 81
IV ETUDE DE L’ASSOCIATIO DES DEDRIMERES CATAIOIQUES A
L’ITERFACE EAU / AIR............................................................................. 83
IV.1 La technique de la balance de Langmuir ............................................................ 83
IV.2 Etude des monocouches d’amphiphiles catanioniques dendritiques par la
technique de la balance de Langmuir ................................................................. 85
V PROPRIETES BIOLOGIQUES DE OUVEAUX CATAIOIQUES
DEDRITIQUES AALOGUES DU GALCER................................................. 89
V.1 Caractéristiques biologiques................................................................................ 89
V.1.1 Paramètres biologiques ............................................................................................... 89 V.1.2 Lignées cellulaires et souches virales.......................................................................... 90 V.1.3 Présentation de la méthode utilisée ............................................................................. 90
V.2 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des dendrimères catanioniques analogues
du GalCer............................................................................................................ 91
VI ETUDE DE L’ITERACTIO ET DE L’ICORPORATIO DES DEDRIMERES
CATAIOIQUES VIS-A-VIS D’U MODELE MEMBRAAIRE ...................... 96
VII PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES CATAIOIQUES DEDRITIQUES
AALOGUES DU GALCER........................................................................ 107
VII.1 Etude des propriétés tensioactives ..................................................................... 107
VII.2 Etude de la distribution de taille des agrégats................................................... 111
VII.3 Etude de la morphologie des agrégats............................................................... 113
VIII COCLUSIOS ET PERSPECTIVES......................................................... 120
IX BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................... 123
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
72
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
73
I INTRODUCTION
La mise au point bibliographique sur le VIH comprenant les thérapies actuellement
disponibles pour le combattre nous a montré la nécessité de développer de nouveaux
inhibiteurs de l’entrée virale. Il devra s’agir de composés efficaces et bon marché qui pourront
être utilisés dans les traitements antirétroviraux fortement actifs afin de stopper l’infection par
le VIH-1.
À la lumière des faits présentés ci-dessus et en s’appuyant sur les travaux réalisés
précédemment au laboratoire, les études de cette thèse seront centrées dans un premier temps
sur la synthèse de nouveaux analogues catanioniques du GalCer qui grâce à leur affinité pour
la glycoprotéine virale gp 120 peuvent agir comme des chimères pour le VIH-1. Afin
d’optimiser leur efficacité en tant que leurres, nous nous intéresserons principalement aux
composés comportant plusieurs motifs analogues du GalCer dans le but d’exploiter l’effet de
multiplicité de sites de reconnaissance. Dans cette optique, de nouveaux composés
catanioniques dendritiques comportant 12 sites de reconnaissance seront synthétisés. Au cours
de ces travaux l’accent sera mis sur la stratégie permettant de diminuer la toxicité cellulaire de
ces composés.
Par la suite nous présenterons la capacité de ces composés dendritiques à remplir leur
rôle d’inhibiteurs de l’entrée virale tout en vérifiant leur viabilité cellulaire. La quantification
de l’efficacité antivirale sera réalisée par des mesures de l’activité anti-VIH-1 et de la
cytotoxicité.
Afin de mieux comprendre la relation entre l’activité antivirale, la cytotoxicité et les
caractéristiques structurales de ces produits une corrélation entre les propriétés biologiques et
physico-chimiques sera établie. Cette relation permettra ainsi d’envisager de nouvelles
structures de composés catanioniques analogues du GalCer toujours plus efficaces d’un point
de vue thérapeutique.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
74
II INTERET DES DERIVES CATANIONIQUES DENDRITIQUES ANALOGUES DU GALCER
La partie sucre des glycosphingolipides fonctionne comme récepteur de différents
agents pathogènes et suscite encore de nombreuses recherches car l’interaction sur un seul site
hydrate de carbone – protéine est souvent de faible affinité 1. La nature à su résoudre ce
problème en rassemblant les hydrates de carbone à la surface cellulaire sous forme de
"clusters", ce qui renforce les interactions par un effet multisites [1, 2]. Ainsi, par cet effet de
multiplicité de sites, l’affinité finale est supérieure à la somme des interactions individuelles
hydrate de carbone – protéine.
Ce principe de multiplicité de sites a été adopté et employé dans le domaine
biomédical afin d’obtenir une meilleure inhibition d’un agent pathogène. Le groupe de
Whitesides [3] a souligné l’effet inhibiteur supérieur des inhibiteurs multivalents par rapport
aux inhibiteurs monovalents. Ces derniers empêchent la fixation du virus à la surface
cellulaire par une inhibition compétitive tandis que les composés comportant plusieurs sites
de reconnaissance peuvent exercer leur action inhibitrice par une combinaison de deux
mécanismes : une affinité augmentée par une inhibition compétitive multivalente et/ou par
une inhibition stérique (Figure 1).
Figure 1 : Exemple d’inhibition d’une interaction polyvalente en utilisant des molécules
multivalentes[3]
Inhibiteur multivalent
Inhibition compétitive monovalente
Inhibition compétitive multivalente
Stabilisation stérique
Inhibiteur monovalent
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
75
En s’appuyant sur cette stratégie, le groupe de I. Rico-Lattes en collaboration avec
l’équipe de J.P. Majoral, a présenté un nouveau système analogue du GalCer, un tensioactif
catanionique dendritique comportant une grande densité de sites de reconnaissances à sa
périphérie, afin d’augmenter la probabilité d’interaction entre le virus et le leurre sans pour
autant augmenter la concentration active en produit [4]. Dans cette approche, les dendrimères
ont la particularité de pouvoir présenter à leur surface un grand nombre de fonctions leur
conférant une forte densité locale de sites réactifs [5, 6].
Afin d’évaluer l’influence de la multiplicité des sites actifs et de la structure sur
l’activité anti-VIH, les dendrimères utilisés ont été choisis de différentes générations,
comportant 6 et respectivement 12 fonctions acides en périphérie avec un cœur dendritique
tri- ou hexafonctionnel. Les tensioactifs catanioniques ont été obtenus en employant 6 ou 12
équivalents de N-hexadécylamino-1-déoxylactitol pour 1 équivalent de dendrimère
comportant 6 ou 12 fonctions acides en surface (Figure 2) [7].
Figure 2: Structure des tensioactifs catanioniques dendritiques synthétisés
antérieurement dans les deux laboratoires [7]
Grâce à cette étude, les auteurs ont démontré que l’activité antivirale de ces
tensioactifs catanioniques dendritiques multivalents (RCI50 = 1,44 - 13 µM) est nettement
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
76
supérieure à l’activité additive d’un nombre équivalent de monomères analogues du GalCer
(Tableau 1).
Ces résultats [7] confirment l’effet de multivalence déjà enregistré sur les activités
thérapeutiques de dérivés dendritiques [3, 8].
Composés CI 50 (µµµµM) RCI 50 (µµµµM)
(*CI 50) CC50 (µµµµM) IT
L16
1
50
50
70
1,4
1c-G1
6
2,1
12,6
3,5
1,7
1c-G2
12
1,1
13,2
2,9
2,6
2c-G0
6
0,37
2,22
9,3
25
2c-G1
12
0,12
1,44
3,9
32
(N x CI50 = RCI50, représente la concentration inhibitrice normalisée, exprimée comme la concentration inhibitrice du catanionique dendritique multipliée par le nombre de sites actifs, N)
Tableau 1 : Résultats biologiques des analogues catanioniques dendritiques synthétisés
antérieurement [7]
La structure du cœur dendritique a une influence importante sur la conformation de
l’assemblage catanionique et par conséquent sur l’activité anti-VIH. Les dendrimères
trifonctionnels imposent une structure en forme de "chou-fleur" aux assemblages
catanioniques tandis que les dendrimères hexafonctionnels conduisent à une forme
cylindrique (Figure 3). En conséquence, les composés à cœur hexafonctionnel sont moins
compacts, les sites actifs plus accessibles pour une interaction avec la gp120 virale et donc ces
tensioactifs catanioniques présentent une activité antivirale supérieure (CI50=0,37 et 0,12 µM
pour les composés possédant 6 respectivement 12 sites actifs) à celles des composés à cœur
trifonctionnel (CI50=2,1 et 1,1 µM pour les composés 6 et 12 fonctionnels respectivement) [7].
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
77
Figure 3: Modèles moléculaires obtenus après minimisation dans l’eau des tensioactifs
catanioniques dendritiques à cœur trifonctionnel (1c-G2) et hexafonctionnel (2c-G1)
Il faut aussi mettre l’accent sur le fait que cette étude a mis en évidence une fois de
plus, le rôle essentiel des chaînes alkyles présentes [9-11] dans la structure des analogues du
GalCer lors de l’interaction avec la glycoprotéine gp120 du VIH. Dans ce sens, ces
tensioactifs catanioniques dendritiques présentent des concentrations actives antivirales de
l’ordre du micromolaire, soit mille fois plus actifs que les glycodendrimères dépourvus de
chaînes alkyles présentés dans la littérature par Kensinger [12, 13].
Malgré leur bonne activité antivirale, ces dérivés catanioniques dendritiques analogues
du GalCer présentent une toxicité cellulaire non négligeable, toxicité expliquée par les auteurs
à l’aide de deux hypothèses.
Une première hypothèse lie la toxicité à une incorporation possible des composés dans
la membrane plasmique, incorporation favorisée par la conformation adoptée par ces
associations dendritiques et qui pourrait perturber les fonctions cellulaires. Ainsi, la
cytotoxicité (CC50=3,5 et 2,9 µM des composés comportant 6 et respectivement 12 sites
actifs) des composés à cœur trifonctionnel (1c-G1 et 1c-G2) pourrait être attribuée à leur
conformation en "chou-fleur" (Figure 3). En effet, de par l’arrangement en bouquet des
chaînes alkyles hydrophobes, cette conformation est plus prédisposée à une interaction et une
incorporation dans la membrane cellulaire par rapport aux dendrimères catanioniques à cœur
hexafonctionnel adoptant une forme cylindrique. Effectivement, de par la conformation
cylindrique, les chaînes alkyles de l’association catanionique 2c-G1 minimisent leurs
interactions avec le milieu externe hydrophile en s’associant fortement entre elles par effets
hydrophobes. Ainsi, l’accessibilité de ces chaînes est fortement limitée et l’interaction et la
fusion du dérivé avec la membrane cellulaire est peu favorable.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
78
Cette stratégie d’hydrophobie masquée développée pour les composés géminis [14]
analogues du GalCer est présentée dans la figure 4 et, met en évidence la faible pénétration
dans la membrane cellulaire des composés adoptant une forme cylindrique. Ces composés
gémini qui ont une faible toxicité [14] se comportent donc comme des bolaamphiphiles (ou
bolaformes), interagissant peu avec les membranes cellulaires [15, 16]. En effet, des études
antérieurement réalisées au laboratoire, ont mis en évidence que les bolaformes [17] adoptant
une conformation "étirée" (espaceur inférieur à 12 groupements méthylène) ne perturbent pas
l’organisation membranaire. Ces composés, contrairement aux N-alkylamino-1-déoxylactitols [18], ne manifestent donc pas la capacité d’interagir et de désorganiser les membranes
cellulaires avec l’extraction des protéines membranaires, d’où leur faible toxicité cellulaire.
Figure 4: Représentation de l’influence de la conformation sur l’incorporation dans la
membrane cellulaire [14]
d’amphiphiles géminis
Cependant, malgré leur forme cylindrique, la cytotoxicité des composés 2c-G0 et 2c-
G1 à cœur hexafonctionnel reste assez importante (CC50=9,3 et 3,9 µM respectivement). Il
semble donc que d’autres paramètres soient responsables de la cytotoxicité de ces
dendrimères catanioniques. Une deuxième hypothèse lie la toxicité cellulaire à une
dissociation partielle de l’entité catanionique en raison d’un caractère hydrophobe trop faible
des branches du dendrimère. Ainsi, en raison d’un effet hydrophobe faible existant entre les
éléments constitutifs (dendrimère – aminolactitol) de l’association catanionique dendritique,
l’aminolactitol pourrait être relarguer et provoquer une perturbation des fonctions cellulaires
par un effet détergent sur les membranes cellulaires.
Conformation non - cylindrique
"espaceur replié"
Conformation cylindrique
"espaceur étiré"
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
79
III SYNTHESE DE NOUVEAUX TENSIOACTIFS CATANIONIQUES DENDRITIQUES ANALOGUES DU GALCER
A la suite de ces travaux réalisés par M. Blanzat et C.O. Turrin dans les groupes de I.
Rico-Lattes et de J.P. Majoral, l’étude présente propose la synthèse de nouveaux tensioactifs
catanioniques dendritiques multivalents à cœur hexafonctionnel comportant 12 fonctions
acides en surface car, comme nous l’avons précédemment présenté, ces deux caractéristiques
structurales offrent une meilleure activité anti-VIH à ce type de composés.
L’originalité de ces nouveaux tensioactifs catanioniques est liée à la présence de
chaînes alkyles terminales dans la structure des dendrimères qui auront pour rôle de renforcer
les effets hydrophobes entre le dendrimère et l’aminolactitol. Par cette consolidation de
l’assemblage catanionique dendritique nous espérons une diminution de la toxicité cellulaire
de ces nouveaux composés puisque comme nous l’avons précédemment noté, cette
cytotoxicité pourrait provenir d’un partiel désassemblage du système catanionique des
dendrimères à cœur hexafonctionnel.
III.1 Synthèse des dendrimères catanioniques analogues du GalCer
Ainsi, deux nouveaux dendrimères à cœur hexafonctionnel comportant 12
groupements acides phosphoniques terminaux et 12 chaînes alkyles supplémentaires, de deux
longueurs différentes (C3 et C10) ont été synthétisés au Laboratoire de Chimie de Coordination
dans l’équipe de J.P. Majoral à Toulouse par C.O. Turrin et G. Spataro (Figure 5).
PN
P
NP
N
ON N
Me
P
S
O
NH
O
P
OOH
OH
O
NH
O P
O OH
OH
R
R
O
N
NMe P
S
O
NH
O PO OH
OH
O
NH
O
POHO OH
R
R
O
N
NMeP
S
O
NH
OPOHO
HO
O
NHO
P O
OHHO
R
R
O
N
NMe
PS
O
NHO
P O
OHHO
O
NH
O
P
O
OH
OHR
R
O
NN
Me
PSO
NHO
PO
HOOH
O
NH
O
P
OHO
HOR
R
O
NN
Me
P
S
O
NH
O
P
OHO
HO
O
NH
OPOHO
HO
R
R
DC3 : R = C3H7
DC10: R = C10H21
Figure 5: Structure de nouveaux dendrimères à cœur hexafonctionnel comportant des
chaînes alkyles terminales
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
80
Le projet initial prévoyait l’utilisation, dans une toute première étape, d’un dendrimère
d’une structure similaire à celle présentée ci-dessus, mais dépourvu des chaînes alkyles
terminales. De par son utilisation, nous aurions pu réaliser un passage graduel vers la structure
des dendrimères étudiés dans les travaux courants car, il nous aurait permis d’étudier
l’influence sur les propriétés biologiques et physico-chimiques liée au remplacement des
fonctions acides carboxyliques terminales par des acides phosphoniques. En raison de
difficultés de purification qui ont conduit à l’obtention de ce dendrimère en quantités trop
faibles, son utilisation dans le cadre de l’étude actuelle n’a pas été possible.
La présence du phosphore dans la structure des dendrimères ainsi que dans les
groupements acides terminaux a permis une caractérisation aisée de ces structures et un
meilleur suivi de la pureté des composés synthétisés. De plus, des études précédemment
réalisées dans le groupe de J.P. Majoral ont mis en évidence le rôle clef des fonctions
phosphoniques terminales [19, 20] sur l’activité biologique de ce type de dendrimères, tout
particulièrement sur le processus d’activation des cellules monocytaires humaines.
Afin de déterminer l’hydrophobie adéquate de l’assemblage catanionique, générant
une toxicité cellulaire réduite et une bonne activité anti-VIH, nous avons fait varier la
longueur des chaînes alkyles de l’aminolactitol. Pour cela, nous avons employé deux
aminosucres : le N-hexadécylamino-1-déoxylactitol (L16) et le N-dodécylamino-1-
déoxylactitol (L12). Nous rappellerons que ces deux aminolactitols (Figure 6) possèdent les
impératifs structuraux (le motif D-galactose lié par une liaison β-O-glycosidique et une
longue chaîne hydrophobe) qui permettront la reconnaissance avec la gp120. De plus, les
chaînes alkyles ont également été greffées sur les dendrimères afin de renforcer cette
interaction avec le virus.
Les deux précurseurs cationiques, le N-dodécylamino-1-déoxylactitol (L12) et le N-
hexadécylamino-1-déoxylactitol (L16) ont été synthétisés en partant du lactose non protégé par
une méthode largement utilisée au laboratoire [21, 22]. Ainsi, la réaction spécifique des sucres
réducteurs avec la dodécylamine et l’hexadécylamine respectivement, suivie par la réduction
de l’imine intermédiaire par le borohydrure de sodium conduit à l’obtention du précurseur
cationique.
Les nouveaux tensioactifs catanioniques dendritiques ont été synthétisés par simple
addition dans un mélange eau : propan-1-ol (1: 3, v : v), à température ambiante, de 12
équivalents d’aminolactitol avec 1 équivalent du dendrimère comportant 12 fonctions acides
en surface. L’addition du propan-1-ol a été nécessaire en raison de la solubilité réduite de
l’acide dendritique dans l’eau (Figure 6).
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
81
L’équilibre acido-basique de la réaction est déplacé vers la formation du dendrimère
catanionique grâce aux effets hydrophobes et aux interactions de van der Waals entre les
chaînes alkyles des deux constituants de l’entité catanionique.
PHOOH
O
P
HO
HO O
PHO
HO O
P
OHHO
O
P
OHHO
O
P OH
OH
O P OH
OH
O
P
OH
OHO
POH
OHO
P
HO OH
O
P
HO OH
O
PHO
OH
O
DC3 : C3H7
DC10 : C10H21
=
=
OOH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NHn
+ 12
L12 : n = 8L16 : n = 12
Température ambiante 2 jours
H2O: PrOH = 1: 3
L16 DC3 L12 DC3
L16 DC10 L12 DC10
Figure 6: Synthèse de nouveaux analogues catanioniques dendritiques du GalCer
Les tensioactifs catanioniques ont été obtenus avec des rendements quantitatifs après
élimination des solvants par évaporation et lyophilisation.
Une étude par résonance magnétique nucléaire a ensuite été réalisée afin de confirmer
la structure de ces nouveaux analogues catanioniques du GalCer, notamment afin de vérifier
la formation des paires d’ions.
III.2 Analyse structurale par résonance magnétique nucléaire
Les composés synthétisés lors de ces travaux (les aminolactitols comme les
tensioactifs catanioniques) présentent en RMN dans D2O, des pics larges ce qui rend difficile
l’interprétation des spectres. En effet, ces dérivés tensioactifs s’auto-associent dans le solvant
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
82
deutéré pour former des systèmes organisés (micelles, vésicules etc.), ce qui altère fortement
la qualité des signaux. Cependant, l’utilisation de mélanges de solvants deutérés peut résoudre
ce type de problème.
Ainsi, pour une analyse précise de la structure et de la pureté de nos composés, nous
avons utilisé en RMN des mélanges de solvants deutérés soit, le mélange D2O : CD3OD :
CDCl3 (1: 3 : 1, v : v: v) pour l’aminolactitol L16 et le mélange D2O : nC3D7OD (1:3, v : v)
pour les tensioactifs catanioniques dendritiques. Ces mélanges de solvants permettent de
solubiliser complètement les produits, tout en évitant la formation d’agrégats
supramoléculaires, ce qui se traduit par une meilleure résolution des signaux. Ces mélanges
ont été mentionnés seulement à titre indicatif, la caractérisation complète des produits sera
décrite dans la partie expérimentale.
Dans le cas des dendrimères catanioniques, le 31P s’est révélé être une sonde fiable
permettant d’indiquer la transformation totale de l’acide phosphonique vers sa forme
déprotonée, spécifique à l’assemblage catanionique. A titre d’exemple on observe sur le
dérivé L16DC3 la disparition du signal à 21,89 ppm correspondant à la forme acide de l’atome
de phosphore au profit d’un signal à 17,27 ppm attribué à la forme déprotonée du tensioactif
catanionique (Figure 7).
Figure 7: Comparaison entre les spectres RM du 31
P du dendrimère DC3 et du
composé catanionique L16DC3 (solvant D2O/Propan-1-ol : 1/3, v/v)
H PO3 -
Catanionique L16DC3
H2PO3
Dendrimère DC3
ppm
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
83
Après la synthèse et la caractérisation de ces nouveaux composés dendritiques
catanioniques nous vérifierons si la cohésion des éléments constitutifs au sein de l’assemblage
catanionique en milieux aqueux est réellement obtenue grâce à l’augmentation des effets
hydrophobes. Cette cohésion sera mise en évidence par des études réalisées à l’interface
eau/air.
IV ETUDE DE L’ASSOCIATION DES DENDRIMERES
CATANIONIQUES A L’INTERFACE EAU / AIR
En raison de leur nature amphiphile, les composés catanioniques ont la propriété de
s’adsorber à l’interface eau/air de manière à orienter leur chaînes hydrophobes vers l’air et
leurs têtes hydrophiles vers l’eau. Ils peuvent former une monocouche de molécules à la
surface dont l’analyse pourra donner d’importantes informations concernant les interactions
moléculaires qui existent au sein de ces associations.
Dans cette optique, nous nous sommes intéressés à l’étude du comportement de nos
produits catanioniques à l’interface eau/air afin de confirmer que ces composés, en raison des
interactions attractives entre les têtes polaires de charges opposées, ainsi que des effets
hydrophobes entre les chaînes grasses, se comportent comme des entités à part entière. En
fait, plutôt comme un composé zwitterionique, et non comme un simple mélange de deux
produits distincts : cationique et anionique, pouvant donner lieu à une ségrégation. Pour cette
étude, nous avons analysé les isothermes de compression de ces dérivés catanioniques à l’aide
de la technique de la balance de Langmuir.
Avant de présenter les résultats de nos expériences et leur interprétation nous décrirons
brièvement le principe de la balance de Langmuir.
IV.1 La technique de la balance de Langmuir
Cette technique permet d’étudier les caractéristiques des films formés à l’interface
eau/air par des amphiphiles insolubles ou peu solubles dans l’eau. La monocouche se forme
en déposant à la surface de l’eau (dénommée sous -phase) une faible quantité d’une solution
d’amphiphile à étudier dans un solvant volatil (chloroforme, méthanol ou éther).
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
84
L’évaporation du solvant disperse les molécules amphiphiles à l’interface, sur toute l’aire
disponible, formant ainsi une monocouche qui pourra par la suite être comprimée par le
déplacement, à la surface de l’eau, d’une barrière mobile en téflon. Tout en diminuant l’aire
de l’interface grâce à la barrière, on mesure la variation de la tension de surface (π, en mN/m)
provoqué par la force exercée par le film des molécules sur le capteur de pression - une lame
de Wilhelmy (en platine ou en papier) placée à l’interface eau/air (Figure 8).
Figure 8: Représentation schématique de la balance de Langmuir
Ainsi, en comprimant à vitesse et température constantes la monocouche amphiphile
on mesure la variation de la tension de surface en fonction de l’aire par molécule (en Å2) afin
de tracer une isotherme de compression ; celle-ci a une allure caractéristique pour chaque
système amphiphile / sous – phase et est dépendante de la température.
Le profil classique d’une isotherme de compression se caractérise par l’existence de
différentes zones (Figure 9) :
Figure 9: Isotherme de compression typique d’un amphiphile insoluble ou peu soluble
dans l’eau
- pour de très grandes aires (hors compression), les molécules se trouvent en phase
gaz, car elles sont très éloignées les unes des autres et n’interagissent pas entre elles. Dans les
Gaz + Liquide
Liquide expansé
Liquide condensé
Solide
Liquide expansé / condensé
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
85
conditions expérimentales habituelles, dès que la solution est épandue à l’interface eau/air, le
film est dans un état plus dense qu’en phase gazeuse pure, car il y a déjà une coexistence entre
la phase gaz et la phase liquide.
- la phase liquide se caractérise par un rapprochement des molécules, le film devient
plus organisé et les chaînes aliphatiques interagissent par le biais des forces de van der Waals.
L’existence d’un plateau dans le profil de l’isotherme traduit la coexistence de deux phases
liquides : expansée et condensée.
- une phase solide peut aussi se traduire par un changement de pente. Dans cette phase
les molécules sont encore plus compactées et organisées. Les contraintes appliquées au film
étant de plus en plus importantes, la monocouche reste stable jusqu’à une certaine tension de
surface critique.
- en augmentant encore la compaction et la pression de surface, la monocouche se
brise pour former de nouvelles phases (multicouches, agglomérats tridimensionnels ou
dissolution des molécules dans la sous -phase), c’est le "collapse". La pression au "collapse",
qui est la plus grande pression de compression du film de Langmuir, est une valeur importante
caractérisant la stabilité de la monocouche.
IV.2 Etude des monocouches d’amphiphiles catanioniques dendritiques par la technique de la balance de Langmuir
Comme nous l’avons précédemment indiqué, la technique de la balance de Langmuir
n’est applicable qu’aux amphiphiles insolubles ou peu solubles dans l’eau car eux seuls sont
capables de former un film compressible à l’interface eau / air.
Cette condition ne peut être remplie par les aminolactitols constitutifs car ces
composés possèdent une trop grande hydrosolubilité. La famille des catanioniques
dendritiques qui se caractérise par une hydrophobie beaucoup plus importante et donc une
solubilité réduite dans l’eau a pu être étudiée par cette technique.
Les monocouches ont été préparées par injection d’une solution concentrée de
catanioniques dendritiques dans la sous – phase aqueuse de la cuve de Langmuir. Après
adsorption des molécules à l’interface et stabilisation de la valeur de la tension de surface, les
films de tensioactifs catanioniques ont été comprimés à une température de 20°C et à une
vitesse constante. Ce protocole d’obtention des films à l’interface eau/air, ainsi que la solution
aqueuse utilisée (0,15 M NaCl) ont été choisis afin de mieux mimer les conditions
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
86
expérimentales utilisées pour les tests biologiques de nos produits. Ces précautions sont
nécessaires car une corrélation entre les propriétés physico-chimiques et biologiques sera
ensuite réalisée.
Une première observation intéressante est le fait que les monocouches formées à
l’interface sont des films stables et compressibles. Les isothermes de compressions obtenues
pour ces quatre tensioactifs catanioniques dendritiques ainsi que le sel de sodium du
dendrimère DC3 (12Na+) sont présentées figure 10.
0 2 4 6 8 100
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65 DC
3Na 1,8*10
-8M
L12DC
3 1,8*10
-8M
L16DC
3 1,8*10
-8M
L12DC
10 1,8*10
-8M
L16DC
10 1,8*10
-8M
Aire par molécule, nm2
Press
ion de surface
mN/m
Figure 10: Isotherme de compression des tensioactifs catanioniques dendritiques et du
sel de sodium du dendrimère DC3 à 20°C
Composé Pression de collapse
πC (m/m)
Aire minimale*
(nm2)
DC3 (12Na+) 14 4,33
L12DC3 18 8,00
L16DC3 40 7,80
L12DC10 46 4,06
L16DC10 54 7,93
* valeurs obtenues en considérant que tout le produit est adsorbé à l’interface
Tableau 2: Pressions au collapse et aires minimales des composés dendritiques
A0 A0 A0 A0 A0
πC
πC
πC
πC
πC
DC3Na 1,8*10
-8M
L12DC
3 1,8*10
-8M
L16DC
3 1,8*10
-8M
L12DC
10 1,8*10
-8M
L16DC
10 1,8*10
-8M
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
87
Comme nous pouvons l’observer sur le graphique (Figure 10), les profils de
compression des deux tensioactifs catanioniques L16DC3 et L12DC3 diffèrent considérablement
de celui du dendrimère DC3 (12Na+), autant par les valeurs des aires minimales par molécule
que par la pression au collapse de la monocouche. La valeur élevée de l’aire par molécule de
ces composés montre clairement la coexistence à l’interface eau / aire du dendrimère DC3 et
des aminolactitols respectivement L16 et L12 grâce aux interactions électrostatiques entre les
têtes polaires. Malgré leur forte hydrosolubilité, ces derniers restent à l’interface grâce aux
effets hydrophobes et aux interactions de van der Waals établis entre leurs chaînes alkyles et
celles du dendrimère DC3. On observe que ces interactions conditionnent la stabilité des
films, car le composé moins hydrophobe L12DC3 se caractérise par une plus faible valeur de
pression de collapse (18mN/m) que celle du catanionique plus hydrophobe L16DC3
(40mN/m), mais au contraire, plus importante que celle du dendrimère DC3 seul (14mN/m)
(Tableau 2).
Il faut également souligner que la ségrégation de ces associations catanioniques dans
les composés constitutifs : anionique et respectivement cationique ne se produit pas, car dans
le profil de compression des deux associations catanioniques dendritiques en C3 nous ne
retrouvons pas l’allure correspondant au dendrimère DC3 pur.
Ces considérations nous permettent d’affirmer que les composés dendritiques L16DC3
et L12DC3 se comportent comme des associations catanioniques, des entités bien distinctes,
possédant des propriétés différentes de celles des constituants individuels. Dans ce cas donc,
la cohésion de l’édifice catanionique est bien maintenue même à de très faibles concentrations
(1,8x10-8 M).
Le sel de sodium du dendrimère DC10 n’a pas permis son utilisation dans les mêmes
conditions en raison de son hydrophobie beaucoup plus importante conduisant à une très
faible solubilité dans l’eau. Néanmoins, les expériences réalisées avec les catanioniques
L16DC10 et L12DC10 ont révélé des courbes de compression bien différentes, avec des valeurs
distinctes pour les aires par molécule ainsi que pour les pressions au collapse (Figure 10 et
Tableau 2).
L’isotherme de compression du tensioactif catanionique L12DC10 est remarquable, car
même si la valeur de la pression au collapse est en accord avec l’hydrophobie du composé,
comme pour tous les autres catanioniques dendritiques, l’aire par molécule pour ce dérivé
(4,06nm2) est plus petite par rapport à celle de son analogue L16DC10 (7,93 nm2). Ce
comportement peut être expliqué de deux façons.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
88
Une première hypothèse implique l’existence d’une interaction beaucoup plus
importante[23] entre les éléments constitutifs de l’association catanionique L12DC10 grâce à un
meilleur recouvrement des deux chaînes alkyles [24] de longueurs similaires en C10 et en C12
respectivement, comparativement aux autres tensioactifs catanioniques comportant des
combinaisons de longueurs de chaînes plus dissemblables: C3 – C16, C3 – C12 ou C10 – C16.
Cette interaction plus importante pourrait engendrer donc une plus forte compaction de
l’ensemble catanionique.
Une deuxième hypothèse pourrait être l’adsorption à l’interface eau/air de cette
association catanionique L12DC10 en conformation cylindrique. Si nous supposons que les
trois autres tensioactifs catanioniques s’adsorbent à l’interface en adoptant une conformation
en chou-fleur, l’aire par molécule du composé L12DC10 serait dans ce cas-là diminuée de
moitié. On peut effectivement constater que l’aire par molécule de ce tensioactif (4,06nm2)
correspond à la moitié de l’aire moléculaire des autres entités catanioniques (~ 8 nm2)
(Tableau 2).
L’absence de ségrégation des associations catanioniques L16DC10 et L12DC10 dans les
composés constitutifs est confirmée par l’absence de similarité entre les deux profils de
compression. Une ségrégation aurait provoqué l’apparition dans les deux cas, d’un profil
caractéristique du dendrimère CD10. De plus, l’aire par molécule du composé L16DC10
(7,93nm2) est voisine de celles des tensioactifs catanioniques comportant le squelette
dendritique en DC3 (7,80 et 8,00 nm2 pour L16DC3 et L12DC3
respectivement) qui, comme
nous l’avons démontré, eux ne dissocient pas. Cette similarité des valeurs de l’aire par
molécule de ces composés n’est pas surprenante si l’on considère que les trois tensioactifs
catanioniques possèdent des têtes hydrophiles identiques.
Suivant le même raisonnement que celui appliqué aux catanioniques comportant le
dendrimère DC3, nous pouvons affirmer que grâce aux interactions électrostatiques entre les
têtes polaires ainsi qu’aux effets hydrophobes et aux interactions de van der Waals établis
entre les chaînes alkyles, les associations L16DC3 et L16DC10 se comportent comme des entités
catanioniques bien distinctes.
À partir de l’analyse de l’ensemble des profils de compressions nous pouvons
remarquer que la valeur de la pression au collapse est corrélée aux contributions hydrophobes
et à la cohésion de la monocouche (Figure 10 et Tableau 2).
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
89
Ayant démontré la bonne cohésion de nos composés catanioniques dendritiques, nous
nous intéresserons par la suite aux propriétés biologiques de ces dérivés.
V PROPRIETES BIOLOGIQUES DE NOUVEAUX CATANIONIQUES DENDRITIQUES ANALOGUES DU GALCER
V.1 Caractéristiques biologiques
Nous avons eu la possibilité de quantifier les propriétés biologiques de nos composés
grâce aux tests antiviraux réalisés in vitro par le Dr. Anne-Marie Aubertin et ses
collaborateurs à l’Institut de Virologie INSERM à Strasbourg.
Avant de présenter les résultats de notre étude une courte description des paramètres
biologiques ainsi que des lignées cellulaires utilisées sera faite.
V.1.1 Paramètres biologiques
Nous redéfinirons les paramètres biologiques déjà présentés dans le premier chapitre
bibliographique, paramètres qui seront utilisés dans cette étude afin de caractériser l’activité
antivirale in vitro de nos associations catanioniques :
- la concentration inhibitrice à 50% (CI50) est définie comme la concentration
minimale en composé nécessaire pour inhiber de 50% l’activité d’un marqueur du virus (ex.
la transcriptase inverse). Plus la valeur de la CI50 est faible, plus le produit est actif.
- la concentration cytotoxique à 50% (CC50) est définie comme la concentration létale
en composé pour 50% des cellules non infectées par le virus. Plus la valeur de la CC50 est
élevée, moins le produit est toxique.
- l’indice thérapeutique (IT) est défini comme le rapport entre la toxicité et l’activité
inhibitrice (CC50 / CI50). Plus la valeur de l’IT est élevée, plus le produit est efficace.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
90
V.1.2 Lignées cellulaires et souches virales
La souche de virus VIH utilisée dans cette étude est une souche lymphotropique de
référence VIH-1 Lai (III B). Ce virus est produit en infectant des cellules de la lignée humaine
CEM-SS.
Des cellules lymphocytaires T, CEM-SS (susceptibles de former des syncitia –
cellules géantes multinucléées) ont été utilisées afin de réaliser les tests biologiques in vitro.
Ces lignées de cellules humaines d’origine myéloïde expriment à leur surface le récepteur
CD4 et sont permissives au VIH.
L’utilisation des cellules comportant des récepteurs CD4 à leur surface peut sembler
contradictoire à première vue car les composés synthétisés sont des analogues du GalCer qui
ne sont pas actifs sur ces récepteurs mais sur le virus. Toutefois, comme nous l’avons présenté
dans la partie bibliographique, dû au fait que les analogues du GalCer interagissent avec la
boucle V3 de la glycoprotéine virale gp 120, ils inhibent l’entrée du VIH-1 dans les cellules
CD4+. Cela s’explique par l’impossibilité d’interaction entre la boucle V3, bloquée par ces
analogues du GalCer et le récepteur CD4 ou les corécepteurs (CXCR4 ou CCR5), étapes
essentielles sans lesquelles la fusion du virus avec les cellules CD4+ est impossible. Ces
composés analogues du GalCer ont donc la capacité, par un effet de concurrence, d’empêcher
aussi bien l’entrée du VIH-1 dans les cellules CD4+ que dans les cellules GalCer+.
Les cellules infectées (cellules CEM-SS) par le virus de l’immunodéficience humaine
présentent un effet cytopathogène (ECP) caractérisé par la formation de cellules multinucléées
géantes.
V.1.3 Présentation de la méthode utilisée
Afin d’évaluer l’effet antiviral de nos composés, les cellules CEM-SS ont été infectées
par le virus VIH-1 Lai et mises en culture après l’ajout dans le milieu de différentes doses de
composés à tester. Cinq jours après l’infection, le dosage de la transcriptase inverse dans le
surnageant de culture permet d’évaluer la quantité de virus relargué dans le milieu et de
déterminer la concentration inhibitrice (CI50), calculée par rapport à des cellules infectées non
traitées, maintenues dans les mêmes conditions de culture.
L’effet toxique des composés est mesuré par un test colorimétrique MTT sur les
mêmes lignées de cellules (CEM-SS), cette fois-ci non infectées. La concentration
cytotoxique (CC50) est alors déterminée par rapport à des cellules non infectées, non traitées.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
91
L’indice thérapeutique (IT) qui est le rapport de la CC50 sur la CI50, donne une
information importante sur l’efficacité du produit utilisé dans un système cellulaire donné.
V.2 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des dendrimères catanioniques analogues du GalCer
Nous rappellerons que l’intérêt pour cette classe de tensioactifs catanioniques
analogues du GalCer provient de l’effet de multiplicité de sites qui permet d’augmenter
l’affinité entre le leurre et le virus comparativement à la somme des interactions individuelles.
La synthèse de ces nouveaux composés a été réalisée dans le but de diminuer la toxicité
cellulaire des dérivés précédemment synthétisés appartenant à la même classe, toxicité
supposée être due à une partielle dissociation de l’assemblage catanionique. Nous avons donc
adopté, comme stratégie de consolidation de l’association catanionique, le renforcement des
effets hydrophobes entre les chaînes alkyles du dendrimère et de l’aminolactitol.
Les tests anti-VIH des dendrimères catanioniques analogues du GalCer réalisés in
vitro sur cellules CEM-SS ont montré que ces composés présentent de bonnes activités
antivirales caractérisées par des concentrations inhibitrices qui varient entre 0,5 et 4,4 µM
(Tableau 3). Nous pouvons observer que toutes ces associations dendritiques sont plus actives
in vitro que les aminolactitols constitutifs possédant le site de reconnaissance du virus.
Comme nous l’avons déjà présenté, cette différence de concentrations actives peut être liée à
la multiplicité des sites actifs au niveau de l’assemblage catanionique.
Malheureusement, ces bons résultats sont modérés par une cytotoxicité non-
négligeable des produits (valeurs de CC50 comprises dans une gamme de 5,3 à plus de 10
µM), plus importante que celles des aminolactitols de départ (75 et 130 pour L16 et L12
respectivement). De ce fait, ces composés sont peu sélectifs (IT inférieurs ou égal à 10).
Une analyse plus détaillée sera réalisée afin de mieux interpréter ces résultats.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
92
Composés CI 50 (µµµµM) RCI 50 (µµµµM)
(*CI 50) CC50 (µµµµM) IT
L16 7,1 ± 1,6 7,1 75 ± 8 10,5
L16DC3 0,5 ± 0,2 6 5,3 ± 1,9 10,6
L16DC10 1,7 ± 0,1 20,4 7,2 ± 0,5 4,2
L12 55,5 ± 23 55,5 130 2,3
L12DC3 2,4 ± 1 28,8 > 10 > 3,7
L12DC10 4,4 ± 0,8 52,8 8 ± 0,2 1,8
2c-G1 0,12 1,44 3,9 32
1c-G2
1,1 13,2 2,9 2,6
N = nombre de sites actifs=12
Tableau 3 : Résultats biologiques des analogues catanioniques multivalents du GalCer
Une comparaison peut également être réalisée entre les activités antivirales de ces
nouveaux composés et celle du composé catanionique dendritique 2c-G1 (ayant les mêmes
caractéristiques structurales: cœur hexafonctionnel, 12 fonctions acides, aminolactitol L16)
précédemment synthétisé et décrit dans la partie introductive du chapitre. Ainsi, nous pouvons
remarquer que le composé L16DC3 présente une activité anti-VIH (CI50=0,5 µM) proche de
l’activité inhibitrice du 2c-G1 (CI50=0,12 µM), tandis que dans le cas du composé L16DC10
(CI50=1,7 µM) nous enregistrons une diminution d’un facteur d’environ 10 de l’efficacité
antivirale. Cela nous indique que le greffage sur le squelette dendritique d’une chaîne alkyle
courte en C3 ne modifie que faiblement l’activité antivirale de cette classe de produits, tandis
que l’ajout d’une chaîne alkyle plus longue, en C10 engendre une diminution significative de
l’activité anti-VIH.
Cette observation est également valable dans le cas des composés catanioniques
dendritiques comportant l’aminolactitol L12. Nous pouvons remarquer (Tableau 3) une perte
d’activité pour le composé L12DC10 comportant une chaîne alkyle en C10 (CI50=4,4 µM), par
rapport à celle du composé L12DC3 (CI50=2,4 µM) qui comporte une chaîne en C3. La perte
d’activité de cette deuxième famille de catanioniques dendritiques par rapport à celle du
composé 2c-G1 (CI50=0,12 µM) ainsi que celles des composés L16DC10 (CI50=1,7 µM) et
L16DC3 (CI50=0,5 µM) peut être attribuée à l’hydrophobie moins importante de l’aminolactitol
L12 comparée à celle du L16. Ceci est confirmé par l’activité anti-VIH réduite du L12
(CI50=55,5 µM) comparée à celle du L16 (CI50=7,1 µM). Ce résultat est en accord avec les
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
93
travaux précédents qui ont montré qu’une chaîne alkyle en C12 est insuffisante pour une bonne
activité anti-VIH. Toutefois, dans notre cas, nous avions envisagé faire face à cet
inconvénient par l’effet de multiplicité de sites et l’effet coopératif hydrophobe des chaînes
alkyles greffées sur le squelette dendritique.
Une analyse plus précise permet de quantifier l’activité antivirale de chaque site actif
du dendrimère catanionique. Ainsi, dans le cas du composé L16DC3 (CI50=0,5µM) l’activité
anti-VIH rapportée à chaque site actif vaut RCI50=0,5x12=6 µM, valeur qui est comparable à
la concentration inhibitrice de l’aminolactitol constituant L16, RCI50=7µM. Cette situation se
retrouve dans le cas du composé L12DC10, dont la RCI50 est comparable à celle du L12.
L’association catanionique la plus hydrophobe, L16DC10 montre même que l’activité de
chaque site actif est diminuée d’environ un facteur 3 (RCI50=20,4µM) par rapport à la CI50 du
L16. Seule l’association L12DC3, la moins hydrophobe de cette nouvelle famille de composés,
présente un effet de multiplicité de sites exprimé par une augmentation de l’activité antivirale
de chaque site actif (RCI50=28,8µM) d’un facteur 2 par rapport à l’activité antivirale de
l’aminolactitol constitutif L12 (RCI50=55,5µM). Ce résultat modeste mais positif souligne
encore une fois l’importance de l’hydrophobie de ces composés sur les activités biologiques.
Ces résultats indiquent que la consolidation de l’assemblage catanionique par
augmentation des effets hydrophobes doit se faire d’une manière contrôlée car une trop
grande hydrophobie induite par l’utilisation du dendrimère DC10 peut conduire à une
diminution d’activité antivirale par site actif et à la perte d’un réel effet de multivalence. Cela
pourrait s’expliquer par un manque de disponibilité de la chaîne alkyle greffée au dendrimère
pour consolider l’interaction avec la gp120 virale.
À ce stade de l’étude nous pouvons souligner l’équilibre subtil qui existe entre la
nécessité d’une hydrophobie importante, essentielle à la consolidation de l’association
catanionique, et le besoin d’une hydrophobie modérée afin d’éviter le blocage au sein de
l’entité catanionique de la chaîne alkyle greffée au dendrimère, engendrant l’impossibilité de
celle-ci d’interagir avec la gp120.
Ainsi, l’analyse structure – activité anti-VIH de cette nouvelle famille de tensioactifs
catanioniques dendritiques nous permet d’identifier le squelette dendritique ayant une chaîne
alkyle en C3 ainsi que l’aminolactitol le plus hydrophobe L16 comme les éléments clefs qui
permettent l’obtention de meilleurs activités antivirales, comparables à celles obtenus
antérieurement au laboratoire.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
94
Concernant la cytotoxicité de ces dendrimères catanioniques (CC50 de 5,3 à plus de 10
µM) nous pouvons remarquer (Tableau 3) que toutes ces associations dendritiques présentent
une toxicité comparable à celle du dérivé catanionique dendritique 2c-G1 (CC50= 3,9 µM),
précédemment synthétisé au laboratoire. Rappelons que la toxicité de ce composé 2c-G1 était
supposée liée à un désassemblage partiel de l’association catanionique. En utilisant la
technique de la balance de Langmuir nous avons démontré que même à des concentrations
bien inférieures (10-8M) aux CC50 (de 5,3 à plus de 10µM), les nouveaux tensioactifs
catanioniques restent associés à l’interface dans des conditions de force ionique similaire à
celle du milieu biologique. Par conséquent, la cytotoxicité de ces produits ne semble pas
provenir d’une dissociation de l’édifice dendritique.
Tous ces éléments présentés ci-dessus auxquels s’ajoute la diminution de l’activité
antivirale par rapport au composé 2c-G1 (Tableau 3) des produits possédant une hydrophobie
plus importante (composés comportant le dendrimère DC10) nous indiquent que probablement
la conformation adoptée par ces associations catanioniques peut être tenue pour responsable
de la baisse d’activité et de la cytotoxicité de ces nouveaux catanioniques dendritiques. Nous
rappellerons qu’une conformation cylindrique de l’assemblage catanionique, telle que celle
adoptée par le composé 2c-G1 peut favoriser une plus grande accessibilité du virus aux sites
actifs par rapport à une conformation en "chou-fleur" (Figure 3). De plus, en raison de son
hydrophobie masquée, cette forme cylindrique devrait être moins toxique que celle en "chou-
fleur".
En tenant compte de ces données, l’activité antivirale réduite ainsi que la toxicité
cellulaire des composés L16DC10 et L12DC10 pourraient être liées à la conformation en "chou-
fleur" adoptée par ces analogues catanioniques dendritiques du GalCer. De plus, leurs
activités antivirales et leurs toxicités cellulaires (Tableau 3) sont plus proches des valeurs
enregistrées pour le composé catanionique dendritique à cœur trifonctionnel 1c-G2 (CI50= 1,1
µM et CC50= 2,9 µM) qui adopte ce type de conformation.
En tenant compte de la structure chimique et des paramètres biologiques très similaires
des composés L16DC3 et 2c-G1, nous serions tentés de croire que l’association catanionique
L16DC3 adopte une conformation cylindrique comme le composé 2c-G1. Pourtant, cela
n’expliquerait pas la toxicité de ce produit qui est comparable à celles des autres composés de
cette nouvelle famille de catanioniques dendritiques.
Nous rappelons que les composés catanioniques dendritiques adoptant une
conformation " en chou-fleur", de par l’arrangement en bouquet des chaînes alkyles
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
95
hydrophobes, sont plus prédisposés à une interaction et une incorporation dans la membrane
cellulaire par rapport aux dendrimères préférant une forme cylindrique. L’interaction et
l’incorporation de ces tensioactifs catanioniques dendritiques dans les membranes plasmiques,
engendrent par la suite une perturbation des fonctions cellulaires qui pourrait être à l’origine
de leur toxicité cellulaire. Aussi, afin de mieux identifier les facteurs à l’origine de la
cytotoxicité de nos composés, nous étudierons leur influence sur des monocouches de
phospholipides, largement utilisées dans le domaine biophysique comme modèles
bidimensionnels de membranes cellulaires.
Les expériences sur les modèles membranaires ont été réalisées en collaboration avec
le Dr. Gerald Brezesinski et le Prof. Dr. Helmut Möhwald de l’Institut Max Planck, Potsdam,
Allemagne.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
96
VI ETUDE DE L’INTERACTION ET DE L’INCORPORATION DES DENDRIMERES CATANIONIQUES VIS-A-VIS D’UN MODELE
MEMBRANAIRE
Les monocouches de phospholipides étalées à l'interface air/liquide sont fréquemment
utilisées comme modèles de membranes cellulaires [15, 25]. Pour notre étude, des monocouches
de DPPC (DiPalmitoyl-Phosphatidyl Choline), un phospholipide classiquement utilisé comme
modèle membranaire, ont été préparées à la surface d’une solution saline (0,15M NaCl) et à
température constante de 20°C (température choisie afin de limiter le processus d’évaporation
de l’eau de la sous -phase). Afin d’étudier les interactions entre la monocouche de
phospholipides et nos dérivés catanioniques injectés dans la sous -phase, nous avons analysé
les isothermes de compression de ces films mixtes à l’aide de la technique de la balance de
Langmuir.
Les profils des courbes des isothermes de compression nous donneront des
informations sur la possible incorporation et l’influence de nos composés sur des membranes
cellulaires. Ainsi, en réalisant ces études sur des modèles membranaires nous espérons trouver
par analogie les réponses concernant la toxicité cellulaire de nos composés.
Les isothermes de compression obtenues pour la DPPC pure et pour chaque mélange
de DPPC – tensioactif catanionique sont présentés en figure 11.
Nous pouvons remarquer qu’à de très faibles concentrations en tensioactifs (1–3x10-9
M) et pour des pressions de surface inférieures à 15mN/m, les profils des isothermes de
compression des mélanges étudiés présentent pratiquement la même allure que la DPPC pure,
mais avec des aires moléculaires plus importantes (∆Å2 allant de 10 à 20). Cette différence
s’explique par l’incorporation du tensioactif au sein de la monocouche de DPPC, ce qui
produit une augmentation de la pression de surface et l’apparition précoce (à des aires par
molécules plus importantes) des transitions de phases. Ainsi, nous remarquons la transition de
la phase gaz vers une phase liquide expansé suivie par la coexistence des phases liquide
expansé - liquide condensé traduite par la présence vers 5 mN/m du même palier
caractéristiques de la DPPC pure. A des pressions de surface supérieures à 15 mN/m le profil
de compression caractéristique d’une phase liquide condensé de la DPPC est perturbé par
l’apparition d’un plateau à une valeur caractéristique pour chaque composé dendritique. On
retrouve ce plateau à la même valeur de pression de surface dans l’isotherme de compression
des catanioniques purs (Figure 11). Il est intéressant d’observer qu’à la suite du palier, donc
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
97
pour des concentrations très faibles en tensioactif, le profil de l’isotherme de compression
retrouve une allure identique à celle de la DPPC pure (à la même aire par molécule). Le fait
de retrouver le profil de la DPPC pure à la suite du palier traduit l’expulsion des molécules de
tensioactifs de la monocouche et leur solubilisation dans la sous -phase.
40 50 60 70 80 90 100 1100
10
20
30
40
50
60
Aire par molécule, Å2
DPPC + L16DC
3 DPPC
DPPC + L16DC
3 1,3*10
-9M
DPPC + L16DC
3 6,6*10-9M
DPPC + L16DC
3 1,33*10
-8M
Pression de surface
mN/m
40 50 60 70 80 90 100 110
0
10
20
30
40
50
60
70
Aire par molécule, Å2
DPPC
DPPC + L16DC
10 6,6*10
-9M
DPPC + L16DC
10 9*10
-9M
DPPC + L16DC
10 1.33*10
-8M
DPPC + L16DC
10 1.8*10
-8M
DPPC + L16DC
10
Press
ion de surface
mN/m
30 40 50 60 70 80 90 100 110
0
10
20
30
40
50
60
Aire par molécule, Å2
DPPC
DPPC+L12DC
3 1,33*10-9M
DPPC+L12DC
3 6,6*10-9M
DPPC+L12DC
3 1,33*10
-8M
DPPC + L12DC
3
Press
ion de surface
mN/m
30 40 50 60 70 80 90 100 110
0
10
20
30
40
50
60
Aire par molécule, Å2
DPPC
DPPC + L12DC
10 3*10-9M
DPPC + L12DC
10 6,6*10-9M
DPPC + L12DC
10 1,33*10-8M
DPPC + L12DC
10 3,3*10-8M
DPPC + L12DC
10
Press
ion de surface
mN/m
0 200 400 600 800 10000
10
20
30
40
50
60
Aire par molécule, Å2
L12DC
3 1,8*10
-8M
L16DC
3 1,8*10
-8M
L12DC
10 1,8*10
-8M
L16DC
10 1,8*10
-8M
Press
ion de surface
mN/m
Figure 11: Isothermes de compression des tensioactifs catanioniques dendritiques en
présence ou en absence de DPPC à 20°C (0,15M aCl) (A) L16DC3 - DPPC; B) L16DC10 - DPPC ; C) L12DC3 - DPPC; D) L12DC10
- DPPC; E) tensioactifs catanioniques dendritiques sans DPPC)
(*concentrations finales en composé catanionique dendritique dans la sous -phase; conc. en DPPC 1,66*10-7M)
A) *
* *
*
B)
C) D)
E)
*
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
98
En augmentant la concentration des composés catanioniques dans la sous -phase
(Figure 11 - concentrations supérieures à 6,6x10-9M) nous pouvons observer que l’interaction
DPPC – tensioactif est amplifiée car juste après l’adsorption du catanionique, l’allure de
l’isotherme révèle directement soit l’existence d’un plateau vers 5 mN/m indiquant la
coexistence des phases liquide expansé - liquide condensé soit l’existence d’une phase liquide
condensé. En augmentant la pression par compression nous pouvons remarquer le même
comportement que celui décrit précédemment, à savoir la présence d’un plateau à une valeur
de pression de surface caractéristique à chaque tensioactif catanionique dendritique suivi du
profil de compression de la DPPC pure, mais à des aires par molécules légèrement
supérieures. Ceci indique qu’à des concentrations plus importantes en dérivé dendritique
celui-ci n’est plus totalement expulsé de la monocouche de phospholipide même à de très
hautes pressions de compression. Nous avons donc une persistance des composés dans le film
de DPPC, qui s’accroît avec l’augmentation de la concentration en produits.
Le tensioactif L12DC10 à un comportement singulier (Figure 11D), car même à des
concentrations plus importantes, son isotherme de compression présente toujours un plateau
caractéristique de la coexistence des phases liquide expansé - liquide condensé à 5 mN/m ce
qui indique une adsorption moins importante à l’interface. Ce comportement est en accord
avec l’isotherme de compression du produit pur, présentée antérieurement (reprise en Figure
11E). De plus, c’est le seul composé à être complètement expulsé de la monocouche de
DPPC, même à des concentrations plus importantes.
Un autre aspect révélé par ces isothermes de compression est la présence d’un plateau
à une valeur bien spécifique pour chaque dérivé catanionique dendritique quelle que soit la
concentration, en présence ou en absence de DPPC.
Une comparaison des isothermes de compression de ces composés dendritiques à la
même concentration, en absence et en présence de DPPC est présentée - figure 12. Comme
nous l’avons déjà observé, la pression au collapse est corrélée aux contributions hydrophobes.
Cela s’explique par les forces de cohésion (effets hydrophobes et interactions de van der
Waals) qui existent entre les chaînes alkyles des molécules compactées au niveau de la
monocouche. Cette force de cohésion impose une barrière de désorption des molécules
tensioactives d’autant plus élevée que les composés sont hydrophobes (Tableau 4). Ainsi le
composé le moins hydrophobe, le L12DC3 présente une pression d’expulsion de la
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
99
monocouche aux alentours de 20mN/m, tandis que le dérivé le plus hydrophobe, le L16DC10,
est resolubilisé dans la sous -phase à une pression beaucoup plus importante de 52 mN/m.
30 40 50 60 70 80 90 100 1100
10
20
30
40
50
60
Aire par molécule, Å2
DPPC
DPPC + L12DC
3 1,33*10-8M
DPPC + L16DC
3 1,33*10-8M
DPPC + L12DC
10 1,33*10-8M
DPPC + L16DC
10 1,33*10-8M
Press
ion de surface
mN/m
0 200 400 600 800 1000
0
10
20
30
40
50
60
Aire par molécule, Å2
L12DC
3 1,8*10
-8M
L16DC
3 1,8*10
-8M
L12DC
10 1,8*10
-8M
L16DC
10 1,8*10
-8M
Press
ion de surface
mN/m
Figure 12: Comparaison entre les isothermes de compression des tensioactifs
catanioniques dendritiques en présence (A) ou en absence (B) de DPPC
à 20°C (0,15M aCl) (*concentrations finales en composé catanionique dendritique dans la sous-phase; rap. molaire LXDCy : DPPC =
1 : 12)
Composé Pression de collapse (avec DPPC)
π (m/m)
Pression de collapse (sans DPPC)
π (m/m)
L12DC3 20 18
L16DC3 40 40
L12DC10 45 46
L16DC10 52 54
Tableau 4 : Valeurs des pressions de collapse des tensioactifs catanioniques dendritiques
en présence ou en absence de DPPC
Tous ces résultats indiquent qu’il y a une forte interaction entre les tensioactifs
dendrimères catanioniques et le modèle membranaire et que l’incorporation et la persistance
dans la monocouche augmentent avec l’hydrophobie des composés. Les profils des
isothermes de compression révèlent aussi que dans les conditions expérimentales, l’expulsion
complète des composés catanioniques de la monocouche a lieu à des pressions de surface
supérieures à 30 mN/m, pression latérale moyenne d’une membrane cellulaire [26, 27].
* * A) B)
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
100
Afin de mieux comprendre l’influence de l’hydrophobie de tous les éléments
constitutifs des dérivés catanioniques dendritiques nous avons étudié plus en détail la famille
des composés comportant le dendrimère DC3. Le choix de cette famille de produits est justifié
par le fait que ces composés présentent un plus d’intérêt biologique car c’est bien le composé
L16DC3 qui est le plus actif de la série et le composé L12DC3 présente un léger effet de
multiplicité de site. De plus, la possibilité d’analyser le comportement du sel de sodium du
dendrimère DC3 nous permet de réaliser une comparaison complète de l’interaction avec la
DPPC de tous les constituants de cette famille. Ainsi les profils des isothermes de
compression des deux tensioactifs catanioniques L12DC3 et L16DC3 aussi bien que ceux des
deux aminolactitols correspondants et le sel de sodium du dendrimère DC3 ont été enregistrés
(Figure 13).
Les expériences réalisées pour tous les produits à la même concentration en
aminolactitol montrent la faible incorporation et même l’expulsion complète de la
monocouche de DPPC des composés les moins hydrophobes comme l’aminolactitol L12 et le
dendrimère DC3 (Figure 13). Nous pouvons observer aussi une incorporation plus importante
des dendrimères catanioniques L12DC3 et L16DC3 liée à une synergie d’interaction entre les
tensioactifs constitutifs (DC3 et L12, L16 respectivement) et la DPPC.
40 50 60 70 80 90 100 110
0
10
20
30
40
50
60
Aire par molécule, Å2
DPPC
DPPC + L12 1,6*10-7M
DPPC + L16 1,6*10
-7M
DPPC + DC3Na 1,33*10-8M
DPPC + L12DC
3 1,33*10
-8M
DPPC + L16DC
3 1,33*10-8M
Pression de surface
mN/m
Figure 13: Comparaison entre les isothermes de compression des tensioactifs constitutifs
des catanioniques dendritiques L12DC3 et L16DC3 en présence de DPPC à 20°C (0,15M
aCl) (*concentrations finales en composé catanionique dendritique dans la sous -phase; rap. molaire LXDCy : DPPC = 1 : 12)
Afin de vérifier qu’à la pression de collapse il s’agit bien d’un phénomène de
désorption et non pas d’une réorganisation de la monocouche en bi- ou multicouches, avec
expulsion des composés catanioniques vers la phase air, nous avons réalisé des mesures de
*
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
101
spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) [28] sur les monocouches formées à
l’interface eau/air.
Les spectres IRRAS enregistrés pour le composé L16DC3 en présence et en absence de
DPPC aussi bien que le spectre témoin de la DPPC nous ont aidé à confirmer notre hypothèse
concernant l’expulsion dans la sous -phase des composés catanioniques dendritiques à partir
d’une certaine compression.
Ainsi, en analysant la région caractéristique de la tête polaire nous pouvons observer
qu’à une pression de surface de 30mN/m (Figure 14b-A) la monocouche mixte DPPC -
L16DC3 (formée par l’adsorption du composé catanionique dans une monocouche de DPPC
non comprimée) présente les bandes caractéristiques du dendrimère catanionique – la bande
phosphonate ῡas(PO3-) à 1157 et à 1191 cm-1. À cette pression, les bandes correspondant aux
élongations asymétriques (ῡas(PO2-) à 1227 cm-1) et symétriques (ῡs(PO2
-) 1088 cm-1),
caractéristiques de la DPPC, ne sont pas décelables. Cela n’est pas surprenant car l’isotherme
de compression de cette monocouche mixte à 30mN/m nous indique l’adsorption d’une
importante quantité de composé tensioactif L16DC3 à l’interface (Figure 14a-A).
En comprimant à 40mN /m, l’allure du spectre IRRAS de la monocouche analysée
change (Figure 14b-B), et l’on peut désormais observer les bandes caractéristiques des deux
composés DPPC et L16DC3. En effet, le profil caractéristique du composé catanionique
dendritique L16DC3 s’estompe au profit de celui de la DPPC. Ce comportement, complété par
l’information donnée par l’isotherme de compression (Figure 14a-B) confirme l’expulsion du
dendrimère catanionique vers la sous -phase.
Les spectres IRRAS enregistrés à une pression de compression de 45 mN/m (Figure
14b-C) révèlent le profil caractéristique du DPPC perturbé par la présence de l’association
catanionique L16DC3. Comme nous l’indique aussi l’allure de l’isotherme de compression
(Figure 14a-C), même à une pression de surface aussi élevée, le tensioactif n’est pas
complètement resolubilisé dans la sous -phase et il coexiste à l’interface avec la DPPC.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
102
40 50 60 70 80 90 100 1100
10
20
30
40
50
60 DPPC + L16DC
3 1,33*10
-8M
DPPC
Aire par molécule
A2
Pression de surface
mN/m
30 mN/m
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
0,004
0,006
1000110012001300
nombre d'onde (cm-1)
-log(R/R0)
1,11x10-7M L16DC3 equil 30mN/mDPPC comp 30mN/mDPPC inj L16DC3 comp 30mN/m
40 mN/m
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
0,004
0,006
1000110012001300
nombre d'onde (cm-1)
-log(R/R0)
1,11x10-7M L16DC3 comp 40mN/mDPPC inj L16DC3 comp 40mN/m 66AADPPC comp 40 mN/m
45 mN/m
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
0,004
0,006
1000110012001300
nombre d'onde (cm-1)
-log(R/R0)
1,11x10-7M L16DC3 comp 40mN/mDPPC inj L16DC3 comp 45mN/m DPPC comp 45 mN/m
Figure 14:
a) Isothermes de compression du DPPC et du tensioactif L16DC3 en présence de DPPC
b) Bandes caractéristiques de la tête polaire des spectres IRRAS du L16DC3 et de la
DPPC enregistrés pour les poins indiqués sur l’isotherme de compression (x – points de mesure en IRRAS, A) à 30mN/m ; B) à 40mN/m ; C) à 45mN/m; conc L16DC3
= 1,33x10-8M ; rap. molaire L16DC3 : DPPC = 1 : 12; T =20°C ; 0,15M NaCl polarisation – p, αi = 40°)
Par analyse des vibrations d’élongation caractéristiques des groupements CH2 qui
apparaissent dans la région 2800-3000 cm-1 nous avons obtenu des informations
supplémentaires. Les bandes des vibrations asymétriques et symétriques des élongations des
CH2 se situent entre 2924 - 2918 et 2855 - 2850 cm–1 respectivement, la fréquence de
vibration étant dépendante de la conformation des chaînes alkyles [29]. Ces valeurs peuvent
donner une estimation du taux de désordre (conformation gauche) ou d’ordre (conformation
trans) au sein des chaînes alkyles. Les spectres IRRAS obtenus pour le dendrimère
catanionique L16DC3 en absence de DPPC, à 30mN/m révèlent des bandes à ῡas(CH2) = 2924
cm-1 et ῡs(CH2)= 2854 cm-1 (Figure 15A) qui indiquent une conformation gauche des chaînes
alkyles, donc un taux important de désordre. En présence de DPPC, ces valeurs sont décalées
ῡ (P=O) 1257
ῡs(PO2-)
1088
ῡas(PO2-)
1157
ῡas(PO2-)
1227
B
ῡas(PO2-)
1227
ῡ (P=O) 1257
ῡas(PO2-)
1157
ῡs(PO2-)
1088
C
ῡs(PO2-)
1088
ῡas(PO2-)
1157
ῡas(PO2-)
1227
ῡas (PO2) 1191
A
b)
B
A x x
x C
x x x
a)
Aire par molécule, Å2
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
103
à ῡas(CH2) = 2920 cm-1 et ῡs(CH2)= 2850 cm
-1, valeurs caractéristiques aussi pour la DPPC
pure. Cela indique à la fois que les chaînes alkyles sont plus ordonnées, le taux de
conformation trans étant augmenté, et que la présence du tensioactif au sein de la
monocouche de DPPC ne perturbe pas cette conformation spécifique d’une phase condensée.
30 mN/m
-0,01
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
28002850290029503000
nombre d'onde (cm-1)
-log(R/R0)
1,11x10-7M L16DC3 equil 30mN/mDPPC comp 30mN/mDPPC inj L16DC3 comp 30mN/m
40mN/m
-0,012
-0,01
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
28002850290029503000
nombre d'onde (cm-1)
-log(R/R0)
1,11x10-7M L16DC3 comp 40mN/mDPPC inj L16DC3 comp 40mN/m 66AADPPC comp 40 mN/m
c
45 mN/m
-0,012
-0,01
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
28002850290029503000
nombre d'onde (cm-1)
-log(R/R0)
1,11x10-7M L16DC3 comp 40mN/mDPPC inj L16DC3 comp 45mN/m DPPC comp 45 mN/m
Figure 15: Bandes caractéristiques des vibrations d’élongation des groupements CH2 des
spectres IRRAS du L16DC3 et
de la DPPC enregistrés pour les poins indiqués sur
l’isotherme de compression – figure 14a (A) à 30mN/m ; B) à 40mN/m ; C) à 45mN/m; conc L16DC3 = 1,33x10
-8M ; rap. molaire L16DC3 : DPPC = 1 : 12; T =20°C ; 0,15M NaCl ; polarisation – p, αi = 40°)
La diminution de l’intensité des signaux caractéristiques des vibrations d’élongation
des groupements CH2 enregistrés pour le mélange DPPC - L16DC3 par rapport au DPPC seul
(Figure 15A) peut être liée à une augmentation de l’angle d’inclinaison des chaînes alkyles
par rapport à la normale de la surface de l’interface [28]. En augmentant la pression de surface
nous observons que les intensités des deux bandes à 2920 cm-1 et 2850 cm-1 deviennent
équivalentes en intensité (Figure 15B, C) en raison d’une expulsion quasi-totale du composé
L16DC3 vers la sous -phase et d’une meilleure compaction des chaînes alkyles de la DPPC.
Ces résultats montrent qu’il y a une interaction entre le tensioactif L16DC3 et la
monocouche de DPPC et que son incorporation ne modifie pas la conformation trans mais
peut perturber l’angle d’inclinaison des chaînes alkyles de la DPPC.
2924
ῡas(CH2) 2920
ῡs(CH2) 2850
2854
ῡas(CH2) 2920
ῡs(CH2) 2850 ῡas(CH2)
2920
ῡs(CH2) 2850
A B C
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
104
Toutes ces expériences correspondent à l’adsorption des molécules de tensioactif à
l’interface air/eau où nous avons préalablement étalé une monocouche de DPPC non
comprimée. Afin d’essayer de se rapprocher encore davantage de conditions biologiques,
nous nous sommes intéressés par la suite à l’étude de l’interaction de nos composés
catanioniques sur une monocouche de DPPC comprimée à 30mN/m, la pression latérale
moyenne existante au sein des bicouches membranaires cellulaires.
Ainsi, nous avons enregistré la variation de l’aire par molécule dans le temps, à une
pression constante d’une monocouche de DPPC comprimée à 30mN/m sous laquelle nous
avons injecté des solutions de tensioactifs catanioniques dendritiques L16DC3 et L12DC3.
L’injection des composés dans la sous -phase aqueuse (0,15M NaCl) se fait de manière
homogène et la pression est maintenue à 30mN/m grâce aux barrières mobiles de la cuve de
Langmuir.
Les résultats présentés figure 16 montrent que malgré la pression latérale importante,
les composés tensioactifs arrivent à s’incorporer dans la monocouche de DPPC.
L’incorporation est très faible dans le cas du dendrimère catanionique L12DC3 qui est moins
hydrophobe et qui, comme nous l’avons précédemment montré présente une pression de
désorption de l’interface d’environ 20 mN/m, donc bien inférieure à celle utilisée pour cette
expérience. Par contre, à cette même concentration, l’incorporation du composé dendritique
L16DC3 dans la monocouche phospholipidique est plus importante (Figure 16). De plus, à
cette pression latérale équivalente à celle d’une membrane biologique, le composé L16DC3
n’est pas complètement expulsé de l’interface, même après une période de huit heures.
Afin d’être sûrs que dans les conditions expérimentales employés il n’y a pas
d’incorporation préférentielle dans la monocouche de DPPC d’un des constituants de
l’assemblage catanionique L16DC3, en raison d’une partielle ségrégation, nous avons réalisé le
même type d’expérience en utilisant l’aminolactitol L16. Les résultats montrent qu’en
employant ce composé à une concentration équivalente en L16 à celle de la solution de L16DC3
la perturbation dans la monocouche de phospholipides est moins importante.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
105
Figure 16: Incorporation des tensioactifs L16DC3, L16, L12DC3 et L16 dans une
monocouche de DPPC comprimée à 30m/m à 20°C (0,15M aCl) (concentration finale en composé catanionique dendritique dans la sous-phase 2,3x10-8M ; rap. molaire LXDC3 :
DPPC = 1 : 12)
Les spectres IRRAS enregistrés durant ces expériences d’incorporation des composés
catanioniques dendritiques dans les monocouches de DPPC comprimées à 30mN/m sont
similaires à ceux décrits antérieurement (Figure 14b-C et 15C) pour les monocouches non
comprimées. Ainsi, cette interaction catanionique - DPPC ne semble pas avoir un effet
perturbateur sur l’organisation des chaînes alkyles de la DPPC. Cependant, les résultats
obtenus en IRRAS indiquent des perturbations au niveau des têtes hydrophiles de la DPPC,
dues probablement à une redistribution des interactions électrostatiques entre les groupements
phosphate de la DPPC et les groupements phosphoniques des associations catanioniques,
chargés négativement, vis-à-vis des groupements ammonium de la DPPC et de
l’aminolactitol.
Pour résumer, tous ces résultats mettent en évidence les interactions qui existent entre
ces nouveaux composés catanioniques dendritiques et le modèle membranaire, interactions
qui semblent être corrélées à l’hydrophobie des associations catanioniques. Pourtant, ces
interactions ne sont pas spécifiques, car comme nous l’avons montré à l’aide des isothermes
de compression et des mesures spectrométriques IRRAS, en augmentant la pression de
surface, les composés sont expulsés de la monocouche totalement ou partiellement (en
fonction de la concentration en tensioactif) pour au final retrouver le profil caractéristique de
la DPPC pure ou légèrement impure. De plus, nous pouvons affirmer que ces interactions ne
sont pas spécifiques car la pression de resolubilisation des tensioactifs, ayant une valeur
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
106
précise pour chaque association catanionique, présente la même valeur en présence ou en
absence de DPPC.
Le fait de retrouver sur les isothermes de compression (à des concentrations faibles en
tensioactifs) le profil de la DPPC pure ou légèrement décalé vers des aires par molécule plus
grandes (∆Å2 maximum 7 à 8) (à des concentrations plus importantes en tensioactifs) après
l’expulsion des molécules tensioactives de la monocouche, met en évidence également
l’absence d’effet désorganisateur de nos composés sur le modèle membranaire.
Même si l’hydrophobie de ces composés semble être un facteur décisif du processus
d’incorporation dans le modèle membranaire, il ne peut pas être tenu pour responsable de la
cytotoxicité de nos produits. Cette affirmation est soutenue par le fait que malgré leurs
intensités sensiblement différentes d’interaction, de pénétration et de persistance dans la
monocouche phospholipidique qui sont directement corrélées à leur hydrophobie, ces
composés présentent des toxicités cellulaires comparables (CC50 de 5,3 à plus de 10 µM).
Pour donner un exemple plus précis, le composé L12DC3 qui est le moins hydrophobe de cette
série de catanioniques dendritiques présente une très faible interaction et pénétration dans la
monocouche de DPPC comprimée par rapport à son analogue L16DC3 et pourtant, ces
composés présentent des valeurs de cytotoxicité similaires, CC50 de plus de 10 et 5,3µM
respectivement. De plus, à une concentration équivalente, l’aminolactitol L16 s’incorpore plus
dans le film de DPPC comprimé à 30 mN/m que l’association catanionique L12DC3 et malgré
cela il est moins toxique que celle-ci (CC50 de 75 et à plus de 10 µM respectivement).
L’analyse des spectres IRRAS nous a également permis d’observer que l’incorporation
de ces catanioniques dendritiques dans le modèle membranaire ne perturbe pas l’organisation
des chaînes alkyles de la DPPC. Cependant, ces résultats révèlent des interactions et de faibles
modifications au niveau des têtes hydrophiles de la DPPC.
En conséquence, les résultats de cette étude sur les monocouches de DPPC indiquent
que la toxicité cellulaire de ces tensioactifs catanioniques dendritiques n’est liée ni à leur
hydrophobie ni à leur incorporation dans la membrane plasmique.
Ainsi, nous étudierons par la suite les propriétés physico-chimiques de ces dérivés
catanioniques afin d’essayer d’identifier d’autres facteurs (l’organisation intrinsèque de
l’édifice catanionique, l’agrégation supramoléculaire, la morphologie des agrégats) qui
pourraient être responsables de la toxicité cellulaire.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
107
VII PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES CATANIONIQUES
DENDRITIQUES ANALOGUES DU GALCER
Dans un premier temps, nous présenterons l’étude des propriétés tensioactives de ces
composés dendrimères catanioniques. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une
mesure de la distribution de taille ainsi que de la morphologie des agrégats formés dans l’eau
par ces dendrimères catanioniques.
VII.1 Etude des propriétés tensioactives
Les mesures de variation de la tension de surface en fonction de la concentration ont
été réalisées par la méthode de l’anneau selon Du Noüy. Des solutions de différentes
concentrations de ces composés dendritiques, obtenues par dilution d’une solution aqueuse
concentrée dans une solution 0,15M NaCl, ont fait l’objet d’une étude par tensiométrie. Nous
rappelons que cette solution saline a pour rôle d’exercer sur les tensioactifs catanioniques une
force ionique équivalente à celle qui existe en milieu biologique.
De par leur forte hydrophobie ces associations catanioniques dendritiques présentent
une faible solubilité dans l’eau. De ce fait, la stratégie adoptée pour une meilleure
solubilisation des produits dans l’eau a été l’hydratation, par l’utilisation des ultra-sons, de
films obtenus par évaporation sous vide des solutions préparées dans un mélange eau/n-
propan-1-ol (1: 3 volumique). Nous mentionnons que les mesures ont été réalisées à une
température de 25°C et non à 37°C (conditions biologiques) afin de réduire l’évaporation du
solvant.
Les résultats de ces mesures tensiométriques montrent que ces quatre dérivés
dendritiques présentent des propriétés tensioactives car ils abaissent la tension de surface de la
solution aqueuse. L’allure de la variation de la tension superficielle en fonction du logarithme
de la concentration en tensioactif catanionique présente une rupture de pente qui est associée à
une organisation du tensioactif dans l’eau (Figure 17). La solubilité limitée de ces composés
dans l’eau n’a pas permis leur étude à des concentrations supérieures à 10-4 M.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
108
35
40
45
50
55
60
65
70
75
-7 -6 -5 -4 -3 -2LogC
Ts (mN/m
)
L16DC3L16DC10L12DC3L12DC10L12L16
Figure 17: Courbes de variation de la tension superficielle en fonction du logarithme de
la concentration des dérivés dendritiques catanioniques et des aminolactitols
correspondants à 25°C dans aCl 0,15M
Composés CAC (µM) TSCAC (m/m)*
L16 96 39
L16DC3 6 47
L16DC10 7 48
L12 460 38
L12DC3 12 45
L12DC10 27 45
* tension de surface à la CAC
Tableau 5 : Valeurs des CAC et TSCAC pour les dérivés dendritiques catanioniques et les
aminolactitols correspondants, L12 et L16 à 25°C dans aCl 0,15M
Les informations obtenues par ces mesures de tensiométrie nous permettent de faire
une comparaison entre les propriétés d’agrégations (CAC) et les propriétés biologiques (CI50
et CC50) de ces composés catanioniques dendritiques. Les résultats rassemblés dans le tableau
6 montrent que toutes les associations dendritiques aussi bien que les aminolactitols
correspondants sont actifs à l’état monomère, car toutes les CI50 sont inférieures à leurs CAC.
En ce qui concerne leur toxicité, nous pouvons remarquer que les composés L12 et L12DC10
deviennent toxiques déjà à l’état non -agrégée car leurs CC50 sont inférieures à leurs CAC.
Nous pouvons également observer que pour les associations catanioniques L16DC3, L16DC10 et
L12DC3 ainsi que pour l’aminolactitol L16, les valeurs de CC50 sont très proches de celles de
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
109
CAC (Tableau 6). Cela indique que ces composés deviennent toxiques à des concentrations
avoisinant leurs concentrations d’agrégation critique.
Composés CI 50 (µµµµM) CC50 (µµµµM) CAC (µM)
L16 7,1 ± 1,6 75 ± 8 96
L16DC3 0,5 ± 0,2 5,3 ± 1,9 7
L16DC10 1,7 ± 0,1 7,2 ± 0,5 8
L12 55,5 ± 23 130 460
L12DC3 2,4 ± 1 > 10 12
L12DC10 4,4 ± 0,8 8 ± 0,2 27
Tableau 6: Paramètres issus des tests biologiques in vitro et des mesures des tensions de
surface pour les dérivés dendritiques catanioniques et les aminolactitols correspondants,
L12 et L16
Afin de réaliser une corrélation plus précise entre les propriétés biologiques (CI50 et
CC50) et les propriétés d’agrégation dans un milieu aqueux de ces composés catanioniques
dendritiques nous avons représenté sur le même graphique la variation de l’activité
inhibitrice, de la toxicité et de la tension de surface en fonction du logarithme de la
concentration (Figure 18).
Il est intéressant de noter que les composés L16DC3, L16DC10 et L12DC3 présentent une
activité anti-VIH non -négligeable (inhibition virale d’environ 20%) à de très faibles
concentrations (10-10 – 10-9M). Ces tensioactifs catanioniques présentent cependant une
activité antivirale réellement significative à des concentrations supérieures à 10-7M pour le
L16DC3, et même supérieure à 10-6M pour les composés L16DC10, L12DC3 et L12DC3. En ce
qui concerne l’activité inhibitrice des aminolactitols L16 et L12, nous pouvons observer qu’ils
deviennent actifs contre le VIH à des concentrations proches et respectivement supérieures à
10-5 M.
Nous avons ensuite étudié la relation entre la cytotoxicité et la CAC de ces
associations catanioniques dendritiques. Ainsi, nous pouvons observer pour tous les composés
analysés, les aminolactitols inclus, l’absence de toxicité de ces tensioactifs sous forme
monomère, c'est-à-dire non –agrégée. Cependant, il faut souligner une brusque augmentation
de la toxicité cellulaire de ces composés catanioniques pour des concentrations proches de
celles des CAC. Ce comportement indique clairement que le phénomène d’agrégation joue un
rôle déterminant sur la cytotoxicité de ces analogues catanioniques dendritiques.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
110
L16
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-10 -8 -6 -4LogC
Ts (mN/m
)
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Activité (Toxicité)%
Tens.superf. L16 Toxicité Activité
L12
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-10 -8 -6 -4 -2LogC
Ts (mN/m
)
-20
0
20
40
60
80
100
120
Activité (Toxicité)%
Tens.superf. L12 Toxicité Activité
Figure 18: Courbes de variation de la tension superficielle, de l’activité inhibitrice et de
la toxicité en fonction du logarithme de la concentration des dérivés dendritiques
catanioniques et des aminolactitols correspondants
Le composé L12DC10 semble être le seul de cette série de catanioniques dendritiques à
présenter une brusque et importante toxicité cellulaire à des concentrations inférieures à sa
CAC. Ce comportement particulier pourrait être expliqué par la présence du produit plus dans
la sous -phase, sous forme agrégée, qu’à l’interface air/eau (comme nous l’avons
précédemment noté en analysant l’isotherme de compression du produit seul et les résultats
L16DC10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4LogC
Ts (mN/m
)
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Activité (Toxicité)%
Tens.superf. L16DC10 Toxicité Activité
L16DC3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
LogC
Ts (mN/m
)
-20
0
20
40
60
80
100
120
Activité (Toxicité)%
Tens.superf. L16DC3 Toxicité Activité
L12DC3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
LogC
Ts (mN/m
)
-40
-20
0
20
40
60
80
100
Activité (Toxicité)%
Tens.superf. L12DC3 Toxicité Activité
L12DC10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
LogC
Ts (mN/m
)
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Activité (Toxicité)%
Tens.superf. L12DC10 Toxicité Activité
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
111
des mesures de tensiométrie) malgré son hydrophobie plus importante que celle du composé
L12DC3. En effet, ce phénomène pourrait entraîner une agrégation du composé dans la
solution aqueuse à une concentration légèrement inférieure à celle déterminée par les mesures
de tensiométrie. Ainsi, la cytotoxicité du composé L12DC3 pourrait être due, comme dans le
cas des autres tensioactifs catanioniques dendritiques, au processus d’agrégation
supramoléculaire.
La toxicité des aminolactitols à des concentrations proches et supérieures à leur
concentration micellaire critique s’explique par l’effet détergent de ces composés sur les
membranes cellulaires.
Afin de comprendre comment le phénomène d’agrégation pourrait être à l’origine de
la toxicité cellulaire de ces associations catanioniques dendritiques, nous nous intéresserons
par la suite à la morphologie des agrégats formés par ces composés dans l’eau. Cette étude
nous donnera également des indications sur la conformation adoptée par ces entités
catanioniques à l’état monomère au sein des agrégats.
Avant d’analyser la morphologie de ces agrégats, nous présenterons les résultats de
l’étude de distribution de taille et de stabilité dans le temps de ces objets supramoléculaires.
VII.2 Etude de la distribution de taille des agrégats
La diffusion quasi élastique de la lumière permet de déterminer le diamètre
hydrodynamique d’une particule (dans une solution de viscosité donnée et à une température
connue) en fonction de son coefficient de diffusion selon l’équation de Stockes-Einstein [30].
Comme nous l’avons déjà mentionné, les échantillons analysés (c = 80µM, dans l’eau)
ont été préparés par hydratation des films des produits obtenus par évaporation des solutions
préparées dans un mélange eau/propan-1-ol (rapport volumique de 1:3). L’utilisation des
ultra-sons a été nécessaire afin d’obtenir des solutions aqueuses homogènes de ces tensioactifs
catanioniques dendritiques peu solubles dans l’eau.
L’étude par diffusion de la lumière montre que les quatre associations catanioniques
forment des agrégats dans l’eau dont la taille moyenne augmente avec l’hydrophobie de
l’édifice catanionique. Les histogrammes obtenus révèlent des distributions gaussiennes de la
taille des agrégats centrées entre 200 et 600 nm suivant le mélange catanionique (Figure 19).
Les solutions sont stables dans le temps pendant 6 jours; ensuite le mélange précipite.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
112
L16DC3 L16DC10
diamètre hydrodynamique moyen = 340 nm indice de polydispersité = 0,44
diamètre hydrodynamique moyen = 570 nm indice de polydispersité = 0,67
L12DC3 L12DC10
diamètre hydrodynamique moyen = 240 nm indice de polydispersité = 0,37
diamètre hydrodynamique moyen = 480 nm indice de polydispersité = 0,26
Figure 19 : Histogrammes représentant la distribution de taille des agrégats formés par
les dérivés dendritiques catanioniques (c = 80µM, T = 25°C)
Afin de pouvoir réaliser une meilleure corrélation entre les propriétés physico-
chimiques et biologiques de ces tensioactifs catanioniques bicaténaires nous avons étudié leur
comportement d’agrégation et de stabilité dans le temps dans un milieu salin (0,15M NaCl)
qui a le rôle d’exercer sur les associations catanioniques une force ionique proche de celle qui
existe en milieu biologique. En essayant le plus possible de reproduire les conditions
Diamètre (nm) Diamètre (nm)
Diamètre (nm) Diamètre (nm)
Intensité (%
)
Intensité (%
) Intensité (%
)
Intensité (%
)
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
113
expérimentales utilisées pour les essais biologiques in vitro, les solutions supplémentaires
analysées en diffusion de la lumière ont été préparées par dilution d’une solution concentrée
(solution mère, c = 80µM, dans l’eau) dans une solution saline (0,15M NaCl), et ont été
conservées et analysées à une température de 37°C. Les résultats obtenus pour ces solutions
(cfinale = 30µM) révèlent que pour les quatre associations catanioniques les agrégats formés
dans l’eau demeurent présents lors de la dilution. Il faut noter que malgré une diminution du
diamètre moyen hydrodynamique (de 40 - 80nm) pour l’ensemble des composés, les résultats
sont similaires à ceux précédemment présentés. Les solutions sont également stables dans le
temps pendant 6 jours; ensuite le mélange précipite.
VII.3 Etude de la morphologie des agrégats
Afin d’étudier la morphologie des agrégats supramoléculaires formés par ces
tensioactifs catanioniques dans l’eau nous avons utilisé la microscopie électronique en
transmission (MET). Cette technique nous permet de visualiser et d’analyser la forme et la
taille des agrégats à une échelle nanométrique. Deux méthodes différentes ont été employées
pour la préparation des échantillons : la méthode par coloration négative et la cryofracture.
Pour la technique par coloration négative, le contrastant choisi est le phosphotungstate
de sodium, ajusté à un pH neutre afin d’éviter toute éventuelle perturbation du système
catanionique.
La cryofracture permet de travailler sans contrastant et de figer la structure des
agrégats en solution et ainsi d’éviter la déshydratation de l’échantillon.
Les expériences de cryofracture ont été réalisées en collaboration avec le Dr. Brigitte
Tiersch et le Prof. Dr. Joachim Kötz de l’Université de Potsdam, Allemagne.
Ces deux méthodes employées pour la préparation des échantillons nous ont permis de
visualiser les agrégats formés par ces dérivés dendritiques dans une solution aqueuse. Les
solutions catanioniques analysées ont été préparées à la même concentration (c = 80µM, dans
l’eau) et de la même manière que celles qui ont été employées pour l’étude de diffusion quasi
élastique de la lumière.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
114
L’analyse des micrographies électroniques obtenues avec les deux techniques de MET
révèle la formation de vésicules unilamellaires pour les quatre dérivés dendritiques (Figure 20
et 21). Les résultats obtenus avec ces deux techniques complémentaires sont en accord
puisque à la fois la forme et la taille des vésicules de chaque assemblage catanionique sont
similaires.
Nous pouvons observer que toutes les associations forment des vésicules dont la
distribution de taille est polydisperse allant de 30 ou 40 nm à 260 ou même 380nm de
diamètre, en fonction de l’hydrophobie de l’édifice catanionique dendritique. Dans ce sens,
les composés comportant l’aminolactitol L16 forment des vésicules plus volumineuses que les
composés comportant l’aminolactitol moins hydrophobe L12. Par exemple, les composés
L16DC3 et L16DC10 sont capables de former des agrégats vésiculaires dont le diamètre peut
aller jusqu’à 330 et 380nm respectivement, alors que les composés L12DC3 et L12DC10
forment des vésicules plus petites d’un diamètre maximal d’approximativement 260 et 270nm
respectivement. Cette étude révèle aussi l’existence d’une faible variation de taille (~50 nm)
des agrégats pour les composés L16DC3 et L16DC10 comportant le même aminolactitol mais un
squelette dendritique différent, cette différence étant réduite dans le cas des assemblages
catanioniques L12DC3 - L12DC10. Une explication pourrait être la meilleure compaction au
sein de l’association catanionique L12DC10 en raison de la similarité de longueurs des chaînes
L12 – C10.
Pour les tensioactifs catanioniques comportant le dendrimère DC10 les diamètres
moyens mesurés en microscopie électronique sont inférieurs à ceux qui ont été obtenus en
diffusion quasi élastique de la lumière. Cela pourrait être expliquée par la tendance des
vésicules à s’agglutiner (comme nous pouvons le remarquer sur les micrographies
électroniques – Figure 20B et E), ce qui fausse les valeurs des diamètres hydrodynamiques
moyens obtenus en DLS.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
115
A
B
C
D
E
Figure 20 : Micrographies électroniques des vésicules formées par les catanioniques
dendritiques L16DC3 (A, B, C) et L16DC10 (D, E) (Technique de coloration négative A et D; Cryofracture B, C et E)
A
B
C
D
E
Figure 21 : Micrographies électroniques des vésicules formées par les catanioniques
dendritiques L12DC3 (A, B, C) et L12DC10 (D, E) (Technique de coloration négative A et D; Cryofracture B, C et E)
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
116
En analysant les micrographies électroniques obtenues par la cryofracture nous
pouvons remarquer que les composés comportant le squelette dendritique DC10 (L12DC10 et
L16DC10) forment des vésicules dont les membranes sont fracturables (empreintes rondes dont
l’ombrage n’est pas uniforme, donnant l’impression de bosses et de creux - Figure 20E et
Figure 21E). Cette fracturabilité indique que le tensioactif ne traverse pas la membrane
vésiculaire ce qui nous permet de conclure que la conformation adoptée par l’entité
catanionique dans ces vésicules est une conformation en "chou-fleur". Ainsi, la fracture de
celles-ci se propage selon un plan de faibles interactions qui passe juste au milieu de la
bicouche vésiculaire (Figure 22A).
Figure 22 : Représentation schématique d’une bicouche membranaire fracturable (A) -
conformation en "chou-fleur" et d’une bicouche membranaire non-fracturable (B)
comportant une conformation cylindrique et en "chou-fleur" du tensioactif
En ce qui concerne les composés comportant le squelette dendritique DC3 (L12DC3 et
L16DC3) les micrographies électroniques indiquent que ces tensioactifs catanioniques sont
capables de former à la fois des vésicules dont les membranes sont fracturables (Figure 20B et
conformation cylindrique - le dendrimère traverse l’association catanionique
H2O
A)
Vésicule formée par les catanioniques dendritiques
Bicouche membranaire fracturable
OU
Plan de fracture
Bicouche membranaire non -fracturable
B)
conformation en
"chou-fleur"
Il n’y a pas
de plan
de fracture
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
117
Figure 21B) ainsi que des vésicules dont les membranes ne sont pas fracturables (empreintes
formant des anneaux - Figure 20C et Figure 21B et C). La non- fracturabilité des agrégats
vésiculaires pourrait être en accord avec la coexistence dans la membrane des deux
conformations possibles : cylindrique et en "chou-fleur" (Figure 22B). C’est en raison de cette
conformation cylindrique qui traverse la membrane vésiculaire que celle-ci n’est pas
fracturable. Pourtant, la seule présence au sein des agrégats d’une conformation cylindrique,
symétrique et rigide, pourrait conduire seulement à la formation des bicouches planes (telles
les phases lamellaires), ce qui ne concorde pas avec la courbure qui existe dans les
membranes vésiculaires. Celle-ci pourrait être apportée par contre, par une coexistence de la
conformation cylindrique avec une conformation en "chou-fleur" qui, par sa forme conique a
la possibilité d’induire une courbure membranaire (Figure 22B).
A la suite de l’étude morphologique des objets supramoléculaires formés par ces
composés catanioniques dendritiques nous pouvons remarquer que la structure du squelette
dendritique a une forte influence sur la conformation adoptée par ces tensioactifs au sein des
vésicules. Ainsi, le dendrimère DC10 favorise une conformation en "chou-fleur" tandis que le
dendrimère DC3 permet aux associations catanionique d’adopter les deux conformations
possibles pour ces tensioactifs : cylindrique et en "chou-fleur".
Afin de confirmer les résultats obtenus en utilisant la diffusion de la lumière à savoir,
la persistance des agrégats formés dans l’eau par ces tensioactifs catanioniques lors d’une
dilution dans une solution saline (0,15M NaCl), nous avons étudié ces échantillons par la
MET. Les solutions ont été préparées par dilution d’une solution concentrée (solution mère, c
= 80µM, dans l’eau) dans une solution saline jusqu’à des concentrations supérieures à leurs
CAC et ont été conservées pour quelques heures à une température de 37°C. Les
micrographies électroniques obtenues révèlent la présence d’agrégats vésiculaires qui sont
similaires à ceux précédemment présentés figures 20 et 21. Ainsi, le processus de dilution à
des concentrations finales supérieures à leurs CAC ne semble pas modifier la morphologie
des agrégats formés par ces associations catanioniques dans l’eau.
Ces données nous permettent d’établir de nouvelles corrélations entre les mesures de
tensiométrie, la morphologie des agrégats formés dans l’eau, la conformation des monomères
au sein des agrégats et les résultats biologiques.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
118
Comme nous l’avons observé, les monomères de la famille de composés comportant le
squelette dendritique DC10 adoptent, au sein des agrégats vésiculaires une conformation en
"chou-fleur" tandis que les associations appartenant à la famille de composés du dendrimère
DC3 présentent, à l’état agrégé une coexistence des deux conformations possibles: cylindrique
et en "chou-fleur". Malgré cette différence d’arrangement de l’entité catanionique au sein des
agrégats, les résultats biologiques cumulés avec ceux obtenus à la suite de l’étude par
tensiométrie indiquent une toxicité similaire pour tous ces composés à l’état agrégé. Ceci nous
permet de conclure que la conformation des monomères au sein d’agrégats n’a pas
d’influence notable sur la cytotoxicité de cette classe de tensioactifs catanioniques
dendritiques à l’état agrégée.
Comme nous l’avons mentionné auparavant, la corrélation des courbes de tensiométrie
avec celles qui expriment la toxicité cellulaire de ces associations catanioniques dendritiques
indique que le processus d’agrégation est à l’origine de la toxicité cellulaire de ces composés.
Par la suite, l’étude de la morphologie des agrégats formés par ces tensioactifs catanioniques
dans l’eau nous a révélé que ces agrégats supramoléculaires ont une morphologie vésiculaire.
En conséquence, la toxicité des composés semble être due à la formation et/ou à l’interaction
des agrégats vésiculaires avec les cellules lymphocytaires. Une possible interaction et fixation
des vésicules sur des récepteurs spécifiques de la membrane cellulaire lymphocytaire ou une
agglutination possible des vésicules à la surface cellulaire pourraient engendrer des
disfonctionnements cellulaires et l’apparition d’une toxicité.
Par ailleurs, une étude bibliographique plus affinée sur ce sujet s’appuie sur les
travaux de Pavan A.[31] et ses collaborateurs qui ont étudié l’influence des vésicules chargées
et non chargées (constituées de tensioactifs ioniques et non – ioniques) sur la fixation sur
différentes cellules lymphocytaires humaines. Leurs résultats indiquent une plus grande
affinité de fixation des vésicules chargées négativement sur la membrane plasmique des
lymphocytes, en raison d’une interaction avec certains composants membranaires spécifiques.
Dès lors, il est possible d’établir une corrélation entre leurs observations et notre étude, car les
cellules utilisées pour les tests biologiques sont de nature lymphocytaire et les vésicules
formées par ces tensioactifs catanioniques dendritiques pourraient être chargées négativement.
En raison de l’equimolarité existante entre les fonctions acides dendritiques et les
groupements ammonium des aminolactitols, les agrégats vésiculaires formés par ces
associations catanioniques devrait présenter une charge globale neutre. Toutefois, nous
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
119
n’avons pas la preuve d’une neutralité uniformément repartie à la surface vésiculaire.
L’existence des microdomaines chargés négativement à la surface vésiculaire pourrait
favoriser l’interaction et la fixation des vésicules avec des récepteurs spécifiques des
membranes cellulaires lymphocytaires, processus qui pourrait, comme nous l’avons expliqué
ci-dessus, engendrer un effet toxique.
Ainsi, ce processus d’interaction entre les vésicules formées par ces catanioniques
dendritiques et les cellules lymphocytaires semble être plus complexe. Des expériences
supplémentaires réalisées en collaboration avec des spécialistes en immunologie pourraient
nous éclaircir sur les causes de la toxicité cellulaire induite par l’agrégation de ces composés
catanioniques dendritiques.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
120
VIII CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Les travaux précédemment réalisés au laboratoire des IMRCP ont souligné l’avantage
de la simplicité de synthèse des analogues catanioniques du galactosylcéramide qui peuvent
agir en tant qu’inhibiteurs de l’entrée virale du VIH. De plus, ces travaux ont montré que
l’activité antivirale des composés catanioniques dendritiques comportant une multiplicité de
sites de reconnaissance est nettement supérieure à l’activité additive d’un nombre équivalent
de monomères analogues du GalCer. Pourtant, l’inconvénient majeur de ces composés
catanioniques dendritiques réside dans leur toxicité cellulaire non- négligeable. Comme nous
l’avons vue, cette cytotoxicité pourrait être induite par l’incorporation des composés adoptant
une conformation en "chou-fleur" dans la membrane plasmique ou par un effet détergent de
l’aminolactitol issu d’un désassemblage partiel de l’édifice catanionique.
Notre étude a eu pour but la synthèse de nouveaux assemblages catanioniques
dendritiques possédant une toxicité réduite afin de les utiliser comme leurres multisites pour
le VIH. La stratégie adoptée pour diminuer la cytotoxicité a été de travailler avec des
composés dendritiques à cœur hexafonctionnel, connus pour leur tendance à adopter une
conformation cylindrique, moins toxique. Egalement, afin de prévenir le désassemblage de
l’entité catanionique nous avons réalisé un renforcement des effets hydrophobes entre les
éléments constitutifs : dendrimère – aminolactitol.
Après la synthèse, la caractérisation et les tests de cohésion à l’interface eau/air de ces
nouveaux composés dendrimères catanioniques, les tests biologiques réalisés in vitro nous ont
montrés que la toxicité cellulaire de ces composés reste toujours dans la même gamme
micromolaire que le produit original. Afin de comprendre d’où provenait la toxicité des
composés nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l’incorporation de ces
tensioactifs catanioniques dendritiques dans des modèles de membranes cellulaires.
Ainsi, en utilisant des monocouches de phospholipides comme modèle membranaire
nous avons pu observer un comportement différent d’interaction et d’incorporation pour
chaque composé catanionique. Pourtant, cette importante différence d’incorporation qui est
directement corrélée à l’hydrophobie des composés ne concorde pas avec une toxicité
similaire des tensioactifs. De ce fait, l’hydrophobie et le processus d’incorporation à l’état
monomère des composés dans les monocouches phospholipidiques ne peuvent pas être tenus
pour responsables de la toxicité cellulaire.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
121
Par la suite, afin d’identifier les facteurs responsables de la cytotoxicité de ces
nouveaux tensioactifs analogues du GalCer, nous avons étudié leurs propriétés physico-
chimiques.
Les mesures de tensiométrie ont confirmé que ces dérivés sont non -toxiques à l’état
monomérique. De plus, l’analyse de la morphologie des agrégats formés par ces composés
dans l’eau nous a permis d’identifier les conformations possibles des monomères au sein des
agrégats. Ainsi, une conformation en "chou-fleur" semble être induite par la présence du
dendrimère DC10 dans l’association catanionique, tandis que les tensioactifs catanioniques
comportant le dendrimère DC3 sont capables d’adopter les deux conformations possibles :
cylindrique et en "chou-fleur". En sachant donc que pour cette famille de nouveaux
dendrimères catanioniques les deux conformations des monomères peuvent exister à l’état
agrégé, on peut supposer que la cytotoxicité des composés n’est pas liée à la conformation des
monomères au sein des agrégats.
Il est important de mentionner que l’étude concernant l’incorporation de ces nouveaux
tensioactifs catanioniques vis-à-vis des monocouches phospholipidiques n’a été réalisée que
pour les composés sous forme monomérique et non vésiculaire, en raison des contraintes
pratiques imposés par cette technique d’analyse.
Enfin, la corrélation entre les résultats des mesures de tensiométrie avec ceux de
l’analyse de la morphologie des agrégats et ceux des tests biologiques, nous a indiqué que la
cytotoxicité de ces associations catanioniques dendritiques augmente brusquement à des
concentrations avoisinant celles de la CAC, indiquant que la formation des agrégats
vésiculaires déclenche l’apparition d’une toxicité non -négligeable.
En nous appuyant sur des résultats similaires décrits dans la littérature, nous avons
proposé d’associer la toxicité cellulaire de ces composés soit à une interaction et une fixation
des vésicules sur des récepteurs spécifiques de la membrane cellulaire lymphocytaire soit à
une agglutination possible des vésicules à la surface cellulaire, qui pourraient induire une
perturbation des fonctions et/ou des échanges cellulaires.
Une future collaboration avec des spécialistes en immunologie pourrait nous aider à
identifier les causes responsables de la toxicité cellulaire induite par l’agrégation de ces
composés catanioniques dendritiques.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
122
Dans les perspectives, l’utilisation de dendrimères de structure similaire mais
comportant un marqueur phosphorescent pourrait nous permettre d’analyser en microscopie
confocale l’interaction entre ces vésicules marquées et des cellules lymphocytaires.
Concernant l’activité antivirale de cette nouvelle famille de composés, notre étude à
montré que le catanionique dendritique L16DC3 réunit les éléments clefs (l’aminolactitol L16 et
le dendrimère DC3) qui lui offrent la meilleure activité anti-VIH de la série. Ces observations
pourraient être utiles pour le design de futurs composés catanioniques dendritiques encore
plus efficaces et non toxiques.
Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH
123
IX BIBLIOGRAPHIE
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Chapitre III
Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
127
I ITRODUCTIO..................................................................................... 129
II MISE AU POIT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES TESIOACTIFS MIXTES
FLUORES / HYDROGEES ...................................................................... 131
II.1 Caractéristiques particulières des chaînes alkyles fluorocarbonées................. 131
II.2 Composés covalents mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés dérivés de sucres132
II.3 Composés catanioniques mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés .................... 135
III MISE AU POIT DE VECTEURS CATAIOIQUES HYBRIDES AALOGUES
DU GALCER .......................................................................................... 136
III.1 Tensioactifs catanioniques pour la délivrance de principes actifs .................... 136
III.2 Synthèse d’analogues catanioniques du GalCer de nature hybride fluorocarboné
/ hydrocarboné .................................................................................................. 138
III.3 Analyse structurale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer............. 142
IV PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES COMPOSES CATAIOIQUES
HYBRIDES FLUORES / HYDROGEES..................................................... 145
IV.1 Etude des propriétés tensioactives ..................................................................... 145
IV.2 Etude de distribution de taille des agrégats....................................................... 148
IV.3 Etude de la morphologie des agrégats............................................................... 151
V ETUDE DE L’ITERACTIO ETRE LES COMPOSES CATAIOIQUES ET
DES MOOCOUCHES DE PHOSPHOLIPIDES ........................................... 157
VI EVALUATIO DES PROPRIETES DE VECTORISATIO SUR CELLULES
IFECTEES PAR LE VIH........................................................................ 162
VI.1 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des associations catanioniques hybrides
analogues du GalCer ........................................................................................ 162
VI.2 Evaluation des propriétés physico-chimiques dans les conditions de vectorisation
........................................................................................................................... 164
VI.3 Formulations de l’AZT avec les tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et
L16F8 .................................................................................................................. 171
VII COCLUSIO ........................................................................................ 174
VIII BIBLIOGRAPHIE.................................................................................... 176
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
128
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
129
I INTRODUCTION
Comme nous l’avons montré dans le premier chapitre bibliographique, la polythérapie
est à l’heure actuelle, le seul moyen de diminuer et de contrôler la multiplication du VIH. Les
régimes polythérapeutiques sont constitués de différentes combinaisons de principes actifs qui
ciblent trois étapes clé du cycle de réplication du virus : l’entrée virale, la transcription et la
maturation. Pourtant, cette stratégie se heurte toujours à d’importants inconvénients parmi
lesquels, l’importante toxicité de certains médicaments. Une stratégie qui permet de réduire la
dose de principe actif administrée, tout en améliorant l’efficacité biologique et en diminuant
la toxicité du principe actif [1], consiste en l’emploi d’un système de vectorisation efficace.
Dans le chapitre précédent nous avons présenté l’influence de la multiplicité de sites
actifs sur le processus de reconnaissance du VIH et sur l’activité antivirale des analogues
dendritiques catanioniques du GalCer. Dans ce cas particulier, l’effet de multiplicité de sites
se manifeste de deux façons car il est présent autant sous la forme monomère de l’édifice
catanionique que sous la forme agrégée – vésiculaire. Pour être plus précis, les vésicules
présentent à leur surface de nombreux groupements galactose qui peuvent être considérés
comme des "clusters" de sites actifs. De ce fait, la probabilité d’interaction avec la membrane
virale est augmentée.
Rappelons également que les glycoprotéines virales gp 120 bourgeonnent à la surface
des cellules humaines infectées par le VIH, ce qui transforme la gp120 en une cible précieuse
pour le développement des thérapies anti-VIH spécifiques [2].
Ainsi, les vésicules formées par les analogues catanioniques du GalCer pourraient être
utilisées comme des vecteurs spécifiques de principes actifs anti-VIH. En raison de leur
toxicité cellulaire, les vésicules formées par les catanioniques dendritiques précédemment
présentés ne peuvent pas être envisagées pour une utilisation dans le domaine de la
vectorisation.
Dans ce troisième chapitre, nos recherches seront donc centrées sur la synthèse et
l’étude d’une nouvelle famille de composés catanioniques analogues du GalCer capables de
former spontanément des vésicules et d’agir ainsi comme des transporteurs spécifiques. De
par la multiplicité de sites de reconnaissance des vésicules formées par ces nouveaux
systèmes catanioniques mixtes fluorés/hydrogénés nous espérons augmenter la probabilité
d’interaction avec la protéine virale et, de ce fait, obtenir une bonne reconnaissance et
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
130
spécificité pour la membrane des cellules infectées. De plus, les produits devront présenter
des toxicités réduites aussi bien sous forme agrégée -vésiculaire que sous forme monomère.
L’ajout d’une chaîne fluorée, qui entraînera une augmentation de l’hydrophobie des
associations catanioniques a pour objectif une amélioration de la stabilité dans le temps des
agrégats vésiculaires formés par ces tensioactifs catanioniques hybrides.
Trois composés mixtes fluorés/hydrogénés, de structures chimiques variées, seront
étudiés afin d’identifier les caractéristiques structurales qui peuvent offrir une meilleure
stabilité des agrégats dans le temps, une toxicité diminuée et une bonne affinité pour le VIH.
Un assemblage catanionique non – fluoré, possédant une hydrophobie proche de celle des
composés catanioniques hybrides sera étudié parallèlement comme système de référence.
Après la synthèse et la caractérisation de ces nouveaux assemblages catanioniques,
leurs propriétés physico-chimiques et biologiques seront décrites et analysées afin d’identifier
le composé le plus adapté à l’application envisagée soit, la vectorisation de principes actifs
anti-VIH. La capacité de ces composés d’agir sous forme monomère en tant que leurres du
VIH sera également étudiée.
Ainsi, l’activité antivirale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer est
envisagée être augmentée par une stratégie de multiciblage : l’utilisation des monomères en
tant qu’inhibiteurs de l’entrée virale du VIH et l’emploi des agrégats supramoléculaires en
tant que système de délivrance spécifique de principes actifs anti-VIH.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
131
II MISE AU POINT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES
TENSIOACTIFS MIXTES FLUORES / HYDROGENES
Avant de détailler la synthèse de ces nouveaux composés catanioniques hybrides, une
brève incursion dans le domaine des composés mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés sera
nécessaire afin de mieux cadrer nos recherches dans l’étude de cette famille de produits.
II.1 Caractéristiques particulières des chaînes alkyles fluorocarbonées
La coexistence d’une chaîne fluorée avec une chaîne hydrogénée dans la structure
intrinsèque d’un amphiphile peut totalement modifier les propriétés physico-chimiques du
composé car d’importantes différences structurales [3, 4] existent entre ces chaînes. En raison
de la taille plus grande de l’atome de fluor (rayon de van der Waals 1,47 Å) par rapport à celle
de l’atome de l’hydrogène (1,20 Å), les chaînes fluorées sont plus volumineuses que les
chaînes hydrogénées, avec des sections transversales d’approximativement 30 Å2 contre 20
Å2 pour les hydrogénés. Les volumes moyens des groupements CF2 et CF3 estimés à 38 Å3 et
respectivement 92 Å3 sont beaucoup plus importants que ceux du CH2 (27 Å3) ou du CH3 (54
Å3). Une conséquence de cette plus grande taille de l’atome de fluor par rapport à l’hydrogène
est la plus grande rigidité des chaînes fluorées qui adoptent préférentiellement une
conformation hélicoïdale, "all-trans" [5] (Figure 1).
A B
Figure 1 : Comparaison entre les modèles moléculaires d’un hydrocarbure (C10H22) - (A)
et d’un fluorocarbure (C10F22) - (B)
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
132
La grande surface des chaînes fluorées et la faible polarisabilité de l’atome de fluor
sont les deux éléments responsables de leur importante hydrophobie; l’effet hydrophobe de la
chaîne étant grossièrement proportionnel à l’aire moléculaire venant au contact de l’eau [6]. De
plus, les forts effets hydrophobes existant entre les chaînes fluorées augmentent leur tendance
à s’auto-organiser dans l’eau et leur adsorption à l’interface, ce qui se traduit par de fortes
activités de surface. Malgré leur fort pouvoir tensioactif, les composés fluorocarbonés ont un
effet détergent (délipidation des membranes) réduit ou même inexistant par rapport aux
amphiphiles complètement hydrogénés [7]. Cette propriété est un véritable atout si l’on
envisage l’utilisation d’amphiphiles fluorées pour des applications biomédicales [8].
Ainsi, la présence d’une chaîne fluorée peut avoir un rôle déterminant sur
l’hydrophobie et la lipophobie des amphiphiles et implicitement, sur les propriétés physico-
chimiques et biologiques des membranes, vésicules ou autres agrégats qu’ils sont capables de
former dans l’eau. En imposant un arrangement plus rigide et plus ordonné dans la structure
intrinsèque des agrégats, la chaîne fluorée peut notamment améliorer la stabilité [9-11], la
fluidité, la rigidité [12], la perméabilité [13] et la capacité d’encapsulation des membranes
vésiculaires [9].
II.2 Composés covalents mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés dérivés de sucres
La recherche bibliographique révèle l’existence d’un nombre impressionnant de
produits covalents hybrides fluorés/ hydrogénés dérivés de polyols ou de sucres,
d’aminoacides, de phosphocholine ou de phosphatidylcholine [14-16].
Des composés mixtes fluorés/ hydrogénés comportant comme partie hydrophile un
sucre (lactose [17, 18], glucose [19], mannose ou galactose [20]) ont été synthétisés et étudiés pour
leur propriétés physico-chimiques et biologiques (Figure 2). Ces produits se sont révélés
capables de former dans l’eau des agrégats d’une grande variété morphologique: des
hélices[18] , des tubules [21], des membranes [22], des vésicules [12]. En raison de la formation
de vésicules d’une stabilité supérieure [9, 10] dans le temps comparativement aux produits
totalement hydrogénés, ces systèmes hybrides représentent une bonne alternative pour
l’encapsulation et la vectorisation spécifique de principes actifs [16].
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
133
O
OH
HO
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
Z
O
Z [NHCH2C(O)]pNHCH(CH2)2RF
(CH2)8R
Z NH(CH2)4CH
NHC(O)(CH2)2C8F17
C(O)NH(CH2)9CH3
Z NHCH2C(O)NHCH
(CH2)2S(CH2)2C6F13
(CH2)2C6H13
p=1; R=CH3; RF=C6F13, C8F17
p=1; R=CH=CH2; RF=C6F13, C8F17
p=2; R=CH3; RF=C6F13
O
OH
HO
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
N CnH2nCOO-Na+
COC2H4C8F17
n=10; n=11
O
OH
HO
O
OH
OH
CHOP(O)-2
RF(CH2)2
CH3(CH2)8
RF=C6F13; C8F17
O
OP(O)-2OCH
HO
OH OH OH
RF=C6F13; C8F17
(CH2)2RF
(CH2)8CH3 O
OP(O)-2-X-CH
HO
OH
OH
OH
X=O; RF=C6F13; C8F17X=(CH2)5O; RF= C8F17
(CH2)2RF
(CH2)8CH3
Figure 2 : Structures chimiques de quelques composés covalents mixtes fluorocarbonés /
hydrocarbonés dérivés de sucres
Riess et ses collaborateurs [5] ont représenté la structure membranaire de vésicules
formées par ce type de composés mixtes fluorés/ hydrogénés comme une bicouche
discontinue (Figure 3). Ce schéma met en évidence la ségrégation partielle des chaînes
fluorocarbonées et hydrocarbonées avec la formation de domaines différents en raison de la
faible affinité qui existante entre ces deux types de chaînes. Les études ont montré que la
présence de ces domaines fluorés dans la membrane vésiculaire engendre une augmentation
de la durée d’encapsulation de la carboxyfluorescéine dans les vésicules formées par les
composés hybrides par rapport aux vésicules formées par les composés totalement
hydrogénés[5].
Figure 3: Représentation schématique de la structure d’une membrane vésiculaire
partiellement fluorée [5]
Fn C
m
Cm
H2O
Tête polaire
Espaceur
Chaînes hydrogénées
Chaîne fluorée
Bicouche mixte
fluorée / hydrogénée
Vésicule fluorée
H2O
Dérivés du lactose
Dérivés du glucose Dérivés du mannose Dérivés du galactose
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
134
Nous trouvons encore plus de similitude avec notre étude dans les travaux de Fantini
et de Vierling, car leurs recherches portent sur l’activité anti-VIH d’analogues covalents
mixtes fluorocarbonés/hydrocarbonés du GalCer. Les composés [F8C7][C16]AEGal,
[FxCy][FqCz]SerGal et HO[C24][F6C5]Gal incorporés dans des liposomes conventionnels
(phospholipide : cholestérol - 2 :1 ) en raison de leur solubilité extrêmement faible dans l’eau,
présentent une activité anti-VIH [2] sur des cellules GalCer(+)HT-29 supérieure à celle de
l’analogue monocaténaire fluoré [F6C11]SerGal (Figure 4) [23]. De plus, les analogues
hydrogénés des dérivés SerGal et du HO[C24][F6C5]Gal se sont révélés inactifs contre ce
même virus. Ces résultats semblent indiquer que la glycoprotéine virale gp 120 se fixe
préférentiellement ou exclusivement sur les domaines riches en glycolipides existants dans la
bicouche liposomale, leur formation étant favorisée par la ségrégation des chaînes des
composés fluorés [15].
Figure 4: Structures chimiques des analogues fluorés / hydrogénés du GalCer Les inconvénients majeurs de ces amphiphiles fluorés sont leur complexité de
synthèse et de purification ainsi que leur solubilité réduite dans l’eau, ce qui rend la
formulation plus laborieuse.
Les produits dont nous allons faire l’étude, les amphiphiles catanioniques hybrides
fluorocarbonés / hydrocarbonés analogues du GalCer, présentent trois avantages importants
comparativement aux analogues covalents du GalCer précédemment cités, soit : une grande
simplicité de synthèse, une excellente hydrosolubilité et la capacité d’auto-association dans
l’eau.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
135
II.3 Composés catanioniques mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés
Les tensioactifs catanioniques représentent depuis quelques années un sujet fascinant
de recherche, car ces mélanges de tensioactifs anioniques et cationiques possèdent des
propriétés physico-chimiques inédites [24]. Nous mentionnerons la diversité morphologique
dictée par la force des interactions intra- et intermoléculaires, le rapport stoechiométrique
entre les deux tensioactifs, la géométrie des molécules, etc. [25] . Parmi les morphologies des
agrégats formés par les tensioactifs catanioniques, les vésicules ont reçu un intérêt tout
particulier en raison de leur formation spontanée [26] et aux applications qui en découle.
Dix huit ans après que le groupe de Kaler [26] eut développé cette nouvelle méthode de
préparation de vésicules spontanées, en mélangeant dans l’eau deux tensioactifs
monocaténaires de charges opposées, la littérature scientifique abonde d’exemples de
composés catanioniques [27]. Des catanioniques bi- [28, 29], tri-, tétra- et pentacaténaires [30], des
dérivés gémini [31, 32] ou dendritiques [33, 34], portant une grande variété de têtes polaires (le
plus souvent ammonium [35], pour le cation et carboxylate [36], sulfate ou sulfonate [37] pour
l’anion), ont vu le jour et ont fait l’objet de nombreuses études physico-chimiques.
Concernant les composés hybrides fluorocarbonés / hydrocarbonés catanioniques, la
littérature n’offre que peu d’exemples comparativement aux composés complètement
hydrogénés. Les travaux de référence dans le domaine, réalisés par les groupes de Kaler [38] et
de Hoffmann [39] sur différents systèmes mixtes fluorés / hydrogénés (C16TAB / FC5 ,
respectivement C14DMAO /C6F13CH2COOH) (Figure 5) portent surtout sur l’étude des
propriétés auto-associatives dans l’eau et sur l’étude des diagrammes de phases à différents
rapports molaires entre les deux amphiphiles.
N
COOF
F
F
F F
F F
F F
F F + NaBr
F
F
F
F F
F F
F F
F F
FF
COO
N
OH
C14DMAO/ C6F13CH2COOH
C16TAB/ FC5
Figure 5 : Structures chimiques de tensioactifs catanioniques mixtes fluorocarbonés /
hydrocarbonés
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
136
Des travaux récents réalisés au laboratoire des IMRCP [22] ont mis l’accent sur la
synthèse et l’étude physico-chimique d’une nouvelle famille de tensioactifs mixtes
fluorocarbonés / hydrocarbonés catanioniques à tête sucre (Figure 6). Ces études ont mis en
évidence le fait que la présence d’une chaîne fluorée en C10 conduit, par sa forte hydrophobie,
à la formation d’agrégats rigides tels que des membranes enroulées ou des structures
lamellaires plutôt que des vésicules. Par contre, une chaîne fluorée en C8 favorise la formation
spontanée de vésicules.
Figure 6 : Structures chimiques de tensioactifs catanioniques mixtes fluorocarbonés /
hydrocarbonés dérivés du lactose
Dans cette étude nous allons exploiter cette tendance des systèmes catanioniques
comportant un segment fluoré en C8 pour induire la formation d’agrégats vésiculaires.
III MISE AU POINT DE VECTEURS CATANIONIQUES HYBRIDES
ANALOGUES DU GALCER
III.1 Tensioactifs catanioniques pour la délivrance de principes actifs
Le but de l’étude courante sera de synthétiser et d’étudier la capacité de nouveaux
tensioactifs catanioniques analogues du GalCer, notamment des dérivés bicaténaires mixtes
fluorés/ hydrogénés, d’être utilisés en tant que systèmes vectoriels de principes actifs anti-
VIH.
Des études récentes réalisées au laboratoire des IMRCP ont mis en avant le grand
potentiel des associations catanioniques à être utilisées dans le domaine de la délivrance de
principes actifs. Une première approche a porté sur la délivrance par voie cutanée d’un
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
137
principe actif anti-inflammatoire associé à un tensioactif dérivé de sucre (Figure 7). Cette
association engendre une importante amélioration de l’activité anti-inflammatoire du principe
actif car la nouvelle entité catanionique de par sa capacité à former spontanément dans l’eau
des agrégats vésiculaires offre au principe actif une très bonne solubilité dans l’eau, une
délivrance contrôlée et prolongée à travers la peau ainsi qu’une protection contre l’irradiation
solaire [40, 41]. Dans ce cas précis, le principe actif participe à sa propre formulation.
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
9
CO
O
N
O
O
Cl
Figure 7 : Structure chimique d’une association catanionique réalisée entre un anti-
inflammatoire et un tensioactif dérivé de sucre
Une approche différente a été l’utilisation d’une association catanionique tricaténaire
(Figure 8), afin de construire un système de vectorisation polyvalent, capable d’assurer le
transport de principes actifs hydrophobes (dans la bicouche membranaire vésiculaire) et/ou de
principes actifs hydrophiles (dans le cœur aqueux des vésicules). Ce système catanionique
tricaténaire [42] doit la bonne stabilité au cours du temps des vésicules formées spontanément
dans l’eau, à la présence d’une troisième chaîne alkyle. Ainsi, l’augmentation de
l’hydrophobie permet l’obtention d’une entité catanionique comme système de vectorisation
efficace. En effet, les vésicules formées spontanément se sont montrées capables d’encapsuler
une quantité importante de substances actives hydrophiles, de garder cette charge pour une
période de temps supérieure à 30 heures et de la délivrer par fusion avec la membrane
cellulaire.
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
12
P
O
O9
9
OH
OH
Figure 8 : Structure chimique d’une association catanionique tricaténaire
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
138
En nous appuyant sur cette expérience, la stratégie adoptée pour l’amélioration de la
stabilité au cours du temps des agrégats vésiculaires, sera d’augmenter l’hydrophobie de
l’ensemble catanionique par l’ajout d’une chaîne fluorée. Caractérisée par une meilleure
hydrophobie et une plus grande rigidité, la partie fluorocarbonée devrait transférer ces
propriétés à la membrane vésiculaire, conduisant ainsi à une meilleure stabilité des agrégats
dans le temps et à une meilleure compaction ainsi qu’une faible perméabilité [9]. En
conséquence, les vésicules formées spontanément par ces catanioniques hybrides fluorés/
hydrogénés qui de plus, comporteront à leur surface des sites de reconnaissance de la gp 120
pourraient s’avérer très utiles en tant que transporteurs spécifiques de principes actifs anti-
VIH.
Trois composés mixtes fluorés/hydrogénés, de structures chimiques variées, seront
étudiés afin d’identifier les caractéristiques structurales qui peuvent offrir une meilleure
stabilité des agrégats dans le temps et une toxicité diminuée.
III.2 Synthèse d’analogues catanioniques du GalCer de nature hybride fluorocarboné / hydrocarboné
L’étude de cette nouvelle famille de produits a eu pour objectif l’identification des
éléments structuraux qui peuvent apporter à ces composés catanioniques à la fois de
meilleures propriétés physico-chimiques, comme la formation d’agrégats supramoléculaires
stables dans le temps et capables d’encapsuler des principes actifs, ainsi que de meilleures
caractéristiques biologiques (activité anti-VIH renforcée et toxicité réduite). Une bonne
activité antivirale se traduira par une forte reconnaissance et une forte interaction de ces
produits avec le virus. Ces propriétés sont essentielles pour une future utilisation des
composés étudiés en tant que systèmes de vectorisation de principes actifs anti-VIH.
Afin de maintenir l’affinité des ces nouveaux tensioactifs catanioniques hybrides avec
la membrane virale du VIH, le précurseur cationique, l’aminolactitol, a été conservé car c’est
lui qui permet la reconnaissance avec la gp120 (le motif D-galactose lié par une liaison β-O-
glycosidique), la longue chaîne hydrogénée permettant le renfort de l’interaction. Les
modifications structurales seront réalisées donc, seulement au niveau de l’acide gras, qui lui
sera fluoré.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
139
Au vu des études antérieures sur l’influence de l’hydrophobie du précurseur cationique
sur les propriétés physico-chimiques et biologiques de l’assemblage catanionique, nous avons
choisi de travailler avec le N-hexadécylamino-1-déoxylactitol (L16) (Figure 9) qui semble
avoir la longueur de chaîne optimale pour une bonne affinité pour la gp120 [43, 44].
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH
12
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
12
C
O
O
CF26
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
12
C
O
O
CF2 CF37
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
12
C
O
O
CF2 CF37
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
12
C
O
O
9
H2O, Température ambiante
HOOCCF2 CF3
7
HOOCCF2
6
HOOC CF2 CF37
HOOC
9
+
+
+
+
H2O, Température ambiante
agitation magnétique, 2 jours
L16
L16H4F8
L16H2F6H4
L16H13
L16F8
H2O, 35 °C
agitation magnétique, 2 jours
agitation magnétique, 2 jours
Figure 9 : Synthèse d’analogues catanioniques du GalCer mixtes fluorés/ hydrogénés
Afin de tester l’influence de la longueur et de la position de la chaîne fluorocarbonée
de l’acide gras sur l’auto-association, la stabilité des agrégats dans le temps et l’affinité pour
le VIH nous avons utilisé trois acides carboxyliques fluorés de structures différentes (Figure 9
et 10). Le choix des deux acides mixtes comportant une partie fluorée en C8 a été fait en
raison des résultats antérieurs obtenus dans le groupe d'Isabelle Rico-Lattes qui ont montré
que la présence d’une chaîne fluorée en C8 (Figure 6) au sein de l’édifice catanionique
favorise la formation des agrégats d’une structure vésiculaire [22]. Pour les mêmes acides, la
présence ou l’absence d’un espaceur hydrogéné (en C4) entre la partie fluorée et la fonction
acide est justifiée par notre intérêt d’étudier son rôle sur les effets hydrophobes entre la chaîne
d’acide gras et la chaîne alkyle de l’aminolactitol et implicitement sur le processus d’auto-
organisation. De par sa présence, nous envisageons d’augmenter l’affinité entre les deux
chaînes fluorée – hydrogénée et donc de renforcer la consolidation des agrégats formés par
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
140
ces tensioactifs catanioniques. Dans le même but, nous avons employé un troisième type
d’acide mixte fluoré/hydrogéné qui comporte une partie fluorée plus courte (en C6),
positionnée entre deux segments hydrogénés. Dans ce cas, les effets hydrophobes au sein de
l’édifice catanionique devraient encore être renforcés par la présence des deux segments
hydrogénés situés aux extrémités de la chaîne alkyle de l’acide. La partie fluorée plus courte,
en C6, a été choisie afin de compenser l’ajout des groupements CH2 et ainsi maintenir une
hydrophobie globale de l’ensemble catanionique proche de celle des deux autres tensioactifs
catanioniques comportant une partie fluorée en C8.
Comme système de référence nous avons choisi un dérivé totalement hydrogéné, qui
est également un analogue catanionique du GalCer. Celui-ci comporte le N-hexadécylamino-
1-déoxylactitol comme base, et comme acide, l’acide myristique (Figure 9 et 10). La longueur
de la chaîne de l’acide (C14) a été choisie afin d’obtenir un tensioactif catanionique ayant une
hydrophobie équivalente ou proche de celle des dérivés mixtes fluorés / hydrogénés étudiés.
Sachant que l’hydrophobie d’un groupement CF2 est considérée comme équivalent à 1,6
motifs CH2 [45], [46], nous pouvons constater que les tensioactifs catanioniques L16F8 et L16H13
possèdent une hydrophobie équivalente.
L16H4F8 L16H2F6H4
L16H13L16F8
+
-RF8RH4
RH16
+
-RFxRHn
RHm
+
-RF6RH2
RH16
RH4
+
-RF8
RH16
+
-
RH16
RH13
Figure 10: Représentation schématique de la structure hybride de nouveaux
catanioniques fluorés/hydrogénés et du catanionique de référence non-fluoré
Tête polaire 1-déoxylactitol Chaînes hydrogénées
(effet hydrophobe)
Chaîne fluorée
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
141
Les acides correspondants aux catanioniques L16H4F8 et L16H2F6H4 ont été synthétisés
au laboratoire de Chimie Bioorganique et des Systèmes Moléculaires Vectoriels, de
l’Université d’Avignon dans l’équipe du Prof. Bernard Pucci, les deux autres acides étant
commerciaux.
Ainsi, ces nouveaux tensioactifs catanioniques mixtes ont été synthétisés par simple
mélange équimolaire dans l’eau à température ambiante, du N-hexadécylamino-1-
déoxylactitol (L16) avec l’acide gras correspondant (Figure 9). L’avancement de la réaction
étant suivi par la disparition de l’acide gras insoluble dans l’eau et par pH-métrie.
Après réaction acido-basique et élimination de l’eau par lyophilisation, les tensioactifs
catanioniques ont été isolés avec des rendements quantitatifs. Tous ces tensioactifs
catanioniques présentent une bonne solubilité dans l’eau à température ambiante.
L’étape suivante de l’étude a été la caractérisation structurale de ces nouveaux
tensioactifs catanioniques analogues du GalCer.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
142
III.3 Analyse structurale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer
Pour confirmer la structure de ces nouveaux analogues catanioniques du GalCer, et
notamment vérifier la formation des paires d’ions, nous avons employé les méthodes de
caractérisation suivantes : la résonance magnétique nucléaire, la spectroscopie infrarouge et la
pH-métrie.
La RM 13C nous a permis de prouver le déplacement total de la réaction acido-
basique vers la formation des paires d’ions. L’analyse des spectres 13C RMN montre que le
signal à 176,58 ppm, caractéristique de l’acide carboxylique de départ a disparu, alors que le
signal de résonance du carboxylate apparaît à 181,49 ppm. Ainsi, la transformation de l’acide
carboxylique vers sa forme carboxylate est totale (Figure 11).
Figure 11: Détail des spectres RM du 13C qui met en évidence la transformation
complète de l’acide sous sa forme carboxylate (exemplifié sur le catanionique L16H13)
L’analyse structurale par résonance magnétique nucléaire a été complétée par une
étude en spectroscopie infrarouge.
COOH acide myristique
COO-
Catanionique L16H13
ppm
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
143
Une preuve supplémentaire de la transformation totale des deux composés constitutifs,
aminolactitol et acide, en tensioactifs catanioniques a été apportée par l’analyse des spectres
réalisés en infrarouge (IR). Pour ces composés bicaténaires catanioniques la conversion totale
de l’acide carboxylique vers la forme carboxylate a été mise en évidence par le déplacement
de la bande correspondant au groupement carboxyle. A titre indicatif, sur le composé
catanionique L16H13 nous pouvons observer la disparition de la bande caractéristique de
l’acide (ῡC=O) à 1701 cm-1 au profit des bandes du carboxylate à 1549 cm-1 (asymétrique) et
1406 cm-1 (symétrique) (Figure 12).
Figure 12: Spectre IR du tensioactif catanionique L16H13 comparé à celui de l’acide
myristique de départ (pastille KBr)
ῡC=O , acide myristique
A
cm-1
Acide myristique
ῡasC=O , Catanionique L16H13
ῡsyC=O , Catanionique L16H13
cm-1
A
Catanionique L16H13
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
144
Ces valeurs varient légèrement en fonction de la structure de l’acide utilisé. Le tableau
1 présenté ci-dessous indique ces valeurs pour chacun des dérivés catanioniques.
Tableau 1 : Déplacements de la bande correspondante à la fonction C=O en IR
Ainsi, l’interprétation des spectres IR a permis de confirmer les résultats obtenus par
RMN, à savoir que l’équilibre acido-basique a été totalement déplacé vers la formation des
paires d’ions catanioniques.
Comme les assemblages catanioniques ont été obtenus par une réaction acido-basique
dans l’eau, le suivi de la réaction par pH-métrie nous informe sur l’évolution de la réaction.
Les acides carboxyliques utilisés présentent une faible solubilité dans l’eau en raison
de leur forte hydrophobie. En conséquence, la transformation des acides en carboxylates peut
être suivie même visuellement car la suspension solide des acides ajoutés à la solution
aqueuse d’aminolactitol disparaît progressivement au cours de la réaction. Cette solubilisation
s’explique par la formation du carboxylate d’ammonium beaucoup plus soluble dans l’eau à
la suite de l’échange de proton entre l’acide et l’aminolactitol. Cette explication est validée
par la variation du pH d’une valeur caractéristique d’un milieu basique de 9,5 à une valeur
finale proche de la neutralité qui varie de 7 à 7,5 en fonction de l’acidité du précurseur utilisé.
Après la synthèse et la caractérisation de ces nouveaux composés bicaténaires
catanioniques, une étude physico-chimique sera réalisée afin d’identifier le meilleur
assemblage catanionique capable d’être utilisé en tant que système de vectorisation des
principes actifs anti-VIH. L’étude sera centrée sur l’identification des caractéristiques
structurales de ces tensioactifs catanioniques ayant une influence sur la formation d’agrégats
supramoléculaires stables dans le temps, tout en gardant une bonne activité anti-VIH et une
faible toxicité.
ῡC=O du carboxylate cm
-1
ῡC=O carboxyle cm
-1
Composé
catanionique (Asymétrique)
(Symétrique) (de l’acide correspondant)
L16H4F8 1567 1404 1711
L16H2F6H4 1568 1402 1715
L16F8 1681 1399 1758
L16H13 1561 1406 1701
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
145
IV PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES COMPOSES
CATANIONIQUES HYBRIDES FLUORES / HYDROGENES
Dans un premier temps, nous présenterons l’étude des propriétés tensioactives suivie
d’une étude de distribution de taille des agrégats formés dans l’eau par ces composés
catanioniques mixtes.
IV.1 Etude des propriétés tensioactives
Les mesures de variation de la tension de surface en fonction de la concentration ont
été réalisées par la méthode de la lame de Wilhelmy. Des solutions de différentes
concentrations de ces composés catanioniques hybrides, obtenues par solubilisation du
produit dans l’eau ont fait l’objet d’une étude par tensiométrie.
Les résultats obtenus montrent que les quatre dérivés catanioniques présentent des
propriétés tensioactives car ils abaissent la tension de surface de la solution aqueuse. Comme
nous pouvons le remarquer sur le graphique (Figure 13) la capacité des composés
catanioniques mixtes à abaisser la tension superficielle est beaucoup plus importante que dans
le cas du composé non fluoré, L16H13. Ce comportement est classique pour les composés
fluorés qui sont plus hydrophobes que leurs analogues hydrogénés, et donc plus présents à
l’interface eau/air. Cependant, la présence d’un premier plateau à des concentrations très
basses (3 - 4,5 x 10-5M), enregistrée seulement pour les tensioactifs catanioniques hybrides,
est peu conventionnelle. Ceci indique la formation d’agrégats supramoléculaires dans la
solution aqueuse à de très faibles concentrations (aux alentour de 10-5M), phénomène qui
pourrait être expliqué par la présence des chaînes fluorées, fortement hydrophobes.
Pourtant, il semble que cette organisation dans la sous– phase apparaisse avant la saturation
en composé amphiphile à l’interface eau /air car, en augmentant la concentration en
tensioactif hybride nous pouvons observer un abaissement important de la tension de surface
jusqu’à une valeur constante qui marque la présence d’un nouveau plateau. Ce comportement
pourrait éventuellement être relié à l’existence d’une transition de phases entre les deux
paliers [47] ou par une réorganisation des chaînes alkyles fluorés/ hydrogénées à l’interface
eau/air, due à la forte lipophobie des segments fluorés. Cette étude sera approfondie par la
suite dans la partie dédiée à l’étude de la morphologie des agrégats formés spontanément dans
l’eau par ces composés mixtes fluorés / hydrogénés.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
146
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
-6,5 -5,5 -4,5 -3,5 -2,5 -1,5
LogC
Ts(m
N/m
)
L16H4F8
L16H2F6H4
L16F8
L16H13
Figure 13: Courbes de variation de la tension superficielle en fonction du
logarithme de la concentration des tensioactifs catanioniques bicaténaires à 25°C
En analysant la figure 13 et les données répertoriées dans le tableau 2, nous pouvons
observer que la diminution des valeurs de tensions de surfaces sur les plateaux correspond à
une augmentation de l’hydrophobie des associations catanioniques, ce qui s’inscrit dans le
comportement classique d’adsorption des tensioactifs à l’interface eau/air. Ainsi, le composé
mixte le moins hydrophobe (L16F8) abaisse la tension de surface de l’eau jusqu’à une valeur
de 31,9 ± 0,6 mN/m, tandis que les solutions concentrées du catanionique (L16H4F8), le
composé le plus hydrophobe de la série, présente une tension minimale de surface de
seulement 22,7 ± 0,2 mN/m.
Concentration (M) TS* palier (m/m) Composés
(hydrophobie décroissante)
organisation
réorganisation organisation réorganisation
L16H4F8 4,6 x 10-5 10-2 36,2 ± 1,2 22,7 ± 0,2
L16H2F6H4 5 x 10-5 5 x 10-3 40,4 ± 0,9 27,1 ± 0,3
L16F8 10-4 10-3 37,8 ± 0,5 31,9 ± 0,6
L16H13 2 x 10-4 - 37,3 ± 0,5 -
L16 3,5 x 10-4 - 38,4 ± 0,3 -
* tension de surface aux paliers
Tableau 2 : Valeurs des concentrations aux paliers et TS palier pour les dérivés
catanioniques bicaténaires à 25°C
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
147
En ce qui concerne le processus d’agrégation, les concentrations obtenues sur le
premier plateau pour les trois associations catanioniques hybrides sont similaires (de 3 à
4,6x10-5M – Tableau 2). Pourtant, les valeurs des concentrations de réorganisation
enregistrées sur le deuxième plateau contredisent les principes de la thermodynamique qui
gouvernent l’auto-organisation des molécules tensioactives et qui prévoient une diminution de
la CAC avec une augmentation de l’hydrophobie du produit. Ainsi, en analysant les valeurs
des concentrations aux paliers présentées dans le tableau 2, nous pouvons remarquer que le
produit le plus hydrophobe (L16H4F8) possède la concentration de réorganisation la plus
élevée (10-2M) tandis que le composé le moins hydrophobe (L16F8) a lui la concentration de
réorganisation la plus basse (10-3 M). Ce comportement sera également discuté par la suite
dans la partie dédiée à l’étude de la morphologie des agrégats formés spontanément dans l’eau
par ces tensioactifs catanioniques hybrides.
Nous pouvons remarquer que malgré une hydrophobie équivalente pour les
tensioactifs catanioniques L16F8 et L16H13, ces composés ont des aptitudes différentes à
abaisser la tension superficielle de l’eau (31,9±0,6 et 37,3±0,5 mN/m respectivement) ainsi
que des valeurs différentes de concentrations de réorganisation et d’organisation
respectivement (10-3 et 2 x 10-4M respectivement). Pourtant, nous pouvons observer la
similitude entre les caractéristiques tensioactives des deux composés en analysant avec plus
d’attention le premier point d’inflexion du profil du catanionique L16F8 (conc. 10-4 M et TSmin
de 37,8±0,5mN/m). Cela signifie que l’association catanionique mixte L16F8 présente pour de
faibles concentrations un comportement proche de celui de son analogue non –fluoré L16H13.
Cependant, à des concentrations plus importantes, l’organisation de ce composé dans l’eau
ainsi qu’à l’interface eau/air est plus complexe. Nous verrons par la suite que la présence
d’une chaîne fluorée à la fois très hydrophobe et lipophobe peut être à l’origine de ce
comportement.
Les études de tensiométrie nous ont permis de comparer les propriétés tensioactives
dans l’eau pour chacune des associations catanioniques bicaténaires. Par la suite, en utilisant
des solutions aqueuses à des concentrations intermédiaires des deux plateaux, nous nous
sommes intéressés à une étude d’agrégation en utilisant la diffusion quasi-élastique de la
lumière et la microscopie à transmission afin de vérifier laquelle des deux concentrations
(d’organisation ou de réorganisation) pourrait être identifiée à la concentration d’agrégation
critique (CAC).
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
148
IV.2 Etude de distribution de taille des agrégats
Comme dans le cas des tensioactifs catanioniques dendritiques nous avons utilisé la
technique de la diffusion quasi-élastique de la lumière afin de déterminer le diamètre
hydrodynamique des agrégats formés spontanément dans l’eau. Nous rappellerons que le
diamètre hydrodynamique d’une particule dépend (dans une solution de viscosité donnée et à
une température connue) de son coefficient de diffusion selon l’équation de Stockes-Einstein.
Les résultats obtenus indiquent que les quatre associations catanioniques forment des
agrégats dans l’eau à des concentrations de 10-3M. Les histogrammes enregistrés ont révélé
des distributions gaussiennes de taille des agrégats allant de 40-60 nm jusqu’à 1000-1500 nm
avec un maximum de population centré aux alentours de 300-600 nm suivant le mélange
catanionique (Figure 14). Nous pouvons remarquer que les composés mixtes
fluorés/hydrogénés aussi bien que le composé de référence non -fluoré, s’auto-organisent
spontanément dans l’eau en formant des agrégats dont la taille est similaire malgré leur
structure chimique différente. Pourtant, nous enregistrons une différence au niveau de la
polydispersité des agrégats. Ainsi, les résultats indiquent que le composé non- fluoré (L16H13)
forme des agrégats supramoléculaires d’une plus grande homogénéité de taille, caractérisés
par un indice de polydispersité de 0,76 tandis que les composés catanioniques mixtes
présentent une valeur de polydispersité d’approximativement 0,34-0,38.
Il est important de souligner que l’analyse par cette technique des solutions de faibles
concentrations (5x10-4M – 5x10-5M – limite inférieure de détection de l’appareil) de ces
tensioactifs catanioniques hybrides nous indique la présence d’agrégats supramoléculaires.
Ces observations confirment le fait que l’agrégation spontanée de ces tensioactifs dans l’eau a
lieu à des concentrations basses (10-4 - 10-5 M, en fonction du produit) donc, bien avant
l’apparition du plateau final (concentrations supérieures à 10-3 M) présent sur les graphiques
de tensiométrie (Figure 13). Ainsi, ces résultats corroborent l’existence des CAC à des
concentrations de 10-4 - 10-5 M, ce qui correspond au premier palier identifié sur le profil de la
variation de la tension superficielle en fonction du logarithme de la concentration en
tensioactif (Figure 13).
La technique de la diffusion quasi-élastique de la lumière nous a également permis de
suivre la stabilité des agrégats dans le temps pour ces mêmes solutions ayant une
concentration de 10-3M. Ainsi, nous avons pu constater une stabilité d’approximativement 7
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
149
jours pour les solutions de tensioactifs catanioniques hybrides tandis que, la stabilité des
solutions du composé catanionique complètement hydrogéné n’est pas supérieure à 12 heures
dans les conditions expérimentales (10-3M et 25°C).
L16H4F8 L16H2F6H4
diamètre hydrodynamique moyen = 290 nm indice de polydispersité = 0,35
diamètre hydrodynamique moyen = 356 nm indice de polydispersité = 0,38
L16F8 L16H13
diamètre hydrodynamique moyen = 275 nm indice de polydispersité = 0,34
diamètre hydrodynamique moyen = 297 nm indice de polydispersité = 0,76
Figure 14 : Histogrammes représentant la distribution de taille des agrégats formés
spontanément par les dérivés catanioniques bicaténaires (c = 10-3M, T = 25°C)
Diamètre (nm) Diamètre (nm)
Intensité (%
)
Intensité (%
)
Diamètre (nm) Diamètre (nm)
Intensité (%
)
Intensité (%
)
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
150
Afin d’améliorer la stabilité des solutions dans le temps et d’homogénéiser la
distribution de la taille des agrégats nous avons soumis les échantillons aux ultrasons (en
utilisant un bain et non une sonde à ultra-sons) pendant une courte période de temps
(approximativement 10 minutes). Ainsi, les histogrammes obtenus montrent toujours une
distribution gaussienne de la taille des agrégats, mais la variation des diamètres
hydrodynamiques est moins importante, allant de 40 nm jusqu’à 200-280 nm avec des
populations majoritaires centrées aux alentours de 100-150 nm suivant le mélange
catanionique.
Nous exemplifierons en présentant les histogrammes obtenus pour le tensioactif
catanionique L16H4F8 (Figure 15). Afin d’affiner notre étude nous avons suivi la stabilité dans
le temps de ces solutions à 25 et à 37°C. Comme nous pouvons le remarquer en analysant les
données répertoriées au-dessous des histogrammes (Figure 15), la variation de la taille des
agrégats due à l’augmentation de la température est très faible. En effet, les agrégats des
solutions conservés à 37°C possèdent des diamètres hydrodynamiques plus faibles d’une
dizaine de nm (~ 20 nm pour le composé L16H4F8) par rapport aux agrégats des solutions
conservées à 25°C.
L16H4F8 à 25°C L16H4F8 à 37°C
diamètre hydrodynamique moyen = 140 nm indice de polydispersité = 0,18
populations : 125 nm (34%) ; 157 (38%) ; 198 nm (15%)
diamètre hydrodynamique moyen = 121 nm indice de polydispersité = 0,26
populations : 105 nm (28%) ; 140 (53%) ; 184 nm (18%)
Figure 15 : Histogrammes représentant la distribution de taille des agrégats formés par
le dérivé catanionique mixte L16H4F8 dans l’eau après l’action des ultra-sons (c = 10-3M)
Diamètre (nm) Diamètre (nm)
Intensité (%
)
Intensité (%
)
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
151
A la suite de l’utilisation des ultra-sons nous avons observé une augmentation de la
stabilité dans le temps des solutions de catanioniques mixtes jusqu’à 11 jours. Cependant, la
stabilité dans le temps du composé non- fluoré L16H13 n’a pas été améliorée, restant dans une
gamme inférieure à 12 heures.
La stabilité nettement supérieure dans le temps des agrégats moléculaires formés par
les composés tensioactifs hybrides par rapport à ceux formés par le composé non- fluoré nous
permet d’affirmer que ces catanioniques mixtes sont plus appropriés à une utilisation en tant
que vecteurs. A ce stade de l’étude, nous n’avons pas décelé de différence de comportement
physico-chimique entre les composés fluorés/hydrogénés qui pourrait nous permettre choisir
le système catanionique le plus adapté à l’application envisagée.
IV.3 Etude de la morphologie des agrégats
Comme nous l’avons présenté dans le chapitre précédent, la technique de microscopie
électronique en transmission (MET) est une méthode couramment utilisée pour l’analyse de la
structure des agrégats supramoléculaires. Deux méthodes différentes ont été employées pour
la préparation des échantillons, la méthode de coloration négative et la cryofracture.
L’analyse des micrographies électroniques obtenues avec ces deux techniques de MET
révèle la formation spontanée de vésicules pour les quatre dérivés catanioniques bicaténaires
(Figure 16 et 17). Les résultats obtenus avec ces deux techniques complémentaires sont en
accord, car à la fois la forme et la taille des vésicules de chaque assemblage catanionique sont
similaires.
Nous pouvons observer que toutes les associations catanioniques présentent une
population de vésicules dont la distribution de taille est extrêmement polydisperse allant de 40
- 60 nm à plus de 1 ou 2µm de diamètre, en fonction de l’hydrophobie du composé (Figure 16
et 17). Ainsi, l’association catanionique non- fluoré (L16H13), la moins hydrophobe de cette
famille de composés, se caractérise par la formation d’une population de vésicules d’un
diamètre d’approximativement 40nm, la présence de vésicules d’un diamètre supérieur à 1µm
étant moins importante. Tandis que les trois associations catanioniques fluorés / hydrogénés
forment des vésicules dont la population majoritaire est centrée aux alentours de 500nm de
diamètre. De plus, la présence de vésicules dont le diamètre est supérieur à 1µm est plus
importante par rapport au composé de référence non- fluoré. Le composé le plus hydrophobe,
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
152
L16H4F8, a même la capacité de former spontanément dans l’eau des vésicules dont le
diamètre dépasse 2µm. La formation d’agrégats moléculaires dont la taille est beaucoup plus
importante est un comportement habituel pour les composés fluorés qui peut être expliqué par
la plus grande rigidité et le volume de la chaîne fluorée.
Figure 16 : Micrographies électroniques (cryofracture (A) et technique par coloration
négative (B et C)) des vésicules formées par le tensioactif catanionique L16H13 (10-2M)
L16H4F8 L16H2F6H4 L16F8
Figure 17 : Micrographies électroniques (cryofracture) des vésicules formées par les
tensioactifs catanioniques hybrides fluorés/hydrogénés (10-2M)
A 2000 nm B 500 nm C 1000 nm
A 100 nm
B 100 nm
C 500 nm
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
153
L’analyse détaillée de la morphologie des ces vésicules "géantes" nous a permis
d’observer leur structure multilamellaire, de type "oignon" avec une structure en multi-
couches (Figure 17C et Figure 18 - exemplifié pour le catanionique mixte L16F8).
Figure 18 : Micrographies électroniques (cryofracture) des vésicules formées par le
catanionique hybride L16F8 (10-2M)
A des concentrations plus importantes en tensioactif (10-3 - 10-2M) nous avons
également observé dans le cas des catanioniques hybrides la coexistence de vésicules et de
filaments (Figure 17A et Figure 19) d’une longueur de quelques centaines de nm et d’une
largeur d’approximativement 10 nm. Ces filaments peuvent provenir d’une partielle
ségrégation des chaînes alkyles hydrogénées de l’aminolactitol et des chaînes fluorées de
l’acide carboxylique. Cette nouvelle forme d’agrégation pourrait être à l’origine de la
présence du palier final observé sur les courbes de tensiométrie. Le fait que la tension de
surface sur le deuxième palier des catanioniques hybrides soit beaucoup plus basse (de 23 à
32 mN/m, en fonction du composé mixte) que celle de l’aminolactitol L16 constitutif (38
mN/m), indique une présence plus importante de la chaîne fluorée à l’interface eau/air.
Figure 19 : Micrographies électroniques (A – cryofracture, B - technique par coloration
négative) des vésicules et des filaments formés par le catanionique hybride
L16F8 (2x10-3M)
300 nm
A 350 nm B 100 nm
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
154
De plus, cette partielle ségrégation pourrait également expliquer l’existence du
deuxième palier enregistré sur les courbes de tensiométrie pour ces trois associations
catanioniques. Nous rappelons que les valeurs de concentrations de réorganisation (10-2,
5x10-3 et 10-3 M) enregistrées sont inversement proportionnelles à l’hydrophobie des
composés (L16H4F8, L16H2F6H4 et L16F8 respectivement). Comme nous l’avons déjà noté, ce
comportement s’oppose aux principes de la thermodynamique qui gouvernent l’auto-
organisation des molécules tensioactives et qui prévoient une diminution de la CAC pour une
augmentation de l’hydrophobie du produit. Nous pouvons en déduire que d’autres facteurs,
comme la ségrégation partielle peuvent être responsables de ce comportement peu
conventionnel.
Ainsi, en analysant la structure des associations catanioniques, leurs valeurs de
concentrations de réorganisation et en tenant compte du phénomène de ségrégation partielle
nous pouvons faire les observations suivantes. Le composé L16F8 n’ayant pas de partie
hydrogénée dans la structure de l’acide carboxylique (qui pourrait renforcer l’interaction avec
la chaîne hydrogénée du L16) a une tendance plus prononcée à la ségrégation car sa
concentration de réorganisation est de seulement 10-3M. De la même façon, nous observons
que dans le cas de l’association catanionique L16H2F6H4, la cohésion des deux chaînes
fluorée / hydrogénée semble être renforcée par la présence des segments hydrocarbonés dans
la structure de l’acide, engendrant une transition à des concentrations supérieures (5x10-3M)
au composé L16F8. Enfin, le tensioactif catanionique L16H4F8 comportant un espaceur
hydrocarboné en C4 entre le groupement acide et la chaîne fluorée en C8 semble présenter une
cohésion plus importante car la ségrégation partielle a lieu à des concentrations encore plus
importantes (10-2 M).
Ces hypothèses pourraient expliquer les valeurs de concentrations de réorganisation
obtenues pour les trois tensioactifs catanioniques hybrides. Nous insisterons sur le fait que les
filaments ont été décelables seulement à des concentrations supérieures aux valeurs de
concentrations de réorganisation caractéristiques pour chaque association hybride fluorée /
hydrogénée. Pourtant, la présence de vésicules a été observée même à des concentrations
inférieures à ces valeurs de concentrations de réorganisation. Cela confirme que la CAC de
ces tensioactifs catanioniques mixtes est caractérisée par l’apparition du premier plateau sur
les courbes de tensiométrie. Ainsi, la diminution de la tension de surface avec l’augmentation
de la concentration en produit pourrait être expliquée par une transition de phases des agrégats
vésiculaires (premier plateau) vers la coexistence de vésicules et de filaments à des
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
155
concentrations plus importantes (>10-3M), correspondant au deuxième plateau sur les courbes
de tensiométrie.
Ces résultats ont mis en lumière l’importance de la présence d’une partie
hydrocarbonée dans la structure de l’acide carboxylique qui peut offrir une meilleure cohésion
et miscibilité aux agrégats supramoléculaires formés spontanément par ces tensioactifs
catanioniques mixtes fluorés / hydrogénés.
Les études de la diffusion de la lumière nous ont montré que la stabilité dans le temps
ainsi que la distribution de taille des agrégats formés par ces tensioactifs catanioniques
hybrides peuvent être modifiées suite à l’action des ultra-sons. Afin de confirmer ces résultats
nous avons analysé en MET les échantillons préparés dans les mêmes conditions d’utilisation
des ultra-sons que celles employées auparavant pour la préparation des solutions étudiées en
diffusion de la lumière (solutions concentrées (10-3M) préparées dans l’eau et soumises aux
ultrasons dans un bain à ultra-sons pour une période de temps d’environ 10 min.). Les
micrographies obtenues révèlent la formation principalement de trois populations de vésicules
unilamellaires dont le diamètre varie de 50 à 200 nm (exemplifié sur le composé L16F8 –
Figure 20). Ainsi, nous observons que les vésicules multilamellaires formées spontanément
par les trois associations catanioniques hybrides et dont les tailles varient entre 300 et 1000
nm sont transformées par l’utilisation des ultra-sons en vésicules unilamellaires d’un diamètre
inférieur à 200nm.
Figure 20 : Micrographies électroniques (cryofracture) des vésicules formées par le
catanionique hybride L16F8 (10-3M) après l’action des ultra-sons
250 nm
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
156
Nous mentionnerons également que par l’utilisation des ultrasons, la formation de
filaments à des concentrations supérieures aux concentrations de réorganisation est diminuée,
l’apport d’énergie favorisant la formation d’agrégats vésiculaires.
Les résultats de MET corroborent donc les résultats obtenus en diffusion de la lumière
au niveau de la taille des objets formés par ces nouveaux catanioniques bicaténaires.
La formation spontanée dans l’eau de vésicules, dont la taille et la stabilité dans le
temps peuvent être contrôlées et améliorées par l’action des ultra-sons, nous permet de
considérer cette nouvelle famille de composés catanioniques fluorés / hydrogénés comme
possédant les propriétés de base pour un système de transport d’un principe actif.
De par la présence de l’espaceur butyle au sein du tensioactif catanionique L16H4F8,
cette association semble se distinguer parmi les trois composés hybrides en raison d’une plus
importante cohésion des chaînes fluorées / hydrogénées ce qui se traduit par une ségrégation
partielle à des concentrations supérieures à 10-2M.
Etant donné que nous envisageons l’utilisation de ces tensioactifs catanioniques
hybrides en tant que transporteurs spécifiques de principes actifs anti-VIH, nous nous
intéresserons par la suite à l’étude de leur interaction avec un modèle membranaire
bidimensionnel constitué d’une monocouche de phospholipides. Le comportement de nos
tensioactifs vis-à-vis de ce modèle membranaire nous donnera par analogie, une indication de
leur influence sur les membranes cellulaires.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
157
V ETUDE DE L’INTERACTION ENTRE LES COMPOSES
CATANIONIQUES ET DES MONOCOUCHES DE PHOSPHOLIPIDES
Afin d’étudier l’incorporation et la persistance de ces tensioactifs catanioniques mixtes
sur les membranes cellulaires, nous nous sommes intéressés à l’analyse des interactions entre
ces associations catanioniques hybrides avec une monocouche de DPPC (DiPalmitoyl-
Phosphatidyl Choline). Ce modèle membranaire sera utilisé comprimé à 30mN/m - pression
latérale moyenne existant au sein des membranes cellulaires.
Comme nous l’avons déjà présenté dans le chapitre précédent, les monocouches de
DPPC ont été préparées à la surface d’une solution saline (0,15M NaCl) à la température
constante de 20°C et maintenues à une pression de 30mN/m grâce aux barrières mobiles de la
cuve de Langmuir. L’injection des composés tensioactifs (5x10-3M dans l’eau) a été faite de
manière homogène dans la sous-phase aqueuse (0,15M NaCl) et nous avons enregistré les
variations de l’aire moléculaire au cours du temps.
Nous devons souligner que ces expériences ont été réalisées à des rapports molaires
composé tensioactif : DPPC de 1 :1, qui est loin d’une situation réelle dans un milieu
biologique, mais qui a été choisi afin d’obtenir par un effet de "zoom" un meilleur aperçu des
interactions entre les composés catanioniques étudiés et les monocouches de DPPC.
Toutefois, les concentrations finales en tensioactifs restent largement inférieures (2,7 x 10-7M)
à leurs CAC.
Les résultats présentés figure 21A montrent que malgré la pression latérale importante,
les composés tensioactifs s’incorporent dans la monocouche de DPPC. Nous remarquons une
importante variation de l’aire moléculaire dans le cas des tensioactifs catanioniques
comportant une chaîne fluorée en C8, ce qui traduit la pénétration des ces composés dans la
monocouche. Le composé L16H2F6H4 présente une incorporation moins intense que les deux
autres tensioactifs hybrides (L16H4F8 et L16F8). Les isothermes enregistrées (Figure 21B)
confirment la présence moins importante de ce produit à une interface sur laquelle il y a déjà
une monocouche de DPPC, cette fois-ci non comprimée.
En ce qui concerne le tensioactif catanionique non –fluoré L16H13 et l’aminolactitol L16
constituant, nous observons une variation plus faible de l’aire moléculaire. Cela pourrait
s’expliquer par une incorporation moins importante de ces produits dans la monocouche
condensée de DPPC ou par le volume plus réduit des chaînes alkyles hydrocarbonées
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
158
rapportées à celles qui sont fluorées. Nous rappelons que les chaînes fluorées sont plus
volumineuses que les chaînes hydrogénées, ayant des sections transversales
d’approximativement 30 Å2 contre 20 Å2.
30 40 50 60 70 80 90 100 110
0
10
20
30
40
50
60
Pression de surface
mN/m
Aire par molécule, Å2
DPPC
DPPC+ L16H2F6H4 1,66*10
-8M
DPPC+ L16H13 1,66*10
-8M
DPPC+ L16F8 1,66*10
-8M
DPPC+ L16H4F8 1,66*10
-8M
Figure 21: Incorporation des tensioactifs catanioniques bicaténaires dans une
monocouche de DPPC comprimée à 30m/m (A) ; isothermes de compression des
monocouches mixtes DPPC – tensioactif catanionique (B)
(0,15M aCl, 20°C)
Ces expériences nous ont également permis de suivre dans le temps l’interaction entre
les tensioactifs étudiés et la monocouche de DPPC. Comme nous pouvons le remarquer sur la
figure 21A, l’association catanionique non- fluorée ainsi que l’aminosucre L16 persistent dans
le film phospholipidique même après un intervalle de temps supérieur à 8 heures. La
différence d’aire par molécule pour la DPPC avant et après l’insertion du catanionique L16H13
étant d’environ 10 Å2.
Les tensioactifs catanioniques hybrides par contre, présentent un comportement
différent car juste après un maximum d’incorporation, nous observons le déclenchement d’un
processus d’expulsion du composé de la monocouche de DPPC. Comme il s’agit d’un
processus significativement plus lent que le processus d’adsorption, l’expulsion complète des
tensioactifs mixtes de la couche monomoléculaire de phospholipides se réalise après une
période de temps supérieure à 6 heures. Au final, la différence d’aire par molécule pour le
DPPC avant et après l’insertion – l’expulsion des catanioniques hybrides est négligeable
(d’environ 3 Å2).
Afin de mieux comprendre les changements provoqués au sein de la monocouche de
DPPC par la pénétration des tensioactifs étudiés, nous avons réalisé des mesures de
spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) sur les films, dont les courbes
viennent d’être présentés (Figure 21A).
A) B)
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
159
Les spectres IRRAS enregistrés pour les monocouches de DPPC en absence et en
présence de composés tensioactifs ainsi que les spectres témoins des tensioactifs hybrides
seront présentés et analysés par la suite.
En analysant la région caractéristique des vibrations d’élongation des groupements
méthylène (Figure 22) qui apparaissent dans la région spectrale 2800-3000 cm-1, nous
pouvons observer que l’incorporation ou l’expulsion des tensioactifs provoquent des
changements mineurs dans la monocouche de DPPC. Ainsi, les spectres obtenus révèlent la
présence des bandes de vibrations asymétriques et symétriques d’élongations des
groupements CH2 (ῡas(CH2) = 2920 cm-1 et ῡs(CH2)= 2850 cm
-1) caractéristiques de la DPPC
pure comprimée à 30mN/m. Ces valeurs indiquent que le degré d’ordre (conformation trans)
au sein des chaînes alkyles de la DPPC n’est pas perturbé lors du processus d’incorporation
et/ou d’expulsion des tensioactifs catanioniques. Ces observations sont valables même dans le
cas de l’incorporation des composés catanioniques hybrides.
30 mN/m
-0,01
-0,006
-0,002
0,002
0,006
0,01
28002850290029503000
nombre d'onde (cm-1)
-log(R
/R0)
DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16 DPPC 30 inj L16 - 1h DPPC 30 inj L16 - 6hL16 30mN/m
30 mN/m
-0,012
-0,007
-0,002
0,003
0,008
28002850290029503000
nombre d'onde (cm-1)
-log(R
/R0)
DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16H13
DPPC 30 inj L16H13 - 1h DPPC 30 inj L16H13 - 6h
30 mN/m
-0,01
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
28002850290029503000
nombre d'onde (cm-1)
-log(R
/R0)
DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16H2F6H4DPPC 30 inj L16H2F6H4 - 1h DPPC 30 inj L16H2F6H4 - 6hL16H2F6H4 30mN/m
30 mN/m
-0,012
-0,007
-0,002
0,003
0,008
28002850290029503000nombre d'onde (cm-1)
-log(R
/R0)
DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16F8DPPC 30 inj L16F8 - 1h DPPC 30 inj L16F8 - 6h L16F8 30mN/m
Figure 22: Bandes caractéristiques des vibrations d’élongation des groupements CH2 des
spectres IRRAS du DPPC avant et après injection des composés tensioactifs – suivi dans
le temps (A)- L16 ; B)- L16H13; C)- L16H2F6H4 ; D)- L16F8)
(polarisation – p, αi = 40°, T = 20°C, pression de compression 30 mN/m)
ῡs(CH2) 2850
ῡas(CH2) 2920
2854 2924
A)
ῡas(CH2) 2920
ῡs(CH2) 2850
B)
2854 2923
ῡas(CH2) 2920
ῡs(CH2) 2850
C)
2854 2923
ῡas(CH2) 2920
ῡs(CH2) 2850
D)
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
160
Les spectres enregistrés pour les composés mixtes L16H2F6H4, L16F8 ainsi que pour
l’aminolactitol L16 en absence de DPPC mettent en évidence la présence des bandes de faible
intensité des vibrations d’élongation des groupements méthylène à ῡas(CH2) = 2923 cm-1 et
ῡs(CH2)= 2854 cm-1 (Figure 22C, D et A respectivement). Ces valeurs indiquent une
conformation gauche des chaînes alkyles hydrocarbonées, donc un degré important de
désordre. La faible intensité des bandes peut être due soit à une faible concentration des
chaînes alkyles hydrocarbonées dispersées parmi les chaînes fluorées, beaucoup plus
volumineuses, soit à un angle d’inclinaison plus important. Cette même explication peut
justifier également la diminution d’intensité des bandes CH2 de la DPPC engendrée par
l’incorporation des tensioactifs catanioniques mixtes dans la monocouche phospholipidique.
D'ailleurs, nous observons qu’après 6 heures, le spectre de la DPPC retrouve le profil
initial enregistré avant l’injection des composés tensioactifs mixtes dans la sous – phase
(Figure 21A et Figure 22C et D). Cela indique à la fois, l’expulsion complète des associations
catanioniques hybrides de la monocouche vers la sous - phase aqueuse ainsi que l’absence
d’un effet désorganisateur de la monocouche phospolipidique.
La persistance des tensioactifs non – fluorés (L16 et L16H13) dans la monocouche de
phospholipides ne modifie pas le profil spectral de la DPPC ce qui révèle le manque de
modifications majeures au niveau des chaînes alkyles (Figure 22A et B).
Par la suite, nous avons analysé la région caractéristique de la tête polaire du DPPC
afin d’identifier les modifications provoquées par la pénétration, la persistance et
respectivement l’expulsion des tensioactifs catanioniques de la monocouche.
Nous pouvons observer que l’incorporation et la persistance de l’aminolactitol L16
dans le modèle membranaire ne produit pas de modifications au niveau des groupements
phosphates du DPPC (Figure 23A). Les mêmes observations sont valables pour le
catanionique non- fluoré L16H13 jusqu’à une période de temps limitée à 6 heures, après
laquelle nous pouvons remarquer (Figure 23B) de faibles perturbations au niveau des
groupements PO2-.
En ce qui concerne les tensioactifs catanioniques mixtes, nous pouvons observer
(Figure 23C et D) que la forte incorporation des composés dans le modèle membranaire est
mise en évidence par l’apparition des bandes de vibrations d’élongation asymétriques et
symétriques [48] des groupements CF2 ( ῡas(CF2) = 1241 et 1195cm-1; ῡs(CF2)= 1153 et 1141
cm-1 pour les composés L16F8 et L16H2F6H4 respectivement). Il est intéressant d’observer
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
161
qu’après 6 heures, le composé L16F8 est complètement expulsé de la monocouche de DPPC,
tandis que le composé L16H2F6H4 y est toujours présent. Il faut mentionner que l’association
catanionique L16H4F8 a un comportement identique au composé L16F8.
30 mN/m
-0,004
0
0,004
1000110012001300nombre d'onde (cm-1)
-log(R/R
0)
DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16 DPPC 30 inj L16 - 1h DPPC 30 inj L16 - 6hL16 30mN/m
30 mN/m
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
0,004
0,006
1000110012001300
nombre d'onde (cm-1)
-log(R/R0)
DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16H13
DPPC 30 inj L16H13 - 1h DPPC 30 inj L16H13 - 6h
30 mN/m
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
0,004
0,006
1000110012001300
nombre d'onde (cm-1)
-log(R
/R0)
DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16H2F6H4DPPC 30 inj L16H2F6H4 - 1h DPPC 30 inj L16H2F6H4 - 6hL16H2F6H4 30mN/m
30 mN/m
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
0
0,002
0,004
0,006
0,008
1000110012001300nombre d'onde (cm-1)
-log(R/R0)
DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16F8DPPC 30 inj L16F8 - 1h DPPC 30 inj L16F8 - 6h L16F8 30mN/m
Figure 23: Bandes caractéristiques de la tête polaire des spectres IRRAS du DPPC avant
et après injection des composés tensioactifs – suivi dans le temps
(A)- L16 ; B)- L16H13; C)- L16H2F6H4 ; D)- L16F8) (polarisation – p, αi = 40°, T = 20°C, pression de compression 30 mN/m)
Ces résultats montrent que les composés L16H13 et L16H2F6H4 ont une plus grande
affinité pour le modèle membranaire de DPPC, le premier par une persistance et une absence
d’expulsion hors de la monocouche phospholipidique et le deuxième par une expulsion
incomplète et très lente. Il est important de noter ce comportement afin de le corréler par la
suite avec les résultats des tests biologiques réalisés sur des cultures cellulaires.
ῡas(PO2-)
1227 ῡs(PO2
-) 1088
A)
ῡas(PO2-)
1227 ῡs(PO2
-) 1088
B)
ῡas(PO2-)
1227
ῡs(PO2-)
1088
ῡas(CF2) 1195
ῡs(CF2) 1141
C)
ῡas(PO2-)
1227
ῡs(PO2-)
1088
δ(CCC)F 1207
ῡs(CF2) 1153
ῡas(CF2) 1241
D)
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
162
Soulignons que l’importante interaction entre ces composés et les molécules de DPPC
ne doit pas être interprétée comme un effet négatif car elle a été volontairement provoquée par
les conditions expérimentales utilisées (un rapport molaire composé : DPPC de 1 :1). Comme
nous l’avons déjà noté, ceci a été réalisé afin de pouvoir faire une meilleure différenciation
entre le comportement des composés utilisés vis-à-vis des monocouches de DPPC et ce dans
les limites de sensibilités imposées par l’analyse IRRAS.
Les deux associations catanioniques hybrides L16H4F8 et L16F8, malgré leur taux
important d’incorporation et de variation de l’aire moléculaire, sont complètement exclues de
la monocouche de DPPC et resolubilisées dans la sous - phase aqueuse. De plus, en se
resolubilisant, ces tensioactifs hybrides ne désorganisent pas la monocouche de DPPC. La
force motrice de ce processus d’expulsion des composés catanioniques mixtes est constituée
par le fort caractère lipophobe du segment fluorocarboné, qui engendre la ségrégation des
chaînes alkyles hydrocarbonées du DPPC. L’aminolactitol L16 semble participer également à
ce processus d’expulsion de la monocouche de DPPC, mais une ségrégation partielle entre les
constituants de l’association catanionique n’est pas impossible.
Ayant mis en évidence l’absence de perturbations majeures du modèle membranaire
suite à l’interaction avec ces tensioactifs catanionique hybrides étudiés, nous nous sommes
intéressés par la suite à l’analyse des résultats des tests biologiques obtenus in vitro afin de
déterminer leur spécificité et leur viabilité cellulaire.
VI EVALUATION DES PROPRIETES DE VECTORISATION SUR CELLULES INFECTEES PAR LE VIH
VI.1 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des associations catanioniques hybrides analogues du GalCer
Comme nous l’avons mentionné dans le chapitre précédent, les tests antiviraux ont été
réalisés in vitro par le Dr. Anne-Marie Aubertin et ses collaborateurs au laboratoire de
l’Institut de Virologie INSERM à Strasbourg. Nous rappelons que les tests impliquent
l’utilisation des cellules lymphocytaires T, CEM-SS, exprimant à leur surface le récepteur
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
163
CD4 et étant permissives au VIH, la souche lymphotropique de référence étant le VIH-1 Lai
(III B).
Nous nous intéresserons à l’activité anti-VIH de ces nouveaux composés
catanioniques bicaténaires analogues du GalCer afin de quantifier leur spécificité pour le
virus, tout en vérifiant leur toxicité cellulaire. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le
tableau 3.
Composés CI 50 (µµµµM) CC50 (µµµµM) IT L16 7,1 ± 1,6 75 ± 8 10
L16H4F8 4,2 ± 1,3 55,5 ± 7,5 13
L16H2F6H4 11,3 ± 2,7 37,5 ± 7,5 3
L16F8 4,4 ± 0,2 52,5 ± 0,5 12
L16H13 8,2 ± 1 > 10 > 1
Tableau 3 : Résultats biologiques des catanioniques bicaténaires analogues du GalCer
Les tests anti-VIH des catanioniques bicaténaires ont montré que ces composés
présentent des activités antivirales qui varient de 4,2 à 11,3 µM (Tableau 3). Comme nous
pouvons l’observer, les deux associations catanioniques comportant une partie fluorée en C8
(L16H4F8 et L16F8) présentent les meilleures activités antivirales (4,2 et 4,4 µM
respectivement) de cette famille de composés. Comparativement à l’activité antivirale de
l’aminolactitol constituant L16 (7,1 µM) ces résultats sont plutôt modestes car leur activité est
améliorée seulement d’un facteur 1,6. Cependant, ces valeurs de concentrations inhibitrices
du VIH sont tout à fait positives car elles mettent en valeur une bonne reconnaissance
spécifique entre ces deux composés catanioniques hybrides et le virus.
Les deux autres tensioactifs catanioniques (L16H2F6H4 et L16H13) sont moins actifs
contre le VIH (CI50 de 11,3 et 8,2 µM respectivement) par rapport aux composés sélectionnés
antérieurement (L16H4F8 et L16F8), l’aminolactitol L16 inclus. De plus, ces deux composés
(L16H2F6H4 et L16H13) possèdent les valeurs les plus basses de CC50, ce qui montre qu’ils sont
également les associations les plus toxiques de cette série de catanioniques. En conséquence,
ces associations catanioniques sont très peu sélectives (IT de respectivement 3 et >1).
La toxicité des composés L16H4F8 et L16F8 est légèrement augmentée par rapport à
l’aminolactitol L16 mais, ces tensioactifs catanioniques arrivent à conserver une valeur de
l’indice thérapeutique supérieure à 10 (13 et 12 respectivement).
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
164
Malgré la similitude des propriétés physico-chimiques entre les trois tensioactifs
catanioniques hybrides, comme nous l’avons précédemment présenté, le composé L16H13H4
présente une toxicité supérieure et une activité biologique inférieure aux composés mixtes
comportant une chaîne fluorée en C8 (Tableau 3). L’intérêt thérapeutique de ce produit ainsi
que du composé totalement hydrogéné L16H13 étant limité, nous n’avons pas réalisé d’études
physico-chimiques supplémentaires pour ceux-ci.
Ainsi, à la suite de l’interprétation de ces résultats, les meilleurs candidats pour
l’application envisagée sont les associations catanioniques comportant une partie fluorée en
C8 : L16H4F8 et L16F8.
Afin de déterminer l’état d’agrégation (forme monomère ou agrégée) à la CI50 et CC50
nous avons étudié les propriétés tensioactives et d’agrégation de ces tensioactifs catanioniques
bicaténaires hybrides dans un milieu proche du milieu biologique.
L’ensemble de ces résultats nous permettra de réaliser une analyse plus précise de la
relation structure – organisation – activité biologique de ces composés.
VI.2 Evaluation des propriétés physico-chimiques dans les conditions de vectorisation
Afin de déterminer une corrélation entre les propriétés physico-chimiques et
biologiques de ces tensioactifs catanioniques bicaténaires nous avons étudié leur
comportement d’agrégation et de stabilité dans le temps dans un milieu proche du milieu
biologique, tout en essayant le plus possible de reproduire les conditions expérimentales
utilisées pour les essais biologiques in vitro.
Ainsi, en utilisant des solutions aqueuses concentrées (5x10-3M), soumises aux
ultrasons, de ces tensioactifs catanioniques bicaténaires nous avons préparé par dilution dans
une solution saline (0,15M NaCl) des solutions de différentes concentrations qui ont fait
l’objet d’une étude par tensiométrie, d’une étude par MET et en diffusion de la lumière. De
plus, la solution saline permet d’exercer sur les tensioactifs catanioniques une force ionique
équivalente à celle qui existe en milieu biologique.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
165
Les résultats des mesures de tensiométrie obtenus pour ces solutions salines révèlent
des courbes de tension de surface (Figure 24) similaires à celles précédemment obtenues pour
les solutions préparées directement dans l’eau. Nous observons toujours, dans le cas des
tensioactifs hybrides, la présence de deux paliers, le premier marquant une organisation et le
deuxième une possible réorganisation des molécules de tensioactifs. Nous mentionnons
également que les mesures ont été réalisées à une température de 25°C et non à 37°C
(conditions biologiques) afin de réduire l’évaporation du solvant. Les données obtenues sont
répertoriées dans le tableau 4.
15
25
35
45
55
65
-6,5 -5,5 -4,5 -3,5 -2,5
Log C
Ts (mN/m
)
L16F8
L16H4F8
Figure 24: Courbes de variation de la tension superficielle en fonction du logarithme de
la concentration des tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et L16F8 (0,15M NaCl, 25°C)
Concentration (µµµµM) TS palier (m/m)
Composés CAC réorganisation CAC réorganisation
CI 50 (µµµµM)
CC50 (µµµµM)
L16H4F8 8 384 37,2± 0,8 23,9± 0,4 4,2 ± 1,3 55,5 ± 7,5
L16F8 16 740 37,1± 1,1 31,9± 0,6 4,4 ± 0,2 52,5 ± 0,5
Tableau 4 : Valeurs des CAC et de réorganisation, TS et paramètres biologiques des
dérivés catanioniques hybrides L16H4F8 et L16F8 (0,15M NaCl, 25°C)
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
166
En utilisant la diffusion de la lumière nous avons pu observer la persistance des
agrégats supramoléculaires formés par ces tensioactifs dans l’eau lors d’un processus de
dilution dans une solution saline (solutions préparées comme décrit précédemment). Nous
exemplifierons avec les histogrammes obtenus pour les tensioactifs L16H4F8 et L16F8 à 37°C
(Figure 25), en mentionnant que les résultats obtenus à la suite des mesures réalisées à 25°C
sont très similaires, les diamètres hydrodynamiques étant légèrement augmentés (~ 20nm).
Le suivi au cours du temps de ces solutions nous à révélé une stabilité jusqu’à 6 jours, quelle
que soit la température de conservation 25 ou 37°C.
L16H4F8 L16F8
diamètre hydrodynamique moyen = 118 nm indice de polydispersité = 0,20
diamètre hydrodynamique moyen = 84 nm indice de polydispersité = 0,28
Figure 25: Histogrammes représentant la distribution de taille des agrégats des
tensioactifs L16H4F8 et L16H4F8 après dilution dans une solution aCl
(cfinale = 10-3M, 37°C)
La présence d’agrégats vésiculaires dans les solutions étudiées en diffusion de la
lumière a été confirmée par l’analyse des micrographies électroniques obtenues en TEM en
utilisant la technique du contrastant (Figure 26).
Diamètre (nm) Diamètre (nm)
Intensité (%
)
Intensité (%
)
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
167
Figure 26 : Micrographies électroniques (technique du contrastant) des vésicules
existantes dans une solution diluée du tensioactif L16F8 (cfinale = 10-3M, 37°C))
Afin d’avoir la confirmation qu’à des concentrations correspondant aux concentrations
actives et non toxiques, les vésicules sont toujours présentes dans la solution aqueuse après
dilution, nous avons utilisé la MET. Ainsi, les solutions de tensioactifs catanioniques mixtes
étudiées ont été préparées à des concentrations (20µM) légèrement supérieures à leur CAC (8
et 16 µM respectivement) par dilution d’une solution aqueuse concentrée (5x10-3M) soumise
aux ultrasons, dans une solution de NaCl 0,15M. Avant d’être analysés, ces échantillons ont
été maintenus à une température de 37°C pour une période de temps d’environ 6 heures afin
de leur permettre d’atteindre l’équilibre.
Les micrographies obtenues (Figure 27) nous ont permis de visualiser la présence de
vésicules dont la taille varie entre 40 et 120 nm de diamètre.
Figure 27 : Micrographies électroniques (méthode du contrastant) des vésicules formées
par les catanioniques hybrides L16H4F8 (A) et L16F8 (B) (20µM)
A de si basses concentrations (20µM), l’utilisation de la diffusion de la lumière n’a pas
été possible, le signal détecté par l’appareil étant trop faible.
Ces études physico-chimiques ont été réalisées à une température de 37 °C et dans une
solution de NaCl 0,15M afin de mimer le mieux possible les conditions expérimentales des
tests biologiques in vitro et de vérifier qu’à cette température et à des concentrations
600 nm
B
300 nm
A
200 nm
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
168
supérieures à celles de CAC (déterminés à 25°C pour des contraintes d’évaporation) il y a
toujours le phénomène d’agrégation vésiculaire.
Ces données supplémentaires nous permettent de mettre en valeur les observations
suivantes.
Dans un premier temps, nous pouvons souligner la stabilité des vésicules formées par
ces catanioniques lors d’un processus de dilution dans un milieu dont la force ionique est
équivalente à celle du milieu biologique ; condition primordiale pour un système de
vectorisation. Ensuite, nous pouvons observer (Figure 28) que pour les deux tensioactifs
catanioniques, il y a une gamme de concentration dans laquelle ces agrégats vésiculaires sont
actifs et non toxiques (concentrations supérieures à la CI50 et inférieures à la CC50). Dans cette
optique, le catanionique L16H4F8 semble être le meilleur candidat car, en raison d’une plus
importante hydrophobie, il possède une valeur de CAC (8 µM) encore plus éloignée de celle
de sa CC50 (55,5µM), lui offrant une marge de sécurité plus importante. De plus, rappelons
que les résultats précédemment décrits (sous-chapitre IV.1) indiquent le composé L16H4F8
comme ayant la plus faible probabilité de ségrégation partielle. Ce comportement est
probablement dû à la présence de l’espaceur hydrocarboné dans la structure de l’acide qui
augmente l’affinité entre la chaîne fluorée et celle hydrogénée de l’aminolactitol.
Enfin, nous pouvons remarquer que pour les deux tensioactifs catanioniques hybrides
les CAC ont des valeurs supérieures à leur CI50, ce qui signifie que les vésicules formées
présentent également une bonne reconnaissance pour le VIH.
0
10
20
30
40
50
60
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
LogC
Ts (mN/m
)
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Activité(Toxicité)%
Tens. superf. L16H4F8 Toxicité Activité
L16H4F8 Concentration µM
B)
A)
8
CAC CI50
4,2 20 55,5
CC50 agrégats vésiculaires
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
169
0
10
20
30
40
50
60
-10 -8 -6 -4 -2
LogCTs (mN/m
)
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Activité(Toxicité)%
Tens. superf. L16F8 Toxicité Activité
Figure 28 : Corrélation (et représentation schématique) entre les caractéristiques
biologiques et physico-chimiques des associations catanioniques mixtes hybrides L16H4F8
(A, B) et L16F8 (C, D)
Toutes les caractéristiques énoncées mettent en évidence l’aptitude de ces deux
systèmes catanioniques hybrides (L16H4F8 et L16F8) à être utilisés comme systèmes
spécifiques de transport de principes actifs anti-VIH.
De par leur activité antivirale à l’état non agrégé, ces deux composés sont encore plus
intéressants car ils peuvent également agir en tant que leurres, inhibant ainsi l’entrée du VIH
dans les cellules.
En ce qui concerne leur toxicité cellulaire, en analysant les figures 28A et 28C, nous
pouvons remarquer que ces composés deviennent toxiques à des concentrations proches ou
légèrement inférieures à des concentrations précédant la transition des phases, marquée par
une descente abrupte du profil de tensiométrie. Cette perturbation du système catanionique
enregistrée par la tensiométrie semble être à l’origine d’une augmentation brusque et
importante de la cytotoxicité des produits. Une explication pourrait être la formation des
filaments qui, comme nous l’avons vu auparavant (sous-chapitre IV.3) représentent une
deuxième forme d’agrégation possible pour ces tensioactifs catanioniques mixtes. Pourtant,
l’étude par TEM des solutions des deux tensioactifs, préparées par dilution (NaCl, 0,15M) à
L16F8 Concentration µM
CC50
52,5
CAC
20
CI50
4,4 16
D)
C)
agrégats vésiculaires
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
170
des concentrations (57µM) proches de celles de CC50 (55 et 52µM respectivement) a indiqué
juste la présence des vésicules, les filaments n’étant pas décelables. Toutefois, le mode de
préparation de l’échantillon pour la TEM (déshydratation partielle) pourrait dans certains cas
perturber ce mode d’agrégation.
L’étude de cette nouvelle famille de tensioactifs catanioniques analogues du GalCer
nous a permis d’identifier les deux composés catanioniques comportant une chaîne fluorée en
C8 (L16H4F8 et L16F8) comme les meilleurs systèmes de la série adaptés à une utilisation (dans
une certaine gamme de concentration) en tant que transporteurs spécifiques de principes actifs
anti-VIH.
Par la suite, nous avons réalisé une étude préliminaire de formulations avec ces deux
composés hybrides (les tensioactifs L16H4F8 et L16F8) et un principe actif anti-VIH (AZT – un
des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH les plus utilisés) sur des
cultures cellulaires. Cette étude nous permettra d’évaluer la compatibilité des deux composés
(tensioactifs - AZT) au niveau cellulaire et de quantifier une potentielle synergie d’activité
antivirale.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
171
VI.3 Formulations de l’AZT avec les tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et L16F8
En préalable à la mise au point d’un protocole d’encapsulation d’un principe actif anti-
VIH dans des vésicules formées par les deux tensioactifs catanioniques hybrides (L16H4F8 et
L16F8), notre étude a consisté en une analyse préliminaire des propriétés biologiques (activité
antivirale et cytotoxicité) de formulations de l’AZT avec chacun des deux tensioactifs
catanioniques. Le but de cette étude est donc de quantifier l’influence du tensioactif à l’état
monomère sur l’activité antivirale de l’AZT et vice et versa. Une comparaison sera faite entre
l’effet inhibiteur et la toxicité cellulaire de ces formulations avec ceux des produits testés
individuellement.
L’expérience antérieure du groupe I. Rico-Lattes [49] dans ce domaine à déjà révélé
pour d’autres dérivés, que la réalisation de formulations aux deux rapports molaires,
tensioactif catanionique : AZT de 500 :1 et 100 :1, peut apporter des informations importantes
sur l’influence des deux composés dans ces formulations et sur une éventuelle synergie
d’activités. En effet, ces études précédentes ont mis en évidence un effet synergique important
in vitro entre un tensioactif catanionique gémini [49] (composé Gem16 présenté dans le
chapitre bibliographique IV.1.1.2) et l’AZT.
Ainsi, en utilisant les mêmes rapports molaires entre ces nouveaux tensioactifs
catanioniques hybrides et l’AZT, il sera intéressant de rechercher une synergie d’activités
entre ces deux différents principes actifs anti-VIH. Rappelons que chacun des deux
constituants sont des inhibiteurs anti-VIH dont le mode d’action est différent: l’AZT, inhibe le
cycle de réplication virale en bloquant l’activité de la transcriptase inverse tandis que le
tensioactif analogue du GalCer agit en bloquant les récepteurs viraux gp120 et ainsi l’entrée
du virus dans les cellules. Suite à un effet synergique, les formulations pourraient présenter
des activités antivirales supérieures aux deux composés pris individuellement.
En utilisant chacun des deux tensioactifs, nous avons réalisé quatre formulations
différentes dans des rapports molaires tensioactif : AZT de 100 : 1 et de 500 :1. Les résultats
des tests biologiques réalisés in vitro, accompagnés de ceux des produits pris
individuellement sont répertoriés dans le tableau 5.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
172
Formulation
/composé CI 50 (µµµµM) [AZT]
(µM) à CI 50 CC 50 (µµµµM) IT
L16H4F8 : AZT (100 : 1) 1,7 0,017 20 12
L16H4F8 : AZT (500 : 1) 0,025 0,00005 34 1360
L16H4F8 4,2 ± 1,3 - 55,5 ± 7,5 13
AZT 0,0028 0,0028 > 1 > 350
L16F8 4,4 ± 0,2 - 52,5 ± 0,5 12
L16F8 : AZT (100 : 1) 0,066 0,00066 30 450
L16F8 : AZT (500 : 1) 0,33 0,00066 26 80
Tableau 5 : Résultats biologiques des formulations tensioactifs hybrides - AZT et des composés testés individuellement (les flèches expriment le facteur d’amélioration de l’activité antivirale des formulations par rapport aux produits pris indépendamment)
En analysant les résultats obtenus pour la formulation L16H4F8 : AZT (100 : 1) nous
pouvons observer une amélioration de l’activité inhibitrice (CI50 = 1,7 µM) d’un facteur 2 par
rapport à l’activité du composé L16H4F8 seul (CI50 = 4,2 ± 1,3 µM). Pourtant, en examinant la
concentration en AZT à cette CI50 nous pouvons voir que cet effet est du à la présence de
l’AZT à une concentration supérieure (0,017 µM) à celle de la CI50 (0,0028µM) de l’AZT
seul. Ainsi cette formulation ne présente pas d’intérêt thérapeutique.
Les formulations du composé L16F8 avec l’AZT sont plus intéressantes car pour les
deux formulations nous pouvons remarquer une augmentation de l’activité antivirale par
rapport aux produits testés individuellement. Ainsi, cette activité inhibitrice est multipliée par
des facteurs 67 et 13 respectivement (Tableau 5) pour des rapports molaires de 100 :1 et de
500 :1 respectivement. Il est intéressant d’observer que pour les CI50 de ces formulations, la
concentration en AZT (0,00066 µM) est diminuée d’un facteur 4 par rapport à sa
concentration active (CI50=0,0028µM), quel que soit le rapport molaire des composés. Ces
résultats mettent en évidence un effet synergique modéré entre ces deux produits actifs.
La formulation la plus intéressante s’est révélée être celle du tensioactif L16H4F8 avec
l’AZT dont le rapport molaire est de 500 : 1 (Tableau 5). Celle-ci présente le meilleur effet
synergique de la série, son activité inhibitrice (CI50 = 0,025 µM) étant 168 fois supérieure à
celle du composé L16H4F8 seul (CI50 = 4,2 ± 1,3 µM). De plus, la concentration en AZT
(0,00005µM) à cette CI50 est diminuée de 56 fois par rapport à la CI50 (0,0028µM) de l’AZT.
L’effet contraire des deux formulations du même tensioactif L16H4F8, l’une qui ne
présente pas d’intérêt thérapeutique et l’autre qui est très efficace met en évidence le fait que
x 56 x 168
4 x
67 x
x 13 x 4
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
173
le rapport molaire entre les deux composés (tensioactif catanionique : AZT) joue un rôle
crucial pour l’activité antivirale et la synergie de la formulation.
En ce qui concerne la toxicité des formulations, nous observons que celle-ci est
légèrement accrue (Tableau 5), sans trop s’éloigner de la gamme des concentrations
cytotoxiques des tensioactifs utilisés individuellement. Malgré cela, grâce à l’amélioration des
activités antivirales, les indices thérapeutiques des formulations (sauf dans le cas de la
formulation L16H4F8 : AZT = 100 : 1) sont considérablement augmentés par rapport à ceux
des composés tensioactifs pris séparément. Comme nous l’avons déjà mentionné, plus cette
valeur est élevée, plus le produit est efficace. Ainsi, les valeurs des indices thérapeutiques
enregistrés dans le tableau 5 font ressortir la formulation L16F8 : AZT (100 : 1) caractérisée
par un IT de 450, mais encore plus celle du tensioactif L16H4F8 avec l’AZT dans un rapport
molaire de 500 : 1 dont l’IT est de 1360.
Ces résultats très prometteurs sur l’effet synergique des activités inhibitrices
soulignent le bon potentiel d’utilisation dans la polythérapie anti-VIH de ces tensioactifs
catanioniques hybrides, tout particulièrement pour le composé L16H4F8.
Rappelons que cette même association catanionique L16H4F8 s’est également
distinguée comme le meilleur système de vectorisation spécifique de la série. Ainsi, de par
cette double activité anti-VIH : transporteur spécifique de principes actifs (à l’état agrégé -
vésiculaire) et inhibiteur d’entrée virale (à l’état monomère) manifestant une très importante
synergie d’activités avec l’AZT, ce système catanionique hybride est encore plus prometteur.
De futures études de vectorisation de l’AZT pourraient confirmer ce double et grand potentiel
thérapeutique du composé L16H4F8.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
174
VII CONCLUSION
Dans ce chapitre, nous avons mis au point une nouvelle famille de tensioactifs mixtes
fluorés/ hydrogénés catanioniques analogues du GalCer afin de les utiliser en tant que
transporteurs spécifiques de principes actifs anti-VIH. La stratégie adoptée a été la
consolidation et l’amélioration de la stabilité dans le temps des agrégats vésiculaires formés
par ces tensioactifs catanioniques en augmentant l’hydrophobie de l’ensemble catanionique
par l’ajout d’une chaîne fluorée.
En adoptant une stratégie de multiciblage, l’utilisation de ces composés en tant que
leurres du VIH a été également étudiée.
L’emploi d’une méthode de préparation polyvalente nous a permis de moduler la
structure chimique de cette nouvelle série de tensioactifs catanioniques, nous permettant ainsi
de modifier la longueur et la position d’un segment fluoré au sein de l’association
catanionique. Ainsi, l’étude s’est centrée sur l’identification des caractéristiques structurales
qui peuvent offrir à cette famille de composés une meilleure stabilité des agrégats dans le
temps, une bonne activité antivirale et une toxicité diminuée.
Après la préparation et l’analyse structurale de ces nouveaux composés, nous nous
sommes intéressés à l’étude de leurs propriétés physico-chimiques et biologiques. Ainsi nous
avons pu identifier deux composés mixtes comme candidats potentiels pour l’application
envisagée. De par leur caractère catanionique et la présence d’une partie fluorée en C8, les
associations L16H4F8 et L16F8 se sont avérées capables de former spontanément dans l’eau des
vésicules plus stables dans le temps qu’un composé de référence non fluoré L16H13, ayant une
hydrophobie équivalente. De plus, grâce à l’action des ultra-sons, ces vésicules possèdent une
bonne stabilité au cours du temps et résistent à la dilution dans un milieu dont la force ionique
est équivalente à celle qui existe en milieu biologique. Ces résultats, corroborés par les
propriétés biologiques de ces deux tensioactifs catanioniques ont mis en évidence l’existence
d’une gamme de concentration dans laquelle les agrégats vésiculaires présentent une bonne
reconnaissance pour le VIH et ne sont pas toxiques (concentrations inférieures à la CC50).
Dans ce domaine, le système catanionique L16H4F8 semble être encore plus prometteur car, en
raison d’une plus importante hydrophobie et une meilleure cohésion des deux chaînes fluorées
/ hydrogénées, il possède une valeur de CAC légèrement plus éloignée de celle de la CC50, lui
offrant ainsi une plus grande marge de sécurité quant à son utilisation.
Toutes ces caractéristiques auxquelles s’ajoute l’absence de perturbations majeures
vis-à-vis des monocouches de phospholipides nous permettent d’affirmer que ces deux
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
175
associations catanioniques hybrides (L16H4F8 et L16F8) peuvent être envisagées pour une
utilisation en tant que transporteurs spécifiques de principes actifs anti-VIH.
Il faut également souligner que cette étude a révélé l’activité antivirale à l’état
monomérique des deux tensioactifs catanioniques hybrides (L16H4F8 et L16F8), activité qui
peut être améliorée d’une manière très importante par association avec un inhibiteur du VIH
dont le mode d’action est différent. Ainsi, les formulations de ces composés avec l’AZT ont
permis la découverte d’un fort effet synergique des activités inhibitrices pour la formulation
L16H4F8 : AZT dont le rapport molaire est de 500 : 1. En conséquence, le composé L16H4F8
semble être plus adapté à une utilisation thérapeutique à la fois pour sa bonne activité anti-
VIH, sa forte synergie (sous forme monomérique) avec l’AZT et pour sa capacité à agir (sous
forme agrégée) en tant que système de vectorisation spécifique.
La suite de cette évaluation devra comprendre des tests d’encapsulation d’une sonde
hydrophile dont le taux d’encapsulation sera suivi dans le temps, afin d’évaluer la
perméabilité de la membrane vésiculaire et la capacité de stockage des vésicules. L’obtention
de résultats favorables permettra de réaliser par la suite des tests d’encapsulation et de
vectorisation de l’AZT.
Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer
176
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Conclusion générale
Conclusion générale
181
CONCLUSION GENERALE
Le VIH, virus qui attaque, affaiblit et détruit le système immunitaire humain, rendant
l’organisme vulnérable ou sans protection vis-à-vis de tous les agents pathogènes, est étudié
depuis plus de vingt ans en vue de trouver une thérapie efficace. Même si les moyens de
l’éradiquer font toujours défaut, un important progrès a été réalisé dans la mise au point de
régimes polythérapeutiques capables de prolonger et d’améliorer considérablement la qualité
de vie des personnes infectées par le VIH.
Le rôle indispensable des inhibiteurs de l’entrée virale pour les régimes
polythérapeutiques, le nombre réduit de composés de cette famille agréés pour une utilisation
cliniques (seulement 2 produits : l’enfuvirtide et le maraviroc) qui de plus, présentent des
inconvénients non-négligeables (faible biodisponibilité, effets secondaires, prix élevé de
fabrication) soulignent la nécessité de développer de nouveaux composés agissant au niveau
des étapes précoces de l’infection par le VIH.
Afin de répondre à cette exigence, les travaux qui ont fait l’objet de cette thèse ont eu
pour but l’amélioration de l’activité antivirale de nouveaux systèmes catanioniques analogues
du GalactosylCéramide (GalCer – récepteur alternatif du VIH). Cette classe d’inhibiteurs de
l’entrée virale réunit des composés dont la synthèse simple et à faible coût a été
précédemment mise au point au laboratoire et qui se sont montrés des leurres efficaces du
VIH.
L’étude a été conduite en suivant deux approches différentes. Dans un premier temps,
nous nous sommes intéressés à l’effet de multiplicité de sites actifs ainsi qu’à l’origine de la
toxicité cellulaire de nouveaux analogues du GalCer multivalents. Tandis que, dans un
deuxième temps, une stratégie de multiciblage a été mise en place afin d’améliorer l’activité
antivirale de nouveaux analogues catanioniques hybrides du GalCer.
En conséquence, dans une première partie, la stratégie adoptée afin de prévenir une
éventuelle dissociation de l’entité catanionique, supposée responsable de la toxicité cellulaire
de ce type de composés, a été de renforcer l’effet hydrophobe entre les éléments constitutifs
par ajout de chaînes alkyles sur le dendrimère.
Ainsi, une nouvelle famille d’associations catanioniques dendritiques à cœur
hexafonctionnel, comportant 12 sites actifs en surface a été synthétisée et étudiée. Plus
Conclusion générale
182
précisément, quatre composés ont été obtenus par une association acido-basique des
aminolactitols (respectivement L12 et L16, comportant les sites de reconnaissance du VIH)
avec deux dendrimères comportant en surface des groupements acides phosphoniques et des
chaînes alkyles de longueurs différentes (en C3 et en C10 respectivement).
Les résultats des tests biologiques réalisés in vitro ont révélé que ces nouvelles
associations catanioniques dendritiques sont des leurres efficaces du VIH. Une analyse
structure – activité antivirale nous a permis d’identifier le dendrimère DC3 et l’aminolactitol
L16 comme les éléments clefs qui permettent d’obtenir les meilleures activités anti-VIH pour
cette famille de composés. Toutefois, l’étude a montré que l’utilisation du dendrimère DC10
induit une trop importante hydrophobie au niveau de l’entité catanionique conduisant à une
impossibilité des chaînes alkyles dendritiques de renforcer l’attachement avec le virus et ainsi
à une perte de l’effet de multiplicité de sites.
Bien que la cohésion de l’entité catanionique ait été assurée, les tests biologiques ont
montré que la toxicité cellulaire de ces nouveaux composés restait toujours de l’ordre du
micromolaire comme dans le cas des produits analogues, antérieurement synthétisés au
laboratoire. De ce fait, l’identification des éléments responsables de la cytotoxicité de ces
tensioactifs catanioniques dendritiques est devenue le nouvel objectif de l’étude.
Ainsi, les résultats des études par tensiométrie et d’incorporation de ces produits à
l’état monomérique dans des modèles membranaires corrélés avec les résultats des tests
biologiques ont indiqué que ces composés ne sont pas toxiques à l’état monomérique. Ainsi,
des facteurs tels que l’hydrophobie et l’incorporation de ces produits à l’état monomérique
dans les modèles membranaires ne sont pas déterminants pour la cytotoxicité de ces nouvelles
associations catanioniques.
Cependant, les résultats obtenus montrent que l’agrégation de ces composés
catanioniques dendritiques sous forme de vésicules déclenche l’apparition d’une toxicité
cellulaire non- négligeable. Une interprétation possible de ce phénomène peut être une
interaction entre ces entités catanioniques et certains récepteurs membranaires ou bien une
agglutination des vésicules à la surface de la membrane cellulaire, qui pourraient provoquer
une perturbation de ces fonctions vitales.
Cette hypothèse pourrait être confirmée par de futures expériences réalisées en
collaboration avec des spécialistes en immunologie.
Dans une deuxième partie de l’étude, nous avons profité de la présence de la gp120 à
la surface membranaire virale ainsi qu’à la surface des cellules infectées par le VIH afin de
Conclusion générale
183
mettre au point une stratégie de multiciblage. Ainsi, en mettant à profit l’affinité de nouveaux
analogues du GalCer en forme non- agrégée ou agrégée pour la gp120, l’objectif a été
l’obtention à la fois des chimères efficaces du VIH ainsi que des vecteurs spécifiques pouvant
délivrer des principes actifs anti-VIH. Pour cela, une nouvelle famille d’analogues
catanioniques du GalCer a été synthétisée, soit des dérivés bicaténaires mixtes fluorés/
hydrogénés. La stratégie adoptée cette fois-ci a été la consolidation et l’amélioration de la
stabilité au cours du temps des vésicules formées par les tensioactifs catanioniques en
augmentant l’hydrophobie de l’ensemble catanionique par ajout d’une chaîne fluorée.
L’emploi d’une méthode de préparation simple, fondée sur une réaction acido-basique
entre l’aminolactitol L16 (comportant le site actif pour le VIH) et trois acides gras (H4F8,
H2F6H4 et F8) différant par la longueur et la position d’un segment fluoré, nous a permis
l’obtention de nouveaux analogues catanioniques mixtes du GalCer. Une quatrième
association catanionique non fluorée, d’une hydrophobie proche à celle des composés
hybrides, a été également préparée en tant que système de référence.
Suite à une étude des propriétés d’agrégation dans l’eau, de la morphologie et de la
stabilité au cours du temps des agrégats supramoléculaires, des interactions avec un modèle
membranaire, des propriétés tensioactives et des tests biologiques in vitro, nous avons pu
réaliser une corrélation entre la structure, les propriétés physico-chimiques et l’activité anti-
VIH de ces composés. Ainsi, deux composés hybrides ont été identifiés comme candidats
potentiels pour l’application envisagée. De par leur caractère catanionique et la présence
d’une partie fluorée en C8, les associations L16H4F8 et L16F8 se sont avérées capables de
former spontanément dans l’eau des vésicules plus stables dans le temps que le composé de
référence non fluoré L16H13, ayant une hydrophobie équivalente. De plus, suite à l’action des
ultra-sons, ces vésicules ont montré une bonne stabilité au cours du temps et une bonne
résistance à la dilution dans un milieu dont la force ionique est équivalente à celle qui existe
en milieu biologique. Ces résultats, corroborés par les propriétés biologiques de ces deux
tensioactifs catanioniques ont mis en évidence l’existence d’une gamme de concentration
dans laquelle les agrégats vésiculaires présentent une bonne activité anti-VIH et ne sont pas
toxiques. Le système catanionique L16H4F8 semble être encore plus prometteur car, en raison
d’une plus importante hydrophobie et une meilleure cohésion des deux chaînes fluorées /
hydrogénées, il possède une valeur de CAC légèrement plus éloignée de celle de la CC50, lui
offrant ainsi une plus grande marge de sécurité quant à son utilisation.
Cette étude a également mis en évidence l’activité antivirale à l’état monomérique de
ces deux tensioactifs catanioniques hybrides (L16H4F8 et L16F8), et donc leur capacité à agir en
Conclusion générale
184
tant que leurres du VIH. De plus, les formulations de ces deux analogues hybrides du GalCer
avec l’AZT, un inhibiteur de la transcriptase inverse du VIH, ont permis la découverte d’un
fort effet synergique des activités inhibitrices pour la formulation L16H4F8 : AZT dont le
rapport molaire est de 500 : 1. Ainsi, le composé L16H4F8 semble être encore plus adapté à une
utilisation thérapeutique à la fois pour sa bonne activité de leurre du VIH, sa forte synergie
(sous forme monomérique) avec l’AZT et pour sa capacité d’agir (sous forme agrégée) en tant
que système de vectorisation spécifique.
Il reste cependant à mener une étude de l’encapsulation de l’AZT dans des vésicules
formées par cette association catanionique hybride L16H4F8, après élimination de l’AZT libre
non encapsulé, pour ensuite confirmer in vitro leur rôle de transporteurs spécifiques.
Partie expérimentale
Partie expérimentale
187
I PRODUITS COMMERCIAUX UTILISES ...................................................... 189
I.1 Réactifs ............................................................................................................... 189
I.2 Solvants .............................................................................................................. 189
II TECHIQUES DE CARACTERISATIO STRUCTURALE ............................. 190
II.1 RM ................................................................................................................... 190
II.2 Infrarouge........................................................................................................... 190
II.3 Spectrométrie de masse...................................................................................... 190
II.4 Analyses centésimales ........................................................................................ 191
III SYTHESE ............................................................................................... 191
III.1 -dodécylamino-1-désoxylactitol - L12 ............................................................. 191
III.2 -hexadécylamino-1-désoxylactitol - L16.......................................................... 193
III.3 Dendrimères catanioniques analogues du GalCer ............................................ 195
III.3.1 Mélanges catanioniques comportant le N-hexadécylamino-1-désoxylactitol : L16DC3 et L16DC10 ................................................................................................................. 195
Mélange catanionique L16DC3 ........................................................................................... 195 Mélange catanionique L16DC10 .......................................................................................... 196
III.3.2 Mélanges catanioniques comportant le N-dodécylamino-1-désoxylactitol : L12DC3 et L12DC10...................................................................................................................... 197
Mélange catanionique L12DC3 ........................................................................................... 197 Mélange catanionique L12DC10 .......................................................................................... 198
III.4 Associations catanioniques bicaténaires analogues du GalCer ........................ 199
III.4.1 Association catanionique L16H4F8 ............................................................................. 199 III.4.2 Association catanionique L16H2F6H4 ......................................................................... 200 III.4.3 Association catanionique L16F8 ................................................................................. 201 III.4.4 Association catanionique L16H13 ............................................................................... 202
IV TECHIQUES DE CARACTERISATIO PHYSICO - CHIMIQUE................... 203
IV.1 Préparation des solutions de catanioniques ...................................................... 203
IV.2 Mesure de tension de surface ............................................................................. 203
IV.3 Evaluation de la taille et de la distribution de taille des agrégats - Diffusion
quasi-élastique de la lumière (DLS).................................................................. 204
IV.4 Caractérisation des agrégats ............................................................................. 205
IV.4.1 Microscopie électronique par transmission............................................................... 205 IV.4.2 Cryofracture .............................................................................................................. 206
IV.5 Isothermes de compression ................................................................................ 209
IV.6 Spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) .............................. 210
V TESTS BIOLOGIQUES ............................................................................... 212
V.1 Conditions expérimentales d’infection des cellules CEM-SS ............................ 212
V.2 Evaluation de l’activité anti – VIH : incorporation d’uridine tritiée ([3H]-
uridine) .............................................................................................................. 213
V.3 Evaluation de la cytotoxicité : test MTT ............................................................ 213
Partie expérimentale
188
Partie expérimentale
189
I PRODUITS COMMERCIAUX UTILISES
I.1 Réactifs
Nom du produit CAS Fournisseur pureté
α – D – Lactose monohydraté 5989-81-1 Sigma-Aldrich > 98%
Hexadécylamine 143-27-1 Aldrich 98%
Dodécylamine 124-22-1 Fluka ≥ 98%
AZT (3′-Azido-3′-déoxythymidine) 30516-87-1 Sigma > 98%
Borohydrure de sodium 16940-66-2 Sigma-Aldrich > 98%
Acide tétradécanoïque (acide myristique) 544-63-8 Aldrich ≥ 98%
Acide Perfluorononanoϊque 375-95-1 Sigma-Aldrich 97%
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycéro-3-
phosphocholine
Dipalmitoyl-phosphatidyl choline
63-89-8 Avanti Polar-
Lipids
> 99%
Phosphotungstate de sodium 12501-23-4 Sigma-Aldrich 99,995%
Chlorure de sodium 7647-14-5 Sigma-Aldrich ≥ 99,5
Hydroxyde de sodium 1310-73-2 Sigma-Aldrich 98%
Acide chlorhydrique 7647-01-0 SDS 37%
Acide sulfurique 7664-93-9 Normapur 98%
I.2 Solvants
Nom du solvant CAS Fournisseur pureté
Chloroforme chromanorm 67-66-3 Prolabo ≥ 99,5
Ethanol absolu normapur 64-17-5 Prolabo ≥ 99,8
Méthanol 67-56-1 SDS ≥ 99,8
Propan – 2 – ol rectapur 67-63-0 Prolabo ≥ 99
Propan – 1 – ol rectapur 71-23-8 Prolabo ≥ 99
H2O deutéré (0,75 mL) 7789-20-0 Euriso-top 100 %D
Méthanol deutéré 811-98-3 Euriso-top 99,8 %D
Chloroforme deutéré 865-49-6 Euriso-top 99,8 %D
Partie expérimentale
190
II TECHNIQUES DE CARACTERISATION STRUCTURALE
II.1 RMN
Les spectres de résonance magnétique nucléaire ont été enregistrés sur des
spectromètres Brüker Avance 300, Avance 400 et Avance 500 dont les fréquences de
précession du proton et du carbone sont respectivement de 300 MHz et 75 MHz, 400 MHz et
100 MHz, et 500 MHz et 125 MHz. Les fréquences de précession du fluor et du phosphore
sont respectivement de 376 MHz et 121 MHz. Les déplacements chimiques δ sont exprimés
en partie par million (ppm) par rapport au déplacement chimique de référence du
tétraméthylsilane (TMS) pour la RMN du 1H et du 13C, de l’acide phosphorique à 85% dans
l’eau pour la RMN du 31P et de l’acide trifluoroacétique dans l’eau pour la RMN du 19F. La
calibration a été réalisée par rapport au déplacement chimique du solvant deutéré (signal
résiduel non deutéré). Les fréquences des constantes de couplages sont exprimées en Hz. Les
spectres 13C ont été enregistrés grâce à une séquence J modulée. Les paramètres des
séquences d’impulsions sont ceux fournis par Brüker.
II.2 Infrarouge
Les spectres de vibration infrarouge ont été réalisés grâce à un spectromètre PERKIN-
ELMER IR FT 1760-X. Les spectres ont été réalisés sur des pastilles de KBr à une
concentration de 0,5% en masse de produit.
II.3 Spectrométrie de masse
Les spectres de masse Electrospray ont été enregistrés sur un appareil Perkin Elmer
Sciex API – 365 ou sur un appareil Applied Biosystems Q Trap pour les N-alkylamino -1-
désoxylactitols qui ont été analysés dans un mélange eau/méthanol à une concentration de
10µg/ml. Le voltage du capillaire est de 5kV, le potentiel de dissociation est optimisé pour
chaque échantillon pour une valeur comprise entre 0 et 150V.
Les spectres ont été enregistrés en mode positif, la source d’ionisation chimique étant
NH3.
Partie expérimentale
191
II.4 Analyses centésimales
Ces analyses ont été effectuées par le service d’analyse du Laboratoire de Chimie de
Coordination (LCC) pour le carbone, l’hydrogène et l’azote et par le Service central d’analyse
du département d’analyse élémentaire du CNRS de Vernaison pour le bore, le sodium et le
chlore.
III SYNTHESE
III.1 N-dodécylamino-1-désoxylactitol - L12
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH
123
45
6
1'2'3'
4'5'
6'
α
β
χ
δ
ε
φ
γ
η
ι
ϕ
κ
Une solution de 3,019g (16 mmol) de dodécylamine solubilisés dans 35 mL de
méthanol est ajoutée à une solution de 3,599 g (10 mmol) de α−D-lactose monohydrate
solubilisés dans 20 mL d’eau distillée. Après 24 heures d’agitation magnétique à température
ambiante, le mélange réactionnel est chauffé à 60°C pendant 30 minutes. Les solvants sont
évaporés sous pression réduite (10 mmHg).
Le solide blanc obtenu est repris dans 200 mL de méthanol et 537 mg (14 mmol) de
NaBH4 sont ajoutés par petites fractions à la solution à température ambiante. Le mélange
réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 24 heures puis il est
chauffé à 60°C pendant 10 heures. Après retour à température ambiante, le mélange
réactionnel est à nouveau laissé sous agitation pendant 12 heures. Les solvants sont ensuite
évaporés sous pression réduite (10 mmHg) pour conduire à un solide blanc.
Le solide est repris dans 150 mL de chloroforme et chauffé à 40°C pendant 15
minutes. La suspension est ensuite filtrée à chaud sur fritté (porosité n° 4) afin d’éliminer
l’amine résiduelle. Cette opération est répétée trois fois.
Le solide sec est ensuite solubilisé dans un minimum d’eau (environ 20 mL pour 5g).
20 mL d’éthanol sont ajoutés pour faire précipiter le produit. La solution est filtrée sur fritté.
Le solide est récupéré et la même opération est répétée une seconde fois.
Le solide est alors repris dans un minimum d’eau et la solution aqueuse est acidifiée
avec de l’acide chlorhydrique (1M) jusqu’à un pH = 3 afin d’hydrolyser les complexes formés
Partie expérimentale
192
entre le sucre et les sels de bore. Ensuite, les borates vont être éliminés du système sous forme
d’esters d’éthyle par évaporation. 400 mL d’éthanol sont ajoutés par petites fractions et la
solution de tensioactif est évaporée à sec sous pression réduite et à 40°C.
Le tensioactif est repris dans un minimum d’eau et la solution est traitée avec une
solution aqueuse de NaOH jusqu’à un pH = 11. Ensuite, le produit est reprécipité en ajoutant
500 mL d’éthanol. La solution est laissée au réfrigérateur quelques heures pour une meilleure
précipitation. Le solide blanc est récupéré par filtration sur fritté. Le produit est séché par
lyophilisation.
Pour obtenir un produit pur, dépourvu des sels inorganiques, le tensioactif est extrait
plusieurs fois dans 100 mL d’acétone anhydre à 40°C pendant 30 minutes.
Après l’évaporation du solvant et lyophilisation 1,5 g d’une poudre blanche de N-
dodécylamino-1-désoxylactitol est obtenue.
Rendement : 30 %
Le produit est hygroscopique.
RM 1H (300 MHz, D2O :CD3COOD = 6: 1) δ δ δ δ ppm : 4,04 (d, JHH = 9 Hz, 1H, H
anomérique); 3,8 – 3,05 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 2,83 – 2,56 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);
1,21 (m, 2H, NH2-CH2-CH2) ; 0,82 (sl, 18H, CH2) ; 0,36 (t, JHH= 9 Hz, 3H, CH3).
RM 13C-1H (75 MHz, D2O) δ δ δ δ ppm : 102,96 (s, C1, anomérique); 79 – 68,02 (m,
CH sucre); 61,93 (s, C6); 61,37 (s, C6’) ; 50 (s, C1); 48,08 (s, Cα); 31,82 – 22,55 (s, CH2
chaîne) ; 13,81 (s, CH3).
Electrospray, m/z : 534,5 [M-Na+] ; 512,4 [M-H+]; 350,3 [MH+ - GalOH]
Analyse élémentaire: Calculé pour C24H49NO10 , 2H2O : C, 52,63%; H, 9,75%; N,
2,56%. Expérimentale: C, 52,56%; H, 9,25%; N, 2,58; B, 270 ppm; Na, 430 ppm; Cl, < 200
ppm.
Partie expérimentale
193
III.2 N-hexadécylamino-1-désoxylactitol - L16
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH
123
45
6
1'2'3'
4'5'
6'
α
β
χ
δ
ε
φ
γ
η
ι
ϕ
κ
λ
µ
ν
ο
Une solution de 4,172g (17 mmol) d’hexadécylamine solubilisés dans 35 mL de
propan-2-ol est ajoutée à une solution de 3,614 g (10 mmol) de α−D-lactose monohydrate
solubilisé dans 20 mL d’eau distillée. Après 24 heures d’agitation magnétique à température
ambiante, le mélange réactionnel est chauffé à 60°C pendant 30 minutes. Les solvants sont
évaporés sous pression réduite (10 mmHg).
Le solide blanc obtenu est repris dans 200 mL de méthanol et 565 mg (15 mmol) de
NaBH4 sont ajoutés par petites fractions à la solution à température ambiante. Le mélange
réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 24 heures puis il est
chauffé à 60°C pendant 10 heures. Après retour à température ambiante, le mélange
réactionnel est à nouveau laissé sous agitation pendant 12 heures. Les solvants sont ensuite
évaporés sous pression réduite (10 mmHg) pour conduire à un solide blanc.
Le solide est repris dans 150 mL de propan-2-ol et chauffé à 40°C pendant 15 minutes.
La suspension est ensuite filtrée à chaud sur fritté (porosité n° 4) afin d’éliminer l’amine
résiduelle. Cette opération est répétée trois fois.
Le solide sec est ensuite solubilisé dans un minimum d’eau (environ 20 mL pour 5g).
20 mL de méthanol sont ajoutés pour faire précipiter le produit. La solution est filtrée sur
fritté. Le solide est récupéré et la même opération est répétée une seconde fois.
Le solide est alors repris dans un minimum d’eau et la solution aqueuse est acidifiée
avec de l’acide chlorhydrique (1M) jusqu’à un pH = 3 afin d’hydrolyser les complexes formés
entre le sucre et les sels de bore. Ensuite, les borates vont être éliminés du system sous forme
d’esters d’éthyle par évaporation. 400 mL d’éthanol sont ajoutés par petites fractions et la
solution de tensioactif est évaporée à sec sous pression réduite.
Le tensioactif est repris dans un minimum d’eau et la solution est traitée avec une
solution aqueuse de NaOH jusqu’à un pH = 11. Ensuite le produit est reprécipité en ajoutant
500 mL d’éthanol. La solution est laissée au réfrigérateur quelques heures pour une meilleure
précipitation. Le produit solide et blanc est récupéré par filtration sur fritté. Le produit est
séché par lyophilisation.
Partie expérimentale
194
Pour obtenir un produit pur, dépourvu des sels inorganiques, le tensioactif est extrait
plusieurs fois dans 100 mL de propan-2-ol à 40°C pendant 30 minutes.
Après l’évaporation du solvant et lyophilisation 1,2 g d’une poudre blanche de N-
dodécylamino-1-désoxylactitol est obtenue.
Rendement : 21 %
Le produit est hygroscopique.
RM 1H (300 MHz, D2O :CD3COOD = 6: 1) δ δ δ δ ppm : 4,24 (d, JHH = 9Hz, 1H, H
anomérique); 3,96 – 3,27 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 3,05 – 2,76 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);
1,42 (m, 2H, NH2-CH2-CH2) ; 0,99 (sl, 26H, CH2) ; 0,59 (t, 3H, CH3).
RM 13C-1H (75 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 103,48 (s, C1,
anomérique); 79,9 – 69,09 (m, CH sucre); 62,22 (s, C6); 61,24 (s, C6’) ; 51,79 (s, C1); 49,56 (s,
Cα); 31,69 – 22,41 (s, CH2 chaîne) ; 13,44 (s, CH3).
Electrospray, m/z : 590,5 [M-Na+] ; 568,5 [M-H+]; 406,5 [MH+ - GalOH]
Analyse élémentaire: Calculé pour C28H57NO10: C, 59,23%; H, 10,12%; N, 2,47%.
Expérimentale: C, 59,6%; H, 10,30%; N, 2,50; B, 167 ppm; Na, 944 ppm;
Partie expérimentale
195
III.3 Dendrimères catanioniques analogues du GalCer
III.3.1 Mélanges catanioniques comportant le N-hexadécylamino-1-désoxylactitol : L16DC3 et L16DC10
Procédure générale :
30 mg de DC3 ou DC10 (6 et 4,85 µmol respectivement) et 41,4 mg ou 33,5 mg L16 (72
et 58,2 µmol respectivement) sont ajoutés dans 16 ml d’un mélange d’eau distillée : propan-1-
ol (rapport volumique 1 : 3). Après 2 jours d’agitation magnétique à température ambiante, on
obtient une solution homogène, qui conduit de façon quantitative après évaporation et
lyophilisation aux produits L16DC3 et L16DC10 respectivement. Les produits se présentent sous
forme des poudres blanches – jaunâtres.
Mélange catanionique L16DC3
N3P3 O C01
C02 C0
3
C04
N N
Me
P
S
O C11
C12 C1
3
C14
NH
O
P
O
OH
O
C3H72
x 12
O
OH
OHHO
HOHO
OHHO
HO
ONH2
1 23
45
6
1' 2'3'
4'5'
6'
α
6
RM 1H (500 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 7,81 – 7,7 (m, 14 au lieu
de18H C03H et CH=N); 7,32 – 6,82 (m, 54H au lieu de 60H, C0
2H, C12H et C1
3H); 4,28 (s, 4H
au lieu de 12H, H anomérique); 3,86 – 3,46 (m, 126H au lieu de 144H, CH et CH2 sucre);
3,31 – 3,06 (m, 80 au lieu de 90, NH-CH2, CH2-NH2-CH2, N-CH3); 2,74 – 2,59 (m, 40H au
lieu de 36H, Ar-CH2, P-CH); 1,92 (m, 26H au lieu de 24H, CH-CH2) ; 1,44 – 1,29 (m, 346H
au lieu de 360H, CH2 et NH2-CH2-CH2); 0,92 (t, 40H au lieu de 36H, CH3); 0,86 (t, 36H,
CH3).
RM 13C-1H (125 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 170,9 (s, CONH);
152,31 ( s, C01); 149,2 (s, C1
1); 139,12 (s, CH=N ); 136,8 (s, C14); 133 (s, C0
4); 130,45 (s,
C13); 128,4 (s, C0
3); 121,56 – 121 (s, C12 et C0
2); 103,42 (s, C1, anomérique); 77,9 – 67,9 (m,
CH sucre); 61,9 (s, C6); 61,47 (s, C6’) ; 49 (s, C1); 47,7 (s, Cα); 43,81 (s, P-CΗ); 42,16 (s, NH-
CΗ2); 34,6 (s, Ar-CH2); 33,56 (s, N-CH3); 32,05 – 22,7 (m, CH2 chaîne) ; 13,84 (s, CH3).
RM 31P-1H (121 MHz, D2O : Propan-1-ol = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 62,72 (s, P=S); 17,27 (s,
P(OH)O-); 9,3 (s, N3P3).
Partie expérimentale
196
Mélange catanionique L16DC10
N3P3 O C01
C02 C0
3
C04
N N
Me
P
S
O C11
C12 C1
3
C14
NH
O
P
O
OH
O
C10H21
2
x 12
O
OH
OHHO
HOHO
OHHO
HO
ONH2
1 23
45
6
1' 2'3'
4'5'
6'
α
6
RM 1H (500 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 7,72 – 7,63 (m, 13H au
lieu de 18, C03H et CH=N); 7,27 – 6,79 (m, 55 au lieu de 60H, C0
2H, C12H et C1
3H); 3,97 –
3,58 (m, 144H, CH et CH2 sucre); 3,39 – 3,36 (m, 20H au lieu de 24, NH-CH2); 3,22 – 3,11
(m, 49H, CH2-NH2-CH2) ; 2,84 – 2,82 (m, 25H, Ar-CH2); 2,69 (m, 18H, N-CH3); 2,26 (t,
11H, P-CH); 2,09 – 2,08 (m, 24H, CH-CH2) ; 1,8 (m, 48H, NH2-CH2-CH2); 1,3 (m, 520H au
lieu de 504, CH2) ; 0,93 (t, 39H au lieu de 36H, CH3); 0,86 (t, 36H, CH3) .
RM 13C-1H (125 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 173,45 (s, CONH);
149,17 ( C01 et C1
1); 136,9 – 136,7 (m, CH=N et C14); 134,23 (s, C0
4); 129,7 (s, C13); 128,04
(s, C03); 121,08 – 119,4 (s, C1
2 et C02); 103,104 (s, C1, anomérique); 78,9 – 70,7 (m, CH
sucre); 62,11 (s, C6); 61,44 (s, C6’) ; 49,9 (s, C1); 48,1 (s, Cα); 43,53 (s, P-CΗ); 40,62 (s, NH-
CΗ2); 34,53 (s, Ar-CH2); 34,03 (s, N-CH3); 31,71 – 19,16 (m, CH2 chaîne) ; 13,67 (s, CH3).
RM 31P-1H (121 MHz, D2O : Propan-1-ol = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 62,84 (s, P=S); 17,27 (s,
P(OH)O-); 9,24 (s, N3P3).
Partie expérimentale
197
III.3.2 Mélanges catanioniques comportant le N-dodécylamino-1-désoxylactitol : L12DC3 et L12DC10
Procédure générale :
30 mg de DC3 ou DC10 (6 et 4,85 µmol respectivement) et 39,1 mg ou 31,6 mg L12 (72
et 58,2 µmol respectivement) sont ajoutés dans 16 ml d’un mélange d’eau distillée : propan-1-
ol (rapport volumique 1 : 3). Après 2 jours d’agitation magnétique à température ambiante, on
obtient une solution homogène, qui conduit de façon quantitative après évaporation et
lyophilisation aux produits L12DC3 et L12DC10 respectivement. Les produits se présentent sous
forme des poudres blanches – jaunâtres.
Mélange catanionique L12DC3
N3P3 O C01
C02 C0
3
C04
N N
Me
P
S
O C11
C12 C1
3
C14
NH
O
P
O
OH
O
C3H72
x 12
O
OH
OHHO
HOHO
OHHO
HO
ONH2
1 23
45
6
1' 2'3'
4'5'
6'
α
6
RM 1H (500 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 7,76 – 7,69 (m, 14 au lieu
de18H C03H et CH=N); 7,25 – 6,8 (m, 55H au lieu de 60H, C0
2H, C12H et C1
3H); 4,31 (s, 3H
au lieu de 12H, H anomérique); 3,95 – 3,64 (m, 120H au lieu de 144H, CH et CH2 sucre);
3,39 – 3,13 (m, 82 au lieu de 90, NH-CH2, CH2-NH2-CH2, N-CH3); 2,8 – 2,75 (m, 40H au
lieu de 36H, Ar-CH2, P-CH); 1,8 (m, 26H au lieu de 24H, CH-CH2) ; 1,42 – 1,26 (m, 252H au
lieu de 264H, CH2 et NH2-CH2-CH2); 0,94 (t, 39H au lieu de 36H, CH3); 0,89 (t, 36H, CH3).
RM 13C-1H (125 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 170,7 (s, CONH);
151,6 ( s, C01); 149,32 (s, C1
1); 138,8 (s, CH=N ); 137,4 (s, C14); 133,4 (s, C0
4); 130,2 (s, C13);
129,42 (s, C03); 121,3 – 121,72 (s, C1
2 et C02); 103,54 (s, C1, anomérique); 77,87 – 67,9 (m,
CH sucre); 62,3 (s, C6); 61,51 (s, C6’) ; 49,71 (s, C1); 48,03 (s, Cα); 43,2 (s, P-CΗ); 41,02 (s,
NH-CΗ2); 35,76 (s, Ar-CH2); 33,13 (s, N-CH3); 32,1 – 22,34 (m, CH2 chaîne) ; 13,82 (s,
CH3).
RM 31P-1H (121 MHz, D2O : Propan-1-ol = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 62,8 (s, P=S); 17,24 (s,
P(OH)O-); 9,33 (s, N3P3).
Partie expérimentale
198
Mélange catanionique L12DC10
N3P3 O C01
C02 C0
3
C04
N N
Me
P
S
O C11
C12 C1
3
C14
NH
O
P
O
OH
O
C10H21
2
x 12
O
OH
OHHO
HOHO
OHHO
HO
ONH2
1 23
45
6
1' 2'3'
4'5'
6'
α
6
RM 1H (500 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 7,79 – 7,67 (m, 14 au lieu
de18H C03H et CH=N); 7,22 – 6,85 (m, 52H au lieu de 60H, C0
2H, C12H et C1
3H); 4,31 (s, 3H
au lieu de 12H, H anomérique); 3,97 – 3,64 (m, 116H au lieu de 144H, CH et CH2 sucre);
3,41 – 3,12 (m, 80 au lieu de 90, NH-CH2, CH2-NH2-CH2, N-CH3); 2,82 – 2,74 (m, 40H au
lieu de 36H, Ar-CH2, P-CH); 1,81 (m, 26H au lieu de 24H, CH-CH2) ; 1,42 – 1,26 (m, 418H
au lieu de 432H, CH2 et NH2-CH2-CH2); 0,954 (t, 42H au lieu de 36H, CH3); 0,904 (t, 36H,
CH3).
RM 13C-1H (125 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 170,5 (s, CONH);
151 ( s, C01); 149,16 (s, C1
1); 139 (s, CH=N ); 136,54 (s, C14); 133 (s, C0
4); 129,78 (s, C13);
128,24 (s, C03); 121,43 – 121,12 (s, C1
2 et C02); 103,117 (s, C1, anomérique); 78,74 – 67,89
(m, CH sucre); 62,13 (s, C6); 61,51 (s, C6’) ; 49,93 (s, C1); 48,05 (s, Cα); 43,24 (s, P-CΗ);
41,07 (s, NH-CΗ2); 34,68 (s, Ar-CH2); 32,97 (s, N-CH3); 31,9 – 22,44 (m, CH2 chaîne) ;
13,74 (s, CH3).
RM 31P-1H (121 MHz, D2O : Propan-1-ol = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 62,76 (s, P=S); 18,02 (s,
P(OH)O-); 9,27 (s, N3P3).
Partie expérimentale
199
III.4 Associations catanioniques bicaténaires analogues du GalCer
Procédure générale :
A 80 mg L16 (139 mmol) dans 100 ml d’eau distillée, on ajoute 139 mmol d'acide
carboxylique (soit 72,28 mg H4F8 ou 59,77 mg H2F6H4 ou 64,5 mg F8 ou 31,69 mg acide
myristique). Après 2 jours d’agitation magnétique à température ambiante (à 35°C pour
l’association de l’acide myristique), on obtient une solution homogène, qui conduit de façon
quantitative après lyophilisation aux associations catanioniques bicaténaires L16H4F8,
L16H2F6H4, L16F8 et L16H13 respectivement. Les produits se présentent sous forme des poudres
blanches.
III.4.1 Association catanionique L16H4F8
C
O
O
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
123
45
6
1'2'3'
4'5'
6'
α
F
F F
F F
F F
F F
F F
F F
F F
F F
RM 1H (400 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 4,42 (d, JHH = 6Hz,
1H, H anomérique); 4,2 – 3,49 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 3,1 – 2,9 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);
2,16 (t, JHH = 9Hz, 2H, CH2–COO-); 2,15- 2,08 (m, 2H, CH2–CF2); 1,6 (m, 6H, NH2-CH2-
CH2 et (CH2)2-CH2-CF2) ; 1,2 (sl, 26H, CH2) ; 0,81 (t, 6H, JHH = 6Hz, CH3).
RM 13C-1H (100 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm:180,66 (s, COO-);
118,62-108,46 (m, CF2 et CF3); 103,19 (s, C1, anomérique); 78,8 – 67,8 (m, CH sucre); 62,02
(s, C6); 61,45 (s, C6’) ; 51,5 (s, C1); 49,93 (s, Cα); 36,9 (s, CH2-COO-); 31,66 (s, CH2-CF2);
30,41 – 19,89 (m, CH2 chaînes) ; 13,5 (s, CH3).
RM 19F (376 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : -126,74 (CF2-CF3); -
124,01, -123,44, -122,51 ((CF2)5 CF2-CF3); -114,86 (CF2-CH2); -81,66 (CF3).
IR (KBr) cm-1: 1567 (ῡCOO- asymétrique), 1404 (ῡCOO- symétrique).
Partie expérimentale
200
III.4.2 Association catanionique L16H2F6H4
C
O
O
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
123
45
6
1'2'3'
4'5'
6'
α
F F
F F
F F
F F
F F
F F
RM 1H (500 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 4,5 (d, JHH = 6Hz, 1H,
H anomérique); 4,2 – 3,52 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 3,2 – 2,9 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);
2,41(t, JHH = 7Hz, 2H, CH2–COO-); 2,22- 2,1 (m, 4H, CH2–(CF2)6–CH2); 1,67 (m, 6H, NH2-
CH2-CH2 et (CH2)2-CH2-CF2) ; 1,28 (sl, 26H, CH2) ; 1,152 (t, 3H, JHH = 7,5Hz, CF2-(CH2)3-
CH3) ; 0,89 (t, 3H, JHH = 7Hz, CH3).
RM 13C-1H (100 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm:180,69 (s, COO-);
118,68-111,26 (m, CF2 et CF3); 103,19 (s, C1, anomérique); 78,83 – 67,88 (m, CH sucre);
62,01 (s, C6); 61,47 (s, C6’); 49,91 (s, Cα); 36,97 (s, CH2-COO-); 31,67 (s, CH2-CF2); 30,52 –
22,39 (m, CH2 chaînes); 19,94 (s, CF2-(CH2)3-CH3); 13,44 (s, CH3).
RM 19F (376 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : -124,27 (-CF2-CF2-
(CF2)2-CF2-CF2); -122,53 (-CF2-CF2- (CF2)2-CF2-CF2); -116, 93 ((-CF2-(CH2)3-CH3); -114,93
(CF2-(CH2)2-COO-).
IR (KBr) cm-1: 1568 (ῡCOO- asymétrique), 1402 (ῡCOO- symétrique).
Partie expérimentale
201
III.4.3 Association catanionique L16F8
C
O
O
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
123
45
6
1'2'3'
4'5'
6'
α
F
F F
F F
F F
F F
F F
F F
F F
F F
RM 1H (400 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 4,5 (d, JHH = 7,6Hz,
1H, H anomérique); 4,2 – 3,5 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 3,1 – 2,9 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);
1,72 (m, 2H, NH2-CH2-CH2) ; 1,27 (sl, 26H, CH2) ; 0,88 (t, 3H, JHH = 6,8Hz, CH3).
RM 13C-1H (100 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm:161,86 (s, COO-);
117,07-108,38 (m, CF2 et CF3); 103,18 (s, C1, anomérique); 78,8 – 67,8 (m, CH sucre); 62,01
(s, C6); 61,45 (s, C6’) ; 49,8 (s, Cα); 31,64 – 22,36 (m, CH2 chaînes) ; 13,4 (s, CH3).
RM 19F (376 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : -126,71 (CF2-CF3); -
123,29 - - 122,29 ((CF2)5 CF2-CF3); -117,56 (CF2-COO-); -81,62 (CF3).
IR (KBr) cm-1: 1568 (ῡCOO- asymétrique), 1402 (ῡCOO- symétrique).
Partie expérimentale
202
III.4.4 Association catanionique L16H13
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
123
45
6
1'2'3'
4'5'
6'
α
C
O
O
RM 1H (300 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 4,33 (d, 1H, H
anomérique); 4,18 – 3,49 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 2,99 – 2,92 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);
2,10 (t, JHH = 9Hz, 2H, CH2–COO-); 1,65 (sl, 2H, NH2-CH2-CH2) ; 1,51 (m, 2H, CH2-CH2–
COO-) ; 1,2 (sl, 46H, CH2) ; 0,82 (t, 6H, JHH = 6Hz, CH3).
RM 13C-1H (75 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 2,67 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 181,49 (s,
COO-); 103,48 (s, C1, anomérique); 79,9 – 69,09 (m, CH sucre); 62,22 (s, C6); 61,21 (s, C6’) ;
51,79 (s, C1); 49,56 (s, Cα); 37,51 (s, CH2-COO-); 31,81 – 22,54 (m, CH2 chaînes) ; 13,5 (s,
CH3).
IR (KBr) cm-1: 1549 (ῡCOO- asymétrique), 1406 (ῡCOO- symétrique).
Partie expérimentale
203
IV TECHNIQUES DE CARACTERISATION PHYSICO - CHIMIQUE
IV.1 Préparation des solutions de catanioniques
Les solutions aqueuses de tensioactifs catanioniques dendritiques ont été préparées
selon le mode opératoire suivant. Dans un tube à essais 1mg de produit a été pesé et solubilisé
dans 0,5 ml d’un mélange eau : n-propanol = 1 : 3. Après l’évaporation des solvants sous
pression réduite (10 mbar), afin d’assurer l’évaporation complète des solvants, le tube à essai
a été soumis pendant une heure à un vide poussé (10-2 mbar). Un film transparent de produit
se forme à l’intérieur du tube. Une quantité précise d’eau ultra pure à été ajoutée afin
d’obtenir, pour chaque association catanionique dendritique, une solution aqueuse d’une
concentration maximale de 10-4 M. La solution a été homogénéisée en la soumettant aux
ultra-sons durant 10 min à une température de 45°C. Après repos, des quantités précises de
cette solution aqueuse ont été diluées, à température ambiante, avec différentes quantités
d’une solution aqueuse NaCl 0,15M.
En ayant une solubilité supérieure à celles des associations catanioniques dendritiques,
les tensioactifs catanioniques mixtes fluorés/hydrogénés n’ont pas eu besoin pour la
préparation des solutions aqueuses d’un protocole opératoire impliquant la formation d’un
film de produits. Ainsi, les solutions ont été préparées par simple solubilisation dans l’eau
ultra pure de différentes quantités de tensioactifs afin d’obtenir une concentration finale de
5x10-3M. Après solubilisation à une température de 45°C, les solutions ont été soumises aux
ultra-sons à la même température pendant 10 minutes. Après repos, des quantités précises de
cette solution aqueuse ont été diluées, à température ambiante, avec différentes quantités
d’une solution aqueuse NaCl 0,15M. La précision des concentrations des solutions préparées
étant de ± 1%.
Les solutions de tensioactifs ont été soumises aux ultra-sons en utilisant un bain à ultra-
sons Elmasonic S 30 (37kHz) avec régulation de température.
IV.2 Mesure de tension de surface
Les mesures de tension de surfaces ont été réalisées avec un tensiomètre VWR TD1
Lauda par la méthode de la lame mouillable selon Wilhelmy ou la méthode de l’anneau selon
Du Noüy. La technique consiste à déformer l’interface air-eau et à mesurer la force nécessaire
Partie expérimentale
204
à la rupture du film de surface. Les solutions ont été étudiées dans une cuve de téflon et la
lame ou l’anneau utilisé était composé de platine et d’iridium.
La force capillaire F du liquide est exprimée par l’équation 1:
F = 2γl
Équation 1
Où γ est la tension superficielle et l la longueur du fil de platine de l’étrier. L’équation
permet à l’appareil de fournir la valeur de la tension superficielle, qui représente l’énergie
interfaciale.
Les solutions dans l’eau ultrapure ont été préparées par pesée. Les prises de mesure
ont été réalisées à l’équilibre soit après 4 ou 24 heures. Les solutions salines (NaCl 0,15M)
ont été préparées par dilutions successives d’une solution mère aqueuse (10-4M et 5x10-3M
pour les associations catanioniques dendritiques et hybrides respectivement) avec une solution
aqueuse NaCl 0,15M. Les prises de mesure ont également été réalisées à l’équilibre.
Pour les mesures des systèmes présentant un plateau intermédiaire, des solutions
supplémentaires ont été préparées afin de vérifier la validité de ces points.
Pour la méthode de l’anneau selon Du Noüy les valeurs ont été corrigées en utilisant le
tableau de correction Harkins – Jordan 1.
IV.3 Evaluation de la taille et de la distribution de taille des agrégats - Diffusion quasi-élastique de la lumière (DLS)
Les études de diffusion quasi-élastique de la lumière ont été réalisées à l’aide d’un
appareil Malvern Instrument Zetasizer 3000HSA à un angle de 90° à 298K ou 310K.
L’appareil est muni d’un laser He – Ne qui émet une lumière monochromatique d’une
longueur d’onde de 633 nm. La gamme de tailles pouvant être étudiée par cet appareil est
comprise entre 5 nm et 10µm. La température est régulée par une plaque à effet Pelletier à ±
0,1°C. Afin d’obtenir la distribution en taille des agrégats, le modèle Contin a été employé.
L’adéquation entre le modèle utilisé et les données expérimentales (fonction
d’autocorrélation) a été vérifiée par la présence d’une distribution régulière des résiduels. La
précision des mesures est de ± 5 nm.
N.B. Les indices de polydispersité ont été obtenus en utilisant un modèle monomodal.
Partie expérimentale
205
La lumière émise par le laser, lors de l’interaction avec des particules en mouvement
(mouvement brownien), est diffusée dans toutes les directions. Pour des objets sphériques, la
diffusion est maximale pour un angle de 90° avec la lumière incidente. Au cours de la
diffusion, la lumière réémise par les objets subit une modification de sa fréquence en raison
d’un effet Doppler, et est donc dépendante de la vitesse de diffusion des particules. La
relation de Stockes-Einstein (1905), relie le rayon hydrodynamique rH des particules à leurs
coefficients de diffusion DT (Equation 2, où k est la constante de Boltzmann, T la température
absolue, et η la viscosité du milieu).
rH = kT / 3πηDT
Équation 2
Par ailleurs, l’intensité diffusée est dépendante du nombre de particules diffusantes. En
tenant compte de cela, et en appliquant un modèle statistique, une distribution de la taille des
particules peut être déterminée.
Les échantillons ont été préparés à différentes concentrations supérieures à la CAC et
préalablement filtrés sur un filtre pour seringue Sartorius dont la taille des pores est de 1,20
µm. La solubilisation des tensioactifs est assurée par chauffage doux et agitation modérée de
la solution afin de ne pas induire des forces de cisaillement (pour une partie des études
réalisées sur les tensioactifs catanioniques hybrides) ou par l’utilisation des ultra-sons (voir
section IV.1 pour la préparation des échantillons). Les solutions préparées sont laissées à
stabiliser pendant une période de temps variable (de 4 à 24 heures) en fonction des conditions
expérimentales et des produits.
IV.4 Caractérisation des agrégats
IV.4.1 Microscopie électronique par transmission
La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour déterminer la
morphologie des agrégats formés spontanément ou par l’utilisation des ultra-sons en solution
aqueuse.
Les solutions aqueuses d’objets préparés à des concentrations supérieures à la CAC ont
été déposées sur une grille de cuivre (Formvar) recouverte d’un film de carbone. L’excès de
solution est enlevé par capillarité (papier filtre) et le solvant est évaporé. La grille est ensuite
Partie expérimentale
206
déposée dans une goutte de contrastant (phosphotungstate de sodium 2% m/m neutralisé à
pH=7), dont l’excès est également retiré par capillarité, puis laissé sécher à l’air libre.
Les études ont été réalisées au Service Commun de Microscopie Electronique de
l’Université Paul Sabatier (TEMSCAN), en utilisant un microscope de type JEOL 200 CX qui
opère à 200 kV.
Le principe de l’observation est basé sur l’effet d’écran que peut produire un réseau de
molécules organisées, tel qu’au sein des agrégats. En effet, l’échantillon est soumis à un
faisceau d’électrons cohérent et les zones de l’échantillon de haute densité moléculaire vont
s’opposer au passage des électrons en raison d’une densité électronique plus importante et
permettre ainsi l’apparition d’un effet de contraste. L’agent contrastant ajouté est un métal
lourd, qui a une bonne affinité pour les zones polaires, et qui renforce ainsi cet effet.
La nécessité d’une étape de déshydratation ainsi que la présence d’un agent contrastant
sont souvent à l’origine d’artéfacts. C’est pour cela que les observations ont été répétées au
moins deux fois.
IV.4.2 Cryofracture
La technique de la cryofracture permet de s’affranchir de l’utilisation d’un agent
chimique de contraste car elle permet d’obtenir une réplique de la surface fracturée d’un
échantillon cryofixé.
Un très faible volume de l'échantillon (environ 1µL) est posé sur une plaquette porte-
objet en cuivre (d'une surface d'environ 1 mm2). Une plaquette identique est alors disposée sur
cette goutte d'échantillon de façon à créer un « sandwich » d'échantillon d'une épaisseur de
l'ordre de 20 micromètres (Figure 1.1 et 1.2). Les plaquettes sont préalablement traitées pour
que l'échantillon mouille correctement la surface. Cet ensemble est ensuite plongé
brusquement dans un bain de propane liquide (de température environ égale à -200°C)
refroidi par l’azote liquide (Figure 1.3). Cette congélation ultrarapide permet en principe de
préserver l'organisation interne de l'échantillon, les molécules constituant la phase fluide
n'ayant, normalement, pas le temps de cristalliser comme elles le feraient si la température
était diminuée progressivement. Le but recherché est une vitrification de l'échantillon.
L'ensemble plaquettes/échantillon est ensuite introduit dans la table porte-échantillon, dans
l'enceinte de l'appareil de cryofracture BAF 400 (Balzers, Liechtenstein) maintenue à une
pression très faible (environ 10-6 mBar) et à une température de -120°C (ou -150°C). Les deux
Partie expérimentale
207
plaquettes de cuivre sont alors séparées de manière mécanique comme schématisée sur la
figure 1.4. La table porte-échantillon s'ouvre, séparant les deux plaquettes de cuivre : la
plaquette supérieure est imbriquée dans la partie mobile du porte-échantillon et la plaquette
inférieure est maintenue dans la partie fixe.
L'échantillon est alors fracturé. La ligne de fracture passe par les zones de moindre
résistance, séparant l'échantillon en deux parties. Ces zones de faibles cohésions sont, par
exemple, la zone hydrophobe d'une couche lipidique dans le cas d'une membrane ou bien la
surface de contact entre les particules colloïdales et le solvant environnant (Figure 1.5).
Une réplique de la surface fracturée est effectuée, par un ombrage de la surface par des
vapeurs de métaux lourds (Pt) à l'aide d'un canon à électron incliné de 45° par rapport à la
surface. Ainsi, le métal se dépose avec une épaisseur caractéristique qui varie selon le relief
de la surface (Figure 1.5). Un deuxième canon dépose une couche uniforme de carbone, avec
un angle de 90°, afin d'augmenter la résistance mécanique de la réplique de la surface
fracturée (Figure 1.5).
L'ensemble constitué de l'échantillon couvert de sa réplique de platine et de carbone est
ensuite ramené à température et pression ambiante, nettoyé dans un solvant adapté (H2O ou
une solution concentré de H2SO4) et déposé sur une grille de microscopie électronique. La
réplique ainsi préparée, est observée au microscope électronique en transmission (Figure 2).
La finesse des grains de platine fixe la résolution de l'image.
L'image de la surface est obtenue grâce à un faisceau d'électrons projeté verticalement
sur la réplique. Le carbone est traversé par les électrons alors que le platine les arrête de façon
plus ou moins totale selon l'épaisseur rencontrée par le faisceau. Un film photographique situé
sous l'échantillon, permet de retranscrire les informations sur le relief en contraste de gris : les
zones de la réplique où le platine s'est accumulé apparaissent en noir, les zones sans platine
sont blanches et les zones sans relief sont grises car le platine s'y est réparti uniformément
(Figure 2). L'analyse précise de l'image est parfois complexe car il s'agit ici d'une coupe
bidimensionnelle dans un échantillon tridimensionnel. Cependant dans bien des cas, elle
permet d'obtenir de précieuses informations sur la structure de l'échantillon.
Partie expérimentale
208
Figure 1 : Représentation schématique de la préparation des échantillons obtenus par cryofracture
L’observation de la réplique a été effectuée sur un microscope électronique à
transmission EM 902 (Zeiss) qui opère à 90 kV et les images ont été enregistrées par une
caméra CCD (Charge Coupled Device camera(TRS)).
Figure 2 : Schéma de l'étape d'observation au microscope électronique en transmission http://www.crpp.u-bordeaux.fr/transform/competences/cryofracture.html
http://www.lps.ens.fr/recherche/surfaces-moleculaires/taulier/Experiences-cryo.html
table porte-échantillon
ligne de fracture
Partie expérimentale
209
IV.5 Isothermes de compression
Les isothermes de compression (pression de surface / aire par molécule (π/A)) ont été
enregistrées en utilisant une balance de Langmuir R&K GmbH (Potsdam, Germany) ayant
une aire de surface de 307,8 cm² et équipée d’un système Wilhelmy de mesure de la pression
de surface qui utilise une lame en papier. La cuve en téflon a été thermostatée à une
température de 20°C en utilisant un bain thermostaté avec une circulation d’eau. La
compression du film a été faite par une barrière mobile.
La cuve est remplie avec une solution aqueuse (0,15mM NaCl) obtenue à partir d’eau
ultra pure (eau Milipore Q-grade de résistivité supérieure à 18 MΩ.cm). Pour la mesure de
tension superficielle on plonge la plaque de Wilhelmy préalablement mouillée. On procède
ensuite au nettoyage de la surface par aspiration avec une trompe à eau pour éliminer toute
traces d’impuretés. On épand la solution du phospholipide (50µl, 1mM en chloroforme) avec
une micro-seringue, en faisant tomber la solution goutte à goutte à la surface aqueuse. On
attend environ 10 minutes que le solvant s’évapore et on injecte dans la sous-phase d’une
manière homogène des faibles quantités (d’ordre de microlitres) d’une solution aqueuse
concentrée (10-4 M et 5x10-3 M pour les associations catanioniques dendritiques et
bicaténaires respectivement – pour la préparation des échantillons voir la section IV.1) du
composé catanionique étudié. Après une période d’approximativement 30 minutes
d’équilibration du système et d’adsorption du tensioactif à l’interface eau - air, le film est
comprimé en déplaçant la barrière à une vitesse de 5 Å2/ molécule/ min. La variation de la
tension superficielle est mesurée par la microbalance équipée d’une lame de Wilhelmy en
papier qui est immergée dans la sous-phase.
Le même protocole est respecté dans le cas des mesures des isothermes de compression
sans DPPC réalisées pour les composés catanioniques dendritiques sauf que l’interface n’est
plus occupée par les molécules de phospholipide.
Chaque mesure a été réalisée au moins deux fois.
Partie expérimentale
210
IV.6 Spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS)
Les mesures de spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) ont été
réalisées sur les monocouches formées à l’interface eau/air en utilisant une balance de
Langmuir (180,09 cm²) équipée d’un système Wilhelmy de mesure de la pression de surface
qui utilise une lame en papier. La cuve en téflon a été thermostatée à une température de 20°C
en utilisant un bain thermostaté avec une circulation d’eau. La compression du film a été faite
symétriquement par deux barrières mobiles.
Les monocouches de DPPC ont été préparées comme présenté précédemment pour les
isothermes de compression (quantité utilisée : 25µl, sol. 1mM en CHCl3), la sous – phase
étant toujours une solution aqueuse saline (0,15mM NaCl) obtenue à partir de l’eau ultra pure
(eau Milipore Q-grade de résistivité supérieure à 18 MΩ.cm).
Pour les mesures réalisées à une pression de compression constante, le film de DPPC a
été comprimé à une pression de 30mN/m avant qu’on injecte dans la sous – phase (d’une
manière homogène et derrière les barrières) des faibles quantités (microlitres) d’une solution
concentrée (10-4 M et 5x10-3 M dans l’eau pour les associations catanioniques dendritiques et
bicaténaires respectivement, solutions préparées comme décrit dans la section IV.1) du
composé catanionique étudié. Pendant l’expérience, la pression de compression est maintenue
constante à 30mN/m par les deux barrières mobiles. Ainsi, l’insertion du tensioactif dans la
monocouche de DPPC provoque un écartement des barrières par rapport à la position initiale
(DPPC comprimé à 30mN/m) pendant que l’expulsion du composé de la monocouche
engendre un rapprochement des barrières.
Des spectres IRRAS ont été enregistrés pour le DPPC pur et ensuite à chaque demi-
heure après l’injection du tensioactif dans la sous – phase pour une période de temps de 8
heures.
Dans la technique de spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS)
chaque spectre infrarouge est une combinaison de deux mesures separées de reflection (Figure
3). Le signal obtenu, en unités de réflexion-absorption (RA), est le rapport de lumière
réfléchie des deux surfaces liquides: RA = -log[(réflexion de l’echantillon)/( réflexion de la
référence)] = -log (R/ R0).
Ces mesures ont été réalisées en utilisant un spectromètre Vertex 70 (Bruker Optik
GmbH) ayant un détecteur de mercure – cadmium – tellure (MCT) fixé à une unité externe de
Partie expérimentale
211
réflexion disposant d’une cuve de Langmuir (XA – 511, Bruker). Le détecteur est refroidi
avec de l’azote liquide. Un mécanisme coulissant déplace alternativement la cuve de référence
et celle de l’échantillon dans le faisceau infrarouge, permettant l’acquisition alternative des
interférogrammes. Les deux cuves sont connectées afin d’assurer la même hauteur de surface
des deux cotées. Pour toutes les mesures nous avons utilisé un angle d’incidence de 40° et une
lumière p – polarisée. Les spectres représentent la moyenne de 400 scans enregistrés à une
vitesse du scanner de 20kHz et une résolution de 8 cm-1. La lumière réfléchie est collectée au
même angle que l’angle d’incidence.
Le faisceau infrarouge incident a été polarisé en utilisant une grille de polarisation
KRS-5. L’assemble des instruments est enfermée dans une enceint en polymère transparent
afin de réduire les fluctuations d’humidité.
Figure 3 : Schéma du principe de mesure en IRRAS
Partie expérimentale
212
V TESTS BIOLOGIQUES
La lignée cellulaire CEM-SS est cultivée dans un milieu RPMI 1640 (Sigma -Aldrich)
– milieu biologique mis au point par Moore et ses collaborateurs en 1966 à " Roswell Park
Memorial Institute ", d’où le nom de RPMI. Le milieu contient : 100UI/ml de pénicilline,
100µg/ml de streptomycine, 2 mM de glutamine et il est additionné de 10% serum de veau
fœtal préalablement décomplémenté 30 minutes à 56°C. Les cultures cellulaires sont
maintenues à 37 °C sous 5% CO2 et repiquées 3 fois par semaine.
V.1 Conditions expérimentales d’infection des cellules CEM-SS
Le virus VIH-1 Lai, normalement conservé à une température de -80°C, est décongelé
en présence de sérum pendant 5 minutes à 37°C. Puis, des aliquotes de virus sont incubés
avec des cellules CEM-SS 1heure, à 37°C. Après cette période de temps, les virus qui n’ont
pas pénétrés dans les cellules sont éliminés du système analysé par trois lavages successifs
dans le RPMI 1640. Par la suite, ces cultures cellulaires partiellement infectées (quelques %)
par le VIH sont remisées dans un milieu de RPMI et sont traitées avec des solutions des
produits à tester (solutions de différentes concentrations obtenus par dilution d’une solution
mère soniquée (10-4M et 5x10-3M des tensioactifs catanioniques dendritiques et tensioactifs
catanioniques hybrides respectivement – solutions préparées comme décrit dans la section
IV.1)) dans le RPMI. Ces cultures cellulaires sont maintenues à 37 °C sous 5% CO2 pendant 5
jours. Des cultures cellulaires infectées et traitées avec un anti-VIH de référence (AZT) ainsi
que des cultures cellulaires infectées et non traitées et des cultures cellulaires non infectées
(traitées et non traitées) sont maintenues dans les mêmes conditions expérimentales.
Après les 5 jours d’incubation des tests d’évaluation de l’activité anti-VIH et de la
cytotoxicité des tensioactifs catanioniques sont réalisés.
Partie expérimentale
213
V.2 Evaluation de l’activité anti – VIH : incorporation d’uridine tritiée ([3H]- uridine)
La mesure de l’incorporation d’uridine radioactive permet d’apprécier l’activité de la
transcriptase inverse du VIH. Une quantité précise d’[3H] – uridine est additionnée à un
volume minimal de milieu de culture frais puis les cellules sont incubées pendant 6h. Elles
sont ensuite lysées avec 1% SDS (dodecyl sulfate de sodium); les lysées sont déposés sur des
carrés de papier Whatman puis les ARN sont précipités en présence de 10% d’acide
trichloracétique (TCA) pendant 20mn à 4°C. Après 2 lavages avec 5% TCA et 2 lavages avec
70% éthanol, la radioactivité incorporée est mesurée à l’aide d’un compteur à scintillation
(Beckman, LS 1800).
Le pourcentage d’inhibition de la transcriptase inverse est déterminé par rapport aux
cellules infectées non traitées.
Rad des cellules infectées traitées - Rad des cellules non infectées non traitées
Rad des cellules infectées non traitées - Rad des cellules non infectées non traitées
Rad = Radioactivité
V.3 Evaluation de la cytotoxicité : test MTT
Ce test est basé sur la capacité des déshydrogénases mitochondriales de cellules
métaboliquement actives à réduire le 3-(4,5-diméthylthiazol-2yl)-2,5-diphényl tétrazolium
bromide (MTT) de couleur jaune, en formazan de couleur bleu-violet (Figure 4), qui précipite
sous forme de cristaux dans les cellules.
S
NN N
NN
Br
déshydrogénases mitochondriales
S
NN N
NHN
3-(4,5-diméthylthiazol-2yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide (MTT) jaune
formazan bleu-violet
Figure 4 : Schéma de la réaction de réduction du MTT en formazan
Puis, les cristaux de formazan sont solubilisés par addition d’isopropanol contenant
0,04N HCl et 10% Triton – X100. Après la solubilisation, la quantité de formazan produite est
% d'inhibition = 100 - de la réplication virale
x 100
Partie expérimentale
214
évaluée par mesure de sa densité optique à 540nm (DO540), nous permettant ainsi de déduire
le nombre de cellules vivantes.
Le pourcentage de toxicité est calculé par rapport aux cellules témoin, non infectées et
non traitées avec les composés anti-VIH testés.
DO540 des cellules non infectées traitées
DO540 des cellules non infectées non traitées
(1) Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Am. Chem. Soc., 1930, 52, 1751.
Cytotoxicité % = 100 - x 100
Liste des produits
Liste des produits
217
LISTE DES PRODUITS
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH
n
L12: n = 8
L16: n = 12
N3P3 O
N N
Me
P
S
O
NH
O
P
O
OH
O
C3H72
x 12
O
OH
OHHO
HOHO
OHHO
HO
ONH2
6
L12 DC3
N3P3 O
N N
Me
P
S
O
NH
O
P
O
OH
O
C3H72
x 12
O
OH
OHHO
HOHO
OHHO
HO
ONH2
6
L16 DC3
N3P3 O
N N
Me
P
S
O
NH
O
P
O
OH
O
C10H21
2
x 12
O
OH
OHHO
HOHO
OHHO
HO
ONH2
6
L12 DC10
N3P3 O
N N
Me
P
S
O
NH
O
P
O
OH
O
C10H21
2
x 12
O
OH
OHHO
HOHO
OHHO
HO
ONH2
6
L16 DC10
Liste des produits
218
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
12
C
O
O
CF2
CF3
7
L16H4F8
O
OH
HO OH
OH
OH
HO OH
OH
O NH2
12
C
O
O
CF2 6
L16H2F6H4
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
12
C
O
O
CF2
CF3
7L16F8
O
OH
HO OH
OHOH
HO OH
OH
O NH2
12
C
O
O
9
L16H13
Ana-Maria Cristina BOLOLOI
ew catanionic amphiphiles analogues of Galactosylceramide: structure, physico-
chemical properties and anti-HIV activity relationship
Abstract
The research work presented in this thesis was focused on the development of new
catanionic surfactants analogues of GalCer (an alternative cellular receptor of the HIV) for the
anti-HIV therapy.
The first part of the study was dedicated to the synthesis and the study of new
dendritic catanionic associations having a reduced toxicity and which were intended to be
used as multisite chimeras for the HIV. In order to prevent the possible partial dissociation of
the catanionic entity, supposed responsible for the toxicity of this class of compounds, we
reinforced the hydrophobic interactions between the constituents by grafting supplementary
alkyl chains on the dendrimers. The “in vitro” biological tests, the study of the physico-
chemical properties and of the interaction of these compounds with a membrane model
allowed us to establish a relationship between the structure, the hydrophoby, the conformation
and the biological activity of these dendritic catanionic associations.
The aim of the second part of the study was to build up a specific anti-HIV drug
delivery system. For this purpose new hybrid (fluorinated/hydrogenated) catanionic analogues
of GalCer were synthesised and investigated. These compounds are able to spontaneously
form vesicles in water, which have a good stability in time, due to the presence of a rigid and
hydrophobic segment. Due to his good anti-HIV activity, the good stability in time of the
vesicles and his strong synergy with another anti-HIV drug, the AZT, a very promising
catanionic association was identified for the delivery of anti-HIV drugs to the infected cells.
Keywords : HIV, catanionic surfactant, hybrid surfactant, galactosylceramide analogs,
dendrimers, vesicle, multisite, drug delivery, formulation, AZT.
Auteur : Ana-Maria Cristina BOLOLOI
ouveaux amphiphiles catanioniques analogues du galactosylcéramide : corrélation
structure, propriétés physico-chimiques et activité anti-VIH
Directeur de thèse : Isabelle RICO-LATTES et Sorin Ioan ROSCA
Lieu et date de soutenance : Université Paul Sabatier, Toulouse le 19 mai 2008
Résumé
Les travaux présentés dans cette thèse portent sur la mise au point de systèmes
catanioniques analogues du GalCer (récepteur cellulaire alternatif du VIH) pour la thérapie
anti-VIH.
Dans une première partie, nous nous sommes concentrés sur la synthèse et l’étude de
nouveaux assemblages catanioniques dendritiques possédant une toxicité réduite et destinés à
être utilisés comme leurres multisites pour le VIH. Afin de prévenir l’éventuelle dissociation
de l’entité catanionique, responsable de la toxicité, nous avons renforcé les interactions
hydrophobes entre les éléments constitutifs par ajout de chaînes alkyles sur le dendrimère. Les
tests biologiques réalisés in vitro, l’étude des propriétés physico-chimiques ainsi que l’étude
des interactions et de l’incorporation de ces composés dendritiques catanioniques dans des
modèles membranaires nous ont permis d’établir une corrélation entre la structure,
l’hydrophobie, la conformation et l’activité biologique de ces produits.
Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à la mise au point de vecteurs
spécifiques pouvant délivrer des principes actifs anti-VIH. Dans ce but nous avons synthétisé
une nouvelle famille d’analogues catanioniques du GalCer - des dérivés bicaténaires mixtes
fluorés/ hydrogénés. Ces composés sont capables de s’auto-organiser spontanément dans l’eau
en formant des vésicules qui possèdent une grande stabilité dans le temps de par la présence
d’une partie fluorocarbonée très rigide et hydrophobe. Un candidat très prometteur pour le
transport de principes actifs anti-VIH a pu être identifié, pour sa bonne activité anti-VIH, sa
faible toxicité, la longue stabilité dans le temps des vésicules qu’il forme et sa forte synergie
avec un autre principe actif anti-VIH, l’AZT.
Mots clés : VIH, tensioactif catanionique, tensioactif hybride, analogues du
galactosylcéramide, dendrimères, vésicule, multivalence, vectorisation.
Discipline : Chimie macromoléculaire et supramoléculaire
Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique,
Université Paul Sabatier – Bât. 2R1, 118 route de &arbonne, 31062 Toulouse Cedex 04