ANALISA PROTEIN

ANALISA PROTEIN

1Protein Komponen berlebih dalam selHampir semuanya (kecuali yang disimpan) untuk fungsi biologis dan struktur selMempunyai berat molekul bervariasi 5000-jutaan daltonTersusun oleh unsur H,C,N,O dan STerdiri dari asam amino yang diikat oleh rantai peptida2

3

4

5

6

7

8

9ProteinDiklasifikasikan berdasarkanKomposisiStrukturFungsi biologisKelarutan proteinAkan terdenaturasi oleh panas, asam, alkali, 8 M urea, 6M guanidine-HCl, pelarut organik dan detergenDenaturasi mempengaruhi sifat kelarutan protein 10Analisa protein dihadapkan pada kenyataan bahwa komponen makanan mempunyai sifat kimia serupa.ExampleN non-protein dapat berasal dari asam amino bebas, peptida kecil, asam nukleat, fosfolipid, gula amino, porphyrin, dan beberapa vitamin, alkaloid, asam urat, urea dan ion ammonium 11Nitrogen adalah unsur utama proteinNamun kandungannya bervariasi dalam makanan (13,4-19,1%) karena komposisi asam amino spesifik dari protein12Analisa Protein penting untukLabel GiziMengetahui sifat fungsional protein pengolahan makananMenentukan aktivitas biologisnya enzim proteolitik untuk mengempukkan daging, pektinase untuk mematangkan buah13ANALISA PROTEIN untuk mengetahui :Kandungan protein totalKandungan protein dalam campuranKandungan protein selama isolasi dan purifikasiNitrogen non proteinKomposisi asam aminoNilai Gizi protein

14Kandungan protein dalam makananFood item% protein (berat basah)Sereal dan pastaBeras merah (butir padi, mentah)7.9Beras putih (butir padi, biasa, mentah,diperkaya) 7.1Tepung terigu, biji gandum13.7Tepung jagung (butiran, kuning) 6.9Spageti (kering, diperkaya)12.8Pati jagung0.3Produk susuSusu (whole, cair)3.3Susu skim (bubuk)36.2Keju 24.9Yogurt (biasa, rendah lemak)5.315Cont.Food item%ptotein (berat basah)Buah dan sayurApel (mentah,dengan kulit)0.2Asparagus (mentah)2.3Strawberry (mentah)0.6Seladai (mentah, beku)1.0Kentang (whole, daging dan kulit)2.0Kacang-kacanganKedelai (biji matang, mentah)36.5Biji-bijian (semua jenis, mentah)23.6Tofu (mentah, keras)15.8Tofu (mentah, biasa) 8.116Cont..Food item% protein Daging, ayam dan ikanDaging (potongan antara leher dan bahu)18.5Daging (kering, curing)29.1Ayam (broiler atau potong,daging dada saja, mentah)23.1Ham (biasa, irisan)17.6Telur (mentah,utuh)12.5Cod (pasifik, mentah)17.9Tuna (putih,direndam dalam minyak, kering padat)26.517Analisa ProteinKjeldahlDumasInfrared SpectroscopyBiuretLowryBradford dye-binding18Metoda KjeldalKjeldal (Johan kjeldahl asal Denmark (1883).Metode peneraan empiris Kelemahan metode Kjeldal :Senyawa bukan protein ada yang mengandung N, walaupun jumlah nya lebih sedikit dari proteinJumlah protein dengan cara ini jumlah protein kasar (crude protein) 19Prinsip cara KjeldalProtein dan komponen organik lainnya didestruksi dengan asam sulfat yang ditambah dengan katalisator. Hasil destruksi dinetralkan dengan alkali dan ditampung dalam larutan asam borat. Anion borat yang terbentuk dititrasi dengan asam standar untuk mengkonversi komponen sampel menjadi nitrogen. 20Cara Kjeldal dibedakan menjadi 2 :Makro sampel yang sukar dihomogenasi dan berat sampel 1-3 gSemimakro untuk sampel lebih kecil (kurang dari 300 mg)

21Tahap analisa metode KjeldalDestruksi

Destilasi

Titrasi

22

23

24Tahap Destruksi (digestion)Digestion dengan asam sulfurat dengan penambahan pottasium permanganat untuk oksidasi komplet dan konversi dari N menjadi ammonium sulfat25Tahap DestilasiHasil destruksi (ammonium sulfat) dialiri air. Larutan alkali yang mengandung sodium thiosulfat ditambahkan untuk netralisasi. Ammonia yang terbentuk ditampung dalam asam borat yang telah ditambahkan methylen blue and methyl red. Terbentuk borat anion.Destilasi sempurna destilat tidak bereaksi basis26TitrasiAnion borat dititrasi dengan HCL terstandarisasiTerjadi konversi membentuk Nitrogen27Perhitungan%N = N HCl (V. Sampel V.blanko) x 14 x 100 Berat sampel(g)

Perhitungan selanjutnya % N dikali dengan faktor perkalian28Dasar perhitungan Protein alamiah unsur N rata-rata 16 % (dalam protein murni)Jumlah protein :Jumlah N x 100/16 atauJumlah N x 6,25Faktor perkalian 6,25 untuk bahan yang belum diketahui komposisi unsu-unsur penyusunnya.29Faktor perkalian N beberapa bahanMacam BahanFaktor perkalianBir, sirup, biji-bijian, ragi6,25Buah-buahan, teh anggur, gandum6,25Makanan ternak6,25Beras5,95Roti, gandum, makaroni, mie5,70Kacang tanah5,46Kedele5,75Kenari 5,18Susu6,38Gelatin5,5530Dapat diaplikasikan pada semua jenis makananTidak mahal (jika tidak meggunakan autosistem)Akurat untuk protein kasarDapat dimodifikasi untuk mengukur jumlah kecil proteinKEUNTUNGAN31Mengukur total N organik, termasuk N yang bukan proteinMemakan waktu (2 jam)Ketelitian rendah dibanding biuret methodeReagen bersifat korosifKELEMAHAN32Dkembangkan oleh ilmuwan Jean-Baptiste Dumas tahun 1831Telah dimodifikasi dan automatis untuk memperbaiki akurasiAlternatif dari kjeldahl dan dapat digunakan untuk semua jenis makananDUMAS33Protein dibakar dengan suhu tinggi (700-1000 C)sehingga dibebaskan nitrogenGas Nitrogen yang terbebaskan dihitung dengan menggunakan GC dengan TCD Protein dihitung dengan cara mengalikan dengan faktor konversiPRINSIP34Sampel (100-500 mg) dimasukkan dalam tabung kapsul kemudian dibakar dalam reaktor automatisN bebas diukur dengan GC

PROSEDUR35Keuntungan Bahan kimia tidak berbahayaDapat diselesaikan dalam 3 menitAlat terbaru dapat menganalisa 150 sampel KelemahanAlat mahalMengukur total N organik, termasuk N yang bukan protein36Metode LowryPrinsipReaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan (merupakan residu protein) akan menghasilkan warna biruMerupakan kombinasi dari cara biuretPanjang gelombang750 nm sensitifitas tinggi (konsentrasi protein rendah)500 nm sensitifitas rendah (konsentrasi protein tinggi)37Sangat sensitif 50-100x lebih sensitif dari metoda biuret10-20 x lebih sensitif dari UV absorption methodeSama dengan Nesslerization (prosedur alternatif)Kurang dipengaruhi oleh turbiditas sampelLebih spesifikSederhana dapat dilakukan 1-1.5 jam

KEUNTUNGAN38Warna bervariasi pada protein yang berbedaVarna tidak terbatas pada konsentrasi proteinsenyawa fenol dapat membentuk warna biru sehingga dapat mengganggu hasil penetapan. Reaksi dapat dipengaruhi oleh sukrosa, lipid, buffer phosphat, monosakarida,heksoamin

KELEMAHAN39Metode LowryKonsentrasi protein diukur pada panjang gelombang 600 nmProtein standar : Albumin serum darah sapi, BSA Perlu membuat kurva standard40Protein diencerkan (20-100 g)Larutan lowry ada 2 macam :Lowry A : fosfotungstat : fosfomolibdat (1:1) atau pereaksi folinLowry B : 2 % natrium karbonat dalam NaOH 0,1NKuprisulfat dan Na-K-tartrat 2 %

PROSEDUR411 ml larutan protein ditambah 5 ml lowry B, digojog dan dibiarkan pada suhu kamar selama10 menit, kemudian ditambah 0,5 ml Lowry A digojog dan dibiarkan 20 menit.Absorbansi dibaca pada 650 nm Kurva standard dari BSA harus hati-hati dalam membuatnya (estimasi konsentrasi protein)PROSEDUR42Metode BiuretPrinsip : ikatan peptida protein membentuk komplek berwarna ungu dengan garam Cu pada kondisi basa.Panjang gelombang 540 nmIntensitas warna parameter kandungan protein dalam bahanWarna yang terbentuk sering tidak identik perlu distandarisasi dengan protein yang sudah diketahui435 ml reagen biuret dicampur dengan 1 ml larutan protein (1-10 mg/ml). Reagen copper sulfat, NaOH, dan pottasium sodium tartrat untuk menstabilkan ion kupri dalam larutan alkalinKemudian didiamkan dalam suhu kamar selama 15-30 menitPenyaringan atau sentrifugasi sebelum pembacaan absorbansi diperlukan jika campuran reaksi tidak sempurnaKurva standard dibuat dari BSAPROSEDUR44Murah Cepat (30 menit)Penyimpangan warna jarang ditemukan dibandingkan metode lain (lowry, Uvabsorption, turbidimetri)Sangat sedikit substansi lain yang terdeteksiN dari non peptida dan non protein tidak terdeteksiKEUNTUNGAN45Kurang sensitif dibanding LowryPenyerapan warna dapat dipengaruhi oleh pigmen jika adaKonsentrasi tinggi dari garam ammonium menimbulkan reaksiVariasi warna pada protein yang berbedaBukan metode absolut perlu standarisasi warnaPenyimpangan warna dapat terjadi di larutan akhir jika tingginya lemak atau KH

KELEMAHAN46Infrared SpectroscopyMengukur penyerapan radiasi oleh molekul dalam makanan atau substansi lainPerbedaan komponen perbedaan frekuensi penyerapanKarakteristik dari ikatan peptida dapat digunakan untuk memperkirakan kandungan protein dalam bahan.Digunakan untuk menentukan kandungan protein susuJuga dapat digunakan untuk padi, sereal, daging dan produk susu.Alat mahal dan harus dikalibrasi dengan tepat, namun cepat (30 detik sampai 2 menit)47Bradford Dye-Binding MethodeKetika Coomassie Brilliant Blue G-250 mengikat protein terjadi perubahan warna dari merah menjadi biru.Penyerapan maksimum pada panjang gelombang 465 595 nmPerubahan absorbansi pada 595 nm proporsi konsentrasi protein sampel48ProsedurCBB G-250 dilarutkan dalam 95% etanol dan diasamkan dalam 85%asam fosforatSampel mengandug protein (1-100g/ml) dan larutan standard BSA dicampur dengan Reagen BradfordDibaca pada 595 nm49Keuntungan Cepat (2 menit)Dapat diciptakanSensitifTidak terpengaruh ammonium sulfat, KH (sukrosa) atau kation (K+,Na+ dan Mg+2)Dapat mengukur protein atau peptida dengan BM 4000 da.50Kelemahan Terpengaruh dengan deterjen non-ionik dan ionik (triton X-100 dan sodium dodesyl sulfat), namun karena dalam jumlah kecil (0,1%) masih dapat terkontrol.Komplek protein dengan larutan dapat berikatan dengan kuvet dari kwarsa harus menggunakan kuvet plastik atau kacaVariasi warna standard protein harus dipilih dengan hati-hati.51Perbandingan metodeKjeldahl, Dumas dan Infrared Spec memerlukan sedikit preparasi. ukuran partikel 20 mesh sudah cukup. Sedangkan metode lain memerlukan preparasi lebih banyak. Kjeldahl dan Dumas mengukur jumlah total N, sedangkan metode lain mengukur sifat-sifat protein52Biuret mengukur kombinasi ikatan peptidaLowry mengukur kombinasi ikatan peptida dan asam amino triptofan dan tirosinInfrared Spec metode tidak langsung untuk memperkirakan kandungan protein berdasarkan enerdi yang terserap, ketika sample ditujukan pada panjang gelombang dari radiasi infrared.Kjeldahl, Dumas dan Biuret lebih rendah sensitivitasnya dibanding Lowry, BradfordInfrared Spec paling cepat. Dumas lebih cepat dibanding Kjeldahl53Yang perlu diperhatikan dalam pemilihan dan analisa : Sifat fisikokimia bahanMetode proses pengolahan makanan pemanasan dapat menurunkan daya ektrak protein untuk analisa dan menyebabkan underestimateSemua methode kecuali Dumas dan Kjeldahl memerlukan standard (protein refrence), sehingga pemilihan standard yang sesuai menjadi penting.

54N non protein dapat diatasi dengan ektraksi sampel di bawah kondisi alkalin kemudian diendapkan dengan tricloroacetic acid atau sulfosalycilyc acid. Pemanasan dapat digunakan untuk membantu pengendapan dengan alkohol,asam atau pelarut organik lain.Dalam penentuan nilai gizi protein (protein digestibility atau PER) metode kjeldahl dengan faktor konversi 6,25 dapat digunakan untuk menentukan kandungan protein kasar.

55Kualitas Nilai Gizi ProteinKualitas Nilai Gizi Protein ditentukan oleh komposisi AA dan digestibility (daya cerna) protein.Antinutrisi dapat mempengaruhi Kualitas Nilai Gizi Protein ex. Tripsin inhibitorBeberapa metode uji mutu protein menggunakan informasi tentang AA essensial dalam makananAA essensial tidak dapat disintesis tubuh sehingga harus ada dalam diet.

56Penentuan Kualitas ProteinProtein digestibility-Koreksi Skor Asam Amino Menentukan komposisi AA dalam makananMenghitung skor asam amino (mg AA dalam 1 g protein/mg AA dalam 1 g reference protein).In vivo tikus jantan dengan diet standard + 10 % protein atau tanpa protein. Kemudian dihitung True Digestibility True digestibility N yang terserap (N makanan-N feses)/N yang masuk.PDCAAS SAA x %true digestibilityUntuk nutritional labeling (50 g = Daily value for protein (g protein/serving x PDCAAS value)/50 g protein.57PER (protein efficiency ratio) menguji kualitas protein secara in vivo dengan mengukur pertumbuhan (berat badan) tikus per gram protein yang dikonsumsiMenentukan kandungan N sampel kemudian menghitung kandungan proteinnyaMembuat diet standard +10 % protein dan diet standard +10% casein sebagai kontrolMemberi makan dan air minum selama 28 hari secara ad libitum (bebas).Catat berat badan tikus awal dan setiap 7 hari sekali sampai hari ke 28Catat makanan yang terkonsumsi selama 28 hari.Hitung PER menggunakan rata-rata berat badan dan total rata-rata konsumsi.Hitung faktor koreksi PER protein uji/ PER casein kontrol

58