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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAUDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
EDUARDO ALONSO CRUZ MONROY
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE Oct-4 e CD44 EM LESÕES
ODONTOGÊNICAS EPITELIAIS BENIGNAS
NATAL/RN
2016
Eduardo Alonso Cruz Monroy
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE Oct-4 e CD44 EM LESÕES ODONTOGÊNICAS
EPITELIAIS BENIGNAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Patologia Oral da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), como
parte dos requisitos para obtenção do grau de
mestre em Patologia Oral.
Orientador: Profª Dra. Lélia Batista de Souza
NATAL/RN
2016
Monroy, Eduardo Alonso Cruz.
Análise da imunoexpressão de Oct- 4 e C44 em lesões odontogênicas
epiteliais benignas /Eduardo Alonso Cruz Monroy. – Natal, RN, 2016.
97 f. : il.
Orientadora: Profª. Drª. Lélia Batista de Souza
Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do
Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-
Graduação em Patologia Oral.
1. Cistos odontogênicos – Dissertação. 2. Tumores odontogênicos –
Dissertação. 3. Células-tronco – Dissertação. 4 imuno-histoquímica.–
Dissertação. I. Souza, Lélia Batista de. II. Título.
RN/UF/BSO Black D65
RN/UF/BSO Black D74
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
DEDICATÓRIA
Dedico o meu mestrado e o presente trabalho a três pessoas cuja cardinal ajuda me permitiu
chegar até aqui.
A mi padre, Silvio Cruz Marañón. Por su infinita ayuda sin medir esfuerzos ni sacrificios, por
el inmenso cariño, el cual me dio la fuera para enfrentar las dificultades en esta patria distante
y principalmente por darme el regalo más valioso que un padre puede darle a un hijo: “la
confianza”,
A minha orientadora e “mãe patológica” Professora Lélia Batista de Souza, por ser um
exemplo de liderança, dedicação e atitude, obrigado por toda a imensa ajuda, cuidado e
inspiração, é uma honra ter sido lapidado por mãos tão experientes, foram muitas horas,
conversas e orientações que sempre levarei com carinho no meu caminho e terei como um
tesouro para a vida toda.
Al Profesor Adalberto Mosqueda Taylor, mi mayor inspiración académica y profesional,
muchas gracias por la ayuda, oportunidad y confianza, la constante presencia de su ejemplo
fue y será siempre una fuente de voluntad y motivación. Una grande fortuna y honor aprender
bajo su guía.
AGRADECIMENTOS
A Deus e suas surpresas, pela oportunidade de vivenciar na linha de fogo uma autêntica
liberdade sob a sombra protetora das suas asas.
A mi familia: Mart, Kary, Caro y Moisés, por ser mis raíces, mis cimientos, mi fuerza en los
momentos difíciles, por significar la esperanza de volver a encontrarnos, el amor que traje de
casa que me permitió mantenerme en paz y sentirme acompañado aún frente a los mayores
desafíos.
A Mireya Olmedo e Harim Santos, meus queridos cúmplices, amigos e colegas que ajudaram
infinitamente para conseguir o sonho de fazer o mestrado no Brasil, obrigado pelo carinho,
ajuda e por acreditar em mim o tempo todo.
A Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico (CNPq) pelo apoio financeiro, tornando essa pesquisa possível.
A México y sus mexicanos… “Uno vuelve siempre a los viejos sitios donde amó la vida…”
A mi familia que estuvo al pendiente de mí, dándome su apoyo y cariño constante, Familia
López Cruz, Marcela y Gabriel Flores, Edith Martínez, Familia Monroy y Yessica Acosta.
A mis amigos de la especialidad en patología y medicina bucal de la UAM-X, José Gabriel
Zambrano, Martha García, Monserrat Real, Itzel Castillejos, Martha Jéssica Olalde, Selik
Camacho y Azalea Lozoya. Por el cariño, compañía, por las risas y los buenos momentos.
A las profesoras Gabriela Anaya y Estela de la Rosa por todo el cariño, apoyo e inspiración.
A mis amigos de México que mantuvieron comunicación constante, demostrándome su
cariño, compartiendo sus vidas, pensamientos y sentimientos conmigo, haciéndome sentir
acompañado: Luis Nishimura, Tania Alberto, Rossy Hernández, Mónica Escalante, Zyanya
García, Proibel Texcucano y Hugo Ice.
Ao Brasil e seus Brasileiros… “E agora, como hei de partir? Se na bagunça do teu coração
meu sangue errou de veia e se perdeu...”
Aos que me receberam com simpatia e receptividade e me ajudaram a dar os primeiros
passos, Keyla, Denisse e Thiago. E a todos os doutorandos da UFRN que me ajudaram em
cada dúvida, erro e dificuldade.
A todos os funcionários e professores da Pós-graduação em Patologia oral da UFRN, Prof.
Leão, Prof. Cassiano, Profa. Rosseana, Profa. Márcia, Profa. Patrícia, Profa. Lélia Maria,
Profa. Éricka, Prof. Hébel, Profa. Ana Miriam, Prof. Antônio.
Os meus 11 mestres que me acompanharam no caminho, me ensinando todo dia coisas novas.
A Luiz Arthur Barbosa, mais que um amigo, colega, companheiro, mais que um inimigo e
quase um anjo guardião... obrigado por estar sempre aí, tentando me proteger, sendo sempre
um ser maravilhoso atrás dessa máscara medonha, me ensinando desde usar um caixa
eletrônico até o valor do perdão.
A Angélica Mandú e a toda a Família Cordeiro Mandú, por todo o carinho, atenção,
receptividade e amizade sincera, obrigado por abrir as portas da sua casa para mim e minha
família, levarei sempre as melhores lembranças desse Recife fantástico que vocês me
apresentaram.
A galera mais legal de Pernambuco, Jefferson Tenório pela amizade bonita, leve e
espontânea, Leorik Pereira por compartilhar esse critério inteligente, sólido e o pensamento
autêntico e livre, Mariana Serpa por ser um exemplo inspirador de disciplina e assertividade.
A Thalita Santana pela amabilidade, disposição para ajudar e o coração nobre, A Mara Luana
Batista por ser sempre uma amiga de quem sempre recebi carinho, consolo e atenção, A
Amanda Gonzaga por ser um exemplo de esforço e dedicação e por fazer a trilha sonora da
minha vida no Brasil, A Patrícia Peixe, minha duplinha, pelo carinho, os cuidados e enormes
ajudas, A Hugo Neto por ser sempre atencioso e amável e educado, A Rodrigo Mafra, por ser
sempre cortês, educado e atencioso.
Ao professor Manuel Gordón Nuñez pela infinita ajuda, cuidado e carinho que só um irmão
ou um pai pode dar. No cabe duda que Dios pone en nuestro camino seres iluminados.
Muchas gracias Profesor, espero algún día llegar a ser cómo tú y tener esa cualidad humana e
intelectual.
A minha família brasileira, a família Barbosa Nascimento, especialmente Marcelo, Kleyber e
Iara, obrigado por me permitir ter um lar onde chegar em paz e encontrar sempre uma palavra
amável, um sorriso, conforto, amizade e confiança. Vocês foram um grande presente de Deus
na minha vida neste lindo pais.
A família Morais Costa, especialmente a Rosangela e Samuel, eternamente grato pelo amor, o
imensurável apoio e por me ensinar tantas coisas novas nesse mundo novo, principalmente o
valor de sorrir e a beleza de deixar a felicidade fluir na vida.
A Rodrigo André (Nux) pela imensa ajuda, paciência, carinho e companhia, no momento
mais difícil desta viagem, especialmente por não ter tido medo.
Aos meus maravilhosos amigos brazucas, pelo carinho, confiança, conversas, risos e atenções
que me deram muita felicidade no Brasil: Francisco Lopes, Daniel Borja, Emmanuel Rocha,
Gabriel Medeiros, Danilo Serafim, Guilherme Beiruth, Guilherme Santana e Diego Henry.
A Daniel Iel, por ser um exemplo de vida, superação e nobreza.
A Josivan Soares pelo afeto, cuidado, os momentos bons e a radio estilo pão.
A Jailson da Silva (Fievel) pelo carinho, paciência e companhia no difícil final deste caminho.
RESUMO
RESUMO
Lesões odontogênicas epiteliais benignas são entidades de grande importância clínica que se
desenvolvem nos ossos maxilares a partir dos tecidos que formam os dentes. Tem sido
demonstrado que em tumores benignos e malignos, estão presentes um grande número de
células-tronco tumorais, as quais tem grandes implicações no desenvolvimento destas lesões.
Oct-4 e CD44 têm sido demostrados como importantes marcadores para células-tronco
tumorais. O objetivo deste estudo foi identificar células epiteliais que expressam marcadores
de células-tronco através da expressão imuno-histoquímica de Oct-4 e CD44 em uma série de
casos de lesões odontogênicas epiteliais benignas. A amostra foi constituída por 20 casos de
ceratocisto odontogênico (CCO), 20 casos de ameloblastoma sólido/multicístico e 20 casos de
tumor odontogênico adenomatoide (TOA). A expressão de Oct-4 e CD44 foi avaliada no
epitélio das lesões através do percentual de células positivas (PP) e da intensidade da
expressão (IE), sendo realizado o somatório destes escores e resultando na Pontuação de
Imunomarcação Total (PIT), que variou de 0 a 7. Os resultados foram submetidos os testes
estatísticos adequados (teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e coeficiente de correlação de
Spearman). Todos os casos apresentaram positividade para os dois marcadores e a maioria
exibiu alta expressão para ambos os marcadores. A análise da expressão de Oct-4 não revelou
diferenças estatisticamente significativas (p = 0,406) entre as lesões estudadas. Com relação a
expressão do CD44, houve diferença estatisticamente significativa entre os casos de
ameloblastoma e TOA com relação ao CCO, apresentando este último maior número de casos
no score 7 (p = 0,034). Na análise da correlação da imunoexpressão de ambos os marcadores
nas três lesões estudadas, não houve correlação estatisticamente significativa. Os resultados
do presente estudo identificaram a presença de células com características de células tronco
dispostas em locais variados do componente epitelial das lesões ora estudadas sugerindo a sua
possível participação na histogênese e diferenciação em lesões odontogênicas epiteliais
benignas, contribuindo, assim, para o desenvolvimento destas lesões.
Palavras-chave: Cistos odontogênicos, Tumores odontogênicos, Células-tronco, imuno-
histoquímica.
ABSTRACT
ABSTRACT
benign epithelial odontogenic lesions are great clinical importance entities that develop in the
jaws from the tissues that form teeth. It has been shown that in benign and malignant tumors,
are present in a large number of tumor stem cells, which has great implications in the
development of these lesions. Oct-4 and CD44 have been demos as important markers for
tumoral stem cells. The objective of this study was to identify epithelial cells expressing stem
cell markers by immunohistochemical expression of Oct-4 and CD44 in a series of cases of
benign epithelial odontogenic lesions. The sample was comprised of 20 cases of odontogenic
keratocyst (OKC), 20 cases of solid/multicystic ameloblastoma and 20 cases of adenomatoid
odontogenic tumor (AOT). The expression of Oct-4 and CD44 was evaluated in epithelial
lesions using the percentage of positive cells (PP) and the intensity of expression (IE), being
realized the sum of these scores, resulting in Total Immunostaining Score (TIS) ranging 0 to
7. The results were submitted to the appropriate statistical test (nonparametric Kruskal-Wallis
and Spearman correlation coefficient). All cases were positive for both markers and most
showed high expression of both markers. The analysis of Oct-4 expression revealed no
statistically significant differences (p = 0.406) among the studied lesions. Regarding the
CD44 expression, there was a statistically significant difference between the cases of
ameloblastoma and TOA in relation to the CCO, with the latter show more cases in the score
7 (p = 0.034). In the correlation analysis of the immunoreactivity of both markers in the three
lesions studied, there was no statistically significant correlation. The results of this study
identified the presence of cells with stemness characteristics arranged at various sites in the
epithelial component of the studied lesions suggesting their possible role in the histogenesis
and differentiation in benign epithelial odontogenic lesions, thus contributing to the
development of these lesions.
Keywords: Odontogenic cysts, odontogenic tumors, stem cells, immunohistochemistry.
LISTA DE
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1. Expressão imuno-histoquímica de Oct-4 em ceratocisto
odontogênico (advance- panoramic viewer 20x e 10x).
65
Figura 2. Expressão imuno-histoquímica de Oct-4 em Ameloblastoma
(advance- panoramic viewer 20x).
65
Figura 3 Expressão imuno-histoquímica de Oct4 em tumor
odontogênico adenomatoide (advance- panoramic viewer
5x).
66
Figura 4 Expressão imuno-histoquímica de CD44 em ceratocisto
odontogênico (advance- panoramic viewer 10x).
66
Figura 5 Expressão imuno-histoquímica de CD44 em Ameloblastoma
(advance- panoramic viewer 10x).
67
Figura 6 Expressão imuno-histoquímica de CD44 em tumor
odontogênico adenomatoide (advance- panoramic viewer 10
x).
67
Quadro 1. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação
antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários
utilizados no estudo.
56
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela1 Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com os escores de
positividade para Oct4 no parênquima das lesões odontogênicas estudadas.
Natal – RN, 2016.
62
Tabela 2 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística
KW e significância estatística (p) para os escores de positividade para Oct-4
em relação aos grupos de lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN, 2016.
54
62
Tabela 3 Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com os escores de
positividade para CD44 no parênquima das lesões odontogênicas estudadas.
Natal – RN, 2016.
63
Tabela 4 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística
KW e significância estatística (p) para os escores de positividade para CD44
em relação aos grupos de lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN, 2016.
63
Tabela 5 Valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman (p) e
significância estatística (p) para os escores de positividade para Oct-4 e CD44
no componente epitelial, de acordo com as lesões odontogênicas estudadas.
Natal, RN – 2016
55 64
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AE1-
AE3
Refere-se a uma mistura de dois anticorpos (AE1 e AE3) capazes de
identificar a maioria das citoqueratinas expressas pelas células epiteliais
humanas.
AH Ácido Hialurónico.
ALDH-1 Aldeido deshidrogenase 1.
BdrU
CCO
Do inglês Bromodeoxyuridine, é um nucleósido sintético que é um análogo
da timidina. BrdU é comumente utilizado na detecção da proliferação de
células em tecidos vivos.
Ceratocisto Odontogênico.
CD133 Glicoproteina expressa em células-tronco hematopoiéticas
CD44 Glicoproteína de membrana celular envolvida em interações célula-célula,
migração e adesão celular.
ChiP Do inglês: Chromatin Immunoprecipitation, traduzido como imuno-
precipitação de cromatina.
CSC Do inglês: câncer stem cells, células-tronco do câncer
CT Célula-Tronco.
CTA Células-Tronco de Tecidos Específicos.
CTE Células-Tronco Embrionarias Pluripotentes.
CTM Células-Tronco Mesenquimais.
CTT Célula-Tronco Tumoral.
DAB Diaminobenzidina
DNA Do inglês, deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido desoxirribonucleico.
EDTA Do inglês Ethylenediamine tetraacetic acid) ou ácido etilenodiamino tetra-
acético.
EGF Do inglês: Epidermal Growth Factor, traduzido como fator de crescimento
epidérmico.
HE Refere-se à técnica histoquímica da hematoxilina e eosina.
HER Do inglês: human epidermal growth factor receptor, traduzido como: Fator
de crescimento epidérmico humano
HSC-3 Linhagem de células derivadas de tumor HSC-3 a partir de células de
carcinoma escamoso humano de boca
IE Intensidade de Expressão.
Ki-67 Proteína nuclear lábil, não-histona expressa no ciclo celular utilizada como
marcador de proliferação celular.
LRH-1 O homólogo do receptor-1 do fígado é uma proteína que é codificada pelo
gene NR5A2. Membro da família de receptores nucleares de fatores de
transcrição intracelulares.
MMP Do inglês, matrix metalloproteinase, traduzido como metaloproteinase da
matriz.
myc Gene regulador que codifica para um fator de transcrição. A proteína
codificada por este gene desempenha um papel na progressão do ciclo
celular, apoptose e transformação celular.
Nanog Fator de transcrição criticamente envolvido com a auto-renovação das
células-tronco embrionárias indiferenciadas, codificada pelo gene NANOG
Oct4 Octâmero de ligação do factor de transcrição 4, gene de regulação da
pluripotência das células-tronco embrionárias
OMS Organização Mundial da Saúde.
OPN Osteopontina.
p53 Refere-se à proteína supressora tumoral p53.
PDGF Do inglês: Platelet-derived growth factor, traduzido como fator de
crescimento derivado de plaquetas.
PP Percentual de Células Positivas.
PIT Pontuação de imuno- marcação total.
POU Sigla derivada dos nomes de três fatores de transcrição: o específico da
Pituitária Pit-1, as proteínas de fator de transcrição octâmero Out-1 e Oct-2
(sequência octâmero é ATGCAAAT) o Unc-86 fator neural de transcrição de
Caenorhabditis elegans.
RM
RT-PCR
Ressonância magnética.
Do inglês Reverse transcription polymerase chain reaction, que se refere à
reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase.
SCF Do inglês, stem cell factor, traduzido como fator de células-tronco.
Sf-1 O factor esteroidosénico proteína 1 (SF1) controla o desenvolvimento sexual
no embrião e na puberdade. é um membro da família de receptores nucleares
de factores de transcrição intracelulares e é codificada pelo gene NR5A1.
SISNEP Sistema Nacional de Informações Sobre Ética em Pesquisa Envolvendo Seres
Humanos.
Sox2 Fator de transcrição em 3q26.33, essencial para manter a auto-renovação das
células-tronco embrionárias indiferenciadas.
SPSS Refere-se ao programa Statistical Package for the Social Sciences.
Stat-3 Do inglês, Signal transducer and activator of transcription 3, traduzido como
Transdutor de sinal e ativador da transcrição 3.
TA Células de Transito-Amplificadoras
TAM
TC
Do inglês Tumor-associated macrophages, traduzido como macrófagos
associados a tumor.
Tomografia computarodizada.
TO Tumores Odontogênicos.
TOA Tumor Odontogênico Adenomatoide.
TOEC Tumor Odontogênico Epitelial Calcificante
TRIS Tris-hidroximetil-aminometano
TRK Do inglês: tirosine kinase receptor, traduzido como receptor tirosina quinase.
LISTA DE SÍMBOLOS
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem.
µL Microlitro.
µm Micrômetro.
KDa Quilodálton.
Mm Milímetro.
mm2 Milímetros quadrados.
Ph Potencial hidrogeniônico.
® Marca registrada.
SUMÁRIO
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 23
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................................... 26
2.1 LESÕES ODONTOGÊNICAS .................................................................................................................. 27
2.1.1 Ceratocisto odontogênico (Tumor odontogênico ceratocístico) ........................................................... 28
2.1.2 Ameloblastoma ......................................................................................................................................... 31
2.1.3 Tumor odontogênico adenomatoide ....................................................................................................... 34
2.2 CÉLULAS-TRONCO ................................................................................................................................ 37
2.2.1 Células-tronco e odontogênese ................................................................................................................ 39
2.2.2 Células-tronco e lesões odontogênicas 41
2.3 OCT-4 ........................................................................................................................................................ 42
2.4 CD44 .......................................................................................................................................................... 45
3 PROPOSIÇÃO ......................................................................................................................................... 49
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................... 51
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ................................................................................................................... 52
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO........................................................................................................ 52
4.3 VARIÁVEIS .............................................................................................................................................. 52
4.3.1 Variáveis independentes .......................................................................................................................... 52
4.3.2 Variáveis dependentes ............................................................................................................................. 52
4.4 POPULAÇÃO ........................................................................................................................................... 53
4.5 AMOSTRA ................................................................................................................................................ 53
4.5.2 Critérios de inclusão ................................................................................................................................ 53
4.5.3 Critérios de exclusão ................................................................................................................................ 53
4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO ..................................................................................................................... 54
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ....................................................................................................... 54
4.7.1 Técnica ...................................................................................................................................................... 54
4.7.2 Analise do perfil imuno-histoquímico .................................................................................................... 56
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................................................ 57
5 RESULTADOS ........................................................................................................................................ 58
5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA .................................................................................................................... 59
5.2 ANALISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE Oct-4 E CD44 ........................................................................ 60
5.2.1 Correlação das imunoexpressões de Oct4 e CD44 ................................................................................ 64
6 DISCUSSÃO............................................................................................................................................. 68
7 CONCLUSÕES ........................................................................................................................................ 81
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................................... 97
INTRODUÇÃO
24
1 INTRODUÇÃO
Os ossos maxilares sediam lesões de naturezas diversas e dentre estas, merecem
destaque os cistos e tumores odontogênicos (TOs). Estas lesões apresentam heterogeneidade
clínica e histológica, o que pode refletir nos comportamentos biológicos variados
apresentados pelas mesmas. As diversas características dessas lesões refletem o
desenvolvimento complexo das estruturas, uma vez que as mesmas são oriundas de alguma
aberração do padrão normal da odontogênese.
Os TOs são lesões derivadas de componentes epiteliais e ectomesenquimais
envolvidos na formação dos elementos dentários (BARNES et al., 2005). O espectro do
comportamento biológico destas lesões é amplo, incluindo proliferações hamartomatosas,
tumores benignos não agressivos, tumores benignos agressivos e tumores malignos
(BUCHNER et al., 2006), por vezes com capacidade metastática (LADEINDE et al., 2005).
No grupo das lesões odontogênicas, os ameloblastomas e os CCOs se destacam por
apresentarem comportamentos biológicos bastante intrigantes. Embora sejam lesões de
natureza benigna, ambas revelam comportamento localmente agressivo e demonstram
tendência a desenvolver recorrências (MENDENHALL et al., 2007; TAWFIK et al., 2010).
Em contrapartida, o TOA, embora também seja originado do epitélio odontogênico, apresenta
crescimento lento e um comportamento biológico bastante indolente (PHILIPSEN et al.,
2007; MOHAMED et al., 2010).
Embora a etiologia destas lesões seja ainda desconhecida, é óbvio que se relaciona de
forma estreita com o desenvolvimento dos órgãos dentários, que em alguns tumores é
parcialmente imitado (REICHART et al., 2008). Sabe-se que o tecido de origem desses
tumores é o epitélio odontogênico, uma vez que é este o tecido que as compõe, mas estão
pouco esclarecidas as características específicas das células epiteliais que originam as lesões
quanto ao seu estado de diferenciação, a sua presença nos tumores maduros e seu papel na
patogênese e progressão de tais lesões (MAMABOLO et al., 2011).
Tem sido demonstrado que diversas lesões malignas e também benignas se originam
de células-tronco e no caso do ameloblastoma e ceratocisto, de células-tronco odontogênicas
presentes na lâmina dentária remanescente, principalmente na área de órgãos dentários
posteriores (HARADA et al., 2002). Nos tumores odontogênicos, a formação de tecidos
dentais é contínua e, acredita-se que derivam de células associadas com o desenvolvimento
25
dos dentes. A contribuição de células-tronco dentárias para a geração de tumores
odontogênicos não é ainda bem conhecida (JUURI et al., 2013a).
Vem sendo sugerido que nem todas as células epiteliais são capazes de gerar um tumor
e que só células antigas, como as células-tronco (CT), teriam a capacidade de passar por
diversas alterações oncogênicas requeridas para a carcinogênese (Xiao et al., 2014). Estas CTs
transformadas seriam chamadas de células-tronco tumorais (CTT) e seriam responsáveis pela
iniciação e expansão do crescimento tumoral além de apresentar uma capacidade de
diferenciação, regeneração e auto-renovação (HARADA et al., 2002; ISLAM et al., 2015).
Estudos recentes demonstraram que, em tumores benignos estão presentes um grande número
de CTT do câncer, as quais têm grandes implicações no desenvolvimento do tumor. Desta
forma, é de extrema importância identificar estas células e caracterizar as vias moleculares
que as mantêm (HARADA et al., 2002; XIAO et al., 2014).
A regulação das CT é fundamental para a homeostase e função dos tecidos. Distúrbios
na sua regulação podem levar à proliferação excessiva de células e muitos tumores são
originados e/ou mantidos por CT defeituosas. Marcadores de CT são expressos em muitas
células tumorais e estão envolvidos em várias etapas de formação de tumores (JUURI et al.,
2013a). Têm sido identificados vários marcadores de CT principalmente para CTT do câncer,
como CD133, CD44, entre muitos outros. Igualmente, são conhecidos três fatores de
transcrição por serem críticos na manutenção da pluripotência de CT embrionárias: Oct4,
Nanog e Sox2 (NOZAWA-SUZUKI et al., 2015).
O Oct4 possui um papel altamente conservado na manutenção da pluripotência de
populações celulares, sendo um fator de transcrição-chave que promove a expressão de genes
específicos de CT embrionárias, regula a sua própria expressão e serve como marcador útil de
pluripotência (STERNECKERT et al., 2012; ZEINEDDINE et al., 2014). CD44 é uma família
de glicoproteínas da superfície celular com variadas isoformas e modificações pós-
translacionais, que é amplamente expressa em muitas células e é um marcador chave de CTT
amplamente utilizado, tendo um importante papel na auto-renovação e diferenciação celular e,
além disso, demostrou ser um indicador de progressão e pior prognóstico em tumores
malignos (HUANG et al., 2014; LI et al., 2015; JORDAN et al., 2015; BASAKRAN et al.,
2015). Portanto, na presente pesquisa pretendeu-se estudar a imuno-expressão do Oct-4 e
CD44 para identificar a presença das CT em lesões odontogênicas epiteliais, assim como
determinar o seu papel nestas lesões.
26
REVISÃO DE LITERATURA
27
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LESÕES ODONTOGÊNICAS
Dentre as diversas lesões que podem se desenvolver nos ossos maxilares, as que se
originam dos tecidos que formam os dentes representam o grupo com maior incidência e de
grande importância clínica. Dentre elas, incluem-se os cistos e os TOs. Os cistos
odontogênicos são encontrados na prática odontológica de forma relativamente comum. Os
TOs, em contraste, são lesões incomuns encontradas unicamente nos maxilares e tecido
adjacentes. Constituem um grupo heterogêneo de lesões que se originam dos tecidos
associados com a formação e desenvolvimento dos dentes ou dos restos desses processos. Do
ponto de vista biológico, algumas destas lesões representam hamartomas com diferentes graus
de diferenciação como os odontomas, enquanto outros são neoplasias benignas (algumas das
quais tem comportamento agressivo como é o caso do ameloblastoma e tumor odontogênico
ceratocístico) ou malignas com agressividade variável e potencial para o desenvolvimento de
metástase (PHILIPSEN; REICHART., 2002; MOSQUEDA-TAYLOR et al., 2008; NEVILLE
et al., 2009; TAWFIK et. al., 2010; CHRYSOMALI et al., 2013).
Os TOs apresentam uma grande diversidade, sendo publicados diferentes esquemas de
classificação na tentativa de definir seus critérios diagnósticos. O primeiro sistema de
classificação internacionalmente aceito para TOs foi publicado em 1971 pela Organização
Mundial da Saúde (OMS), que foi revisado e atualizado em 1992 e em 2005 (MOSQUEDA-
TAYLOR et al., 2008). Com base nas classificações histológicas de 1971 e 1992 da OMS,
foram relatadas series de TOs de várias partes do mundo, mas, muitas questões polêmicas
ainda precisavam ser abordadas a respeito de subtipos, terminologia e diagnóstico (BARNES
et al., 2005).
A etiologia dos TOs é desconhecida, sendo que a maioria se desenvolve sem uma
causa aparente (MAMABOLO et al., 2011). A frequência total e relativa de TOs individuais
varia em diferentes locais geográficos, principalmente por causa da grande diversidade
genética e cultural. Embora esta informação seja útil para clínicos e patologistas orais, porque
TOs podem representar um desafio diagnóstico e terapêutico, relatórios clínicopatológicos e
dados estatísticos estão disponíveis apenas em determinados países (AVELAR et al., 2011). O
fato da maioria dos TOs geralmente permanecer assintomática e indolor durante todo o
decurso da doença é a razão principal pela qual os pacientes não procuram atendimento até as
28
lesões atingirem grandes tamanhos (TAWFIK et al., 2010). Conhecer a frequência e as
características clínicas básicas dos TOs é importante porque permite estabelecer as
características dessas lesões em diversas populações e ajuda a identificar os grupos de risco e
possíveis fatores associados ao seu desenvolvimento bem como desenvolver diagnósticos
diferenciais mais precisos (MOSQUEDA-TAYLOR et al., 2008).
Os diferentes graus de interação entre os tecidos formadores e os diferentes padrões de
crescimento que caracterizam as vias patológicas que levam à gênese e desenvolvimento
destes tumores têm sido amplamente estudados por muitos anos e continuam a ser objeto de
investigação científica contemporânea. Porém, estudos genéticos e moleculares têm levado a
um aumento da quantidade de conhecimento e compreensão de suas complexas vias
fisiopatológicas (CHRYSOMALI et al., 2013).
O grupo dos TOs epiteliais benignos abrange os quatro tipos de ameloblastoma (sólido
/ multicístico, unicístico, periférico e desmoplásico), o TOA, o tumor odontogênico epitelial
calcificante (TOEC), o tumor odontogênico escamoso e o tumor odontogênico ceratocistico,
sendo este último o mais freqüente neste grupo, seguido de ameloblastoma sólido /
multicístico (BARNES 2005; REICHART et al., 2008; MORGAN et al., 2011).
2.1.1 Ceratocisto odontogênico (Tumor odontogênico ceratocístico)
O CCO, (também denominado tumor odontogênico ceratocístico), é uma forma
diferente de cisto odontogênico de desenvolvimento que merece consideração especial devido
às suas características histopatológicas e comportamento clínico específicos (NEVILLE et al.,
2009). A pesquisa de banco de dados on-line indica que a comunidade científica continua a
utilizar o termo "ceratocisto odontogênico” como mais favorável do que “tumor odontogênico
ceratocístico” (BHARGAVA et al., 2012).
Trata-se de uma lesão benigna intraóssea uni- ou multicística, de origem odontogênica,
com potencial comportamento agressivo e infiltrativo, podendo ser solitário ou múltiplo
(BARNES et al., 2005). Foi estudada extensivamente com uma nomenclatura continuamente
mudando de 'cisto primordial' para ‘CCO' (BHARGAVA et al., 2012). O termo ceratocisto
odontogênico foi empregado pela primeira vez por Philipsen, em 1956, para todos os cistos
que histologicamente mostravam ceratinização (POGREL et al., 2003). Pindborg e Hansen
29
são creditados como tendo sugerido os critérios histológicos para CO em 1963 (BHARGAVA
et al., 2012).
O CCO representa uma lesão cística agressiva, frequente na segunda, terceira e quarta
décadas de vida, presente geralmente na região posterior da mandíbula de pacientes do sexo
masculino (GOMES et al., 2009a; BHARGAVA et al., 2012). A natureza agressiva desta
lesão única dos maxilares manteve-o no centro das atenções desde a sua descoberta, com
casos documentados de erosão da cortical, envolvimento de tecidos moles e extensão para a
base do crânio, órbita e fossa infratemporal (BHARGAVA et al., 2012).
Sugere-se que surgem a partir dos restos da lâmina dentária e, em alguns casos, a partir
da camada basal do epitélio da mucosa sobrejacente (STOELINGA et al., 2003). Estudos
sobre as recidivas em CCOs demonstraram perfuração óssea e adesão firme na mucosa
sobrejacente (SHEAR et al., 2003). Atualmente, a possibilidade mais aceita da origem é a
partir da lâmina dentária ou dos seus restos, que inclui a lâmina pré-funcional, mais comum
na região posterior dos maxilares, onde se sabe que a lesão é mais propensa a ocorrer
(SHEAR et al., 2003; BHARGAVA et al., 2012).
Os CCOs podem ocorrer em faixas etárias amplas, com maior acometimento em
grupos dos 10 a 40 anos de idade com média de idade, relatada por diversos autores variando
entre 38 a 40 anos (BHARGAVA et al., 2012), com predileção masculina em uma proporção
de 1,6:1 (CHIRAPATHOMSAKUL et al., 2006). Pode ocorrer tanto na mandíbula quanto na
maxila, mas afeta mais frequentemente a mandíbula com uma proporção de 2:1, com
predileção para a região dos molares e ramo mandibular (ERYILMAZ et al., 2009;
BHARGAVA et al., 2012).
Na maioria das vezes, o CCO é assintomático e quando são de tamanho pequeno são
descobertos em exames radiográficos de rotina. Dor, inchaço e secreção podem estar
associados com CCOs de maior dimensão. Quando de grande tamanho, podem permanecer
assintomáticos, mas podem apresentar um significativo envolvimento da cortical óssea e
estruturas adjacentes. Múltiplos CCOs podem estar presentes e tais pacientes devem ser
avaliados em busca de outras manifestações da síndrome do carcinoma nevoide basocelular
(Síndrome de Gorlin) (BARNES et al., 2005; ERYILMAZ et al., 2009; NEVILLE et al.,
2009; BHARGAVA et al., 2012).
30
O exame de imagem pode revelar lesões radiolúcidas uniloculares ou multiloculares
extensas que ocupam a maior parte da mandíbula, sem qualquer expansão cortical apreciável
(WHITE et al., 2004). Numa revisão de 51 casos de CCOs foi evidenciado que a relação de
imagem radiolúcida do tipo unilocular para o multilocular foi de 2,5:1 e as lesões
multiloculares ocorreram mais frequentemente na mandíbula (CHIRAPATHOMSAKUL et
al., 2009). As características radiográficas dos CCOs não são patognomônicas e podem ser
semelhantes a outros cistos e TOs. Através de estudo realizado por van Rensburg et al.,
(2003) foi evidenciado que as lesões eram predominantemente multiloculares e lobuladas.
Imagens de TC revelaram posição e características morfológicas do CCOs, tais como áreas de
erosão, perfuração e loculação da cortical. Os autores também afirmaram que a RM é a única
modalidade não invasiva para caracterizar CCO com precisão, especialmente no pré-
operatório. Reabsorção radicular não é uma característica consistente, embora as lesões
tenham margens escleróticas diferentes (SHEAR et al., 2007). Lesões maxilares tendem a
envolver estruturas adjacentes com maior frequência do que as suas homólogas mandibulares
(BARNES et al., 2005). Além disso, a TC e RM podem ser de utilidade na detecção de lesões
múltiplas (BHARGAVA et al., 2012).
O revestimento do CCO é fino e friável, difícil de remover a partir do osso. O lúmen
cístico é preenchido com um material pastoso e, em ocasiões, um líquido claro também pode
ser encontrado. O revestimento da lesão é composto por um epitélio escamoso estratificado
paraceratinizado. Algumas vezes, lesões apresentam ambos os componentes de ortoceratina e
paraceratina, mas são lesões pouco frequentes (BHARGAVA et al., 2012). O epitélio que
compõe esta lesão possui tipicamente 6-8 camadas de células de espessura com ausência dos
prolongamentos epiteliais; a camada basal encontra-se arranjada em paliçada com células
cilíndricas baixas ou cúbicas. Os núcleos são hipercromáticos, apresentando polaridade
invertida em relação à membrana basal. Figuras de mitose podem ser vistas na camada
suprabasal. A camada de paraceratina superficial apresenta um formato corrugado ou
ondulado. Cistos-satélite, cordões e ilhas de epitélio odontogênico podem ser vistos no tecido
conjuntivo fibroso. Geralmente, o tecido conjuntivo não apresenta componente inflamatório.
Quando presente, o infiltrado inflamatório pode causar a perda das características
histopatológicas típicas da lesão (STOELINGA et al., 2001; BARNES et al., 2005; NEVILLE
et al., 2009; BHARGAVA et al., 2012;).
Lo Muzio et al. (2005), estudaram a imunoexpressão do p63 em cistos odontogênicos
e evidenciaram que os CCOs exibiram mais intensa e difusa marcação para esta proteína,
31
suportando a hipótese de proliferação suprabasal em CCOs. Curiosamente, a expressão de p63
também tem sido relatada em carcinomas de células basais, que pode ter uma correlação com
as formas sindrômicas do CCO (DELLAVALLE et al., 2002). Gurgel et al. (2008) no seu
estudo imunohistoquímico em CCOs relataram altos níveis de Ki-67, p53 e p63. Cavalcante et
al., (2008) no seu estudo sobre a expressão imuno-histoquímica de MMPs 1, 7 e 26 em CCOs
sindrômicos e isolados concluíram que estas metaloproteinases de matriz podem desempenhar
papéis importantes na biologia dos CCOs, tanto no crescimento quanto na invasividade. Eles
também encontraram níveis mais elevados destas proteases, principalmente MMP-1 no
epitélio de CCOs associados com a síndrome do carcinoma basocelular nevoide.
Para o tratamento do CCO, a técnica de enucleação simples tem resultado em alta
recorrência. A marsupialização foi utilizada no passado com pouco ou nenhum sucesso.
Outras opções cirúrgicas incluem curetagem, ostectomia periférica, remoção da mucosa
sobrejacente em casos de perfuração cortical e ressecção óssea, incluindo osteotomias
segmentares ou marginais (BELL et al., 2003; GHALI et al., 2003). A enucleação e
curetagem ou enucleação e ostectomia periférica demonstraram ter menor taxa de recorrência
quando comparadas com a enucleação simples, que tem taxas de recorrência que vão de 2,5%
a 62,5%. Ressecção óssea, tem quase 0% de recorrência, mas está associada com morbidade e
necessita de reconstrução do defeito cirúrgico pós-operatório. Inclusão de cauterização
química (solução de Carnoy) no tratamento reduz ainda mais as taxas de recorrência. A
crioterapia como adjuvante da cirurgia convencional tem sido defendida para o tratamento de
lesões odontogênicas. Considerando a alta recorrência, recomenda-se um acompanhamento
regular e vigilância. O período de acompanhamento recomendado para CCO é, pelo menos,
uma vez por ano durante 5 anos após o tratamento inicial (GHALI et al., 2003; BERTOLUS
et al., 2010; BHARGAVA et al., 2012).
2.1.2 Ameloblastoma
Os ameloblastomas representam um conjunto de neoplasias benignas de epitélio
odontogênico com estroma fibroso maduro, sem a participação de ectomesênquima
odontogênico. Caracterizam-se por apresentar um crescimento lento e serem localmente
invasivos, possuírem comportamento biológico agressivo, alta taxa de recorrência se não
forem removidos de forma adequada e uma baixa propensão para metástases (BARNES et al.,
2005; JHAMB, KRAMER 2014). Podem surgir dos restos da lâmina dentária, de um órgão do
32
esmalte em desenvolvimento, do revestimento epitelial de um cisto odontogênico ou das
células basais da mucosa oral (NEVILLE et al., 2009; MASTHAN et al., 2015).
Os ameloblastomas compreendem 1% de todos os tumores orais e, dentro do vasto
grupo dos TOs, representam cerca do 11-18% destas entidades patológicas. Apresenta um
pico de incidência na terceira e quarta décadas de vida. Na maioria dos estudos, representa o
segundo TO mais comum. Cerca de 80% dos ameloblastomas ocorrem na mandíbula,
principalmente na região do terceiro molar e os restantes 20% na maxila, com uma relação do
sexo masculino para o feminino de 1:1 (REGEZI et al., 2009; DE SILVA et al., 2012;
HAMMARFJORD et al., 2013; ASEGAWA et al., 2013; BANSAL et al., 2015; MASTHAN
et al., 2015).
As lesões de ameloblastoma comumente se manifestam clinicamente como massas
tumorais assintomáticas, de crescimento lento e invasivo, que podem levar à perfuração óssea
e infiltração dos tecidos moles (GHANDHI et al., 2006; HAMMARFJORD et al., 2013).
Além disso, podem causar mobilidade e/ou deslocamento dos dentes e expansão da cortical
óssea (NEVILLE et al., 2009). Em exames radiográficos, apresentam-se como lesões
radiolúcidas uniloculares ou multiloculares (HENRIQUES et al., 2009; YAZDI et al., 2009;
DHANUTHAI et al., 2012; SIAR et al., 2012; HASEGAWA et al., 2013), sendo mais
frequente o tipo multilocular, mas é discutível se esta aparência indica um comportamento
mais agressivo uma vez que a aparência radiográfica unilocular não significa que a lesão seja
um ameloblastoma unicístico (SANTOS et al., 2014; MASTHAN et al., 2015). Estes tumores
podem ser descobertos através de achados incidentais em exames de rotina (CHAE et al.,
2015).
Têm sido estudadas diversas proteínas, vias de sinalização e fatores de crescimento os
quais desempenham um papel crucial na patogênese do ameloblastoma. Genes supressores de
tumor (p53, p63 e p73) podem provocar alterações moleculares na patogênese desta lesão. O
p53 desempenha um papel importante na diferenciação e proliferação de células epiteliais
odontogênicas. As MMPs desencadeiam mitogênios para ser libertados, conduzindo à
proliferação das células do ameloblastoma (MASTHAN et al., 2015).
Do ponto de vista clínico-patológico, os ameloblastomas são classificados em quatro
tipos denominados: sólido (multicístico), unicístico, periférico (extra-ósseo) e desmoplásico.
(DHANUTHAI et al., 2012; CHAE et al., 2015). Estes tipos apresentam diferentes
comportamentos clínicos, sendo de grande relevância para a indicação do tratamento e do
33
prognóstico. Mais do 80% dos casos de ameloblastomas são do tipo sólido/multicístico. A
variante sólida é reconhecida por apresentar o pior prognóstico devido ao alto índice de
recorrências, havendo casos recidivantes documentados com mais de dez anos após o
tratamento inicial (BARNES et al., 2005; BLACK et al., 2010; FREGNANI et al., 2010;
MASTHAN et al., 2015).
Em conformidade com vários estudos, o tipo sólido/multicístico é o subtipo mais
comum representando do 54% ao 93%, enquanto que o tipo unicístico é responsável por 5-
46% dos casos e afeta uma população mais jovem, apresentando três variantes: luminal,
intraluminal e mural. O ameloblastoma periférico é o menos comum e tem um
comportamento biológico menos agressivo, ocorrendo em 1,8 a 2,0% dos casos (BUCHNER
et al., 2006; CHAE et al., 2015;). O tipo desmoplásico é também pouco frequente, numa
análise de 115 casos de ameloblastomas, se encontrou que este subtipo representou do 4,0% a
13,0% das lesões (SUN et al., 2009). Do ponto de vista microscópico, tem grande semelhança
histológica com o órgão do esmalte visto no desenvolvimento dos dentes. Nas variantes sólida
e periférica, há uma grande variedade de padrões histopatológicos tais como: folicular,
plexiforme, de células basais, acantomatoso e de células granulares (BARNES et al., 2005;
NEVILLE et al., 2009;).
Na variante sólida multicística, o padrão histopatológico folicular é o mais comum e
reconhecível, onde as ilhas de epitélio se assemelham ao epitélio do órgão do esmalte num
estroma de tecido conjuntivo fibroso maduro (NEVILLE et al., 2009). Uma única camada de
células colunares altas do tipo ameloblástico forma ninhos epiteliais e exibe polaridade
nuclear invertida. Os ninhos são constituídos por células epiteliais angulares e centrais
frouxamente arranjadas, que lembram o retículo estrelado do órgão do esmalte. Em outras
áreas, as células periféricas podem ser mais cuboidais e assemelham-se a células basais
(BARNES et al., 2005; NEVILLE et al., 2009).
A variante plexiforme consiste em cordões anastomosados de células epiteliais que
envolvem as células arranjadas frouxamente do tipo retículo estrelado do órgão do esmalte. A
variante de células granulares apresenta células contendo grânulos eosinofílicos no seu
citoplasma na porção central dos ninhos epiteliais, enquanto a variante acantomatosa mostra
diferenciação escamosa das células epiteliais centrais. A variante de células basais consiste
em ninhos de células basalóides em paliçada periférica não apresentando células centrais
34
semelhantes ao retículo estrelado do órgão do esmalte (BARNES et al., 2005; NEVILLE et
al., 2009).
O tratamento dos ameloblastomas tem sido descrito de diferentes modalidades para
cada subtipo clínico-patológico, porém a ressecção marginal é o tratamento mais amplamente
utilizado, embora taxas de recidiva de até 15% sejam descritas após a ressecção marginal ou
em bloco. Alguns cirurgiões advogam uma abordagem mais conservadora para o tratamento
por meio do planejamento da cirurgia após avaliação cuidadosa, por cortes de TC do tumor. A
remoção do tumor, seguida por osteotomia periférica, reduz com frequência a necessidade de
cirurgia reconstrutiva extensa. Alguns tumores podem não ser responsivos a esse tratamento
devido ao seu tamanho ou ao seu padrão de crescimento e, portanto, muitas vezes opta-se por
tratá-los com cirurgia radical (NEVILLE et al., 2009).
É fundamental o acompanhamento a longo prazo, uma vez que as recidivas podem
ocorrer até 45 anos após a ressecção inicial e mais de 50% de todas as recorrências ocorrem
dentro dos 5 primeiros anos após a cirurgia (SANTOS et al., 2014; CHAE et al., 2015;). No
entanto, sabe-se que a recorrência de ameloblastomas pode ocorrer tão cedo quanto dois anos
após o tratamento inicial. A maioria dos casos de lesões recorrentes, observados em alguns
estudos, corresponde a lesões do tipo multilocular que foram diagnosticadas histologicamente
como padrão folicular e / ou plexiforme (SANTOS et al., 2014).
2.1.3 Tumor odontogênico adenomatoide
O TOA é um tumor composto de epitélio odontogênico em uma variedade de padrões
histo-arquiteturais, em um estroma de tecido conjuntivo maduro e caracterizado por um
crescimento lento, não invasivo, não agressivo (BATRA et al., 2005; DE MATOS et al.,
2012). Foi descrito pela primeira vez por Dreilbaldt em 1907 como um pseudo-
adenoameloblastoma e relatado por Harbitz em 1915 como um adamantinoma cístico. Uma
variedade de termos têm sido usados para descrever esse tumor dentre deles:
adenoameloblastoma, tumor ameloblástico adenomatoide, adamantinoma, epitelioma
adamantino ou odontoma teratomatoso. Philipsen e Birn propuseram a denominação “tumor
odontogênico adenomatoide”, nome amplamente aceito e utilizado até os dias atuais, sendo
adotado pela classificação da OMS de tumores odontogênicos em 1971 (KOMAL et al., 2011;
DE MATOS et al., 2012; JINDWANI et al., 2015).
35
Este tumor corresponde a 2-13% de todos os tumores odontogênicos, mais da metade
acometendo adolescentes, sendo 90% descritos antes dos 30 anos de idade, porém pode ser
encontrado em uma ampla faixa etária, sendo mais comuns em mulheres jovens numa relação
homem: mulher de 1:1,9. Ocorre principalmente nas porções média e anterior dos maxilares,
são geralmente intraósseos, com uma preferência para a maxila numa razão de 2,1:1. O tipo
periférico é muito raro e ocorre quase exclusivamente na gengiva maxilar anterior. Os casos
que estão associados a dentes inclusos são principalmente com o canino maxilar. Muitas
vezes, provoca a expansão do osso circunvizinho e o deslocamento dos dentes adjacentes
(BARNES et al., 2005; BATRA et al., 2005; GARG et al., 2009; BASKARAN et al., 2011;
JINDWANI et al., 2015).
Existem três variantes de TOA: o tipo folicular (73%) correspondendo a uma lesão
central associada com um dente impactado; o tipo extra-folicular (24%) o qual se apresenta
como uma lesão central sem conexão ou associação com o dente e, geralmente se apresenta
como uma lesão radiolúcida bem definida unilocular acima das raízes dos dentes
erupcionados, muitas vezes se assemelhando a um cisto odontogênico e o tipo periférico (3%)
que geralmente se apresenta como um inchaço gengival, localizado na porção palatina ou
lingual (JOHN et al., 2010; DE MATOS et al., 2012).
A histogênese do TOA ainda é discutível e controversa, sendo sugerido que o mesmo
pode ser derivado a partir da lâmina dentária ou seus restos. Resultados de estudos
ultraestruturais e imuno-histoquímicos apoiam que a origem desses tumores seja do epitélio
reduzido do órgão do esmalte (DE MATOS et al., 2012). Alguns pesquisadores acreditam que
alguns deles poderiam se originar a partir do epitélio odontogênico de um cisto dentígero
(NONAKA et al., 2007; JOHN et al., 2010).
Clinicamente, todas as variantes de TOAs são caracterizadas por um crescimento
lento, mas progressivo, raramente contínuo e nunca infiltram o osso da mesma forma que os
ameloblastomas. A maioria dos TOAs são assintomáticos com poucos ou nenhum sintoma
subjetivo. As lesões intraósseas podem causar expansão da cortical óssea, enquanto é
incomum a perfuração da placa cortical, podendo apresentar-se como um aumento de volume
ósseo, endurecido a palpação, assintomático ou dor leve (DE MATOS et al., 2012). Os TOAs
intraósseos podem causar o deslocamento dos dentes vizinhos. A variante periférica
apresenta-se com o aspecto de épulis. TOAs intraósseos podem ser encontrados em
associação com dentes permanentes não erupcionados (tipo folicular), em particular os quatro
36
caninos em 60% dos casos e os caninos superiores sozinhos correspondem a 40% (BARNES
et al., 2005).
Radiograficamente, o TOA folicular apresenta uma estrutura bem definida, radiolúcida
e unilocular localizada em torno da coroa do dente, e muitas vezes partindo da raiz de um
dente permanente não erupcionado imitando um cisto dentígero, com halo esclerótico. Dois
terços dos TOAs de variante intraóssea apresentam também pequenas radiopacidades. Quando
não está associado a um dente incluso (tipo extrafolicular), o TOA apresenta-se como uma
lesão radiolúcida unilocular. A variante periférica pode apresentar erosão da crista óssea
alveolar, no entanto, os TOAs frequentemente parecem envolver tanto a coroa quanto a raiz,
ao contrário do cisto dentígero que habitualmente não envolve as raízes do dente (LEE et al.,
2000; BARNES et al., 2005; JOHN et al., 2010).
Microscopicamente, o TOA é composto por nódulos sólidos de células epiteliais
fusiformes, poligonais ou cubóides que formam ninhos, estruturas rosetóides, estruturas
ductiformes e cordões de epitélio com uma configuração trabecular ou cribriforme dispostas
em escasso estroma de tecido conjuntivo fibroso. Entre as células epiteliais e no centro das
estruturas rosetoides, pode estar presente um material amorfo eosinofílico (muitas vezes
descritos como "gotículas tumorais'). O componente epitelial pode ser marcadamente celular
com células semelhantes à pré-ameloblastos dispostas radialmente, intercaladas com células
fusiformes. Em outras áreas, as células epiteliais formam finos cordões entrelaçados que
lembram um pouco os ameloblastomas plexiformes. Podem ser encontrados dois tipos de
material de secreção: depósitos finos adjacentes as pontas dos pré-ameloblastos que têm uma
intensa tonalidade pela hematoxilina e eosina convencional e largas faixas de material
eosinofílico no estroma subepitelial. Qualquer desses materiais podem constituir a base para a
mineralização. Ainda é uma questão de especulação se estas realmente representam matriz do
esmalte ou material dentinoide. Geralmente, apresenta-se circundado por uma cápsula fibrosa
bem desenvolvida (MORGAN et al., 2011; DE MATOS et al., 2012).
Estudos com imuno-histoquímica relatam que o crescimento lento, o caráter benigno e
baixa tendência a recorrer estão claramente relacionados à baixa proliferação celular
observada pela marcação para o antígeno Ki67 (CRIVELINI et al., 2005, SEMPERE et al.,
2006). Além disso, um segundo ponto de interesse, notou-se a positividade difusa para AE1-
AE3 associada a uma reatividade nuclear universal para o antígeno p63 ao longo de
praticamente todas as células que formam este tumor. Do ponto de vista imuno-histoquímico,
37
este último aspecto confirma que as células basais epiteliais são as células progenitoras dos
elementos que compõem este tumor benigno de baixo grau de proliferação, apesar de possuir
um amplo fenótipo e variada morfologia. (JOHN et al., 2010). A maioria dos TOAs são
removidos cirúrgicamente, sem consequências clínicas adversas (MORGAN et al., 2011).
2.2 CÉLULAS-TRONCO
A mais antiga definição de CT inclui “células que permanecem nos tecidos e retêm a
capacidade de proliferar por toda a vida”. As CT têm papéis essenciais no desenvolvimento
dos órgãos e reparação tecidual. Em um organismo, todos os tecidos são construídos a partir
de células-tronco embrionárias pluripotentes (CTE) (HARADA et al., 2002; BEHJATI et al.,
2014). As CT embrionárias se diferenciam em células-tronco multipotentes através da
adequada combinação de fatores de crescimento, incluindo células epiteliais, mesenquimais e
outras CT de tecidos específicos (ODORICO et al., 2001; HARADA et al., 2002; XIAO et al.,
2014). Interações entre essas CT iniciam e regulam os processos de desenvolvimento,
resultando na formação de tecidos funcionais altamente especializados e órgãos (XIAO et al.,
2014). Uma vez que o organismo se desenvolve e que a diversificação dos tipos celulares está
completa, as CTE perdem-se e algumas CT adultas multipotentes permanecem no tecido
desenvolvido para sustentar a homeostase e a reparação de lesões, sendo mais restrita sua
diferenciação nos tecidos ou órgãos adultos (HARADA et al., 2002). Por estas causas são
chamadas de “células-tronco adultas” ou "células-tronco de tecidos específicos" (CTA) para
distingui-las das células CTE (HARADA et al., 2002; KØRBLING et al., 2003). Muitos
tecidos humanos adultos (tais como a medula óssea, polpa dentária, tecido adiposo, derme e
cordão umbilical) contêm populações de células-tronco mesenquimais (CTMs) (XIAO et al.,
2014).
A divisão de CT resulta em algumas células-filhas que são, elas mesmas, também CT
e outras células-filhas que geram células diferenciadas que, eventualmente, são perdidas a
partir dos tecidos. Anteriormente, acreditava-se que todas estas células em proliferação eram
CTA, mas, recentemente, tem sido proposto que as CT geram células diferenciadas
terminalmente através de uma população de células intermediárias conhecidas como células
de trânsito-amplificadoras (TA). Depois de vários ciclos de divisão de células, todas as células
TA filhas retiram-se permanentemente do ciclo celular e sofrem diferenciação terminal.
(HARADA et al., 2002).
38
Com base na localização das CT epiteliais em dentes, folículo piloso e no intestino, as
CTA parecem se manter em um refúgio seguro (nicho) e / ou raramente se dividem, como
uma forma de minimizar a exposição a uma variedade de fatores extrínsecos e prevenção da
mutação no DNA durante a divisão celular. As CTA parecem ser adaptadas especificamente
para a sobrevivência permanente (HARADA et al., 2002).
Na grande maioria das células, os telômeros protegem os cromossomos do
encurtamento a cada divisão celular. Quando as células se dividem para além dos limites
impostos pelo comprimento dos telômeros, a instabilidade dos seus cromossomos provoca a
morte celular. Há relatos de que as CTA contêm telomerase, uma polimerase de DNA
ribonucleoproteica que adiciona repetições de telômeros para as extremidades do cromossomo
para compensar a perda da sequência durante a replicação de DNA. As células de vários
tecidos regenerados, incluindo o sistema hematopoiético, células da cripta do intestino,
células basais da pele e células dos folículos pilosos, têm demonstrado expressão de
telomerase. A detecção da atividade da telomerase em tecidos normais parece estar associada
à presença de CT e técnicas “in situ” permitem a detecção da telomerase em CTA (HARADA
et al., 2002).
Até o momento, a origem do desenvolvimento de CTMs ainda não é clara. Embora
seja comumente considerado que CTMs derivam do mesoderma, provas indicaram que o
neuro-epitélio Sox1+ e a crista neural dão origem ás primeiras CTMs (XIAO et al., 2014).
Em muitos tecidos pós-natais, as CTMs estão localizadas principalmente no nicho
perivascular, embora possam ter outra localização (CAPLAN et al., 2007; FENG et al., 2011).
Sob estímulos indutores, CTMs são capazes de se diferenciar em células maduras
mesenquimais específicas, como adipócitos, condrócitos e osteoblastos. Além disso, as CTMs
também podem dar origem a linhagens de células não-mesenquimais, tais como células
endoteliais, células neuronais e ceratinócitos (SASAKI et al., 2008; XIAO et al., 2014).
CTA epiteliais se localizam na camada basal de diversos tecidos epiteliais, tais como a
epiderme da pele e do epitélio das mucosas do aparelho digestivo e respiratório. É uma
população de células heterogêneas dinâmicas, têm ciclos lentos e mantêm a longo prazo
potencial de auto-renovação (XIAO et al., 2014). As células-tronco epiteliais contribuem para
renovação fisiológica e cicatrização de feridas em tecidos epiteliais por divisões assimétricas
para gerar as camadas superiores da epiderme da pele (PLIKUS et al., 2012; XIAO et al.,
2014).
39
Transplante e experimentos de rastreamento de linhagem confirmaram que as células-
tronco epiteliais dão origem não só a todas as linhagens epiteliais (BARKER et al., 2010)
mas, também, células de Merkel neuroendócrinas. CTM e células-tronco epiteliais foram
isoladas a partir de tecidos humanos, incluindo a região oral: gengiva, órgãos dentários e
ligamento periodontal (XIAO et al., 2014).
2.2.1 Células-tronco e odontogênese
O processo de desenvolvimento dos órgãos dentários é semelhante ao de muitos
órgãos, tais como os pulmões, rins e folículo capilar. As interações entre células epiteliais e
mesenquimais iniciam o desenvolvimento de dentes e regulam sua morfogênese. Os detalhes
de sinalização epitelial-mesenquimal no desenvolvimento dos dentes têm sido bem
documentados (THESLEFF et al., 2003). Nos seres humanos, a odontogênese começa no
meio da sexta semana de gestação. Em um embrião, as células basais da lâmina dentária
sofrem proliferação e formam uma banda em forma de ferradura que se invagina no tecido
mesenquimal subjacente; este processo é chamado de invaginação do epitélio. O tecido
mesenquimal derivado a partir de células da crista neural, induz a proliferação das células
epiteliais odontogênicas e as conduz para finalmente se diferenciarem em células produtoras
de esmalte, os ameloblastos. As células do tecido mesenquimal reagem aos sinais de células
epiteliais odontogênicas. Elas diferenciam-se em cementoblastos, células do ligamento
periodontal, odontoblastos e outras células da polpa dentária (incluindo neurónios, células
endoteliais e fibroblastos). Uma vez que um dente é formado, as células do epitélio
odontogênico não existem mais, excetuando os restos epiteliais odontogênicos denominados
restos de Serres e de Malassez, bem como eventuais restos epiteliais nas regiões posteriores
dos últimos molares, ao passo que as células mesenquimais permanecem na polpa dental e
tecido periodontal (DASSULE et al., 2000; XIAO et al., 2014).
Os dentes são um importante modelo para o estudo do desenvolvimento e renovação de
orgãos ectodérmicos. A capacidade de renovação dos dentes varia muito entre as espécies.
Vários modos de renovar dentes têm evoluído e comum a todas elas é a exigência de células-
tronco. As células-tronco putativas foram identificadas tanto no incisivo de roedor, que cresce
e se renova continuamente e em répteis, que substituem continuamente seus dentes
(KETTUNEN et al., 2000; JUURI et al., 2013b; ABDUWELI et al., 2014)
40
O processo de odontogênese é regulado por fatores de transcrição que controlam a
expressão dos genes responsáveis por determinar o modo como as células funcionam e
respondem ao ambiente. Além disso, esses fatores de transcrição regulam a expressão dos
fatores de crescimento e medeiam as interações entre as camadas de tecidos odontogênicos.
Os fatores de transcrição Oct-4, Sox2, Nanog e Stat-3 são considerados os principais
interventores na especificação transcricional do fenótipo das CTE. Em um estudo, Cunha et
al. (2013) avaliaram o padrão de expressão dos fatores de transcrição de células-tronco
pluripotentes, tais como o Oct-4, Sox2, Nanog e Stat-3, bem como o seu potencial
envolvimento na regulação dos nichos de CT em vários estágios da morfogênese inicial in situ
de dentes humanos. Para isso, os autores realizaram uma análise imuno-histoquímica em
germes dentários na fase de capuz e sino, obtidos a partir de 20 fetos humanos de ambos os
gêneros. Foi observado que no estágio de capuz, a expressão entre os fatores estudados difere
nos germes dentários permanentes, com Nanog sendo citoplasmático e os outros com
expressão citoplasmática e nuclear. No estágio de sino, o padrão de expressão para Stat-3 em
todas as regiões foi nuclear e citoplasmático. Este foi similar à expressão dos outros fatores
estudados na alça cervical, retículo estrelado e epitélio externo do esmalte, com exceção de
Nanog, que foi mais expresso na região citoplasmática das células da alça cervical. De um
modo geral, observou-se que todos os fatores de transcrição analisados estavam ativos durante
a morfogênese fetal dos dentes humanos. Foi visto ainda que a expressão dos fatores de
transcrição ocorre nas populações celulares que proliferam e expressam marcadores de
células-tronco pluripotentes, sugerindo suas amplas habilidades de potencial desenvolvimento
e diferenciação. Baseado nisso, os autores concluíram que a inter-relação entre esses fatores
de transcrição é complexa e está relacionada à formação do nicho de células-tronco, que
regulam a diferenciação em ameloblastos e odontoblastos.
Juuri et al., (2013b) analisaram o padrão de expressão do fator de transcrição Sox2 em
espécies animais que apresentavam modos diferentes de sucessão dental. Neste estudo, os
autores avaliaram germes dentários em distintas fases do desenvolvimento, obtidos a partir de
mamíferos e répteis. Os resultados mostraram que as células da lâmina dentária de mamíferos
e de répteis apresentavam um padrão similar de expressão do fator Sox2. Este também foi
expresso na lâmina dentária durante a adição de dentes da série dos molares nos mamíferos.
Foi visto ainda que as células do epitélio dental positivas para Sox2 apresentavam
competência para formação de dentes sucessores e que esse fator de transcrição pode regular
o estado progenitor de células epiteliais odontogênicas. Quando se realizou a supressão
condicional do Sox2 em ratos, observou-se o crescimento anormal do epitélio responsável
41
pela formação dos molares posteriores. Por fim, os autores concluíram que os padrões de
expressão do Sox2 apoiam a hipótese de que os mamíferos possuem uma capacidade
dormente de renovação continuada dos elementos dentários.
Abduweli et al., (2014) realizaram um estudo através de análises estruturais e cinéticas
da dentição faríngea do peixe medaka para identificar as famílias inteiras de dentes,
determinar os ciclos de substituição de dentes e retratar nichos de células-tronco
odontogênicas no sistema de substituição de dentes, utilizando teste por Bromodeoxiuridina
(BrdU) para avaliação de proliferação celular e expressão de Sox2 na dentição faríngea por
hibridização in situ. Foi observado que o sistema dentário desta espécie é organizado em
famílias de dentes bem orientados, tendo uma, até cinco gerações de dentes, com elementos
funcionais e os germes de dentes sucessores, em diferentes fases de desenvolvimento e / ou
ciclos de substituição de dentes. A hibridização in situ em secções parasagitais de parafina de
dentição faríngea superior revelou sinais Sox2 nas porções restritas do epitélio faríngeo
correspondente à extremidade mais posterior da família de dentes individuais, onde as células
imunomarcadas por BrdU tinham sido observadas. Não houve sinais detectáveis de Sox2 no
tecido conjuntivo adjacente. Este estudo confirmou a existência de supostas células-tronco na
extremidade posterior de cada família de dentes onde as células que expressam Sox2 também
estão localizadas.
2.2.2 Células-tronco e lesões odontogênicas
Os ameloblastomas são tumores benignos que apresentam características semelhantes
às do órgão do esmalte do germe dentário, mas eles são localmente invasivos e
potencialmente destrutivos. Tem se formulado perguntas a respeito da origem desses tumores
e porquê eles apresentam-se com várias células semelhantes às células epiteliais dentárias.
Resultados de estudos, numa tentativa de responder a estas e outras questões relacionadas,
demostraram que células de ameloblastoma expressam telomerase, que é encontrada apenas
em embriões, CT ou tumores malignos (KUMAMOTO et al., 2001). É ainda desconhecido se
a atividade da telomerase em ameloblastoma é expressa desde o início ou se acumula no
processo de tumorigênese. Cerca de 70% dos ameloblastomas na mandíbula estão localizados
na região molar e do ramo ascendente; esta evidência circunstancial sugere que as células do
ameloblastoma originam-se de células-tronco odontogênicas ou células amplificadas
transitórias (TA), que estão localizadas na lâmina dentária dos molares. Durante o
desenvolvimento dos ameloblastomas, as células-tronco da lâmina dental podem ser alvos
42
para agentes carcinogênicos, mas também há a possibilidade de que elas atuem sobre as
células TA e impeçam a sua diferenciação normal. Ativação de oncogenes pode afetar tanto as
CT como as células TA, fazendo com que as células TA voltem para células semelhantes a
CT. Estudos sugerem que as células TA revertem-se para CTe são reprogramadas (HARADA
et al., 2002).
2.3 OCT-4
O Oct-4 consiste em um fator de transcrição do domínio POU (Pit-Oct-Unc)
codificado pelo gene Pou5f1. Os fatores de transcrição da família POU podem ativar a
expressão dos seus genes-alvos através da ligação ao motivo da sequência octamérica
ATGCAAAT. A proteína Oct-4 consiste em 3 domínios: N-terminal, POU e C-terminal. O
domínio POU é composto por dois subdomínios estruturalmente independentes, um composto
por 75 aminoácidos na região amino-terminal POU-específico e o outro subdomínio é
constituído por 60 aminoácidos na região carboxi-terminal. Ambos os domínios fazem
contato específico com o DNA através da estrutura helix-turn-helix e são conectados por um
ligante de 17 aminoácidos (WU e SCHÖLER, 2014).
Oct-4 está envolvido na manutenção da pluripotência e auto-renovação das células-
tronco embrionárias indiferenciadas (HUANG et al., 2014). Também é considerado o
principal "interruptor” genético no estabelecimento da totipotência/pluripotência durante o
ciclo da vida em mamíferos e, presume-se, que seja o mais importante gene no circuito
molecular da pluripotência (WU e SCHÖLER, 2014).
Tem sido sugerido que as células-tronco embrionárias têm uma rede de regulação
envolvendo três maiores reguladores de auto-renovação e manutenção do estado
indiferenciado. Estes reguladores são o Oct-4, Nanog e o SOX2. Além disso, Oct-4 e Nanog
têm sido considerados uns dos principais fatores que permitem a reprogramação de células
adultas em células pluripotentes induzidas (MAJOR, PITTY, FARAH, 2013).
O Oct-4 é expresso em células-tronco embrionárias, células germinativas e células-
tronco humanas adultas e é encontrado silenciado na maioria das células somáticas (SUNG et
al., 2012; HUANG et al., 2014). Desempenha um crítico papel no desenvolvimento e auto-
renovação de células-tronco embrionárias e tem sido associado a processos oncogênicos.
Pesquisas recentes relataram que Oct-4 exibe elevada expressão em vários tipos de câncer,
43
incluindo câncer de mama, câncer colo-retal, pulmão, fígado, cérebro, ovário, bem como
câncer de cabeça e pescoço, estando associado com a progressão tumoral (HASSIOTOU et
al., 2013; TSAI et al., 2014).
A expressão desregulada de Oct-4 foi encontrada em vários tumores sólidos humanos,
bem como em tumores de células germinativas. Tem sido proposto que a expressão elevada
de Oct-4 tem um papel no desenvolvimento das células-tronco tumorais e pode afetar o
processo tumorigênico através da formação de colônias, motilidade e migração das células
tumorais. Em ratos, a expressão de Oct-4 é regulada por vários receptores nucleares, incluindo
fator esteroidogênico -1 (SF-1), fator nuclear de células germinativas, receptores retinóides e
receptor de fígado homologo-1(LRH-1) (SUNG et al., 2012).
A identificação das CTT criou uma nova área de pesquisa com aplicações promissoras
no prognóstico e terapêutica do câncer humano. Evidências indicam que essas células
também desempenham um papel importante na patogênese e progressão de carcinomas
desenvolvidos na cavidade oral (QIAO et al., 2012; PAPAGERAKIS et al., 2014; TSAI et al.,
2014).
No estudo de Tsai et al. (2014) foi observado que o nível de expressão de Oct-4 foi
maior em amostras de carcinomas epidermóides orais recorrentes e metastáticos quando
comparados com espécimes primários do tumor. Os autores também verificaram que
propriedades iniciais do tumor são mediadas por Oct-4 através da regulação da transição
epitélio-mesenquimal e sugeriram que Oct-4 pode ser um alvo terapêutico para carcinomas
epidermóides orais.
Além disto, o Oct-4 considerado o gene-mestre da pluripotência e regulador de
células-tronco embrionárias é um fator de transcrição, também conhecido como Out-3, Oct-
3/4, Otf3 ou NF-A3. Regula a auto renovação e diferenciação de células-tronco embrionárias,
incluindo células germinativas, sendo codificado pelo gene POU5F1 (pertence ao domínio
POU (Pit, Out, Unc), da família de proteínas de ligação do DNA, (classe 5, fator de
transcrição 1) no 6p21.3. Também é conhecido como octâmero de ligação ao fator de
transcrição 4. Estas proteínas regulam a expressão de genes-alvo ligando-se ao motivo do
octâmero ATGCAAAT dentro das suas regiões promotoras ou potenciadoras. Oct4, cuja
expressão está associada com as propriedades de células-tronco pluripotentes, é um fator
essencial para controlar as fases precoces da embriogênese (ZEINEDDINE et al., 2014;
SAMARDZIJA et al., 2012).
44
Oct4, foi descoberto e caracterizado pela primeira vez em 1989, sendo não somente
um marcador de células-tronco, mas, também está envolvido na especificação de linhagens
sendo uma proteína celular envolvida na reprogramação da célula somática in vitro. Oct4
também é expresso em diferentes tipos de células-tronco do câncer e está envolvido na origem
da resistência tumoral a quimioterapia e recidiva do câncer (ZEINEDDINE et al., 2014).
Ele é utilizado em patologia como marcador imuno-histoquímico, apresentando marcação
nuclear, é altamente sensível e específico para germinomas intracranianos, sendo conhecido
como fator de mau prognóstico para o carcinoma de células escamosas do esôfago e pode ser
um fator de mau prognóstico para câncer de pulmão de células não pequenas (HATTAB et al.,
2005; HE et al., 2012; LI et al., 2012).
Oct4 é mais do que um regulador mestre de pluripotência, é o regulador mestre ao
longo de toda a via de expressão e reprogramação. É bem sabido que Oct-4 é especificamente
expresso em células pluripotentes e a sua expressão é suficiente para induzir pluripotência em
células somáticas. No entanto, Oct-4 também é expresso em células comprometidas para cada
uma das três camadas germinativas de embriões no estágio de gastrulação. Isto sugere que
Oct-4 desempenha um papel importante no compromisso de células pluripotentes para
linhagens somáticas. Na verdade, as células-tronco embrionárias superexpressam Oct-4,
sofrem diferenciação rápida e perdem pluripotência (STERNECKERT et al., 2012).
É bem documentado que a super-expressão de Oct4, Sox2 e Nanog, em conjunto ou
separadamente, conduzem a tumorigenicidade, metástase de tumor e até recorrência após
quimio-radioterapia em diferentes tipos de câncer. Alta expressão de Oct-4 tem sido detectada
em diferentes tipos de câncer, tendo um papel crítico na sobrevivência das células tumorais.
Geralmente, estes fatores de transcrição são mais frequentemente superexpressos em tumores
pouco diferenciados (em comparação com os tumores bem diferenciados) e o nível destes
fatores envolvidos na expressão de células-tronco, diminui com a diferenciação das células
(ZEINEDDINE et al., 2014).
Existem prováveis mecanismos moleculares conservados o que poderia explicar des-
diferenciação de células somáticas, como observado em tumores malignos e reprogramação
das células somáticas. Até agora, não foi ainda demonstrada que ocorra reprogramação
normalmente, em particular alguma situação no organismo adulto. No entanto, pode-se supor
que este é um potencial processo normal e se existir, deve estar constantemente sob estrito
controle no organismo adulto (por exemplo, co-expressão de Oct-4, Nanog, Sox2 e myc,) e
45
nunca deve ocorrer em células adultas diferenciadas normais. Então, há a hipótese de que a
formação de câncer é o resultado de reprogramação descontrolada, envolvendo Oct4 e muitos
outros genes de células-tronco (ZEINEDDINE et al., 2014).
2.4 CD44
CD44 é uma família de glicoproteínas da superfície celular com variadas isoformas e
modificações pós-translacionais que é amplamente expressa na superfície de muitas células de
mamíferos, que inclui células endoteliais, células epiteliais, fibroblastos e leucócitos. O CD44
tem várias funções fisiológicas importantes principalmente na facilitação nas interações
célula-célula e célula-matriz através da sua afinidade para o ácido hialurônico (AH) (seu
ligante primário). Acredita-se que esta ligação é responsável pela sinalização celular,
regulação e outros processos biológicos celulares como proliferação, adesão, migração,
hematopoiese e a ativação, direção e extravasamento dos linfócitos. A sobre-regulação de
CD44 está correlacionada com a progressão do tumor e fenótipo metastático em muitos tipos
de câncer, (LI et al., 2015; JORDAN et al., 2015; BASAKRAN et al., 2015).
As células dentro de um tecido interagem através da matriz intercelular ou através de
junções celulares. O CD44, como uma molécula de adesão celular, permite a comunicação
através de transdução de sinal célula-célula e medeia a transdução de sinal do receptor do
fator de crescimento epidérmico humano, bem como as vias comuns de sinalização celular do
receptor tirosina quinase que regulam a divisão celular e funciona como uma plataforma para
alguns fatores de crescimento, bem como proteoglicanos de heparan-sulfato (BASAKRAN et
al., 2015).
Na membrana basal também é importante na adesão epitelial ao hialuronato e para
manter a orientação polar destas células; este processo pode contribuir para a remodelação de
tecidos e pode estimular a proliferação e migração celular. CD44 também se liga ao ácido
hialurônico, colágeno, laminina, fibronectina, osteopontina, MMPs e E-selectina / CD62E.
Também é considerado um marcador de células B ativadas e é importante no
desenvolvimento de células T. Além disso, está envolvido na fixação de leucócitos e
rolamento nas células endoteliais, “homing” para órgãos linfóides periféricos (por ligação a
adressina mucosa, uma proteína presente nas células endoteliais das placas de Peyer e
linfonodos) bom como quimiotaxia e agregação de leucócitos (YAN, ZUO, WEI., 2015).
O CD44 é codificado por um único gene, incluindo 20 exons. A forma “padrão”
(referida como CD44s) consiste dos exons 1-5 e 15-20. Os exons variáveis são identificados
46
como V1 a V10. Várias isoformas de CD44 (CD44v) surgem por inserção de um ou mais
exons variantes na estrutura comum compartilhada por todas as formas de CD44. O papel
destas isoformas variantes não é completamente compreendido, embora se acredite que alguns
têm um papel crítico na metástase do câncer de cólon (SAHLBERG et al., 2014). O CD44
“padrão” é a isoforma mais curta e mais abundantemente expressa; as outras variantes são
expressas de um modo específico em células e na fisiopatologia de muitas doenças
(manifestando a diversa atividade fisiológica de CD44), incluindo câncer, artrite, infecções
bacterianas e virais, doença pulmonar intersticial, doença vascular e cicatrização de feridas
(LI et al., 2015; JORDAN et al., 2015).
A diversidade de atividade biológica é conferida tanto pela variedade de isoformas
distintas de CD44 geradas através do complexo de “splicing” alternativo, como por
modificações pós-tradução (por exemplo, N- e O-glicosilação), interações com um número de
diferentes ligantes e a quantidade e distribuição espacial do CD44 na superfície da célula. O
ácido hialurónico de glicosaminoglicano da matriz extracelular (AH) é o princípio do ligante
de CD44 (JORDAN et al., 2015).
No que diz respeito as interações de CD44 nas células-tronco, este é um receptor de
glicoproteína que é ativado por ligação ao seu maior ligante de AH. Este regula as células-
tronco de ligação “homing”. Em células-tronco hematopoiéticas, o CD44 medeia essas células
“homing” na medula óssea. O fator de crescimento derivado das plaquetas estimula as
células-tronco mesenquimais (CTMs) para produzir mais células CD44 que facilitam a
viagem através do AH extracelular de ligação. Este processo é sugerido para ajudar no
recrutamento de CTMs durante o desenvolvimento tecidual e cicatrização. A ligação CD44 /
AH parece interagir com diferentes fatores intrínsecos do nicho. Uma via comum é a reação
com sulfato de heparano extracelular. Sulfato de heparano é conhecido por se ligar com a
proteína e dá origem a proteoglicanos de sulfato de heparano. A fracção de sulfato de
heparano permite que CD44v3 se ligue a fatores, tais como o fator de crescimento de
fibroblastos e mais forte com o fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-
EGF). Fatores de crescimento medeiam a ligação de CD44 a TRK para trabalhar como
transdutores de sinais celulares. Por outro lado, o CD44 também pode interagir com integrina.
A integrina é uma molécula de adesão celular de ligação de componentes extracelulares ao
citoesqueleto de actina intracelular. Integrina geralmente se encontra desempenhando um
papel na sinalização célula-a-célula, na diferenciação celular, proliferação e migração. Assim,
47
CD44 e integrinas em associação com estas interações bi-moleculares conduz a hipótese de
que CD44 medeia as funções de integrina nas células (BASAKRAN et al., 2015).
Células-tronco cancerígenas sintetizam AH (o ligante primário para CD44) para atrair
os macrófagos associados a tumores (MAT) nos nichos de células-tronco do câncer (CTT). As
CTT e MAT produzem fator oncogênico de crescimento derivado do fator de crescimento de
plaquetas (PDGF-BB) que mantém a célula tumoral em uma fase proliferativa sustentada.
Como resultado, essa interação recruta células estromais no nicho CTT. Células de estroma
são conhecidas por produzir vários fatores de crescimento que regulam a atividade de células-
tronco (BASAKRAN et al., 2015).
A interação de CD44s com AH desempenha um papel crucial na invasão celular. O
AH é encontrado mais concentrado em células pré-malignas e malignas do que nas células
normais, apoiando a teoria de que ela desempenha um papel na capacidade de invasão do
câncer (BASAKRAN et al., 2015).
Recentemente, tem surgido estudos de CD44 como um biomarcador em CTT ou
células iniciadoras de câncer. Uns grandes números de estudos de CTT utilizam a expressão
de CD44 padrão ou isoformas variantes como marcadores típicos. Pesquisas atuais estão
focalizando o papel da sinalização de CD44 durante a transição epitelial-mesenquimal (TEM)
(JORDAN et al., 2015).
Patrawala et al. (2006) determinaram que células CD44 + do carcinoma de próstata
podem preferencialmente expressar certos genes de células tronco, importantes para a auto-
renovação, proliferação e propriedades de células-tronco / progenitoras.
Em um estudo sobre carcinoma escamocelular humano da região de cabeça e pescoço
Bourguignon et al. (2012) determinaram que a HSC-3 (linhagem de células derivadas de
tumor HSC-3 a partir de células de carcinoma escamoso humano de boca) contém uma
subpopulação de CTT caracterizada por altos níveis de CD44v3 e expressão de aldeído 1
desidrogenase (ALDH1). Estas células tumorais também expressaram vários marcadores de
células-tronco (fatores de transcrição Oct4, Sox2 e Nanog) e exibiram as propriedades
características de CTT como auto-renovação / formação clonal e a capacidade de gerar
populações de células heterogêneas. Ressaltaram que o ácido hialurônico (AH) estimula o
CD44v3 (um receptor de AH), interage com Oct4-Sox2-Nanog, ambos levando a uma
formação complexa e a translocação nuclear de três fatores de transcrição de CSC. Uma
48
análise mais detalhada revelou que microRNA-302 (miR-302) é controlado por um promotor
a montante contendo locais de ligação para Oct4-Sox2-Nanog, considerando que ensaios de
imunoprecipitação da cromatina (ChIP) demonstram que a estimulação da expressão de miR-
302 por HA-CD44 é Oct4-Nanog-Sox2 dependente em CTT específicas do carcinoma
escamocelular de cabeça e pescoço. Este processo resulta na supressão de vários reguladores
epigenéticos e o aumento da regulação de diversas proteínas de sobrevivência levando a auto-
renovação, formação clonal e resistência a cisplatina.
CD44v6 é positivamente correlacionada com a invasão e metástase em muitos tumores
malignos humanos. Nos maxilares, CD44v6 está implicada no comportamento agressivo de
tumores odontogênicos incluindo ameloblastoma e CCO (WANG et al., 2009a; WANG et al.,
2009b; SALEHINEJAD et al., 2012; SIAR et al.,2015;). Wang et al. (2009 a) analisaram a
expressão da integrina αv e CD44v6 em CCOs, considerando que CD44v6 é um receptor para
a osteopontina (OPN) e que a interação entre estas duas moléculas desempenha um papel na
promoção da motilidade das células tumorais e que a interação do OPN-CD44v6 promove a
ativação da integrina além de aumentar a adaptação imune das células que expressam OPN.
Os autores confirmaram que existe expressão concomitante de OPN e CD44v6 em células
epiteliais de revestimento dos CCOs, ratificando a existência de mecanismos autócrinos /
parácrinos para OPN nestas lesões. Sabendo-se que o CD44 aumenta o potencial metastático
em tumores malignos, a interação OPN-CD44- pode ajudar na invasão e disseminação do
revestimento epitelial do CCO no osso esponjoso circundante por aumentar a motilidade e
migração das células epiteliais. Os autores sugeriram que o comportamento agressivo e a alta
capacidade osteolítica local dos CCOs podem ser parcialmente explicados pela elevada
expressão de OPN e CD44v6 em células epiteliais do revestimento destas lesões.
Siar et al. (2015) analisaram a imuno-expressão de podoplanina em conjunto com E-
caderina, β-catenina e CD44v6 em 25 ameloblastomas recorrentes, considerando a área do
tumor, o tipo celular e a localização celular e os resultados foram comparados com 25
ameloblastomas primários. Verificou-se o CD44v6 foi mais expresso em ameloblastomas
primários (84%) do que nos recorrentes (64%). A localização da proteína foi
predominantemente membranar e em menor extensão citoplasmática. Esta reação positiva foi
claramente expressa pelas células semelhantes ao retículo estrelado bem como em ninhos
centrais dos tumores dos subtipos foliculares e plexiformes. As células semelhantes a pré-
ameloblastos geralmente foram não-reativas. Os níveis de CD44v6 foram mais elevados no
front invasivo
49
PROPOSIÇÃO
50
3 PROPOSIÇÃO
O presente trabalho de pesquisa tem como objetivo identificar, quantificar e comparar
a expressão imuno-histoquímica do Oct4 e CD44 como marcadores de CT, em diferentes
lesões odontogênicas epiteliais benignas (CCO, ameloblastoma e TOA), relacionando suas
expressões com as características histomorfológicas e avaliando seu possível papel na
patogênese e comportamento biológico variado exibido pelas lesões estudadas.
51
MATERIAIS E MÉTODOS
52
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O projeto de pesquisa foi registrado no Sistema Nacional de Informações Sobre Ética em
Pesquisa envolvendo Seres Humanos (SISNEP) e, de acordo com as Diretrizes e Normas
Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres Humanos (Resolução CNS 466/2012).
Desta forma, foi submetido à análise de seu conteúdo pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte com parecer de aprovação número 1.168.505
de 31/07/2015 (Anexo 1).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Esta pesquisa consistiu em uma análise descritiva e comparativa da expressão imuno-
histoquímica de Oct-4 e CD44 em espécimes de lesões epiteliais odontogênicas benignas
(CCO, ameloblastoma, TOA).
4.3 VARIÁVEIS
4.3.1 Variáveis independentes
Tipo de lesão:
Ameloblastoma
Ceratocisto odontogênico
Tumor odontogênico adenomatóide
4.3.2. Variáveis dependentes
Expressão imuno-histoquímica do Oct4 e CD44 em células epiteliais das lesões
odontogênicas vistas à microscopia de luz.
53
4.4 POPULAÇÃO
Do total de casos registrados e diagnosticados nos arquivos do Serviço de Anatomia
Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) no período de 2010 a 2015, foram selecionados os
casos de lesões epiteliais benignas de epitélio odontogênico (CCO, ameloblastoma, TOA) que
constituíram a amostra da presente pesquisa.
4.5 AMOSTRA
O presente trabalho foi executado a partir de espécimes teciduais, emblocados em
parafina, pertencentes ao arquivo do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de
Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN. A amostra selecionada para a
realização desta pesquisa foi intencional e foi constituída por 20 casos de CCO (não
associados com a síndrome de carcinoma nevoide basocelular), 20 casos de ameloblastoma
sólido, e 20 casos de TOA, todos emblocados em parafina, diagnosticados no serviço
anteriormente citado. Foram utilizados na pesquisa 60 espécimes teciduais pelo fato deste
número possibilitar uma boa distribuição e dispersão dos dados, além de embasamento na
literatura especializada (ALVES PEREIRA et al. 2010; SANTOS et al. 2011).
4.5.2 Critérios de inclusão
Os critérios determinados para inclusão de casos na amostra foram a quantidade de
material biológico arquivado suficiente para a realização do estudo imuno-histoquímico e em
condições adequadas de armazenamento dos espécimes.
4.5.3 Critérios de exclusão
Foram excluídos do estudo, os casos que não apresentaram boa condição de
armazenamento dos blocos de parafina ou que não tinham quantidade de material suficiente
para realização dos estudos pretendidos, assim como, os casos cujos participantes não
aceitaram participar da pesquisa.
54
4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO
Para a realização do estudo morfológico foram utilizadas lâminas com cortes de 5μm
de espessura do material incluído em parafina, corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina
(H/E) que posteriormente foram examinados à microscopia de luz (Microscópio Nikon
Eclipse E200 Japan Co. Tokyo, Japan). Em seguida, foi efetuada uma análise descritiva dos
aspectos histológicos observados nos ameloblastomas sólidos/multicísticos, CCOs e TOAs,
conforme descritos por Barnes et al., (2005).
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
4.7.1 Técnica
Todos os espécimes de ameloblastomas sóliods/multicísticos, CCOs e TOAs fixados
em formol a 10% e emblocados em parafina, referentes aos casos selecionados para este
estudo, foram submetidos a cortes histológicos de 3m de espessura, os quais foram
estendidos em lâminas de histológicas, previamente limpas e desengorduradas, preparadas
com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxy-silano (Sigma-Aldrich CO, St Louis, MO,
USA). Posteriormente, o material foi submetido a técnica da imunoperoxidase, utilizando os
anticorpos primários anti-Oct-4 e anti-CD44 conforme as etapas laboratoriais descritas
abaixo:
Desparafinização, reidratação e recuperação antigênica em solução de Trilogy (Cell
Marque, CA, USA), na concentração de 1:100, em panela Pascal, por 30 minutos;
Bloqueio da peroxidase endógena tecidual em solução de peróxido de hidrogênio a 3%
(10 volumes), por 15 minutos, à temperatura ambiente (TA);
Lavagem em água corrente (5 minutos);
Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl (tris-hidroximetil-
aminometano, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), pH 7,4 (5 minutos cada);
Bloqueio das ligações inespecíficas em solução de proteína Block (Thermo Scientific,
Runcorn, UK) por 5 minutos, TA;
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada);
55
Incubação dos cortes com os anticorpos primários (Quadro 1);
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada);
Incubação com o reagente amplificador do sistema de detecção Advance (Dako, North
America Inc.) por 15 minutos, TA;
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada);
Revelação da reação com a solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid DAB
+ Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) em câmara escura, por
5 minutos, TA;
Lavagem em água corrente (5 minutos);
Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
Contracoloração com hematoxilina de Harris (5 minutos), TA;
Lavagem em água corrente (5 minutos);
Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
- Álcool etílico 80º GL (2 minutos), TA;
- Álcool etílico 95º GL (2 minutos), TA;
- Álcool etílico absoluto I (5 minutos), TA;
- Álcool etílico absoluto II (5 minutos), TA;
- Álcool etílico absoluto III (5 minutos), TA;
Diafanização em três banhos de xilol (2 minutos cada);
Montagem em resina Permount® (Erviegas, São Paulo, SP, Brasil).
O controle positivo foi de acordo com a especificação do fabricante, lisado celular de
CT embrionarias humanas para Oct-4 e tecido vesical urinário humano para CD 44. O
controle negativo consistiu na substituição dos anticorpos primários por albumina de soro
bovino a 1% (BSA – Bovine Serum Albumin) em solução tampão.
56
Clone Especificidade Diluição Recuperação antigênica Incubação
Abcam
Ab19857
OCT4
1:800 Trilogy, pH 6.0 panela
pascal, 10 minutos
Overnight
4°C.
Abcam
Ab51037
CD44 1:100 Trilogy, pH 6.0 panela
pascal, 10 minutos
overnight
4°C.
Quadro 1: Clone, especificidade, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos
anticorpos primários a serem utilizados no estudo (Fabricante: Abcam, Cambridge, USA).
4.7.2 Analise do perfil imuno-histoquímico
Para Oct-4 foram consideradas positivas, todas as células epiteliais da lesão que
exibiram coloração acastanhada em seu núcleo e para CD44 foram consideradas positivas,
todas as células epiteliais que exibiram coloração acastanhada na membrana celular. Foi
realizada uma análise semi-quantitativa de acordo com o método descrito por Ge et al. (2010),
onde cada lâmina foi examinada em sua totalidade sob um microscópio de luz com aumento
de 400X (Microscópio Nikon Eclipse E200 Japan Co. Tokyo, Japan). Foram selecionados 5
campos aleatórios que apresentassem áreas de lesão adequada para avaliação, uma pontuação
inicial foi atribuída o que representou a proporção estimada de células tumorais positivas,
sendo calculado o percentual de células positivas (PP) para cada espécime e a intensidade da
expressão (IE). Através desta análise, o PP foi classificado como 0 (0%), 1 (<25%), 2 (25-
50%), 3 (51-75%) ou 4 (> 75%) e a IE foi classificada como 0 (ausência de expressão), 1
(fraca), 2 (intermediária) ou 3 (forte). As pontuações do percentual de células positivas (PP) e
da intensidade da expressão (IE) foram então somadas para obter um escore total, que variou
de 0 a 7. A pontuação da imunomarcação total (PIT) foi calculada sendo (PIT) = PP + IE.
Desta forma, para sua descrição os espécimes foram categorizados em dois grupos de acordo
com seus escores totais: (1) Baixa expressão: <4 pontos; (2); Alta expressão: 4 a 7 pontos.
Além disso, foi realizado um análise de concordância de Kappa (intra examindor), sendo
realizada a análise do perfil imuno-histoquímico para ambos os marcadores duas vezes pelo
mesmo examinador, tendo uma razoável concordância.
57
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos a partir das análises morfológicas e imuno-histoquímicas foram
organizados em um banco de dados e então submetidos aos testes estatísticos adequados para
análise descritiva utilizando o programa SPSS IBM® Company (Statistical Packagefor the
Social Sciences) na versão 22.0. As variáveis qualitativas foram apresentadas na forma de
frequências absolutas e relativas, os escores das variáveis foram descritos por mediana e
intervalos interquartis (percentil 25 e 75). Os valores dos dados obtidos foram submetidos aos
testes estatísticos não paramétrico de Kruskal-Wallis e coeficiente de correlação de Spearman
(r). As hipóteses do estudo foram testadas adotando nível de significância de 5%, sendo
considerados significativos os valores de p≤0,05.
58
RESULTADOS
59
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA
Na análise histopatológica sob microscopia de luz, dos casos de CCOs, observou-se o
típico epitélio cístico de espessura uniforme com a camada superficial de paraceratina
corrugada que caracteriza esta lesão, exibindo de 6 a 8 camadas de células, com os
ceratinócitos da camada basal hipercromáticos, em paliçada e a polaridade nuclear invertida.
O epitélio e a interface com o tecido conjuntivo eram planos. Na maioria dos casos foram
identificados fragmentos com destacamento do epitélio da cápsula fibrosa. Na maioria dos
casos não se observou um lúmen cístico evidente, a cápsula de tecido conjuntivo fibroso na
maioria dos casos era delgada e em 10 casos (50%) foram observados focos de moderado a
intenso infiltrado inflamatório de predomínio crônico mononuclear, os restantes 10 casos
(50%) exibiram infiltrado leve ou ausente.
Foram considerados apenas os ameloblastomas sólidos no nosso estudo. Na análise
morfológica microscópica identificou-se proliferação das células epiteliais em ilhas e cordões
anastomosados, células periféricas colunares hipercromáticas e núcleo com polaridade
invertida, organizadas em paliçada, formando estruturas foliculares e plexiformes, em cujas
porções centrais exibiam células angulares frouxamente arranjadas semelhantes ao retículo
estrelado do órgão do esmalte, em permeio de um estroma fibroso. Na maioria dos casos
(75%) observou-se um padrão histológico misto com associação de áreas plexiformes e
foliculares no mesmo caso, em 13 casos (65%) o padrão folicular predominava sobre o
plexiforme, apenas 2 casos (10%) exibiram predominância do padrão plexiforme sobre o
folicular, e 5 casos (25%) apresentaram apenas o padrão folicular sem associação. O estroma
era predominantemente fibroso denso, com áreas de densidade variada, exibindo vasos
sanguíneos de pequeno calibre estando, por vezes, congestos. Na maioria dos casos
apresentaram leve ou ausente infiltrado inflamatório (60%), 5 casos (25%) moderado e apenas
3 casos (15%) apresentaram infiltrado intenso principalmente disposto em focos. Alguns
casos apresentavam áreas com degeneração cística e células granulares.
Histopatologicamente, os casos de TOA apresentavam proliferação sólida de células
epiteliais constituindo o parênquima tumoral e escasso estroma. As células neoplásicas eram
predominantemente cúbicas e ovais, exibindo estruturas espiraladas semelhantes a rosetas em
100% dos casos. Em 18 casos (90%) observaram-se estruturas semelhantes a ductos,
circundadas em sua maioria por células colunares e núcleo polarizado contrariamente ao
60
interior das estruturas pseudoductais, apenas em 3 casos (15%) observou-se a presença de
estruturas calcificadas. Em alguns casos, essas lesões eram circundadas por cápsula de tecido
conjuntivo fibroso denso.
5.2 ANALISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE Oct-4 E CD44
Analisando a expressão dos anticorpos utilizados no presente estudo, verificamos que
a imunoexpressão do Oct4 exibiu uma marcação tipicamente nuclear, apresentando variações
na intensidade de expressão em diferentes áreas dentre as lesões estudadas. Foi expressa
principalmente nas células do parênquima tumoral, mas também certa expressão nuclear foi
observada nos fibroblastos que produzem a matriz colágena do estroma.
Nos casos de CCO a imunoexpressão de Oct4 foi variável nas diferentes camadas do
epitélio. Na camada basal se observou um padrão de imunoexpressão, onde apenas algumas
células dispersas apresentavam marcação nuclear, sendo o restante de células negativas ou
com fraca marcação para Oct4 (figura 1). Em 13 casos (65% das lesões estudadas) se
observou imunoexpressão intensa, 3 casos (15%) apresentaram marcação fraca a moderada e
em 4 casos (20%) nenhuma célula da camada basal apresentou marcação. Na camada
intermediaria do epitélio, 19 casos (95%) exibiram marcação intensa em todas as células e
apenas 1 caso (5%) apresentou marcação moderada. Na camada superficial, 14 casos (70%)
não apresentaram imunoexpressão e 6 casos (30%) apresentaram fraca a moderada
positividade em alguns poucos núcleos na camada de superficial.
A avaliação dos casos de ameloblastoma revelou uma alta e irregular imunoexpressão
do Oct4, apresentando uma marcação de moderada a intensa nas células colunares periféricas
das estruturas foliculares ou plexiformes em 16 casos (80%), fraca em 3 casos (15%) e apenas
1 caso (5%) foi negativo nessa localização. Nas regiões centrais dos ninhos epiteliais
compostos por células angulares semelhantes ao retículo estrelado do órgão do esmalte, 16
casos (80%) apresentaram marcação moderada a intensa, 3 casos (15%) marcação fraca e
apenas 1 caso (5%) não apresentou positividade. Nas áreas sólidas se identificaram 13 casos
(65%) com marcação intensa, 5 (25%) moderada e 1 (5%) negativo (figura 2).
Nos TOAs, foi observada forte imunoexpressão do Oct4, localizando-se
principalmente nas células que formavam estruturas espiraladas em forma de rosetas e
enovelados (figura 3), onde 12 casos (60%) foram intensamente positivos, 6 casos (30%)
exibiram expressão moderada e apenas 2 casos (10%) apresentaram marcação fraca. As
61
estruturas semelhantes a ductos mostraram imunoexpressão intensa em 11 casos (55%),
moderada em 5 casos (25%) e fraca em 4 casos (20%). As células fusiformes do parênquima,
adjacentes ou periféricas as rosetas, enovelados e estruturas semelhantes a ductos, foram
frequentemente negativas para a imunomarcação com Oct4, 14 casos (70%) forma negativos,
5 casos (25%) apresentaram imunoexpressão fraca a moderada em e apenas 1 caso (5%)
exibiu positividade intensa nessa localização.
Com relação a expressão para CD44, CCOs exibiram imunoexpressão variável nas
diferentes camadas do epitélio (figura 4). Na camada basal se observou positividade intensa
em 9 casos (45%), 6 casos (30%) presentaram marcação fraca a moderada e 5 casos (25%)
não apresentaram nenhuma célula da camada basal com marcação. Na camada intermediária
do epitélio, 17 casos (85%) exibiram marcação intensa em todas as células dessa camada, 1
caso (5%) apresentou marcação moderada e 2 casos (10%) apresentaram fraca marcação. Na
camada de paraceratina, nenhum dos 20 casos de CCOs (100%) apresentaram
imunoexpressão de CD44.
A imunoexpressão de CD44 nos casos de ameloblastoma foi predominantemente
irregular (figura 5), apresentando uma marcação de moderada a intensa nas células colunares
periféricas das estruturas foliculares ou plexiformes em 12 dos casos (60%), fraca em 6 casos
(30%) e 2 casos (10%) negativa. Nos ninhos epiteliais das regiões centrais compostas por
células angulares semelhantes ao retículo estrelado do órgão do esmalte, 13 casos (65%)
apresentaram marcação moderada a intensa e 7 casos (35%) marcação fraca. Nas áreas sólidas
se identificaram 13 casos (65%) com marcação moderada a intensa, 2 (10%) fraca m 5 casos
(25%) negativos nas áreas sólidas. Destaca-se que todos os casos estudados apresentavam
diversas áreas negativas de extensões variáveis no parênquima neoplásico.
Nos TOAs foi observada alta imunoexpressão do CD44, localizando-se principalmente
nas células que formavam estruturas espiraladas em forma de rosetas e enovelados (figura 6),
onde 18 casos (90%) foram intensamente positivos na membrana celular e apenas 2 casos
(30%) exibiram expressão fraca. As estruturas semelhantes a ductos mostraram
imunoexpressão intensa em 5 casos (25%), 9 casos (45%) positividade moderada, 4 casos
(20%) expressão fraca e 2 casos (10%) negativos. As células fusiformes do parênquima,
adjacentes ou periféricas as rosetas, enovelados e estruturas semelhantes a ductos, foram
principalmente negativas para a imunoexpressão com CD44, com 17 casos negativos (85%), 2
62
casos (10%) apresentando fraca positividade e apenas 1 caso (5%) exibiu expressão intensa
nessa localização.
A análise da imunoexpressão da Oct4 revelou positividade em todos os casos de CCO,
ameloblastoma e TOA. No parênquima epitelial que compõe essas lesões, todos os grupos
estudados apresentaram maior frequência do escore 7 (Tabela 01). Os fibroblastos que
compõem a matriz revelaram certa imunomarcação na maioria dos casos para Oct-4. O teste
não paramétrico de Kruskal-Wallis revelou não haver diferença estatisticamente significativa
entre os grupos em relação às medianas dos escores de positividade para Oct4 (p = 0,406)
(Tabela 02).
Tabela 01. Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com os escores de
positividade para Oct4 no parênquima das lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN, 2016.
Grupo
Escores de PIT
Total
n (%) 0
n (%)
1
n (%)
2
n (%)
3
n (%)
4
n (%)
5
n (%)
6
n (%)
7
n (%)
CCO 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 4 (20,0) 4 (20,0) 12 (60,0) 20 (100,0)
AM 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 1 (5,0) 8 (40,0) 9 (45,0) 20 (100,0)
TOA 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 0 (0,0) 4 (20,0) 2 (10,0) 4 (20,0) 9 (45,0) 20 (100,0)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Legenda: CCO – Ceratocisto odontogênico; AM – Ameloblastoma; TOA – Tumor odontogênico
adenomatóide.
Tabela 02. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos,
estatística KW e significância estatística (p) para os escores de positividade para
Oct-4 em relação aos grupos de lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN,
2016.
Grupo n Mediana Q25-Q75 Média dos postos P
Lesão
CCO 20 7,00 6,00 – 7,00 34,00 0,406
Ameloblastoma 20 6,00 6,00 – 7,00 30,35
TOA 20 6,00 4,25 – 7,00 27,15
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Legenda: CCO – Ceratocisto odontogênico; TOA – Tumor odontogênico adenomatóide.
63
A análise da imunoexpressão de CD44 revelou positividade em todos os casos de CCO,
ameloblastoma e TOA. Nas células epiteliais que compõem essas lesões, o grupo dos
ceratocistos apresentou maior frequência do escore 7 (N = 13; 65%), o grupo dos
ameloblastomas e dos TOAs mostraram maior frequência do escore 6 (Tabela 03). O teste não
paramétrico de Kruskal-Wallis revelou haver diferença estatisticamente significativa entre os
grupos em relação às medianas dos escores de positividade para CD44, no componente
parenquimatoso (p = 0,034) (Tabela 04).
Tabela 03. Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com os escores de
positividade para CD44 no parênquima das lesões odontogênicas estudadas.
Natal – RN, 2015.
Grupo
Escores de PIT
Total
n (%) 0
n (%)
1
n (%)
2
n (%)
3
n (%)
4
n (%)
5
n (%)
6
n (%)
7
n (%)
CCO 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 1 (5,0) 1 (5,0) 4 (20,0) 13 (65,0) 20 (100,0)
AM 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (10,0) 3 (15,0) 3 (15,0) 7 (35,0) 5 (25,0) 20 (100,0)
TOA 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 1 (5,0) 3 (15,0) 9 (45,0) 6 (30,0) 20 (100,0)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Legenda: CCO – Ceratocisto odontogênico; AM – Ameloblastoma; TOA – Tumor odontogênico
adenomatóide.
Tabela 04. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística KW
e significância estatística (p) para os escores de positividade para CD44 em
relação aos grupos de lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN, 2016.
Grupo n Mediana Q25-Q75 Média dos postos P
Lesão
CCO 20 7,00 6,00 – 7,00 38,03 0,034
Ameloblastoma 20 6,00 4,25 – 6,75 24,83
TOA 20 6,00 5,25 – 7,00 28,65
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Legenda: CCO – Ceratocisto odontogênico; TOA – Tumor odontogênico adenomatóide.
64
5.2.1 Correlação das imunoexpressões de Oct4 e CD44
Foram analisadas possíveis correlações entre os escores de imuno-postividade para
Oct4 e CD44 empregando-se o coeficiente de correlação de Spearman (r). No componente
epitelial dos CCOs, ameloblastomas e TOAs, não foram observadas correlações
estatisticamente significativas entre as imunoexpressões das proteínas analisadas (Tabela 05).
Tabela 05. Valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman (r) e significância
estatística (p) para os escores de positividade para Oct-4 e CD44 no componente epitelial, de
acordo com as lesões odontogênicas estudadas. Natal, RN – 2016
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN
OCT4 x CD44 r P
Ceratocisto Odontogênico 0,271 0,248
Ameloblastoma 0,107 0,653
Tumor Odontogênico
Adenomatóide -0,034 0,887
65
Figura 01. Expressão imuno-histoquímica de Oct-4 em ceratocisto odontogênico, evidenciando-
se expressão nuclear nas camadas basal e intermediária (Advance- Panoramic Viewer 20x e
10x).
Figura 02. Expressão imuno-histoquímica de Oct-4 em Ameloblastoma, evidenciando-se
expressão nuclear nas células periféricas e centrais.dos ninhos epiteliais (Advance- Panoramic
Viewer 20x).
66
Figura 03. Expressão imuno-histoquímica de Oct-4 em tumor odontogênico adenomatóide,
evidenciando-se expressão nuclear nas estruturas semelhantes a rosetas e enovelados (Advance-
Panoramic Viewer 5x).
Figura 04. Expressão imuno-histoquímica de CD44 em ceratocisto odontogênico,
evidenciando-se expressão membranar nas células das camadas basal e intermediaria.
(Advance- Panoramic Viewer 10x).
67
Figura 05. Expressão imuno-histoquímica de CD44 em Ameloblastoma, evidenciando-se
expressão membranar nas células periféricas e centrais dos arranjos epiteliais. (Advance-
Panoramic Viewer 10x)
Figura 06. Expressão imuno-histoquímica de CD44 em tumor odontogênico adenomatóide
localizada na porção membranar das células que compõem as estruturas em forma de rosetas e
enovelados (Advance- Panoramic Viewer 10x).
68
DISCUSSÃO
69
6 DISCUSSÃO
As lesões odontogênicas epiteliais dos maxilares constituem um grupo heterogêneo e
diverso de lesões com grande importância clínica (PHILIPSEN; REICHART, 2002;
NEVILLE et al., 2009; CHRYSOMALI et al., 2013). O epitélio odontogênico sob condições
fisiológicas faz parte da formação dos órgãos dentários, mas, também, pode dar origem a
diversos tipos de lesões nos maxilares. Estas lesões são classificadas em cistos e tumores e
estes últimos podem ser benignos ou malignos, com base nos seus comportamentos
biológicos (MISHRA et al., 2015).
O mecanismo patogênico dos TOs está intimamente relacionado com os processos de
desenvolvimento dentário. Para a organogênese dos germes dentários, a indução recíproca
entre mesênquima odontogênico e epitélio odontogênico progride sequencialmente no
processo de diferenciação para odontoblastos a partir do mesênquima odontogênico e
ameloblastos a partir do epitélio odontogênico. O desenvolvimento do dente ocorre a partir da
lâmina dentária e continua em etapas distintas, caracterizadas por alterações morfológicas dos
tecidos envolvidos. Durante estes processos de formação dos dentes, a tumorigênese do
epitélio odontogênico ocorre no estado imaturo dos tecidos odontogênicos, resultando em
diferentes características histológicas e potenciais variáveis para o desenvolvimento do tumor
(LEE et al., 2013).
Os TOs representam lesões derivadas tanto do tecido epitelial quanto do mesenquimal
ou de ambos, os quais participam da formação dentária e correspondem a aproximadamente,
1% de todos os tumores dos maxilares. A prevalência dos TOs está sujeita a alterações
decorrentes dos critérios de classificação de tais lesões, bem como de influências étnicas e
geográficas (DHANUTHAI et al., 2012; SIAR et al., 2012) De acordo com levantamentos
epidemiológicos feitos no México e nos EUA com base na classificação da OMS de 1992
(MOSQUEDA et al., 1997; BUCHNER et al., 2006), os odontomas foram os TOs mais
comuns, seguidos dos ameloblastomas. Por outro lado, em um estudo realizado na Índia
(SRIRAM et al., 2008), usando a mesma classificação da OMS de 1992, verificou-se que o
ameloblastoma foi o TO mais comumente diagnosticado. Pesquisas realizadas utilizando a
classificação da OMS de 2005, feitas na China e Sri Lanka, os autores evidenciaram também
que os ameloblastomas foram os tumores mais frequentes (LUO et al., 2009;
SIRIWARDENA et al., 2012). Porém, em outro extenso estudo de casos na população chinesa
que incluiu o CCO como um TO empregando a denominação de Tumor Odontogênico
Ceratocístico, este indicou que o ceratocisto foi o mais frequente (JING et al., 2007).
70
Na presente pesquisa, foram incluídos 20 casos de CCO, 20 ameloblastomas do tipo
sólido/multicístico e 20 TOA, os quais exibiram seus aspectos histomorfológicos
característicos. Os CCOs apresentaram epitélio com espessura uniforme, superfície corrugada,
paraceratinizada e interface epitélio-conjuntiva plana e cápsula de tecido conjuntivo fibroso, a
qual, em 10 casos (50%) exibia focos de leve ou ausência de infiltrado inflamatório de
predomínio crônico e 10 casos (50%) apresentava infiltrado de moderado a intenso, mas,
ainda assim esses focos não atingiam o tecido epitelial das amostras. O CCO é um cisto
odontogênico de desenvolvimento que se origina a partir de restos epiteliais de lâmina
dentária. Tem sido discutido a natureza neoplásica cística benigna desta lesão, em função da
observação de ocorrência de mutação no gene patched (PTCH) em casos esporádicos e
naqueles casos associados com a Síndrome de Gorlin. As mutações ou perda de
heterozigosidade, no gene PTCH pode levar a desregulação de oncoproteínas que resultam em
efeitos de estimulação na proliferação. Em 2005, o CCO foi designado pela OMS como uma
neoplasia cística benigna, renomeando-o como tumor odontogênico ceratocístico, destacando
seu comportamento agressivo, muitas vezes infiltrativo e o potencial de recorrência. Esta
reclassificação e a nova terminologia continua a ser controversa, e até o momento, não tem
sido consenso universal na aceitação do mesmo como lesão neoplásica e sua nova
denominação (COTTOM et al., 2012).
A histogênese do CCO está relacionada com o desenvolvimento da lâmina dentária e
seus remanescentes específicos após o processo de odontogênese. A frequente presença do
CCO na região posterior ao terceiro molar explica em parte a origem desta lesão a partir da
lâmina dental remanescente, mas isso não explica a presença destas lesões em outras
localizações. Ilhas epiteliais derivadas da lâmina dentária também são encontradas na gengiva
e no ligamento periodontal. Isto pode, em parte, explicar a apresentação clínica periodontal
lateral ou folicular destas lesões. O fato de que estas lesões se desenvolvam seletivamente a
partir dos restos epiteliais de uma ilha epitelial específica, sendo quiescente em outras áreas
com ilhas epiteliais, continua a ser uma das incógnitas desta entidade. A implicação clínica
disso são as recidivas após a remoção de um CCO, onde alguns restos epiteliais podem
permanecer e depois dar origem a uma nova lesão (MENON et al., 2015).
O ameloblastoma representa um dos TOs mais frequentes, sendo de natureza benigna,
mas localmente invasiva, com alto risco de recorrência, desenvolvendo-se exclusivamente nos
maxilares, com notável incidência na região posterior da mandíbula. O tipo clínico-patológico
sólido / multicístico é o tipo mais comum e o mais agressivo, correspondendo aos casos
71
incluídos no presente estudo (BARNES et al., 2005; GOMES et al., 2010; MISHRA et al.,
2015).
De acordo com a literatura especializada, o ameloblastoma origina-se a partir de
células da lâmina dentária que se assemelham as estruturas da fase de capuz / sino do órgão
dentário em desenvolvimento. Na classificação da OMS publicada em 2005, os
ameloblastomas apresentam quatro subtipos com base na localização e histopatologia: sólido /
multicístico (91%), unicístico (6%), extra-ósseo/ periférico (2%) e desmoplástico (1%)
(BARNES et al., 2005). Além disto, estes tumores apresentam padrões histopatológicos
diversos embora a maioria revele os padrões folicular e plexiforme, caracterizados por ilhas
e/ou plexos de epitélio odontogênico do tipo ameloblástico, cujas células basais periféricas
são alongadas e se dispõem em paliçada, assemelhando-se a pré-ameloblastos, e as células na
zona central se assemelham a células do retículo estrelado do órgão do esmalte. As células
tumorais se dispõem no interior de um estroma fibroso que carece de capacidade indutiva para
formar tecido duro. Os casos do presente estudo apresentavam predominantemente os dois
padrões mais constantes: folicular e plexiforme. Em 75% dos casos, foi evidenciada a
presença da associação do padrão folicular com plexiforme; em 13 casos (65%) o padrão
folicular predominava sobre o plexiforme; apenas 2 casos (10%) exibiram predominância do
padrão plexiforme sobre o folicular e em 5 casos (25%) foi evidenciado apenas o padrão
folicular sem associação.
Numerosos estudos têm sido desenvolvidos para explicar a patogênese do
ameloblastoma, sendo sugerida ser multifatorial. Alterações celulares na proliferação,
diferenciação, senescência e tumorigênese ocorrem através da ativação ou inativação das vias
moleculares de sinalização relacionadas aos tecidos que originam esta neoplasia. As
moléculas de sinalização importantes são mais expressas ou subexpressas durante a
tumorigênese dos ameloblastomas. Para explicar sua patogênese têm sido propostas diversas
teorias relacionadas com clonalidade, proliferação, apoptose, genes supressores de tumores,
mecanismos de reabsorção óssea e a participação de MMPs e suas diversas vias de sinalização
(GOMES et al., 2010; MISHRA et al., 2015; MISHRA et al., 2015).
O TOA é uma lesão de origem epitelial odontogênica que foi descrita pela primeira
vez por Driebaldt, em 1907, como um pseudo-adenoameloblastoma. A classificação atual da
OMS (BARNES et al., 2005) o define como um tumor composto de epitélio odontogênico
evidenciando padrões arquiteturais variados em meio a um estroma de tecido conjuntivo
72
maduro (BASKARAN et al., 2011). Muitas vezes é inicialmente diagnosticado como cisto
odontogênico e representa cerca de 1% a 9% de todos os tumores odontogênicos (LEE; KIM,
2013) sendo caracterizado por um crescimento lento, mas progressivo, exibindo um
comportamento biológico indolente. Em comparação com ameloblastomas, o TOA é um
tumor benigno, não-agressivo com crescimento limitado e sem tendência de reincidiva (LEE
et al., 2013). Os casos de TOA incluídos no presente estudo apresentaram as características
histopatológicas típicas, com todos os casos apresentando estruturas espiraladas semelhantes a
rosetas; em 18 casos (90%) foram evidenciadas estruturas semelhantes a ductos, circundadas
em sua maioria por células colunares e núcleo polarizado para o interior das estruturas
pseudoductais e apenas em 3 casos (15%) se observou a presença de estruturas calcificadas.
Tem sido descrito que as neoplasias que surgem a partir de divisão mitótica de uma
única célula somática são definidas como clonais, mesmo se as suas células são
geneticamente divergentes através de uma maior evolução clonal dentro da população de
células clonais originais. De acordo com a teoria da mutação somática da carcinogênese, os
tumores resultam da progénie de uma única célula que adquiriu uma ou mais mutações
somáticas. É amplamente aceito que a maioria das neoplasias tem uma composição
monoclonal. No entanto, um padrão policlonal não exclui a possibilidade de um verdadeiro
processo neoplásico porque neoplasias em estágios iniciais tem sido sugerido para serem
policlonais reativos e, depois, ocorre o desenvolvimento de uma expansão monoclonal
(GOMES et al., 2009b).
Uma série de estudos têm demonstrado a presença de CTT em tumores sólidos e estas
representam uma pequena subpopulação de células neoplásicas no interior da massa tumoral
que compartilham muitas características com CT de tecidos, tais como a auto-renovação e
diferenciação, sendo os principais responsáveis para sustentar o crescimento dos tumores uma
vez que mantêm elevado potencial tumorigênico. Tem sido evidenciado que o ciclo celular
em CTT, assim como nas CT normais é lento, o que confere resistência a terapias que têm
como alvo principalmente células em divisão rápida (TAKAISHI et al., 2009; ALMEIDA et
al., 2016).
A regulação de CT é fundamental para a homeostase e função dos tecidos. Distúrbios
na sua regulação podem levar à proliferação excessiva de células e muitos tumores são
originados e/ou mantidos por CT defeituosas. Marcadores de CT são expressos em muitas
células tumorais e estão envolvidos em várias etapas de formação dessas lesões (JUURI et al.,
2013a). Têm sido identificados vários marcadores de CT principalmente para CTT do câncer,
73
como CD133 e CD44, entre muitos outros. Igualmente, são conhecidos fatores de transcrição
por serem críticos na manutenção da pluripotência de CT embrionárias como, por exemplo, o
Oct4, Nanog e Sox2 (NOZAWA-SUZUKI et al., 2015).
Diversos estudos têm buscado identificar os eventos moleculares responsáveis pelo
desenvolvimento e progressão dos TOs, destacando os de caráter genético e epigenético
(MIGALDI et al., 2008; WANG et al., 2009a; WANG et al., 2009b, JUURI et al., 2013a). No
entanto, pouco se sabe sobre a participação de CT no desenvolvimento destes tumores. Sabe-
se que as CT estão associadas com a formação de alguns tipos tumorais (BASU-ROY et
al.,2012; LIU et al.; 2013). Sabe-se, também, que TOs são derivados de tecidos relacionados
com o germe dentário em desenvolvimento, mas o papel das CT na patogênese destes tumores
não é bem estabelecido e são escassos os estudos com marcadores moleculares para
identificar CT (JUURI et al.,2013a).
Os dentes representam um importante modelo para o estudo do desenvolvimento e
renovação de orgãos ectodérmicos. O processo de odontogênese é regulado por fatores de
transcrição que controlam a expressão dos genes responsáveis por determinar o modo como
as células funcionam e respondem ao ambiente (KETTUNEN et al., 2000; JUURI et al.,
2013b; ABDUWELI et al., 2014). Cunha et al. (2013) avaliaram a expressão de fatores de
transcrição de CT pluripotentes, Oct-4, Sox2, Nanog e Stat-3, na regulação dos nichos de CT
em vários estágios da morfogênese inicial in situ de dentes humanos. Os autores observaram
que todos os fatores de transcrição analisados estavam ativos durante a morfogênese fetal dos
dentes humanos, sendo evidenciados nas populações celulares que proliferam e expressam
marcadores de CT pluripotentes, sugerindo assim apresentar amplas habilidades de potencial
desenvolvimento e diferenciação.
Nas pesquisas realizadas por Juuri et al., (2013b) e Abduweli et al., (2014), estes
autores analisaram o padrão de expressão do fator de transcrição Sox2 em espécies animais
que apresentavam modos diferentes de sucessão dental, confirmando a existência de CT
envolvidas no processo de formação dos órgãos dentários, principalmente no epitélio
odontogênico.
Tem sido sugerido que as células do ameloblastoma originam-se de CT odontogênicas,
que estão localizadas na lâmina dentária dos molares e que são ativadas por oncogenes.
Durante o desenvolvimento dos ameloblastomas, as CT da lâmina dental podem ser alvos
para agentes carcinogênicos ou vírus que impeçam a sua diferenciação normal (HARADA et
al., 2002).
74
Dentre as diversas pesquisas com CT e neoplasias, destacam-se aquelas realizadas em
neoplasias malignas, principalmente em carcinomas. O Oct-4 e o CD44 têm sido demostrados
como importantes marcadores para CTT, por terem um importante papel na histogênese,
patogênese e comportamento das lesões (TSAI et al., 2014; HUANG et al., 2014; FU et al.,
2015; LEE et al., 2015; HABU et al., 2015; SAWANT 2016). Entretanto, estudos sobre CT
em neoplasias benignas são escassos e ainda mais raros em lesões odontogênicas
(KUMAMOTO et al., 2001; HARADA et al., 2002; JUURI et al., 2012a; HEIKINHEIMO et
al.,2015; BILODEAU et al; 2015). Até o momento, não há relatos de pesquisas relativas a
expressão de Oct-4 em lesões odontogênicas e estudos sobre expressão de CD44 nestas lesões
são poucos e na maioria deles, este marcador foi utilizado para ser avaliado como molécula de
adesão (WANG et al., 2009a; WANG et al., 2009b; SATHI et al., 2012; SALEHINEJAD et
al., 2012).
Em um estudo publicado em 2001, Kumamoto et al. demostraram imunoexpressão de
telomerase em ameloblastomas (esta proteína é encontrada apenas em embriões, CT e tumores
malignos). Sugere-se que a atividade da telomerase é crucial para a imortalização celular e
cancerização. Ainda é desconhecido se a atividade da telomerase em ameloblastoma é
mantida desde o início ou se é acumulada no processo de tumorigênese. Todas as 21 amostras
deste estudo foram positivas, sendo a expressão da telomerase detectada nos núcleos das
células neoplásicas, mas não nas células do estroma. Numerosas células colunares ou células
periféricas exibiram imunoexpressão de telomerase, enquanto só algumas células centrais
poliédricas estreladas apresentaram positividade para este anticorpo. Estes resultados sugerem
que a atividade da telomerase está associada com a oncogênese ou potencial proliferativo do
epitélio odontogênico. No presente estudo, da mesma forma que o estudo de Kumamoto et al.
(2001), todos os casos de ameloblastoma foram positivos tanto para o Oct4 quanto para o
CD44, sendo evidenciada alta expressão para Oct-4 e CD44 em 95% e 90% dos casos,
respetivamente. Com relação a localização da imunomarcação, no presente estudo, tanto as
células colunares periféricas quanto as centrais semelhantes ao retículo estrelado do órgão do
esmalte exibiram alta frequência de expressão para ambos os marcadores, o que sugere que
ameloblastomas apresentariam células com características de CT em ambas as localizações.
Harada et al. 2002, retomando informações de pesquisas prévias, sugeriram que a
proteína Bcl-2 desempenha um papel na manutenção da população de CT localizadas nas
camadas periféricas dos ninhos do ameloblastoma, a partir das quais as células em
proliferação podem ser recrutadas, uma vez que a expressão de Bcl-2 se localizava
75
principalmente nas camadas periféricas dos casos de ameloblastomas estudados. A proteína
produzida pelo gene BCL-2 previne a apoptose e é expressa durante o desenvolvimento,
especialmente em locais caracterizados por interações epitélio-mêsenquima. Diferente das
informações citadas por Harada et al. (2002), no presente estudo, os casos de ameloblastoma
exibiram alta positividade para ambos os marcadores em ambas localizações, sugerindo que
talvez existam nichos de CT ou células com características de CT em ambas as localizações.
SOX2 é um marcador de CT e células progenitoras em diversos tecidos e órgãos
epiteliais, incluindo os dentes (ARNOLD et al. 2011; JUURI et al. 2013b), sendo expresso em
epitélio oral embrionário e na lâmina dentária, que apresentam características de CT epiteliais,
mas não nas células epiteliais da bainha de Hertwig participando da formação das raízes nem
nos restos epiteliais de Malassez, que estão presentes após a formação dentária (JUURI et al.
2013a).
Juuri et al. (2013a), avaliaram a expressão do fator de transcrição SOX2 em
ameloblastoma, e constataram expressão nas células epiteliais do ameloblastoma de padrões
folicular e plexiforme, estando localizada também na lâmina dental do desenvolvimento de
molares decíduos humanos. Também foi evidenciada sua expressão em fragmentos de lâmina
dentária associada com os terceiros molares e no epitélio de brotamento da porção posterior,
em camundongos. SOX2 foi associada com a formação dos dentes supranumerários em
tumores semelhantes a odontoma, induzido por ativação da via de sinalização Wnt em
camundongos. Os autores propuseram que as funções de SOX2 mantém o estado progenitor
do epitélio em ameloblastomas e que estes podem ser originários de epitélio da lâmina dental
que expressa SOX2.
Em um estudo de 2015, Heikinheimo et al., avaliaram a expressão de SOX2 em 15
ameloblastomas do tipo sólido/multicístico e 12 CCOs, comparando-os com tecido epitelial
de gengiva normal de adulto. Diferindo dos resultados do estudo de Juuri et al. (2013a),
Heikinheimo et al. (2015) observaram que a imunoexpressão da proteína SOX2 foi negativa
nos casos de ameloblastoma e nas amostras de epitélio gengival normal adulto, enquanto os
casos de CCO exibiram uma notável positividade no epitélio da lesão. Os autores
descreveram que o perfil de diferenciação do CCO parece estar mais próximo do epitélio oral
fetal e da lâmina dentária do que do órgão do esmalte. A elevada expressão de SOX2 em
CCO diferiu daquela evidenciada nos casos de gengiva normal de adulto. Os autores também
sugeriram que o elevado nível de expressão do SOX2 evidenciado em seu estudo indica a
76
presença de características de CT também no epitélio do CCO. No presente estudo, ao avaliar
a expressão Oct-4 e CD44 evidenciou-se que estas exibiram alta expressão na maioria dos
casos, tanto nos ameloblastomas quanto nos CCOs, apoiando a ideia de que também o CCO
possui células com características de CT no epitélio constituinte da lesão.
Bilodeau et al. (2015) avaliaram a expressão e co-expressão de LEF-1 e seu
coativador β-catenina em TOs e tumores de glândula salivar. LEF-1 é um fator de transcrição
nuclear da via Wnt que regula a diferenciação de CT multipotentes da pele e a β-catenina é
considerada um coactivador de transcrição que interage com LEF-1. Nesse estudo, foram
usados 51 TOs, incluindo 13 ameloblastomas, 11 CCO, 3 TOAs e os demais casos
correspondiam a TOs mistos e malignos. Os autores observaram positividade para LEF-1 em
64% (7/11) dos CCO, 15% (2/13) dos ameloblastomas e 33% (1/3) dos TOAs. Não foi
observada nenhuma correlação entre os subtipos histológicos de ameloblastoma e a
positividade de LEF-1. Diferente dos resultados da pesquisa de Bilodeau et al. (2015) que
observaram positividade para LEF-1 em pouco mais da metade dos CCOs, e em baixo
porcentagem dos ameloblastomas e TOAs, no presente estudo, verificamos que os 60 casos da
nossa amostra exibiram positividade para ambos os marcadores (Oct-4 e CD44), em
diferentes porcentuais de positividade e variadas intensidades, mas, na maioria dos casos,
sendo considerados como tendo alta expressão.
Frente a escassez de estudos avaliando a participação de CTT em lesões
odontogênicas, justifica-se a realização de pesquisas utilizando outros marcadores de CTT
para contribuir com novas informações sobre o assunto. Por isto, no presente estudo, foram
utilizados os marcadores Oct4 e CD44 com o objetivo de identificar a presença de células
reativas a estes marcadores em uma série de lesões odontogênicas benignas de origem
epitelial que apresentam naturezas e comportamentos biológicos diversos.
O CD44 representa uma glicoproteina transmembranar, multi-estrutural e multifuncional,
sendo inicialmente identificada como um receptor de AH, participando de processos
fisiológicos e patológicos incluindo a adesão celular, angiogénese e inflamação. Considera-se
que o CD44 se encontra intimamente ligado ao desenvolvimento de vários tumores sólidos,
sendo inicialmente identificado como um receptor para AH e receptor linfócitos-homing, e
pode atuar como uma plataforma especializada para fatores de crescimento e MMPs. Sua
expressão é regulada por diversos fatores extracelulares e intracelulares, sendo um alvo da via
Wnt/ β -catenina. Os estudos moleculares revelaram que a alta expressão de CD44 está
77
correlacionada com os fenótipos de CT cancerosas, sendo crítico na transição epitelio-
mesênquima, contribuindo para a invasão tumoral, metástase, recidiva e quimioresistência.
Também tem sido relatado como sendo um dos principais biomarcadores para isolamento e
caracterização de CTT. Há fortes evidências que sustentam que as CTT impulsionam o
processo de iniciação do tumor e metástase (TAKAISHI et al. 2009; XU et al., 2015).
Wang et al. (2009b), analisando a atividade lítica, migração e invasão do
ameloblastoma, verificaram a imunoexpressão de osteopontina (OPN) em 30 ameloblastomas
(sendo apenas 6 do tipo sólido\multicístico) e a expressão da integrina αv e do CD44v6 em 20
destes 30 ameloblastomas, eles evidenciaram uma taxa de expressão de 90% (18/20) para
CD44v6. Tanto as células semelhantes ao retículo estrelado quanto as semelhantes a
ameloblastos, exibiram alta expressão de OPN e CD44v6, sugerindo que a ligação da OPN ao
receptor de membrana CD44v6 nas células tumorais pode facilitar a migração, invasão e
propagação de ameloblastoma. Tanto em ameloblastomas convencionais como nos
unicísticos, não foi encontrada diferença significativa na intensidade da imunomarcação entre
as células semelhantes ao retículo estrelado do órgão do esmalte e as células semelhantes a
ameloblastos. Os resultados do presente estudo estão em acordo com os achados no estudo de
Wang et. al. (2009 b), onde houve alta expressão de CD44 em porcentagens similares tanto
nas células colunares semelhantes a ameloblastos como nas centrais semelhantes ao retículo
estrelado do órgão do esmalte.
Wang et al. (2009a) avaliaram a imunoexpressão dos mesmos marcadores (OPN,
CD44v6 e integrina αv) em outro estudo utilizando 20 casos de CCO, 8 cistos dentígeros
(CD) e 10 cistos radiculares (CR), sendo avaliadas a motilidade das células, migração,
invasão e propagação e possível contribuição da OPN, integrina αv, e CD44v6 no
comportamento agressivo e capacidade osteolitica local dos CCOs. Os autores encontraram
forte imunomarcação citoplasmática de OPN em células epiteliais do revestimento cístico, em
8 dos 20 CCOs mas não em todos os CDs e CRs. Foi observada uma intensa e difusa
imunomarcação membranar de CD44v6 em quase todas as células do revestimento epitelial
dos CCOs, CDs e CRs. No entanto, a camada epitelial superficial de paraceratina nos CCOs
não mostrou positividade para CD44v6. No presente estudo, a expressão de CD44 foi
membranar, onde em 95% dos casos de CCOs foi constatada alta expressão, apresentando-se
difusa na camada basal, principalmente intensa na camada intermediária e negativa na camada
de paraceratina em 100% dos casos, achados estes semelhantes aos evidenciados no estudo de
Wang et al. (2009 b).
78
Salehinejad et al. (2012) avaliaram a motilidade e migração celular em cistos
odontogênicos com graus diferentes de comportamento biológico, através da análise da
expressão imuno-histoquímica de OPN e CD44v6 em 14 ceratocistos odontogênicos, 14
cistos odontogênicos calcificantes (COCs), 14 CDs e 14 CRs. Foi observada positividade
para ambos os marcadores em todas as células epiteliais do revestimento cístico, com
diferentes graus de imunoexpressão. Os maiores níveis de expressão para OPN e CD44v6
foram encontrados nos CCOs, seguido de COCs, CRs e CDs. A comparação destes
marcadores entre os quatro grupos revelou diferenças significativas (p <0,001). Os autores
sugeriram que um maior nível de expressão de OPN e CD44v6 em células epiteliais de
algumas lesões, como CCO e COC, pode explicar o comportamento localmente agressivo
destas lesões.
Sathi et al. (2012), analisaram a imunoexpressão de três marcadores de CTT (CD133,
CD44 e ABCG2) em 23 casos de ameloblastoma além do marcador de proliferação Ki-67,
sendo evidenciado que em todos os casos os três marcadores de CTT foram expressos. Para
CD133, nove casos (39,13%) apresentaram alta expressão e 14 casos (60,87%) apresentaram
baixa expressão. Para CD44 e ABCG2 doze dos 23 casos (52,17%) apresentaram alta
expressão e 11 casos (47,83%) apresentaram baixa expressão. Foi evidenciado que o Ki-67 foi
expresso principalmente, em células periféricas semelhantes a ameloblastos, o que sugere que
estas células têm um maior grau de diferenciação e, por conseguinte, são menos possíveis de
conter CTT. Por outro lado, as células positivas para os marcadores de CTT situadas na
proximidade de células periféricas foram negativas para o Ki-67 e poderiam representar
potencialmente células-tronco tumorais. Analisando a correlação entre a expressão dos
marcadores de CTT com características clínicopatológicas e a expressão para o Ki-67, apenas
a expressão de CD44 esteve correlacionada com a recorrência do tumor (p = 0,0391). Estes
autores sugeriram que a positividade para estes marcadores de CT em ameloblastomas estão
possivelmente envolvidos na proliferação celular, progressão tumoral e recorrência. No
presente estudo, 90% dos casos apresentaram alta expressão para CD44 e apenas 10%
exibiram baixa expressão. Diferindo dos achados da pesquisa de Sathi et al. (2012), foi
observado, em nosso estudo, que células positivas para o CD44 nos casos de ameloblastoma
foram positivas em proporções semelhantes tanto as células periféricas semelhantes a
ameloblastos quanto as centrais poliédricas, semelhantes ao retículo estrelado do órgão de
esmalte.
79
O Oct4 representa um membro da família de fatores de transcrição de domínio POU
que é expresso em CT embrionárias, células germinativas e CT adultas, esse fator de
transcrição tem sido associado com a pluripotencialidade, capacidade proliferativa e de auto-
renovação, propriedades observadas em CTE e células germinativas. Ele é expresso em vários
tipos de câncer, incluindo câncer de mama, câncer colorretal, bem como câncer de cabeça e
pescoço e está associado com a progressão do tumor (HUANG et al. 2014).
Diversos estudos em carcinoma oral demostraram alta expressão de Oct-4 nas células
tumorais (HUANG et al., 2014; QIAO et al., 2014; FU et al., 2015). Qiao et al. (2014),
realizando estudo imuno-histoquímico empregando Oct-4 e Sox2 para avaliar carcinogênese,
verificaram que o Oct4 foi expresso em mucosa oral normal, lesões pré-malignas, sítios
primários de carcinoma epidermóide e locais de metástase de carcinoma epidermóide.
Segundo estes autores, o perfil de expressão Oct4 + Sox2+ pode contribuir para evidenciar a
transformação maligna de mucosa oral. Huang et al. (2014) analisaram os níveis de expressão
imuno-histoquímica das proteínas ALDH1, CD44, OCT4 e SOX2 em 66 amostras de
carcinoma de língua, investigando as relações entre as expressões de marcadores de CT e o
prognóstico. Os autores evidenciaram, através do teste de correlação de Spearman, que a co-
expressão de CD44 e Oct-4 não foram significativamente correlacionados.
No presente estudo, feita a análise de correlação entre as imunoexpressões de Oct4 e
CD44 nos casos de lesões odontogênicas epiteliais benignas, não foi evidenciada correlação
estatisticamente significativa. Isto poderia indicar que a co-expressão destes dois marcadores
não seria apropriada para avaliar a presença de células-tronco neste tipo de lesões, não
obstante, a expressão individual indique a presença de células com características troncais e a
sua possível participação na histogênese e diferenciação em lesões odontogênicas epiteliais
benignas.
O perfil de expressão de ambos os marcadores evidenciado nos casos de CCO sugere a
presença de células com características de CT em apenas algumas células da camada basal,
sendo altamente expressa na camada intermediária e aparentemente perdendo esse potencial
na mudança para paraceratina, na camada superficial.
No ameloblastoma, o perfil de expressão dos marcadores empregados na presente
pesquisa sugere que estas CT se encontrariam em áreas irregulares, tanto nas células
periféricas colunares quanto nas células poliédricas semelhantes ao retículo estrelado do órgão
do esmalte e também em áreas sólidas do parênquima do tumor.
80
Com relação aos resultados evidenciados nos casos de TOA, o perfil de expressão dos
mesmos marcadores sugere que as prováveis CT se encontrariam em nichos bem localizados
nas estruturas espiraladas semelhantes a rosetas e enovelados celulares, sendo também
encontradas nas estruturas semelhantes a ductos, característicos desta lesão.
Tomando em consideração as características de Oct-4 e CD44 como marcadores de
CT e os achados da presente pesquisa, pode-se deduzir que as lesões epiteliais benignas que
se desenvolvem a partir de tecidos odontogênicos primitivos, apresentam células com
características de CT, contudo o papel que desenvolvem nas lesões benignas odontogênicas
permanece incompletamente compreendido, necessitando de outras pesquisas empregando
diversas metodologias que possam contribuir para maior entendimento da participação destas
células nas referidas lesões.
Numerosos estudos têm demostrado a presença de CT no câncer. Na presente
pesquisa, verificamos a presença da destas células através da imunopositividade para os
marcadores em lesões benignas de naturezas e comportamentos diversos. Portanto, é possível
sugerir que talvez existam fatores (moleculares, genéticos e epigenéticos) que regulem e
estabilizem as CT nas lesões benignas possibilitando que elas não progridam para um
processo de desdiferenciação e, consequentemente, atinjam um genótipo e fenótipo maligno.
81
CONCLUSÕES
82
7 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:
Observou-se alta imunoexpressão para ambos os marcadores (Oct-4 e CD44) nas
células epiteliais das três lesões estudadas. Este achado confirma a presença e a
provável participação destas proteínas nas funções conhecidas para cada uma delas e,
por conseguinte, que as lesões incluídas no estudo apresentam células com
características de CT, sugerindo a presença de tipos celulares com características de
CT em CCOs, ameloblastomas e TOAs, os quais poderiam contribuir para o
desenvolvimento e a diferenciação celular nestas lesões odontogênicas epiteliais
benignas.
Não foi evidenciada diferença estatisticamente significativa na imunoexpressão de
Oct-4 entre CCO, Ameloblastoma e TOA. Portanto, sugere-se que embora as 3 lesões
apresentem naturezas e comportamentos diferentes, todas apresentam numerosas
células com características de potenciais CT.
Foi evidenciada diferença estatisticamente significativa na expressão
imunohistoquímica de CD44 entre o CCO quando comparado com o Ameloblastoma e
o TOA em relação às medianas dos escores de positividade.
Não foi observada correlação entre as imunoexpressões de Oct-4 e CD44 em nenhuma
das 3 lesões estudadas.
83
REFERÊNCIAS
84
REFERÊNCIAS
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2014.
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93
ANEXO
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PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP
DADOS DO PROJETO DE PESQUISA
Título da Pesquisa: ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE MARCADORES DE CÉLULAS-TRONCO
TUMORAIS EM LESÕES ODONTOGÊNICAS EPITELIAIS BENIGNAS
Pesquisador: LÉLIA BATISTA DE SOUZA
Área Temática:
Versão: 1
CAAE: 47388115.6.0000.5537
Instituição Proponente: Pós-Graduação em Patologia Oral
Patrocinador Principal: Financiamento Próprio
DADOS DO PARECER
Número do Parecer: 1.168.505
Data da Relatoria: 31/07/2015
Apresentação do Projeto:
Este projeto de pesquisa corresponde a um projeto de mestrado associado ao programa de pós-graduação
em patologia oral.
O projeto está bem estruturado, e corresponde a um projeto de impacto, pois visa abordar o tema associado
com diversas lesões dos maxilares que se originam dos tecidos associados com a produção e
desenvolvimento dos dentes ou dos restos desses processos. As mais frequentes são aquelas que se
desenvolvem do tecido epitelial, as quais, do ponto de vista biológico podem ser císticas, hamartomatosas e
neoplásicas. Dentre este grupo destacam-se o ceratocisto odontogênico, o tumor odontogênico
adenomatoide e o ameloblastoma. A provável origem desses tumores é o epitélio odontogénico. Acredita-se
que diversas lesões malignas e também benignas originam-se de células-tronco e no caso do ameloblastoma
e ceratocisto odontogênico, de células-tronco odontogênicas presentes na lâmina dentária remanescente. As
células-tronco tem a capacidade de passar por diversas alterações oncogênicas requeridas para
carcinogênese. Estas CTs transformadas seriam chamadas de células-tronco tumorais (CTT) e seriam
responsáveis pela iniciação e expansão do crescimento tumoral além de apresentar uma capacidade de
diferenciação, regeneração e auto-renovação. Em tumores benignos também estão presentes, um
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grande número de CTT, as quais têm grandes implicações no desenvolvimento desses tumores. Devido a
tudo isto, é de extrema importância identificar estas células e caracterizar as vias moleculares que as
mantém. O Oct4 é um fator de transcrição chave que promove a expressão de genes específicos de células
tronco embrionárias possui um papel altamente conservado na manutenção da pluripotência de populações
celulares, regula a sua própria expressão, e serve como marcador útil de pluripotência. A baixa condição de
oxigênio desempenha um papel muito importante na manutenção da potencialidade das células tronco. A
pluripotência delas é regulada pela família de fatores induzíveis de hipóxia (HIFs), que são dependentes de
tensões de oxigênio. O HIF-2 é um regulador positivo de Oct4, que é um dos principais fatores de transcrição
utilizados para gerar a indução inicial das células tronco pluripotentes.
Objetivo da Pesquisa:
O presente trabalho de pesquisa tem como objetivo identificar, quantificar e comparar a expressão imuno-
histoquímica do Oct4 como marcador de células-tronco, em diferentes lesões odontogênicas epiteliais
benignas (Ceratocisto odontogénico, ameloblastoma e tumor odontogénico adenomatoide) bem como avaliar
a imuno-expressão de HIF2 como regulador do Oct4, relacionando suas expressões com as características
histomorfológicas das lesões estudadas, avaliando seu possível papel na patogênese e comportamento
biológico variado exibido pelas lesões constantes do estudo.
Avaliação dos Riscos e Benefícios:
Os riscos são considerados mínimos pois irão utilizar biopsias já coletadas e armazenadas no arquivo da
disciplina de patologia oral. Os benefícios serão indiretos para os participantes, mas são importantes para a
pesquisa e ciência.
Comentários e Considerações sobre a Pesquisa:
O projeto de pesquisa está bem estruturado, e irá utilizar biopsias já coletadas do total de 60 participantes,
sendo 20 para cada classe analisado. O impacto desta pesquisa está associado em contribuir para a melhor
compreensão das células-tronco em lesões odontogênicas epiteliais e também determinar o seu papel
nestas lesões através do estudo da expressão imuno-histoquímica do seu regulador HIF-2.
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Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória:
Todos os termos de apresentação obrigatória foram apresentados e estavam adequados.
Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações:
Após análise do protocolo de pesquisa e documentos relacionados, O CEP Central/UFRN verificou que o
referido protocolo, encontra-se adequadamente instruído, obedecendo as diretrizes éticas regulatórias par a
pesquisas envolvendo seres humanos no país e, por esse motivo, recebe parecer de APROVADO.
Situação do Parecer:
Aprovado
Necessita Apreciação da CONEP:
Não
Considerações Finais a critério do CEP:
Em conformidade com a Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde - CNS e Manual Operacional
para Comitês de Ética - CONEP é da responsabilidade do pesquisador responsável:
1. elaborar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE em duas vias, rubricadas em todas as
suas páginas e assinadas, ao seu término, pelo convidado a participar da pesquisa, ou por seu representante
legal, assim como pelo pesquisador responsável, ou pela (s) pessoa (s) por ele delegada(s), devendo as
páginas de assinatura estar na mesma folha (Res. 466/12 - CNS, item IV.5d);
2. desenvolver o projeto conforme o delineado (Res. 466/12 - CNS, item XI.2c);
3. apresentar ao CEP eventuais emendas ou extensões com justificativa (Manual Operacional para Comitês
de Ética - CONEP, Brasília - 2007, p. 41);
4. descontinuar o estudo somente após análise e manifestação, por parte do Sistema CEP/CONEP/CNS/MS
que o aprovou, das razões dessa descontinuidade, a não ser em casos de justificada urgência em benefício
de seus participantes (Res. 446/12 - CNS, item III.2u) ;
5. elaborar e apresentar os relatórios parciais e finais (Res. 446/12 - CNS, item XI.2d);
6. manter os dados da pesquisa em arquivo, físico ou digital, sob sua guarda e responsabilidade, por um
período de 5 anos após o término da pesquisa (Res. 446/12 - CNS, item XI.2f);
7. encaminhar os resultados da pesquisa para publicação, com os devidos créditos aos pesquisadores
associados e ao pessoal técnico integrante do projeto (Res. 446/12 - CNS, item XI. 2g) e,
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8. justificar fundamentadamente, perante o CEP ou a CONEP, interrupção do projeto ou não publicação dos
resultados (Res. 446/12 - CNS, item XI.2h).
NATAL, 03 de Agosto de 2015
_______________________________________
Assinado por:
LÉLIA MARIA GUEDES QUEIROZ
(Coordenador)