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Análise da superexpressão de chaperonas moleculares de cana-de-açúcar em Arabidopsis thaliana como
modelo para o estudo da influência destas proteínas na produção de biomassa
Aluna: Danieli Cristina GonçalvesOrientador: Carlos Ramos – Instituto de Química (IQ)Co-orientador: Gonçalo Pereira – Instituto de Biologia (IB)
MARÇO/2010
Tópicos AbordadosTópicos Abordados
• Introdução– Chaperonas– Chaperonas e Plantas– Produção de Biomassa
• Resultados anteriores• Objetivos• Metodologia• Resultados• Próximos passos
AsAs ChaperonasChaperonas
• Proteína – estrutura tridimensional!!• Ambiente celular não favorece o
enovelamento e estabilidade…• Chaperonas:
– Ligação e estabilização– Translocação– Desagregação– Renovelamento– Entrega para proteólise
CONTROLE DE
QUALIDADE
AsAs ChaperonasChaperonas
• Regulação de vias!!– Função protéica (correto enovelamento)– Disponibilidade (estabilidade e degradação)
• Expressão: estresse e constitutiva!• Classificadas em famílias, de acordo a massa
molecular– Muito conservada entre eucariotos
AsAs ChaperonasChaperonas
Adaptado de Borges & Ramos, 2005
ChaperonasChaperonas ee PlantasPlantas
• Organismos sésseis– Estresses ambientais: temperatura, salinidade,
metais pesados, deficiência hídrica.– Sobrevivência e produtividade!!
FormaçãoFormação dada MadeiraMadeira
• Xilogênese– Divisão, expansão, deposição de parede
lignificada e morte celular.– Expressão diferencial espacial e temporal
• Qualidade da madeira:– Dimensão dos elementos anatômicos, balanço
dos constituintes (celulose, hemicelulose, lignina)
FormaçãoFormação dada MadeiraMadeira
Adaptado de Hertzberg et al, 2001
FormaçãoFormação dada MadeiraMadeira
• Qual o papel das chaperonas neste processo??
– Chaperonas são mais expressas na diferenciação do xilema do que em outros tecidos;
– Expressão de smHsp diminuída em resposta a compressão mecânica (+ lignina);
– Chaperonas Hsp70, Hsp60, Hsp90 e smHsps com maior nível de expressão no xilema de Eucalyptus;
EucalyptusEucalyptus
• Espécies do gênero Eucalyptus - plantações industriais– E. grandis e E. urophyla – rápido
crescimento e adaptabilidade– E. globulus – alto teor de celulose e
menor conteúdo de ligninas– E. pellita - menor valor comercial; alto
conteúdo de ligninas
ResultadosResultados AnterioresAnteriores
• Genolyptus:– Maior expressão de Hsp70 e smHsp no xilema de E.
globulus• Microarranjos:
– Hsp100 e Hsp90 com maior expressão no xilema de E. globulus
• cDNAs chaperonas:– Proteínas já expressas em E. coli;– Caracterização biofísica realizada;
ResultadosResultados AnterioresAnteriores
• Identidade entre as proteínas:– smHsp - 70%– Hsp70 - 94%– Hsp100 - 85%– Hsp90 - 92%
ObjetivosObjetivos
• Análise do banco Genolyptus:– Perfil da expressão de chaperonas e co-chaperonas nas
diferentes espécies e tecidos
• Superexpressão as chaperonas Hsp100, Hsp82, Hsp70 e smHsp (de cana de açúcar) em planta-modelo (Arabidopsis thaliana)
MetodologiaMetodologia
• Como controle negativo, utilizaremos o vetor ‘vazio’
Subclonagem dos cDNAs em vetor binário
Transformação de A. thaliana
Cultivo de A. thaliana
Avaliação dos efeitos da
superexpressão
Fenótipo
Anatomia
Composição
Metodologia:Metodologia: SubclonagemSubclonagempET28a-HSP PCR HSP pGEM-HSP
Metodologia:Metodologia: TransformaçãoTransformação
• Via A. tumefaciens.• Transformação in planta:
solução contendo A. tumefaciens borrifada sobre plantas no estágio inicial de florescimento
MetodologiaMetodologia: AvaliaçãoAvaliação dosdos transgênicostransgênicos
• Fenotípica
• Anatomia do caule– Coloração com Safranina-O e Azul de Astra: conteúdos de
celulose e lignina e distribuição no tecido
• Composição– Ligninas e carboidratos – dosagem e HPLC
Fonte: Srebotnik & Messner, 1994
ResultadosResultados
• Construção do ‘vetor vazio’
35S Poli A
pCAMBIA
1539 / 7914 1370 / 8083
1000
2000
5000
ResultadosResultados
• Subclonagem da Hsp82– PCR OK!– Ligação no pGEM OK!
• pGEM – 3000 pb• Hsp82 – 2100 pb
– Sequenciamento OK!– Ligação no pRT100
pGEM-Hsp821 2 3 4 M
1000
2000
3000
5000
Legenda:
1) Não digerido
2) XhoI e BamHI
3) BamHI
4) XhoI
ResultadosResultados
• Cultivo de A. thaliana– Problemas com o subtrato;
PróximosPróximos PassosPassos
• Finalizar a subclonagem da Hsp82• Iniciar a subclonagem das outras Hsps• Transformar A. thaliana• Análises:
– Fenotípicas– Anatômicas– Químicas
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Obrigada!!