Aneta Gerszberg i Andrzej K. KononowiczAneta Gerszberg i Andrzej K. Kononowicz

Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej RoślinZakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej RoślinUniwersytet ŁódzkiUniwersytet Łódzki

Molekularna uprawaMolekularna uprawa

Termin molekularna uprawa (ang. Termin molekularna uprawa (ang. molecular farmingmolecular farming), ), odnosi się do produkcji na masową skalę (uprawy polowe) odnosi się do produkcji na masową skalę (uprawy polowe) rekombinowanych białek przez rośliny. Możliwość rekombinowanych białek przez rośliny. Możliwość wykorzystania roślin jako systemów produkcyjnych dla wykorzystania roślin jako systemów produkcyjnych dla białek o znaczeniu farmakologicznym została wykazana białek o znaczeniu farmakologicznym została wykazana w drugiej połowie lat 90’.w drugiej połowie lat 90’.

Molekularna uprawa poprzedzona jest identyfikacją białka Molekularna uprawa poprzedzona jest identyfikacją białka o pożądanej aktywności terapeutycznej czy o pożądanej aktywności terapeutycznej czy diagnostycznej, jego analizą na poziomie molekularnym diagnostycznej, jego analizą na poziomie molekularnym i wreszcie jego ekspresją w heterologicznym systemie i wreszcie jego ekspresją w heterologicznym systemie komórkowym.komórkowym.

Zalety molekularnej uprawyZalety molekularnej uprawy

� możliwość otrzymania materiału roślinnego na masową skalę przy niskich kosztach produkcji;

� opracowanie skutecznych technik transformacji oraz regeneracji in vitro;� obecność eukariotycznych szlaków biosyntezy białek, co pozwala na uzyskanie

prawidłowego produktu białkowego;� uzyskanie bezpiecznego produktu; nie istnieje bowiem niebezpieczeństwo

zakażenia człowieka takimi patogenami jak wirus HIV, priony czy wirus żółtaczki;� pominięcie lub uproszczenie procedury oczyszczania produktu białkowego;

tkanki mogą być wykorzystane jako jadalne szczepionki;� docelowe kierowanie białek do wewnątrzkomórkowych przedziałów np.

chloroplastów (transformacja chloroplastów minimalizuje ryzyko horyzontalnego transferu genów oraz umożliwia akumulację produktu białkowego do poziomu 46% całkowitego rozpuszczalnego białka; gwarantuje stabilną ekspresję transgenu).

Wady molekularnej uprawyWady molekularnej uprawy

� niewłaściwe wstawienie, integracja genu i w konsekwencji ograniczenie jego ekspresji; możliwość potranskrypcyjnego wyciszenia genu,

� wtórny i pleiotropowy efekt ekspresji genu,� obecność roślinnych specyficznych glikanaz (np. α-1,3-fukozy czy

β-1,2-ksylozy), które mogą zmieniać właściwości rekombinowanych białek w roślinach,

� indukcja insercyjnej mutagenezy będącej wynikiem integracji transgenu w obszarze endogennego genu;

� horyzontalny transfer genów (złamanie barier międzygatunkowych wśród roślin za pośrednictwem transgenicznego pyłku)

Roślinne kultury tkankowe w produkcji Roślinne kultury tkankowe w produkcji rekombinowanych białekrekombinowanych białek

� zawiesiny komórkowe� kultury korzeniowe� kultury somatycznych zarodków

Lista wybranych biofarmaceutyków Lista wybranych biofarmaceutyków produkowanych przy wykorzystaniu systemów produkowanych przy wykorzystaniu systemów

roślinnychroślinnych

< 0,01 %Czynnik wzrostuTytońZabliźnianie ran

< 0,01 % świeżej masy

Homotrimeryczny kolagenTytońKolagen

0,30 %HirudynaRzepakInhibitor trombiny

0,02 %AlbuminaTytońOparzenia, operacje chirurgiczne

7,00 % SomatotropinaTytońHormon wzrostu

0,10 %LaktoferynaZiemniakAntybakteryjne

-AprotyninaKukurydzaInhibitor trypsyny dla

zabiegów transplantacyjnych

-< 0,01 % świeżej

masy

Interferon αInterferon β

RyżTytoń

Zapalenie wątroby typu B i C

Poziom ekspresjiBiałkoRoślina

transgenicznaPotencjalne

zastosowanie

Białka i enzymy przemysłowe uzyskiwane Białka i enzymy przemysłowe uzyskiwane z roślin transgenicznychz roślin transgenicznych

� awidyna, lakaza, trypsyna i β-glukuronidaza produkowane w transgenicznej kukurydzy,

� laktoferyna i β-kazeina produkowane w transgenicznych ziemniakach,

� bakteryjna celulaza produkowana w Arabidopsis thaliana,� ksylanaza grzybowa produkowana w rzepaku i tytoniu,� fitaza produkowana w rzepaku,� hirudyna w połączeniu z oleozyną produkowaną w rzepaku

StafylokinazaStafylokinaza

Obecnie do produkcji stafylokinazy wykorzystuje się różnorodne sObecnie do produkcji stafylokinazy wykorzystuje się różnorodne systemy ystemy ekspresyjne np. ekspresyjne np. Escherichia coli, Escherichia coli, ProteusProteus mirabilis, Pichia pastoris, Bacillus mirabilis, Pichia pastoris, Bacillus subtilissubtilis..

Stafylokinaza jest białkiem wytwarzanym i wydzielanym przez niekStafylokinaza jest białkiem wytwarzanym i wydzielanym przez niektóre tóre szczepy szczepy Staphyloccocus aureusStaphyloccocus aureus, a także , a także S. S. epidermidis, , S. lentus, S. S. lentus, S. sciurisciuri, , S. lugdunensis, S. xylosus, S. hominis.S. lugdunensis, S. xylosus, S. hominis.

Model aktywacji plazminogenu przez stafylokinazęwg. Collen i Lijnen, 1993.

1.1. nieaktywny kompleks Plg nieaktywny kompleks Plg –– SakSak

2.2. generowanie aktywnej plazminy ze generowanie aktywnej plazminy ze stafylokinazą Pli stafylokinazą Pli –– SakSak

3.3. wytwarzanie aktywnej plazminywytwarzanie aktywnej plazminy

[3][3]

[1][1][2][2]

PliPli

Plg + SakPlg + Sak Plg Plg -- SakSak Pli Pli -- SakSak

PlgPlg

W toku naszych dotychczasowych badań skonstruowaliśmy transgeniczne rośliny ziemniaka (Solanum tuberosum cv. Desireé) produkujące białko fuzyjne recSAK-mGFP-GUS, którego domena recSAK wykazuje właściwości amidolityczne, charakteryzujące bakteryjną stafylokinazę.

Do transformacji wykorzystano szczep AGL1 Agrobacterium tumefaciens, ze zrekombinowanym plazmidem pCAMBIA1304 zawierającym fuzję genową stafylokinazy i genów reporterowych, pod kontrolą promotora CaMV 35S.

Nośnikiem zrekombinowanego genu stafylokinazy był plazmid binarny pCAMBIA 1304 (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, Canberra, Australia). W odcinku T-DNA tego plazmidu znajduje się roślinny gen selekcyjny odporności na higromycynę oraz marker reporterowy w postaci fuzji genowej mgfp5-gusA-His6.

� Transformacja Solanum tuberosum za pośrednictwem A. tumefaciens.� Histochemiczna analiza poziomu ekspresji β-glukuronidazy.� Histochemiczna analiza aktywności β-glukuronidazy in situ.� Izolacja genomowego DNA z tkanki S. tuberosum.� Amplifikacja DNA techniką PCR.� Rozdziały elektroforetyczne w żelach agarozowych.� Izolacja białek z tkanki przetransformowanych roślin S. tuberosum.� Analiza Western blot oraz elektroforeza białek (SDS-PAGE).� Test na aktywność amidolityczną ekstraktu białkowego

z transgenicznych roślin S. tuberosum.

METODYMETODY

A B

C D

E F

G H

1 mm 1 mm

1 mm

1 mm

2 mm 2 mm

2 cm

1 mm

Kolejne etapy regeneracji Solanum tuberosum cv. Desireé po transformacji

Agrobacterium tumefaciens

A i B A i B –– różnicująca się tkanka różnicująca się tkanka kalusowakalusowa

C C –– G G –– formujące się roślinkiformujące się roślinki

H H –– transformant na pożywce transformant na pożywce selekcyjnejselekcyjnej

A B

Regeneranty Solanum tuberosum

A A –– roślina kontrolna (z lewej), roślina transgeniczna (z prawej)roślina kontrolna (z lewej), roślina transgeniczna (z prawej)

B B –– rośliny transgenicznerośliny transgeniczne

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Elektroforegram produktów amplifikacji sekwencji kodującej stafylokinazę na matrycy genomowego DNA

S. tuberosum, po transformacji A. tumefaciens.

kanał 1 – wzorzec mas kanał 7 – S24kanał 2 – roślina kontrolna kanał 8 – S25kanał 3 – S5 kanał 9 – S26 kanał 4 – S7 kanał 10 – S27kanał 5 – S13 kanał 11 – S28kanał 6 – S23

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Elektroforegram produktów amplifikacji sekwencji kodującej stafylokinazę na matrycy genomowego DNA Solanum tuberosum po transformacji A. tumefaciens.

kanał 1 – wzorzec maskanał 2 – roślina kontrolna kanał 3 – S6kanał 4 – S8 kanał 5 – S9kanał 6 – S17 kanał 7 – S18kanał 8 – S19 kanał 9 – S21kanał 10 – S22

Histochemiczna analiza aktywności β-glukuronidazy

w zregenerowanych roślinach Solanum

tuberosum.

C1 mm

A1 mm B1 mm

A – kontrola negatywnaB – roślina GUS-pozytywna C-D – przykłady chimeryzmu genu gusA w tkankachS. tuberosumE-F – mikroskopowa detekcja ekspresji GUS

D1 mm

E200 µµµµm 100 µµµµm F

Analiza Western blotAnaliza Western blot

A A –– elektroforeza białekelektroforeza białekkanał 1 kanał 1 –– wzorzec maswzorzec maskanał 2kanał 2-- SS66

kanał 3 kanał 3 –– roślina kontrolnaroślina kontrolnakanał 4 kanał 4 –– SS88

kanał 5 kanał 5 –– SS99

B B –– Western blotWestern blotkanał 4 kanał 4 –– SS88

kanał 5 kanał 5 –– SS99

119 kDa97,4 kDa

1 2 3 4 5

A

2 3 4 5

B

Aktywność amidolityczna stafylokinazyAktywność amidolityczna stafylokinazy

Kontrola Transgeniczne rośliny

WNIOSKIWNIOSKIKonstrukcja transgenicznych roślin Konstrukcja transgenicznych roślin Solanum tuberosumSolanum tuberosum

produkujących białko fuzyjne SAKprodukujących białko fuzyjne SAK--mGFPmGFP--GUSAGUSA��analiza PCR wykazaanaliza PCR wykazałła obecnoa obecnośćść sekwencji sekwencji saksak bbęęddąącej elementem cej elementem transgenu CaMV::transgenu CaMV::saksak--mgfpmgfp--gusA gusA w genomowym DNA 22,5% w genomowym DNA 22,5% zregenerowanych rozregenerowanych rośślinlin Solanum tuberosum,Solanum tuberosum,��ekspresja biaekspresja białłka fuzyjnego SAKka fuzyjnego SAK--mGFPmGFP--GUSA zostaGUSA zostałła potwierdzona a potwierdzona testem histochemicznym na aktywnotestem histochemicznym na aktywnośćść ββ--glukuronidazy,glukuronidazy,��analiza Western blot ujawnianaliza Western blot ujawniłła obecnoa obecnośćść stafylokinazystafylokinazy w ekstrakcie w ekstrakcie biabiałłkowym z dwkowym z dwóóch na szech na sześćść analizowanych roanalizowanych rośślin,lin,�� w preparacie biaw preparacie białłkowym tylko jednej z dotychczas zbadanych rokowym tylko jednej z dotychczas zbadanych rośślin, lin, stwierdzono aktywnostwierdzono aktywnośćść amidolitycznamidolitycznąą charakteryzujcharakteryzująąccąą stafylokinazstafylokinazęę,,��rozbierozbieżżnonośści pomici pomięędzy wynikami analiz PCR, aktywnodzy wynikami analiz PCR, aktywnośścici GUSGUS, , Western blot i aktywnoWestern blot i aktywnośści amidolitycznej ekstraktci amidolitycznej ekstraktóów biaw białłkowych kowych wskazujwskazująą na wysokie prawdopodobiena wysokie prawdopodobieńństwo u otrzymanych rostwo u otrzymanych rośślin lin transgenicznych z jednej strony uszkodzetransgenicznych z jednej strony uszkodzeńń lub rearanlub rearanżżacji transgenu,acji transgenu,z drugiej zaz drugiej zaśś –– na mona możżliwoliwośćść zakzakłłóóceceńń w ekspresji genw ekspresji genuu i aktywnoi aktywnośści ci jego produktu biajego produktu białłkowegokowego

PODSUMOWANIE

Niniejsza praca dostarczyła po raz pierwszy eksperymentalnych dowodów na możliwość wprowadzenia do roślin genu kodującego stafylokinazę, jego ekspresję w otrzymanych roślinach oraz uzyskania tą drogą produktu białkowego wykazującego właściwości amidolityczne.

Praca ta dowodzi możliwości wykorzystania roślin jako naturalnych bioreaktorów do produkcji rekombinowanej stafylokinazy, białkowego aktywatora plazminogenu, preparatu białkowego do wykorzystania w terapii chorób układu krążenia krwi u człowieka, spowodowanych wewnątrznaczyniowymi zakrzepami.

Aneta GerszbergAneta Gerszberg

Aneta Aneta WiktorekWiktorek--SmagurSmagur Katarzyna HnatuszkoKatarzyna Hnatuszko

Piotr ŁuchniakPiotr Łuchniak Joanna Joanna KaźmierczakKaźmierczak

Tomasz SakowiczTomasz Sakowicz

Janusz SzemrajJanusz Szemraj Tadeusz PietruchaTadeusz Pietrucha

Uniwersytet MedycznyUniwersytet Medyczny

Uniwersytet ŁódzkiUniwersytet Łódzki

Andrzej K. KononowiczAndrzej K. Kononowicz