ankara Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ yÜksek...
TRANSCRIPT
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
POLİSİKLİK AROMATİK HİDROKARBON(PAH)’LARDAN BENZO(A)PİRENİN
SIZMA, RİVİERA ve PRİNA ZEYTİNYAĞLARINDA BELİRLENMESİ
Zehra BALOĞLU
Danışman: Prof. Dr. Ali BAYRAK
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ANKARA
2005
Her hakkı saklıdır
Prof. Dr. Ali BAYRAK danışmanlığında, Zehra BALOĞLU tarafından hazırlanan bu
çalışma 11/02/2005 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Gıda Mühendisliği Anabilim
Dalı’nda Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan: Prof. Dr. Ali BAYRAK İmza:
Üye: Prof. Dr. Aziz TEKİN İmza:
Üye: Doç Dr. Dilek SİVRİ İmza:
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof. Dr. Metin OLGUN
Enstitü Müdürü
i
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
POLİSİKLİK AROMATİK HİDROKARBON(PAH)’LARDAN BENZO(A)PİRENİN SIZMA, RİVİERA ve PRİNA ZEYTİNYAĞLARINDA BELİRLENMESİ
Zehra BALOĞLU
Ankara Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Ali BAYRAK
Bu çalışma, 20 adet naturel sızma zeytinyağı, 20 adet riviera zeytinyağı ve 10 adet rafine prina yağında bulunan benzo(a)piren (BaP) miktarlarını belirlemek amacıyla yapılmıştır. Örneklerin hazırlanmasında silika kartuş kullanılmış ve katı faz ekstraksiyonu yapılmıştır. Analizler fluoresans dedektörü ile kombine edilmiş HPLC cihazında yapılmıştır. Yöntemde ortalama geri alma oranı % 76,08 ± 1,49, tespit edilebilir en düşük miktar 0,3 µg/kg olarak belirlenmiştir. Bu bilgiler, yöntemin zeytinyağlarındaki BaP miktarının belirlenmesinde rutin olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Analizi yapılan naturel sızma zeytinyağı örneklerinin 3’ünde 0,330 µg/kg ile 0,870 µg/kg arasında BaP tespit edilmiştir. Bu örnekler için ortalama BaP miktarı 0,539 ± 0,167µg/kg’dır. Riviera zeytinyağının 8’inde tespit edilebilir düzeyde BaP kalıntısına rastlanmazken, 12’sinde 2,465 µg/kg seviyesine kadar BaP bulunmuştur. BaP tespit edilen örneklerde ortalama miktar 0,737 ± 0,192 µg/kg olarak saptanmıştır. Prina yağlarının çoğunda yüksek miktarlarda BaP bulunmuştur. BaP tespit edilen 7 örnekte ortalama miktar 31,472 ± 7,42 µg/kg (en az: 0,460 µg/kg, en çok: 58,241 µg/kg)’dır. Naturel sızma zeytinyağı, riviera zeytinyağı ve prina yağlarının ortalamaları arasındaki farklılıkların irdelenmesinde varyans analizi tekniği kullanılmış ve ortalamalar arasındaki farkların önemli olduğu saptanmıştır. Farklı yağ gruplarının tespitinde ise DUNCAN testinden yararlanılmış, sadece prina yağı ortalaması ile diğer yağ örneklerinin ortalamaları arasındaki farkların istatistik olarak önemli olduğu belirlenmiştir (p< 0,01).
2005, 43 sayfa
ANAHTAR KELİMELER: Benzo(a)piren, sızma, riviera, prina, zeytinyağı, HPLC
ii
ABSTRACT
Master’s Thesis
DETERMINATION OF BENZO(A)PYRENE FROM POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS IN EXTRA VIRGIN, RIVIERA AND OLIVE POMACE OILS
Zehra BALOĞLU
Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Food Engineering
Supervisor: Prof. Dr. Ali BAYRAK
This study was carried out to determine the amount of benzo(a)pyrene in 20 of extra virgin olive oils, 20 of riviera olive oils and 10 of refined olive pomace oils. Solid phase extraction (silica cartidge) was used in the preparation of samples. Analyses were made by HPLC combined with fluorescence dedector. In this method, mean of recovery was found % 76,08 ± 1,49 and limit of dedection was 0,3 µg/kg. The findings showed that this method can be used for determining benzo(a)pyrene in olive oils for routine analysis. In three of the extra virgin olive oil samples analysed, BaP was determined between 0,330 µg/kg and 0,870 µg/kg and mean concentration was 0,539 ± 0,167µg/kg. BaP was not determined at limit of dedection in eight of riviera olive oils samples whereas, it was found 2,465 µg/kg in 12 of these samples. In the samples containing BaP, mean concentration of BaP was determined 0,737 ± 0,192 µg/kg. In the most of the olive pomace oils, BaP was found at the highest level. The mean concentration of BaP was 31,472 ± 7,42 µg/kg (min: 0,460 µg/kg, max: 58,241 µg/kg) in 7 samples containing BaP. Results were analyzed by the one-way analysis of variance for determining the differences among the BaP concentrations of extra virgin olive oils, riviera olive oils, olive pomace oils. It was found that the mean concentrations were significantly different (p≤0,09) DUNCAN test for comparision among means, only mean concentration of BaP in olive pomace oil was statistically significant (p< 0,01).
2005, 43 pages
Key Words: Benzo(a)pyrene, extra virgin, riviera, olive-pomace, olive oil, HPLC
iii
TEŞEKKÜR
Bu çalışmanın her aşamasında yakın ilgi ve önerileri ile beni yönlendiren danışman
hocam Prof. Dr. Ali BAYRAK’a, laboratuvar çalışmalarımda büyük desteklerini
gördüğüm Ankara İl Kontrol Laboratuvar Müdürü Hasan Hüseyin BAYRAM’a, manevi
desteklerinden dolayı aileme ve eşime teşekkürlerimi sunarım.
Zehra BALOĞLU
Ankara, Ocak 2005
iv
İÇİNDEKİLER
ÖZET……………………………………………………………………………………..i
ABSTRACT……………………………………………………………………………..ii
TEŞEKKÜR…………………………………………………………………………….iii
SİMGELER DİZİNİ……………………………………………………………………..v
ŞEKİLLER DİZİNİ…………………………………………………………………….vii
ÇİZELGELER DİZİNİ………………………………………………………………..viii
1. GİRİŞ……………………………………………………………………………..1
2. KAYNAK ÖZETLERİ…………………………………………………………..3
Benzo(a)piren Analizlerinin Temel Prensipleri…………………………….…….6
3. MATERYAL ve YÖNTEM……...……………………………………………16
3.1. Materyal…………………………………………………………………………16
3.2. Yöntem………………………………………………………………………….16
3.2.1. Kimyasal malzemeler…………………………………………………………16
3.2.2. Çözeltiler………….…………………………………………………………..16
3.2.3. Cihaz ve malzemeler…………...……………………………………………..17
3.2.4. Standart çözeltiler……………………………………………………………..17
3.2.5. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi……………………………………..17
3.2.6. Benzo(a)pirenin belirlenmesi…………………………………………………18
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA…….………………………...21
4.1. Kalibrasyon……………………………………………………………………...21
4.2. Geri Kazanım……………………………………………………………………22
4.3. Benzo(a)piren Analiz Sonuçları………………………………………………...27
5. SONUÇ………………...………………………………………………………33
KAYNAKLAR…………………………………………………………………………35
EKLER…………………………………………………………………………………40
EK 1………………………………………………………………………………….41
EK 2………………………………………………………………………………….41
EK 3………………………………………………………………………………….42
ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………………………………….43
v
SİMGELER DİZİNİ
ACN Asetonitril
BaP Benzo(a)piren
Cas No Chemical Abstracts Service Number
DACC Donor-Acceptor Complex Chromatography
DBahA Dibenz(a,h)antrasen
DMF Dimetilformamit
DMSO Dimetil sulfoksit
DNA Deoksiribonükleik asit
EINECS No European Inventory of Existing Commercial Substances Number
FEDIOL Avrupa Yenebilir Yağ Üreticileri Ticari Birliği
GC Gaz Kromatografisi
GC-FID Gaz Kromatografisi – Alev İyonlaşma Dedektör
GC-MS Gaz Kromatografisi – Kütle Spektroskopisi
HPLC Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi
HPLC-FLD Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi-Fluoresans Dedektör
IARC Uluslararası Kanser Araştırma Merkezi
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
KOH Potasyum Hidroksit
LC Sıvı Kromatografisi
LC-GC Coupling of Liquid Chromatography with Gas Chromatography
LC-GC-MS Coupling of Liquid Chromatography, Capillary Gas
Chromatography and Mass Spectrometry
LC-LC Coupling of Liquid Chromatography with Liquid
Chromatography
LP-GC-MS Low–Pressure, Wide-Bore Gas Chromatography–Mass
Spectrometry
MFO Mikrozomal Karışık Fonksiyonlu Oksidaz
MSPD Matrix Solid Phase Dispersion
MTBE Metiltertiobutileter
vi
NPLC-SE-RPLC Solvent Evaporator for Coupled Normal Phase – reversed Phase
High – Performance Liquid Chromatography
ODS Octadecyl silane
PAH Polisiklik Aromatik Hidrokarbon
ppb Milyarda Bir Kısım
ppm Milyonda Bir Kısım
RNA Ribonükleik asit
RP Ters Faz
RP-HPLC Ters Faz Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi
RPLC Ters Faz Sıvı Kromatografisi
RSD Relatif Standart Sapma
SFE Süper Kritik Akışkan Ekstraksiyon
SIM Selected İon Monitoring
SPE Solid Phase Extraction
TCPI Tetrachlorophthalimidopropyl
TLC İnce Tabaka Kromatografi
US EPA United States Environmental Protection Agency
vii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1. BaP’in kimyasal formülü…………...…………………………………………3
Şekil 2.2. BaP’in oluşum şeması…………...….………………………………………...4
Şekil 2.3. BaP’in metabolizması ve aktivasyonu…………..……………………………5
Şekil 4.1. BaP standart kalibrasyon eğrisi (0,15 – 2 ng/mL)………….………………..21
Şekil 4.2. BaP standart kalibrasyon eğrisi (2 – 100 ng/mL)…………..……………….22
Şekil 4.3. Kullanılan kimyasalların kontrolü amacıyla elde edilen kromatogram……..23
Şekil 4.4. BaP ilave edilmemiş yağ örneğinin kromatogramı………………………….24
Şekil 4.5. BaP ilave edilmiş yağ örneğinin kromatogramı (0,5 µg/kg)………………...24
Şekil 4.6. BaP ilave edilmiş yağ örneğinin kromatogramı (1 µg/kg)…………………..25
Şekil 4.7. BaP ilave edilmiş yağ örneğinin kromatogramı (2 µg/kg)…………………..25
Şekil 4.8. BaP standardının 3 farklı konsantrasyondaki (0,5 ppb, 1 ppb ve 2 ppb)
kromatogramları……………………………………………………………..27
viii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 4.1. Zeytinyağında BaP geri alma oranları…………………………………….26
Çizelge 4.2. Naturel sızma, riviera ve prina yağlarında BaP miktarları………………..28
Çizelge 4.3. Yağ örneklerinin BaP miktarları…………...……………………………..29
1
1. GİRİŞ
Polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH)’lar, çeşitli şekillerde birleşen iki veya daha fazla
benzen halkalı bileşikler olup, organik maddelerin tamamlanmamış yanması sonucu
oluşurlar (Tuominen 1990, Williams 1990, Anonim 1998, Moret et al. 2000, Anonim
2001c, Anonim 2001d, Kaya 2002, Moret ve Conte 2002, Anonim 2003b).
Yapılan çalışmalar PAH’ların insanlarda ve çeşitli hayvanlarda kanserojenik etkiye
neden olduğunu veya kanser oluşumunu uyardığını göstermektedir (Anonim 1983,
Dıraman 1994, Shuguang et al. 1994, Moret et al. 1997, Kaya et al. 1998, Anonim
2001b, Anonim 2003b). PAH’lar çevreyi kirleten diğer maddelerle karşılaştırıldığında
çok düşük derişimde bulunmalarına rağmen, kanserojenik ve mutajenik etkileri çok
büyüktür (Pupin ve Toledo 1996, Troche et al. 2000).
PAH’lar hem lipofilik olmalarından hem de çevrede yaygın olarak bulunmalarından
dolayı yağlara kolayca bulaşırlar (Dıraman 1994, Gfrerer ve Lankmayr 2003). PAH’lar
yağlara çevresel kirliliklerden ve/veya rafinasyondan önceki işlem basamaklarının
birinden bulaşmış olabilir (Stijn et al. 1996, Troche et al. 2000).
PAH’ların ham hindistan cevizi yağında yüksek seviyede bulunması, yağ endüstrisinde
dikkatleri PAH kontaminasyonuna çekmiştir (Anonim 2002b).
Bitkisel yağlardaki PAH kontaminasyonu hakkında farklı görüşler vardır (Moret ve
Conte 2000).
PAH’lar hava kirliliği, tarlaların yakılması, toprak-su, ambalaj materyali, jüt çuvalları,
yağlama yağları ve ekstraksiyon çözücüleri gibi faktörlerin biri veya birkaçı ile
bitkilerin yenebilir kısımlarına ve/veya biyokimyasal sentezle bitkilere bulaşabilirler
(Pupin ve Toledo 1996, Moret ve Conte 2000, Troche et al. 2000, Moreda et al. 2001,
Gfrerer ve Lankmayr 2003).
2
PAH’lar özellikle prina yağlarında bulunur. Bu durum, üretim sırasındaki birkaç
faktörden kaynaklanabilir. Birincisi, prinanın kurutulması aşamasında yüksek sıcaklık
uygulanması, ikincisi çözücünün uçurulması sırasında yüksek sıcaklık uygulanması,
üçüncüsü prinadan yağın ekstraksiyonu sırasında, önceden kontamine olmuş çözücünün
kullanılmasıdır (Anonim 2001a, Anonim 2002a, Anonim 2003a, Bogusz et al. 2004).
Yağlı tohumların yanıcı gazlarla doğrudan kurutulması sırasında, ayçiçek, soya, palm,
üzüm çekirdeği ve hindistancevizi yağı gibi bazı yağlar PAH’larla kontamine olabilir.
Fakat bütün bu bilgilere rağmen, çoğu PAH’ların bitkisel yağlara kontaminasyonu
hakkında net bilgiler yoktur (Moreda et al. 2001).
Rafinasyon, seçilen koşullara bağlı olarak PAH’ların miktarını azaltır (Larsson et al.
1987, Pupin ve Toledo 1996, Moret et al. 2000, Cert et al. 2000, Moreda et al. 2001).
Bu azalma PAH’ların molekül ağırlığının bir fonksiyonudur (Moret et al. 1997).
Bitkisel yağlardan PAH’ların uzaklaştırılması rafinasyon basamaklarından renk açma ve
koku giderme aşamasında gerçekleşir (Perrin et al. 1993). Hafif PAH’lar çoğunlukla
koku giderme aşamasında buharlaştırma yolu ile, daha yüksek molekül ağırlıklı
PAH’lar ise renk açma işlemi ile uzaklaştırılır (Moret ve Conte 2000). Aktif karbon ile
ağartma toprağı kombine edildiğinde, ağır PAH’ların uzaklaştırılması daha etkin
olmaktadır (Anonim 2003c, Anonim 2003d). Ağır PAH’lar tamamen uzaklaştırılamaz
(Moret et al. 1997), 5-6 halkalı ağır PAH’ların hafif olanlara oranla daha zor
uzaklaştırılmasının nedeni, daha hidrofobik ve uçuculuklarının daha az olmasıdır
(Bogan et al. 2003).
Uluslararası Kanser Araştırma Merkezi (IARC)’ne göre PAH’lardan en kanserojenik ve
mutajenik olanı BaP’dir. Bu nedenle su ve gıdalardaki PAH analizlerinde belirteç olarak
kullanılır (Osborne ve Crosby 1987, Perrin et al. 1993, Dıraman 1994, Monte ve Conte
2000, Troche et al. 2000).
Bu çalışmada sızma ve riviera zeytinyağları ile rafine prina yağlarındaki BaP
miktarlarının kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmesi amaçlanmıştır.
3
2. KAYNAK ÖZETLERİ
Polisiklik aromatik hidrokarbonlardan olan BaP, IUPAC tarafından 3,4-benzopiren
olarak isimlendirilen organik bir bileşiktir (Anonim 2004a). BaP’in kimyasal formülü
ve bazı özellikleri aşağıda verilmiştir.
Cas no: 50-32-8
EINECS no: 200-028-5
Molekül ağırlığı: 252,32
Molekül formülü: C20H12
Kaynama noktası: 495 oC
Şekil 2.1. BaP’in kimyasal formülü Erime noktası: 178 oC
(Speer et al. 1990). Buhar basıncı: 8,4x10-7 Pa (25 oC)
Yoğunluğu: 1,351 g/cm3
BaP 20 oC’da açık sarı renkte, kokusuz, kristal veya toz halindedir (Anonim 2002c).
Son derece stabil olup, kaynama noktası aynı karbon sayısındaki n-alkanlardan daha
yüksektir (Lee et al. 1981, Chen ve Chen 2001), ayrıca lipofilik ve apolar karakterlidir
(Moret et al. 1997, Moret et al. 2000, Troche et al. 2000).
Suda çözünürlüğü 0,0000003 g/mL olan BaP eter, aseton, kloroform, toluen,
tetrahidrofuran, siklohekzan, dimetilformamit ve dimetil sulfoksitte çözünür (Anonim
2002c, Anonim 2004b). BaP’in oluşumu Şekil 2.2.’de verilmiştir.
4
Şekil 2.2. BaP’in oluşum şeması (Björseth ve Becher 1986).
BaP, vücutta ilk reseptör olarak mikrozomal karışık fonksiyonlu oksidaz (MFO)’lar
tarafından karşılanır. Aromatik bileşikler metabolize edilmek amacıyla MFO’lar
tarafından oksitlenerek ya vücutta kullanılabilir konuma dönüştürülür veya glutatiyon
ve glukuronitler gibi bileşiklere bağlı olarak atılır. Oksitlenmeyle başlayan metabolik
işlem sırasında oluşan bazı metabolitlerin, özellikle DNA, RNA ve proteinlere
bağlanarak mutajenik ve kanserojenik etkiler ortaya çıkardığı bildirilmektedir (Dıraman
1994).
5
Şekil 2.3. BaP’in metabolizması ve aktivasyonu (Dıraman 1994).
6
BaP’in kanserojenik özellikleri ispat edilmiş olmasına rağmen, kanserin nedenlerinin
çeşitli olması ve toksikolojik etkilerinin tahmininin zor olması nedeniyle, sağlık riski
oluşturan PAH seviyeleri belirlenememiştir (Moret et al. 2000).
Almanya, Avusturya, Hollanda gibi bazı Avrupa ülkeleri tütsülenmiş gıdalarda BaP için
1 ppb’yi yasal limit kabul etmiştir (Barranco et al. 2003a). Fakat bu ülkelerin katı ve
sıvı yağlar için yasal limitleri bulunmamaktadır (Moret et al. 2000).
Rafine edilmiş yağlardaki PAH’ların en yüksek seviyeleri, toplam PAH < 25 ppb, ağır
PAH < 5 ppb ve BaP < 1 ppb olarak Avrupa Yenebilir Yağ Üreticileri Ticari Birliği
(FEDIOL) tarafından kabul edilmiştir (Anonim 2002b).
İspanya, toplam ağır PAH için 5 ppb, her bir ağır PAH için 2 ppb sınır belirlemiştir
(Moret ve Conte 2002). Türkiye, katı ve sıvı yağlar için 10 µg/kg BaP sınırlaması
getirmiştir (Anonim 2002d).
Uluslararası Zeytinyağı Konseyi 2001 yılında prina yağlarında, B(a)P’nin en yüksek
tolere edilebilir derişimini 2 µg/kg olarak belirtmiş, aynı miktar Birleşmiş Milletler
Gıda Güvenlik Araştırıcıları ve İrlanda tarafından da kabul edilmiştir (Bogusz et al.
2004).
2.1. Benzo(a)piren Analizlerinin Temel Prensipleri
Bitkisel yağlardaki BaP miktarlarının belirlenmesi için analizlerde uygulanan temel
işlem basamakları aşağıda verildiği gibidir (Moret ve Conte 2000).
1) Ekstraksiyon 2) Saflaştırma 3) Analitik tespit
a) Sıvı – sıvı dağılma a) Kolon kromatografi a) HPLC/FLD
b) Kafein kompleksi b) İnce tabaka kromatografi b) GC / FID, GC/MS
c) Sabunlaştırma c) Katı faz ekstraksiyonu c) LC-LC, LC-GC, LC-LC-GC
7
Bu tekniklerden herhangi birinin kullanılması analiz edilecek materyale, PAH türüne,
zamana, eldeki imkanlara ve istenilen duyarlılığa bağlı olarak değişebilmektedir.
Ekstraksiyon yapmanın amacı, PAH’ları lipitlerden ayırmak ve mümkün olduğunca
aynı çözücüyü kullanarak çözmektir. Bu amaç için çoğu kez kullanılan 3 işlem; sıvı-sıvı
dağılma, kafein kompleksi ve sabunlaştırmadır.
Sıvı-sıvı dağılma yöntemi ile yağ örnekleri siklohekzan gibi organik bir çözücüde
çözülür, PAH’lar dimetilformamit (DMF)-su veya dimetil sülfoksit (DMSO) çözeltisi
ile ekstrakte edilir (Moret ve Conte 2000).
Kafein kompleksi ile ekstraksiyon yönteminde, yağ siklohekzanda çözülür, PAH’lar
kafein-formik asit çözeltisinde çalkalama yöntemi ile ekstrakte edilir. Sonra ayrılan
kompleks sulu sodyum klorür çözeltisi ile, PAH’lar ise siklohekzan ile ekstrakte edilir.
Sabunlaştırma yönteminde ise, yağ alkollü KOH ile en az 40 dakika geri soğutucu
altında sabunlaştırılır ve sabunlaşmayan maddeler siklohekzan ile ekstrakte edilir
(Moret ve Conte 2000).
Moret et al. (1997), zeytinyağında yukarıda anlatılan 3 ekstraksiyon işlemini
karşılaştırmıştır. Ekstraksiyondan sonra, örnek saflaştırma basamağında katı faz
ekstraksiyonu (SPE) uygulanmış, analiz ise HPLC-FLD ile yapılmıştır. Üç ekstraksiyon
yöntemi de farklı sonuçlar vermiştir. Buna göre sabunlaştırma yönteminde daha fazla
skualen kalıntısı kalmış ve ilave bir saflaştırma basamağına ihtiyaç duyulmuştur.
Zeytinyağında sabunlaşmayan kısmın yaklaşık %50’sini oluşturan skualen kartuştan
PAH’larla birlikte elue olmuştur. Sıvı-sıvı dağılma yönteminde ise, örnekte eser
miktarda skualen kalmıştır. Hem saflaştırma, hem analiz süresi açısından en iyi
yöntemin sıvı-sıvı dağılma basamağını izleyen SPE temizleme ile sağlandığı
görülmüştür.
8
Gfrerer ve Lankmayr (2003), mikrodalga destekli sabunlaştırma işlemini balkabağı
tohum yağlarına uygulamış, işlem 1,5 M KOH ile mikrodalga destekli sabunlaştırma ve
bunu izleyen sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi ile yapılmıştır. H2SO4 ile saflaştırma
işleminden sonra son bir temizleme işlemi için, bondesil-siyano fazlı aktif silikajel
adsorpsiyon kromatografisi kullanılmıştır. Bileşenlerin teşhisi, SIM modunda GC-MS
ile yapılmış, BaP için 252, 253 ve 125 iyonları hedef iyon olarak belirlenmiştir.
Yöntemin BaP için hesaplama limiti 0,31 ng/g, geri kazanımı % 89,5’dir. Buna göre,
mikrodalga sabunlaştırma işlemi de geleneksel sabunlaştırma işlemi gibi hızlı ve
güvenilir bulunmuştur.
Sıvı-sıvı dağılma, kafein kompleksi veya sabunlaştırma yöntemi ile elde edilen ekstrakt,
önemli miktarda PAH olmayan maddeleri de içerdiğinden, uygulanacak analitik
tekniğin seçiciliğine göre temizleme işlemine ihtiyaç duyulur. Genellikle ince tabaka ve
farklı adsorbent materyaller kullanılan kolon kromatografi tekniği uygulanır. Kolon
dolgu maddesi olarak çoğunlukla silikajel, alumina, florosil ve sephadex LH-20
kullanılır. Bu kolonların hazırlanması zaman alıcıdır, fazla çözücü gerektirir ve
tekrarlanabilirliği düşüktür. Bazı araştırıcılar, saflaştırma basamağında dolgulu tip silika
kolon yerine SPE silika kartuş kullanımını başarılı bulmuştur. SPE kartuş daha iyi geri
kazanım ve kesinlik değerleri vermiştir. Daha az çözücü ve analiz zamanı gerektirir
(Moret ve Conte 2000).
Barranco et al. (2003a) katı faz ekstraksiyonla örnek hazırlama yönteminde, yıkama
çözeltisi, örnek çözeltisi ve kuruma zamanı gibi deneysel faktörlerin etkisini C18 kartuş
kullanarak incelemiş, geri kazanım ve seçiciliği farklı sorbent materyaller [oktil (C8),
etil (C2), siklohekzil (CH), fenil (PH), amino propil (NH2)] kullanarak denemiştir. Saf
hekzanla elusyon, 10 dakika kurutma, C18 kolonu kullanmayı ve su ile yıkamayı içeren
SPE’yi önermişlerdir.
Bugün PAH’ların analizinde GC ve HPLC teknikleri kullanılmaktadır (Moret ve Conte
2000). Ters faz HPLC-FLD ile GC-MS, PAH’ların duyarlı olarak tespitinde en güçlü
tekniklerdir (Moret ve Conte 1998). Kapiler kolonlu GC ile çok düşük miktarlardaki
PAH’lar kolayca tespit edilebilir.
9
Bazı PAH’ların analizinde HPLC, GC’ye tercih edilen bir tekniktir. HPLC, GC’den
biraz daha hızlıdır, fakat düşük molekül kütleli PAH’ları ayırmada daha düşük
çözünürlük etkisine sahiptir.
Ters faz kolonlar, GC ile ayrılması zor olan PAH izomerlerini kolaylıkla ayırabilir. En
çok kullanılan kolonlar, asetonitril-su veya metanol-su mobil faz ve gradient elusyon ile
kullanılan, ters faz C18 kolonlarıdır (Moret ve Conte 2000). Moret et al. (2001), ters faz
sıvı kromatografi için mobil faz olarak asetonitril, aseton ve metanol gibi çözücüleri
denemiş ve asetonitrilin en iyi olduğunu saptamıştır. Asetonitril/su oranı yüksek güçlü
mobil faz, PAH’ları daha hızlı elue etmektedir.
PAH’ların çoğu güçlü fluoresans gösterir, bu nedenle spektrofluorometrik dedektör ile
kombine edilmiş HPLC, seçicilik ve duyarlılık için en iyisidir. HPLC tekniği, GC’nin
analiz edemeyeceği yüksek molekül kütleli PAH’ların tespitini sağlamada çok daha
başarılıdır (Moret ve Conte 2000, Moret et al. 2001).
Çözücü ekstraksiyonu ve temizleme yöntemlerine bir alternatif olarak süperkritik
akışkan ekstraksiyonu (SFE), seçici ekstraksiyon yapması nedeniyle tercih edilmektedir.
Yağ örneklerinde PAH’ların izolasyonunda yarı geçirgen membran kullanılan yeni bir
yöntem bildirilmiş olup, bu yöntemde hem 20g’dan daha fazla yağ diyaliz edilmekte,
hem de yağ içeriği % 90-99 oranında azaltılabilmektedir (Moret ve Conte 2000).
Vreuls et al. (1991) tarafından on-line LC-GC-MS, Moret ve Conte (1998) tarafından
off-line LC-LC tekniği geliştirilmiştir. Kombine tekniklerin (LG-GC, LC-LC-GC)
gelişmesi PAH analizleri için yeni ufuklar açmıştır. Bu teknikler etkili bir biçimde
analiz zamanını ve kullanılan çözücü miktarını azaltmıştır (Moret ve Conte 2000).
Stijn et al. (1996), yenebilir katı ve sıvı yağlarda PAH’ların analizi için on-line LC-LC
bir yöntem geliştirmiştir. DACC (Donor-acceptor complex chromatography) kolon ile
örnek temizlendikten sonra, PAH’lar HPLC-FLD ile tespit edilmiştir. Geleneksel
yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem çok daha hızlı bulunmuştur. Polar ve apolar
mobil fazlar, DACC kolonla PAH’ları diğer bileşiklerden ayırmak için denenmiştir. En
10
güzel ayırım isopropanol ile elde edilmiştir. Değişik uzunluk ve iç çaplardaki birçok
kolon denenmiş ve en iyi sonuçlar 80x3 mm boyutundaki DACC kolonu ile elde
edilmiştir. Yöntemle 0,1 µg/kg PAH tespit edilebilmektedir.
Bogusz et al. (2004) tarafından yapılan bir çalışmada florosil ve Nucleoprep C18
kolonlarla katı faz ekstraksiyon kullanılarak zeytinyağından BaP ekstrakte edilmiş, elde
edilen ekstrakt GC-MS, LP-GC-MS ve HPLC ile analiz edilmiştir. HPLC cihazında
DACC ve ODS kolon kullanılmıştır. SPE izolasyon yöntemine alternatif olarak
örneklere matrix katı faz dağılım (MSPD) yöntemi de uygulanmıştır. Tespit limiti,
standart kapiler kolonlu GC-MS için 1 ng/g, LP kolonlu GC-MS için 1,6 ng/g, standart
kolonlu HPLC için 0,5 ng/g, DACC kolonlu HPLC için 0,3 ng/g’dır. Yapılan
deneylerde SPE ve MSPD ekstraksiyon yöntemleri de karşılaştırılmıştır. SPE
MSPD’den daha basit, daha hızlı ve daha stabil bulunmuştur. MSPD seri çalışma için
uygun görülmemiş, fakat katı veya yarı katı yağ örnekleri için sabunlaştırma,
ekstraksiyon ve temizleme basamaklarını gerektiren geleneksel yöntemlerden daha basit
olduğu tespit edilmiştir. LP-GC-MS’e karşılık standart GC-MS cihazı kıyaslanmış, LP-
GC-MS cihazında BaP yaklaşık 5-6 dakikada elue edildiği halde, GC-MS’de bu süre 42
dakikaya uzamıştır. Fakat GC-MS’in hassasiyeti biraz daha yüksektir. BaP analizi için
kolon seçiciliğinin yeterli olması ve girişim gözlenmemesi gibi sebeplerden dolayı
yöntem olarak LP-GC-MS seçilmiştir. Bu yöntem HPLC ile elde edilen sonuçların
doğrulanması için önerilmiştir. Kısa HPLC kolonu (CP ChromSpher π) ile standart
HPLC kolonu (CP EcoSpher 4 PAH) karşılaştırıldığında kısa CP ChromSpher π kolonu
aynı tayin limitinde BaP’i daha kısa zamanda analiz etmiş, fakat bu kolon karışık
PAH’lar için uygun bulunmamış, yalnız BaP bulunan yağ örnekleri için
uygulanabileceği kaydedilmiştir.
Vreuls et al. (1991), bitkisel yağlarda PAH’ların tespiti için kuadropol MS ile kombine
edilmiş LC-GC (LC-GC-MS) kullanmıştır. Uygulanan yöntem, bitkisel yağ
örneklerinde eser seviyelerdeki PAH’ların hızlı tespiti için önerilmiştir. Örnek
hazırlama basamağına gerek duyulmadığından, sadece LC kolonun trigliserit ile aşırı
yüklenmesini engellemek için örnek n-pentan ile seyreltilmiştir. Yöntemin tespit limiti
11
scan modu için 20 ppb, SIM modu için 0,5 ppb’dir. Yapılan analizlerde zeytinyağında
19 ppb, ayçiçeği yağında 40 ve 38 ppb BaP tespit edilmiştir.
Moret et al. (2001) tarafından yapılan bir çalışmada ters faz sıvı kromatografi kolonu ile
kombine edilen normal faz sıvı kromatografi kolonu için on-line bir çözücü evaporatör
sistem geliştirilmiştir. Çalışmanın amacı yenebilir yağlarda ağır PAH’ların hızlı
tespitinde, on-line NPLC-SE-RPLC sistem için, en uygun şartları belirlemektir.
Geliştirilen yöntemin geri kazanımının %80’nin üzerinde olduğu tespit edilmiştir.
Moret ve Conte (1998) off-line LC-LC yöntemi ile yenebilir yağlarda PAH’ları
belirlemeye çalışmışlardır. Mobil fazın bileşimi ve enjekte edilen yağ miktarının
optimizasyonu denenmiştir. Geliştirilen yöntemin geri kazanımının, sıvı-sıvı dağılmayı
takip eden SPE dahil, tüm geleneksel numune hazırlama yöntemlerinden daha yüksek
olduğu bildirilmiştir. İşlemin tamamı 2 saaten daha az sürmekte ve sistem kolayca
otomatize edilebilmektedir.
Weiβhaar (2002), yenebilir yağlarda ağır PAH’ların tespiti için hızlı bir yöntem
uygulamıştır. Örnekler isohekzan/butilmetileterde çözülmüş, PAH’lar polistiren katı faz
ekstraksiyon kartuşuna adsorbe edilmiştir. Trigliseritler ve aromatik olmayan bileşikler
isohekzan/butilmetileter çözeltisinde, PAH’lar ise tetrahidrofuranda elue olmuştur.
Çözücü buharlaştırıldıktan sonra PAH’lar asetonitrilde çözülmüş ve fluoresans
dedektörlü RP-HPLC ile analiz edilmiştir. 5-6 halkalı PAH’ların geri kazanımları %85-
95 iken, 4 halkalıların geri kazanımları yaklaşık %60-75 olduğundan dolayı, 2 ve 3
halkalı PAH’lar için kullanılan yöntem uygun bulunmamış, zeytinyağında BaP’in tespit
limiti 0,2 µg/kg bulunmuştur.
Moret ve Conte (2002), bitkisel yağlarda PAH’ların tespiti için hızlı bir yöntem
geliştirmiştir. PAH analizlerinin en çok zaman alan kısmı örnek hazırlama olduğu için,
rutin analizlere uygun silika kartuş ile katı faz ekstraksiyonu, tek örnek hazırlama
basamağı olarak uygulamıştır. n-hekzan ile karıştırılmış yağ çözeltisinin 250 mg’ı 5g’lık
silika kartuşa yüklenmiş ve PAH fraksiyonu 8 mL n-hekzan/diklormetan 70/30 (v/v)
çözeltisi ile elue edilmiştir. Çözücü buharlaştırıldıktan sonra C18 ters faz kolonlu
12
HPLC-FL’ye enjekte edilmiştir. Ayrıca yapılan çalışmada 5 g’lık silika kartuş farklı yağ
örnek ve miktarları için test edilmiştir. Silika fazın trigliseritleri tutma, PAH
fraksiyonlarını bırakma kapasitesinin yağ miktarına ve bileşimine, mobil faz
polaritesine, silika fazın miktarına bağlı olduğu kaydedilmiştir. Sonuçlar ağır PAH’lar
için hafif PAH’lardan daha iyi geri kazanımlar göstermiştir. Yöntemin duyarlılığı her
bir PAH için 0,1 ppb seviyesini tespit edecek düzeydedir. Geliştirilen yöntemle elde
edilen HPLC bulguları, daha zor (örneğin sıvı-sıvı dağılma, bunu izleyen SPE
saflaştırma basamağı ve HPLC ile tespit) elde edilenlerle karşılaştırıldığında,
saflaştırma düzeyinin geleneksel işlemlerle benzer olduğu gözlenmiştir. Önerilen
yöntemin hızlı, tekrarlanabilirliği yüksek, rutin analizler için daha uygun olduğu
bildirilmiştir.
Troche et al. (2000), bitkisel yağlarda BaP’in saptanabilmesi için basit bir yöntem
açıklamıştır. Yağ örnekleri asetonitril ile ekstrakte edildikten sonra kuruyana kadar
buharlaştırıcıda konsantre edilmiş ve kalıntı hekzanda çözülmüştür. Elde edilen çözelti
sep-pack silika plus kartuşla temizlendikten sonra, BaP HPLC-FL ile tespit edilmiştir.
Zeytinyağında tespit limiti 0,23 µg/kg, hesaplama limiti 0,32 µg/kg’dır. Yöntemin geri
kazanımı > %93’tür. Bir örnek için toplam analiz zamanı yaklaşık 100 dakikadır ve
kullanılan çözücü miktarı düşüktür. Sıvı ve katı yağlarda PAH’ların sıvı-sıvı
ekstraksiyonu için kullanılan en yaygın çözücü DMSO ve DMF olmasına rağmen, daha
az emülsiyon oluşturduğundan ve son basamakta atılması daha kolay olduğundan
yöntemde asetonitril kullanılmıştır. Yöntem 18 yağ örneğine uygulanmış ve tespit
edilemeyen seviyeden 1,99 µg/kg seviyesine kadar BaP bulunmuştur. Zeytinyağı
örneklerinde BaP miktarı saptanamayan değer ile 1,16 ppb arasındadır.
Barranco et al. (2003b) tarafından yapılan bir çalışmada yenebilir yağlarda PAH’ların
tayini için silika kolon ve alumina kolon ile örnek temizleme yöntemleri
karşılaştırılmıştır. Her iki yöntemin seçicilik, duyarlılık, doğruluk ve kesinlik değerleri
uygun bulunmuştur. Fakat silika kolonlu temizleme işleminin tamamı yaklaşık 70
dakika iken, alumina kolon için bu süre 2 saatten fazladır. Ayrıca alumina temizleme
kolonunda daha fazla girişim pikleri gözlenmiştir ve kullanılan çözücü miktarı daha
fazladır. Yine yapılan çalışmada, silika kolon ile temizleme işlemi için hareketli faz
13
olarak düz zincirli alkan kullanıldığında, silika kolonun katı ve sıvı yağlar için en fazla
tutma kapasitesine sahip olduğu, bu nedenle n-hekzan seçildiği ve n-hekzana daha polar
bir çözücünün (dietileter) ilavesi ile PAH’ların daha hızlı elue olduğu kaydedilmiştir.
Silika kolonun yağı tutup, PAH’ları elue etme kapasitesinin miktara, yağ içeriğine ve
mobil faz bileşimine bağlı olduğu bildirilmiştir.
Menichini et al. (1991), zeytinyağlarındaki PAH’ların tespit edilmesinde gaz
kromatografi yöntemi için kalite kontrol testi geliştirmişlerdir.15 yağ örneğine 3,0 ve
360 µg/kg arasındaki seviyelerde 3-6 halkalı, 8 farklı PAH ilave edilmiştir. 3 seviyede,
5 eşit miktarda PAH ilave edilen örnekler, rastgele 3 uzman tarafından çalışılmıştır.
İlave edilen herbir seviye için ortalama geri kazanımlar PAH bileşiğinin özelliklerine ve
uzmanın yeteneğine bağlı olarak %56-107 arasında değişmiştir. Yöntemin tespit limiti 3
µg/kg olarak kaydedilmiştir. DMSO ile ekstrakte edildikten sonra silikajel ince tabaka
kromatografi ile saflaştırılan yağ örneklerinin analitik tespiti için GC-FID kullanılmıştır.
Analiz sonuçlarına göre, test edilen yöntem zeytinyağlarındaki PAH’ları
değerlendirmek için, yüksek derecede doğruluk ve çok iyi kesinlik verdiğinden dolayı
güvenilir bulunmuştur.
Yağlardaki PAH miktarları çok düşük seviyelerde olduğundan, PAH’ları yağdan tam
anlamıyla izole etmek zordur. Bazı araştırıcılar yağ karışımlarındaki PAH’ların
ekstraksiyonu için, modifiye silika TCPI DACC ile temizleme işlemi uygulayarak yeni
bir yöntem tanımlamıştır. Trigliseritler hexan/metiltertiobutileter (MTBE) çözeltisi ile
uzaklaştırılmış, PAH’lar saf metilen klorür ile elue edildikten sonra ters faz HPLC-FL
ile tespit edilmiştir. Tespit limiti 0,1 µg/kg’dır ve yöntemin geri kazanımı %78-100
arasındadır (Perrin et al. 1993).
Speer et al. (1990) 28 bitkisel yağın PAH miktarını tespit etmek için, örnekleri sıvı-sıvı
dağılma tekniği ile ekstrakte edip, jel permeasyon kromatografi ile temizledikten sonra
kapiler GC-MS kullanmıştır. Zeytinyağlarında 54,7 µg/kg’dan 110,8 µg/kg seviyelerine
kadar toplam PAH tespit edilmiştir. Diğer yağlarla karşılaştırma yapıldığında, ağır PAH
bakımından benzer kontaminasyonlar göstermesine rağmen hafif PAH miktarları 53 –
105,6 µg/kg arasında değişen yüksek düzeylerde bulunmuştur. Bu durum,
14
zeytinyağlarına PAH seviyelerini azaltan koku giderme ve renk açma gibi rafinasyon
işlemlerinin uygulanmaması ile açıklanmıştır. 7 zeytinyağı, 8 aspir yağı, 5 ayçiçek yağı,
5 mısır yağı, 1 susam yağı, 1 keten yağı ve 1 buğday yağı örneği analiz edilmiştir. Tüm
PAH bileşikleri için tespit limiti 0,1 µg/kg’dır. BaP için 250 ve 252 iyonlarına
bakılmıştır. BaP miktarı, zeytinyağında ortalama 0,7 (0,2 – 1,2) µg/kg, aspir yağında 0,3
(tespit edilemedi – 4,1) µg/kg, ayçiçeği yağında 0,7 (<0,1 – 0,8) µg/kg, mısır yağında
1,3 (0,5 – 2,3) µg/kg, susam yağında tespit edilemedi, keten yağında 0,9 µg/kg, buğday
yağında 1,3 µg/kg tespit edilmiştir.
Moret et al. (1997), naturel sızma, rafine ve lampante zeytinyağından oluşan 51 örneğin
PAH miktarını sıvı-sıvı dağılma, katı faz ekstraksiyon ve HPLC-FLD yöntemi ile tespit
etmiştir. BaP için yöntemin en düşük tespit edilebilir miktarı 0,015 ppb’dir. Elde edilen
veriler naturel sızma zeytinyağlarındaki PAH miktarının 2,96 ppb ile 75,414 ppb
arasında değiştiğini göstermiş, BaP miktarı ise 1,210 ppb seviyesine kadar bulunmuştur.
Rafine ve naturel sızma zeytinyağı karışımından oluşan 5 yağ örneğinin analiz
sonuçlarına göre, PAH’ların toplam miktarı naturel sızma zeytinyağlarının PAH
miktarından daha düşük bulunmuştur. Hafif PAH miktarındaki azalmaya rafinasyon
basamaklarının neden olduğu belirtilmiştir. Ağır PAH’ların miktarı ise bazen naturel
sızma yağlardan daha yüksek tespit edilmiştir. Rafinasyon basamaklarında kullanılan
çözücünün kontaminasyona neden olabileceği bildirilmiştir.
Pupin ve Toledo (1996) tarafından yapılan bir çalışmada, 40 adet Brezilya zeytinyağı
örneği BaP için, sıvı-sıvı dağılma ile ekstraksiyon, silika jelde temizleme ve HPLC-
FLD yöntemi ile analiz edilmiştir. Yöntemin geri kazanımı % 90,5, tespit limiti 0,5
µg/kg’dır. BaP hemen hemen tüm örneklerde, tespit edilemeyen seviyeden 164 µg/kg’a
kadar yüksek miktarlarda bulunmuştur. Avrupa’dan paketli ithal edilen zeytinyağlarında
0,6 – 1,2 µg/kg, Avrupa’dan ithal edilen fakat Brezilya’da paketlenen zeytinyağlarında
0,9 – 9,7 µg/kg, Arjantin’den ithal edilen zeytinyağlarında 0,5 – 164,4 µg/kg ve bitkisel
yağlarla karıştırılan zeytinyağlarında ise 2,2 – 9,2 µg/kg BaP bulunduğu kaydedilmiştir.
Barranco et al. (2003a), zeytinyağında 0,5 ng/g, prina yağlarında 67 ng/g ve 2,6 ng/g
BaP tespit etmişler ve İspanya’da prina yağlarına getirilen düzenlemelerden sonra PAH
miktarında önemli düşüş olduğunu bildirmişlerdir.
15
Üzüm çekirdeklerinden yağın alınması için uygulanan kurutma prosesi PAH miktarında
artışa neden olmaktadır. Moret et al. (2000) tarafından yapılan bir çalışmada, kurutma
işleminin hafif PAH miktarına önemli bir etkisi olmazken, ağır PAH fraksiyonlarında
büyük bir artış gözlenmiştir. Başlangıçta örneklerde ortalama 1,4 ppb (0,9 -2,4 ppb)
BaP bulunurken, kurutmadan sonraki miktar ortalama 20,2 ppb (8,6 – 44,3 ppb)
seviyesine yükselmiştir. Balenovic et al. (1995), 36 üzüm çekirdeği yağı örneğini
incelemiş ve ortalama 20 µg/kg gibi yüksek seviyelerde BaP bulmuşlardır.
Larsson et al. (1987)’ın ham bitkisel yağlardan PAH’ların uzaklaştırılmasında
rafinasyon prosesinin etkisi üzerine yapmış olduğu çalışmada, ham, rafine ve deodorize
yağdan üretim hattı boyunca örnekler alınmıştır. Yapılan analizler sonucu, ham kokonat
yağında BaP 20-34 µg/kg iken, deodorize yağda <0,1-0,3 µg/kg bulunmuştur.
Camacho et al. (2003), İspanya prina yağlarında renk açma prosesinin polisiklik
aromatik hidrokarbonların eliminasyonuna etkisini araştıran bir çalışma yapmışlardır.
Bu amaçla ağartma topraklı aktif karbon, adsorbent olarak kullanılmış ve ağartma
toprağı kullanımı BaP miktarını düşürmüştür. Fakat bunun yeterli olmadığı, bu yüzden
bu aşamada aktif karbon kullanımının gerekliliği belirtilmiştir. Pollard et al. (1993)
tarafından yapılan bir çalışmada ise, ham hindistan cevizi yağındaki BaP
miktarlarındaki azalma incelenmiş, ağartma toprağıyla (%15,6’lık) 10,8 µg/kg’a, toz
halindeki aktif karbonla (>%99,2’lik) 0,1 µg/kg’dan daha düşük konsantrasyonlara
ulaşılmıştır.
16
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1. Materyal
Araştırmada kullanılan sızma, riviera zeytinyağları ve prina yağları piyasadan temin
edilmiştir. Çalışma 20 adet sızma, 20 adet riviera zeytinyağı ve 10 adet rafine prina yağı
örneği üzerinde yapılmıştır.
3.2. Yöntem
Örneklerde BaP miktarlarının kalitatif ve kantitatif tespiti, Moret ve Conte 2002’ye göre
yapılmıştır. Katı faz ekstraksiyon yöntemi ile hazırlanan örnekler fluoresans dedektörlü
HPLC cihazına enjekte edilmiştir. Bu analizlerin yapılmasında kullanılan kimyasal
malzemeler, çözeltiler ve cihazlar aşağıda verilmiştir.
3.2.1. Kimyasal malzemeler
n-hekzan, HPLC saflıkta (Merck no 104391, Cas no 110-54-3)
Diklorometan, HPLC saflıkta (Merck no 106044, Cas no 75-09-2)
Aseton, HPLC saflıkta (Merck no 100020, Cas no 67-64-1)
Asetonitril, HPLC yüksek saflıkta (Merck no 100029, Cas no 75-05-8)
BaP stok standart, 10 ng/µL asetonitrilde (Dr.Ehrenstorfer GmbH, L20635000AL, Lot:
20812AL)
Bidestile su, Millipore ultra saf su cihazı (Elix 3 model, F1NN21161, Millipore) ile
saflaştırılmıştır.
3.2.2. Çözeltiler
n-hekzan / diklorometan çözeltisi (70/30, v/v)
17
3.2.3. Cihaz ve malzemeler
5 g’lık silika kartuş (Varian, ME-SI, 5GM 20 mL, 20/PK, Lot 0135203, MFG code:
05404, Part 12256026)
Vakum manifoldu (Supelco Visiprep DL, 571004, Visidry Drying Attachment, US Pat
No 4,810,471)
Azot, yüksek saflıkta (BOS)
Kullanılan cam malzemelerden kaynaklanan herhangi bir bulaşmanın olmaması için,
tüm cam malzemeler asitle yıkandıktan sonra kullanılmıştır.
3.2.4. Standart çözeltiler
İlgili firmalardan satın alınan 10 µg/mL konsantrasyondaki stok standart BaP
çözeltisinden 10 mL’lik balona 1 mL aktarılır. Balon aseton ile çizgisine tamamlanarak
1 µg/mL’lik BaP çözeltisi elde edilir. Bu çözelti aseton ile seyreltilerek 100, 50, 10, 5,
2, 1,5 ve 1 ng/mL konsantrasyonlardaki BaP standart çözeltileri hazırlanır. Elde edilen
bu standart çözeltiler aseton ile 0,5, 0,3, 0,25 ve 0,15 ng/mL’e seyreltilir. Hazırlanan
tüm çözeltiler karanlıkta ve +4 oC’da muhafaza edilir.
3.2.5. Yüksek performanslı sıvı kromatografi cihazı
Çalışmada kullanılan HPLC; gaz giderici, quaterney pompa, otosampler, DAD
dedektör, fluoresans dedektör, ısıtıcılı kolon bloğu ve handheld kontrol modülü ile
donatılmış Hewlett Packard 1100 serisidir. Tüm sistem, pentium IV işlemcili HP
Chemstation software bir HP bilgisayara ve HP laserjet 4200 model yazıcıya
bağlantılıdır.
Analizler Varian ChromSep HPLC kolon (SS 250 x 4,6 mm, ChromSpher 5 PAH
kolon) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Fluoresans dedektör kullanılarak yapılan
analizlerde emme dalga boyu 430 nm, yayma dalga boyu 375 nm’dir. Moret et al.
(2001) tarafından önerildiği şekilde asetonitril/su, mobil faz olarak kullanılmıştır.
18
Asetonitril 0,45 µm’lik filtreden, su 0,2 µm’lik selüloz asetat filtreden süzülmüştür.
HPLC ile çalışma koşulları aşağıda verilmiştir.
Cihaz HPLC, Agilent 1100
Kolon VARİAN ChromSpher 5 PAH, (250 x 4,6 mm)
Dedektör Fluoresans dedektör
Dalga Boyu (UV) 375 ex – 430 em nm
Kolon sıcaklığı 25 oC
Mobil faz %90 asetonitril ve %10 bidestile su
Akış hızı 1 mL/dakika
Enjeksiyon hacmi 20 µL
3.2.6. Benzo(a)pirenin belirlenmesi
BaP’in saptanmasında kullanılan yöntem üç aşamada gerçekleştirilmektedir. Bunlar,
katı faz ekstraksiyonu, tayin ve hesaplamadır.
Katı faz ekstraksiyonu: Yağdaki BaP’in belirlenebilmesi amacıyla Moret ve Conte
(2002) tarafından önerilen yöntem modifiye edilerek uygulanmıştır. Bu amaçla 5 g ±
0,00005 g yağ 10 mL’lik balona tartılmış, üzerine n-hekzan ilave edilerek balon
çizgisine tamamlanmış ve homojen oluncaya kadar titreşimli karıştırıcıda
karıştırılmıştır. Geri kazanım denemelerinde, örneklere uygun miktarda BaP ilavesi bu
aşamada gerçekleştirilmiştir. Örneğe ilave edilen BaP miktarları ise 0,5, 1 ve 2
µg/kg’dır.
Yağı n-hekzanla çözdükten sonra, vakum manifolduna 5 g’lık silika kartuş
yerleştirilerek şartlanması için 20 mL n-hekzan geçirilmiş, akış hızı yaklaşık saniyede 1
damla olacak şekilde ayarlanmıştır. Sonra 20 mL diklorometan geçirilerek kartuşun
şartlanması tamamlanmış ve şartlanan kartuşa 1 mL örnek konmuştur. Kartuşa 70 /30
(v/v) oranında n-hekzan / diklorometan çözeltisinden 6 mL ilave edilerek yine saniyede
1 damla geçirilmiştir. Bu aşamaya kadar biriken artıklar atılarak kartuşun altına yeni bir
19
15 mL’lik vial yerleştirilmiştir. BaP’i elue etmek için kartuşa 10 mL n-hekzan /
diklorometan çözeltisi ilave edilmiştir. Bu çözeltinin tamamı yine aynı akış hızında
alttaki viale toplanmıştır. Toplanan 10 mL’lik çözeltinin tamamı azot gazı altında
uçurulmuştur. 1 mL asetonla çözerek 2 mL’lik viale alınmış ve HPLC’de analiz
edilmiştir.
Kromatografik tayin: Kromatografik analiz için hazırlanan örnekten 20 µL alınarak
HPLC cihazına enjekte edilmiştir.
Hesaplama: Yağdaki BaP miktarı, aşağıdaki eşitliklerden yararlanılarak hesaplanmış ve
sonuç µg/kg olarak ifade edilmiştir.
a) Deney çözeltisindeki BaP derişiminin hesaplanması
Pikler, BaP standardının alıkonma zamanı ile karşılaştırılarak tanımlanmıştır.
Kalibrasyon eğrisinden yararlanarak hesaplama yapılmıştır. Örneğin pik alanı dikkate
alınarak uygun kalibrasyon eğrisi denklemi kullanılmıştır. 0,15 - 2 ng/mL
konsantrasyonları için y = 6,3301x denklemi, 2 – 100 ng/mL konsantrasyonları için ise
y = 5,2274x denkleminden yararlanılmış veya deney çözeltisindeki BaP
konsantrasyonunu hesaplamak için aşağıdaki formül kullanılmıştır.
As
Cs AtCt =
Ct : Deney çözeltisindeki BaP’in konsantrasyonu, ng/mL
Cs : Standart çözeltinin konsantrasyonu, ng/ mL
At : Deney çözeltisindeki BaP’in pik alanı
As : Standart çözeltinin pik alanı
20
b) Yağdaki BaP miktarının hesaplanması
Yağdaki BaP aşağıdaki eşitlikten hesaplanır.
Ct . Vt
mBenzo(a) piren(ng/g) =
Ct : Deney çözeltisindeki BaP’in konsantrasyonu (ng/mL)
Vt : Deney çözeltisinin hacmi, mL
m : Deney çözeltisinin temsil ettiği örnek miktarı, g
Sızma, riviera zeytinyağı ve prina yağı gruplarının ortalamaları arasındaki farklılıkların
irdelenmesinde varyans analizi (one way ANOVA) tekniği, farklı yağ gruplarının
tespitinde ise DUNCAN testi kullanılmıştır.
21
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA
4.1. Kalibrasyon
BaP’in HPLC ile analizinde, kalibrasyon aralığı 0,15 -2 ng/mL ve 2 – 100 ng/mL
olarak belirlenmiştir. Bu nedenle farklı konsantrasyonlara ait 2 kalibrasyon eğrisi
çizilmiştir.
Birinci kalibrasyon eğrisinin hazırlanmasında 0,15, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 ng/mL
konsantrasyonlarına eşdeğer BaP standart çözeltileri kullanılmış olup, regresyon
katsayısı (R2) 0,9939’dur. İkinci eğrinin hazırlanmasında ise 2, 10, 50 ve 100 ng/mL
konsantrasyonlarına eşdeğer BaP standart çözeltileri kullanılmış olup, regresyon
katsayısı (R2) 0,9969’dur.
Standart kalibrasyon eğrilerinin hazırlanmasında konsantrasyona (ng/mL) karşılık pik
alanları esas alınmıştır. Standart kalibrasyon eğrileri Şekil 4.1. ve Şekil 4.2.’de
verilmiştir.
Kalibrasyon
0,150,25
0,5
1
1,5
2
y = 6,3301x
R2 = 0,9939
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3
konsantrasyon (ng/mL)
alan Seri 1
Doğrusal (Seri 1)
Şekil 4.1. BaP standart kalibrasyon eğrisi (0,15 – 2 ng/mL)
22
Kalibrasyon
2
10
50
100
y = 5,2274x
R2 = 0,9969
0
100
200
300
400
500
600
0 50 100 150
konsantrasyon (ng/mL)
alan Seri 1
Doğrusal (Seri 1)
Şekil 4.2. BaP standart kalibrasyon eğrisi (2 – 100 ng/mL)
4.2. Geri Kazanım
BaP tespit yönteminin performans deneyleri, BaP geri kazanım oranlarının belirlenmesi
yolu ile gerçekleştirilmiştir. Kimyasallardan kaynaklanan bir girişim olup olmadığı ise
örnek kullanmaksızın hazırlanan deney çözeltisinin HPLC-FLD analizi ile
belirlenmiştir. Şekil 4.3.’de örneksiz gerçekleştirilen analiz sonucunda elde edilen
kromatogram verilmiştir. Buna göre BaP analizinde kullanılan kimyasallardan
kaynaklanan herhangi bir girişim olmadığı anlaşılmaktadır.
23
Şekil 4.3. Kullanılan kimyasalların kontrolü amacıyla elde edilen kromatogram. Yöntemin etkinliğini kanıtlamak için yapılan BaP geri kazanımlar 0,0, 0,5, 1 ve 2 µg/kg
ilave düzeyleri için ayrı ayrı, 6 paralelli olarak belirlenmiştir. Geri kazanım
analizlerinde BaP kontaminasyonu olmadığı bilinen yağ örneği kullanılmıştır.
Şekil 4.4.’de herhangi bir ilave yapılmaksızın analiz edilen yağ örneğine ait
kromatogram verilmiştir. Şekilden de görüleceği gibi BaP’nin alıkonma süresine
karşılık gelen noktada girişim yaparak tespiti olumsuz etkileyebilecek herhangi bir pik
gözlenmemiştir.
Şekil 4.5., 4.6. ve 4.7.’de sırasıyla 0,5 µg/kg, 1 µg/kg ve 2 µg/kg düzeyinde BaP
içerecek şekilde standart ilave edilmiş yağ örneklerinde geri kazanım denemeleri
sonucunda elde edilen kromatogramlar verilmiştir.
24
Şekil 4.4. BaP ilave edilmemiş yağ örneğinin kromatogramı.
Şekil 4.5. BaP ilave edilmiş yağ örneğinin kromatogramı (0,5 µg/kg).
25
Şekil 4.6. BaP ilave edilmiş yağ örneğinin kromatogramı (1 µg/kg).
Şekil 4.7. BaP ilave edilmiş yağ örneğinin kromatogramı (2 µg/kg).
Çizelge 4.1.’de zeytinyağlarına uygulanan analiz yöntemi ile elde edilen BaP geri
kazanım oranları verilmiştir. Ortalama geri kazanım oranı % 76,08 ± 1,49 olarak
belirlenmiştir.
26
Çizelge 4.1. Zeytinyağında BaP geri kazanım oranları, %
İlave düzeyi, µg/kg BaP geri kazanım oranı
0,5 77,72 ± 1,87
1,0 77,29 ± 1,64
2,0 73,25 ± 0,98
Ortalama 76,08 ± 1,49
n= 6
Kalıntı analiz yöntemlerinin performansı, farklı ilave düzeylerine karşılık elde edilen
geri kazanım oranları ile ifade edilmektedir. Codex Alimentarius kalıntı analizlerinde
ortalama geri kazanım oranının %70-120 aralığında olması gerektiğini bildirmiştir.
(Anonim 1993, Anonim 2004c). Çizelge 4.1.’de görüldüğü gibi, bu çalışmada elde
edilen analiz yöntemine ait geri kazanım değerleri, Codex Alimentarius Komisyonu
değerleriyle uyumludur.
Yöntemde BaP’e ait alıkonma sürelerinin tekrar edilebilirlik düzeyleri yüksek
bulunmuştur (Şekil 4.8.). Farklı konsantrasyonlardaki 3 standart çözeltiye (0,5 ng/mL, 1
ng/mL ve 2 ng/mL) ait alıkonma sürelerinin ortalamadan sapma oranları (varyasyon
katsayısı) % 0,039 olarak hesaplanmıştır. Bu değerler, alıkonma sürelerindeki sapmanın
ihmal edilebilir düzeyde olduğunu göstermektedir. Şekil 4.8.’de alıkonma sürelerinin
tekrar edilebilirliğinin yanında, konsantrasyon-FLD sinyali arasındaki ilişkinin doğrusal
olduğu da açık bir şekilde görülmektedir.
27
Şekil 4.8. BaP standardının 3 farklı konsantrasyondaki (0,5 ppb, 1 ppb ve 2 ppb) kromatogramları. Yağlardaki BaP’in HPLC-FLD ile analizinde duyarlılık düzeyi yüksek bulunmuştur.
Zeytinyağında bulunan 0,3 µg/kg düzeyindeki BaP kalıntısı, HPLC-FLD analizi ile net
bir şekilde saptanabilmektedir. Tespit edilebilir en düşük BaP miktarı 0,3 µg/kg olarak
belirlenmiştir. Zeytinyağı örneklerine ait kromatogramlarda girişim yaparak BaP pikinin
tanımlanmasını zorlaştıracak herhangi bir maddeye rastlanılmamıştır.
Yöntemde silika kartuş ile katı faz ekstraksiyonu, tek örnek hazırlama basamağı olarak
uygulanmış ve elde edilen veriler saflaştırma düzeyinin uygun olduğunu göstermiştir.
Bu durum, BaP analizinin daha kısa zamanda ve daha az kimyasal madde kullanılarak
yapılabileceğini göstermiştir.
4.3. Benzo(a)piren Analiz Sonuçları
Araştırmada piyasadan temin edilen 20 adet naturel sızma zeytinyağı, 20 adet riviera
zeytinyağı ve 10 adet rafine prina yağında (toplam 50 adet örnekte) BaP miktarları
kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmiştir. Analizi yapılan örneklerin BaP miktarları
28
Çizelge 4.2.’de verilmiştir. Bu yağlara ait örnek kromatogramlar ise EK 1, EK 2 ve EK
3’te verilmiştir.
Çizelge 4.2. Naturel sızma, riviera ve prina yağlarında BaP miktarları, µg/kg
Naturel sızma zeytinyağı
Riviera zeytinyağı Prina yağı
1 0,870 0,809 0,460
2 te 0,461 te
3 te 0,340 te
4 te te 58,241
5 te 0,380 48,730
6 te 0,394 15,698
7 0,330 2,465 34,664
8 te 0,383 37,300
9 te 0,324 25,214
10 te te te
11 te te
12 te te
13 te te
14 0,417 1,691
15 te 0,485
16 te te
17 te 0,418
18 te 0,696
19 te te
20 te te
te: Tespit edilemedi (< 0,300 µg/kg) Çizelge 4.2.’in incelenmesinden anlaşılacağı gibi, analiz edilen 20 adet naturel sızma
zeytinyağı örneğinden 3 tanesinde BaP tespit edilmiştir. Diğer örneklerde tespit
edilebilir düzeyde BaP kalıntısına rastlanmamıştır. BaP saptanan örneklerin ortalama
miktarı 0,539 ± 0,167 µg/kg (en az: 0,330 µg/kg, en çok: 0,870 µg/kg)’dır.
29
Analiz edilen 20 riviera zeytinyağı örneği için analiz sonuçları incelendiğinde, 8 örnekte
tespit edilebilir düzeyde BaP kalıntısına rastlanmazken, 12 örnekte 2,465 µg/kg
seviyesine kadar BaP bulunmuştur. BaP tespit edilen örneklerde ortalama miktar
0,737 ± 0,192 µg/kg (en az: 0,324 µg/kg, en çok: 2,465 µg/kg)’dır.
Prina yağlarının analizinden elde edilen değerlere bakıldığında, hemen hemen tüm
örneklerde yüksek miktarlarda BaP kalıntısına rastlanmıştır. BaP tespit edilen 7 örneğin
sonuçlarına göre ortalama miktar 31,47 ± 7,41 µg/kg (en az: 0,460 µg/kg, en çok:
58,241 µg/kg) olarak hesaplanmıştır.
Elde edilen analiz sonuçlarına göre, naturel sızma zeytinyağı, riviera zeytinyağı ve prina
yağı gruplarının ortalamaları arasındaki farklılıkların irdelenmesinde varyans analizi
(one way ANOVA) tekniği kullanılmıştır. Yapılan hesaplamalar sonunda, yağ
örneklerinin ortalamaları arasındaki farkların önemli olduğu saptanmıştır (p < 0,01).
Farklı yağ gruplarının tespitinde ise DUNCAN testi kullanılmıştır. DUNCAN testine
ilişkin hesaplamalar sonunda sadece prina yağı ortalaması ile diğer yağ örneklerinin
ortalamaları arasındaki farkların istatistik olarak önemli olduğu saptanmıştır (p< 0,01).
Çizelge 4.3.’de yağ örneklerinin DUNCAN test sonuçları gösterilmiştir.
Çizelge 4.3. Yağ örneklerinin BaP miktarları, µg/kg
n X ± SX
Sızma zeytinyağı 3 0,539 ± 0,167 b
Riviera zeytinyağı 12 0,737 ± 0,192 b
Prina yağı 7 31,472 ±7,41 a
DUNCAN test sonuçlarına göre, aynı sutündaki farklı harfler, örneklerin istatistik olarak birbirinden farklı olduklarını göstermektedir ( p< 0,01).
Analiz sonuçlarına göre, hiçbir naturel sızma zeytinyağı örneği Avrupa Yenebilir Yağ
Üreticileri Ticari Birliği tarafından kabul edilen 1 ppb BaP seviyesini aşmamıştır.
Moret et al. (1997), yapmış olduğu analizler sonucunda 51 naturel sızma zeytinyağı
örneğinden sadece 1’inde 1,210 ppb seviyesinde BaP tespit etmişlerdir. Diğer 50
örneğin hemen hemen hepsinde 0,3 ppb’nin altında BaP bulunduğunu bildirmişlerdir.
30
Troche et al. (2000) naturel sızma zeytinyağlarında 0,79 µg/kg ve 0,34 µg/kg, riviera
zeytinyağlarında 1,16 µg/kg, 0,48 µg/kg, 0,70 µg/kg ve <0,32 µg/kg düzeylerinde BaP
bulunduğunu bildirmişlerdir.
Riviera zeytinyağı sonuçları incelendiğinde, 2 örnekte 1 ppb’nin üstünde BaP tespit
edilmiş, genelde BaP miktarı 0,3 µg/kg ile 0,5 µg/kg seviyeleri arasında bulunmuştur.
Naturel sızma zeytinyağı ve riviera zeytinyağı örneklerinin ortalama BaP miktarı 1
ppb’nin altındadır.
Bir çalışmada analiz edilen 5 adet riviera zeytinyağında ise 0,460 – 1,335 ppb arasında
BaP tespit edilmiştir. Riviera zeytinyağlarının BaP miktarı, naturel sızma
zeytinyağlarından daha fazla bulunmuştur. Bu duruma, rafinasyon basamaklarında
kullanılan çözücü ile kontaminasyonun neden olabileceği bildirilmiştir (Moret et al.
1997).
Analiz edilen prina yağ örneklerinde 2 ppb seviyesinin çok üzerinde (ortalama 31,47
µg/kg) BaP tespit edilmiştir. Uluslararası Zeytinyağı Konseyi, prina yağlarında en çok
bulunabilecek BaP miktarını 2 µg/kg olarak belirtmiştir (Bogusz et al. 2004).
Prina yağlarındaki BaP miktarlarının daha yüksek olması, üretim sırasındaki birkaç
faktörden kaynaklanmış olabilir. Prinanın kurutulması aşamasında ve çözücü
uçurulması sırasında yüksek sıcaklık uygulanması veya prinadan yağın ekstraksiyonu
sırasında önceden kontamine olmuş çözücünün kullanılması muhtemel nedenlerden
sayılabilir. Özellikle prinaya uygulanan kurutma işleminin BaP kontaminasyonuna
neden olduğu bildirilmektedir (Anonim 2001a).
Prina yağlarında bulunan BaP seviyesinin naturel sızma ve riviera zeytinyağlarından
yüksek olması beklenen bir durumdur. Fakat elde edilen seviyeler çok yüksek
düzeydedir. Ağartma toprağı kullanımının BaP miktarını gerekli limitlere düşürmek için
yeterli olmadığı gözlenmiştir. Bu yüzden yağlardaki PAH’ların başlangıç miktarı da
dikkate alınarak renk açma aşamasında mutlaka aktif karbon kullanılmalıdır.
31
Modern sürekli sistemlerden elde edilen prina, klasik sistemlerden gelen prinaya oranla
daha çok nem ve daha az yağ içerdiğinden dolayı, prina kekini kurutmak amacıyla
uygulanan sıcaklık daha yüksektir. Bu durum daha fazla PAH kontaminasyonuna neden
olmaktadır. Bu nedenle, prina yağlarındaki PAH kontaminasyonunu önlemenin yolu,
kurutma sıcaklığının düşürülmesi ve zeytin kalıntısına uygulanan ısıtma işlemi
sırasındaki yakıt dumanının önlenmesidir (Anonim 2001a, Anonim 2002a, Anonim
2003a).
Bu çalışma sonucunda, 3 naturel sızma zeytinyağı ve 12 riviera zeytinyağında BaP
bulunmuştur. Geleneksel veya modern yöntemlerde soğuk pres kullanarak zeytinyağı
elde edilmesinin PAH oluşumuna neden olmadığı ifade edilmiştir (Anonim 2002a,
Anonim 2002b). Halbuki araştırılan yağlardan riviera zeytinyağlarında daha fazla sayıda
örnekte BaP’e rastlanmıştır. Bu durum, pahalı zeytinyağını seyreltmek amacıyla, rafine
prina yağı veya kontamine rafine zeytinyağının kullanılmasından kaynaklanmış
olabilir.
Speer et al. (1990) çeşitli bitkisel yağların PAH miktarlarını araştırdıkları
çalışmalarında, zeytinyağı örneklerinin ağır PAH bakımından diğer bitkisel yağlarla
benzer kontaminasyonlar göstermesine rağmen, hafif PAH miktarlarının daha fazla
olduğunu tespit etmiş ve bu durumu naturel zeytinyağına PAH miktarını azaltan
rafinasyon işleminin uygulanmaması ile açıklamıştır. Aynı araştırıcılar 7 adet riviera
zeytinyağı örneğinde ortalama 0,7 µg/kg (0,2 – 1,2) BaP bulmuşlardır.
Araştırmalarımızdan elde ettiğimiz bulgular, Speer et al. (1990)’ın bulguları ile
karşılaştırıldığında, riviera zeytinyağı sonuçlarımız ile paralellik göstermektedir.
Pupin ve Toledo (1996), Brezilya marketlerinden aldıkları zeytinyağı örneklerinde çok
yüksek miktarlarda BaP tespit etmiştir. Avrupa’dan paketli ithal edilen 7 zeytinyağında
ortalama 0,6 ppb, Avrupa’dan ithal edilip Brezilya’da paketlenen örneklerde 0,9 ppb ile
9,7 ppb arasında BaP bulunmuştur. Arjantin’den ithal edilen örneklerde ise 164,4 ppb
gibi çok yüksek rakamlara kadar BaP bildirmişlerdir. Bizim BaP sonuçlarımız
Avrupa’dan paketli ithal edilen yağ örneklerinin sonuçları ile benzerlik göstermektedir.
32
Fakat Arjantin’den ithal edilen yağ örnekleri kadar yüksek kontaminasyon olmadığı
açıkça görülmektedir.
Barranco et al. (2003a), 15 zeytinyağı ve 14 prina yağında yapmış olduğu PAH analiz
sonuçlarına göre, zeytinyağında 0,5 ppb, prina yağında 67 ppb ve 2,6 ppb BaP tespit
etmiştir. İspanyada prina yağları için en çok 2 ppb BaP sınırı getirilmiştir. Sınır
belirlenmeden önce analiz yapılan prina yağlarında 67 ppb BaP tespit edilirken, limit
getirildikten sonra marketten alınarak analiz edilen prina yağlarında 2,6 ppb BaP’e
rastlanmıştır. Böylece yasal bir limit belirlemenin PAH miktarını en aza indirmek için
faydalı olduğu görülmüştür.
PAH’larla ilgili en önemli konulardan birisi, gıdalarda bulunmasına izin verilebilecek
en yüksek miktarının belirsizliğidir. BaP gibi diğer PAH’lar için de yasal bir limit
getirilmesinin faydalı olacağı düşünülmektedir.
33
5. SONUÇ
Sızma ve riviera zeytinyağları ile rafine prina yağlarındaki BaP miktarlarının kalitatif ve
kantitatif olarak belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmada, 20 adet sızma, 20 adet riviera
zeytinyağı ve 10 adet prina yağı analiz edilmiştir.
Analiz edilen naturel sızma zeytinyağı örneklerinden 3 tanesinde BaP tespit edilmiştir.
BaP saptanan örneklerde ortalama miktar 0,539 ± 0,167 µg/kg (en az: 0,330 µg/kg, en
çok: 0,870 µg/kg) bulunmuştur.
Riviera zeytinyağlarında 8 örnekte tespit edilebilir düzeyde BaP kalıntısına
rastlanmazken, 12 örnekte 2,465 µg/kg seviyesine kadar BaP bulunmuştur. BaP tespit
edilen örneklerde, ortalama miktar 0,737 ± 0,192µg/kg (en az: 0,324 µg/kg, en çok:
2,465 µg/kg)’dır.
BaP tespit edilen 7 prina yağı örneği sonuçlarına göre ortalama BaP miktarı 31,47 ±
7,41 µg/kg (en az: 0,460 µg/kg, en çok: 58,24 µg/kg) bulunmuştur.
Prina yağı örneklerindeki BaP miktarının daha fazla olması, prinanın kurutulması
aşamasında ve çözücü uçurulması sırasında yüksek sıcaklık uygulanması veya prinadan
yağın ekstraksiyonu sırasında önceden kontamine olmuş çözücünün kullanılması
olabilir. Özellikle prinaya uygulanan kurutma işleminin BaP kontaminasyonundan
sorumlu olduğu düşünülmektedir.
Riviera zeytinyağı örneklerindeki ortalama BaP miktarı, naturel sızma zeytinyağı
örneklerinden biraz daha fazla tespit edilmiştir. Bunun sebebi, pahalı zeytinyağını
seyreltmek için rafine prina yağı veya kontamine rafine zeytinyağının kullanılması
olabilir.
Naturel sızma, riviera zeytinyağı ve prina yağı örneklerinin ortalamaları arasındaki
farklılıkların irdelenmesinde varyans analizi (one way ANOVA) tekniği kullanılmıştır.
Yapılan hesaplamalar sonunda yağ örneklerinin ortalamaları arasındaki farkların önemli
34
olduğu saptanmıştır (p< 0,01). Farklı yağ gruplarının tespitinde ise DUNCAN testi
kullanılmıştır. DUNCAN testi sonunda sadece prina yağı ortalaması ile diğer yağ
örneklerinin ortalamaları arasındaki farkın istatistik olarak önemli olduğu saptanmıştır
(p< 0,01).
Yöntemin ortalama geri kazanım oranı % 76,08 ± 1,49, en düşük tespit limiti 0,3
µg/kg’dır. Uygulanan yöntem rutin analizler için uygulanabilir bulunmuştur.
35
KAYNAKLAR
Anonim. 1983. International Agency for Research on Cancer (IARC). Monographs on the evaluation of carcinogenic risk of chemical to humans, polynuclear aromatic
compounds. Part 1, France. Anonim. 1993. Guidelines on good laboratory practice in pesticide residue analysis.
Food and Agricultural Organization of United Nations. World Health Organization, Rome.
Anonim. 1998. Measuring carcinogens in food. http://europa.eu.int/comm/research/success/en/agr/0311e.html Anonim. 2001a. Contaminants- Polycyclic aromatic hydrocarbons in olive residue oil. http://www.foodlaw.rdg.ac.uk/news/eu-01186.htm Anonim. 2001b. Survey of some brazilian market basket commodities for polycyclic
aromatic hydrocarbons content. http://ift.confex.com/ift/2001/techprogram/paper 6577.htm Anonim. 2001c. Polycyclic aromatic hydrocarbons, 15 listings. http://www.sanitaweb.it/web/Biblioteca/carcinogens/rahc/pahs.pdf Anonim. 2001d. PAHs in vegetable oils in the EU http://www.rssl.com/food-e/shownewsletter.asp?ID=187#2401 Anonim. 2002a. European Commission. Directorate F- Food and Veterinary Office. Final report of a mission carried out in France from 21st to 30th october 2002 in order to assess the control measures in place for vegetable oil production and in
particular for the assessment of controls on PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons) contamination of such oils.
http://europa.eu.int/comm/food/fs/inspections/fnaoi/reports/contaminants/france/ fnaoi_rep_fran_8688-2002_en.pdf Anonim. 2002b. Polyaromatic hydrocarbons (PAH) in evening primrose oil. http://www.vsp-holland.com/vsp/newsletters/16-0209.pdf Anonim. 2002c. Safety Data Sheet. http://www.irmm.jrc.be/rm/sds/sds-bcr_051r.pdf Anonim. 2002d. Türk gıda kodeksi gıda maddelerinde belirli bulaşanların maksimum seviyelerinin belirlenmesi hakkında tebliğ (tebliğ no: 2002/63). Resmi gazete: 23 Eylül 2002 tarihli ve 24885 sayılı tebliğ. Anonim. 2003a. Prinanın bir yakıt olarak kullanımı ve eldesi. http://www.obitet.gazi.edu.tr/Makaleler/T23_Prina.htm
36
Anonim. 2003b. Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi Başkanlığı Çevre Sağlığı Araştırma Müdürlüğü Hava Kirliliğine Genel Bakış. www.rshm.saglik.gov.tr/hki/pdf/hava.pdf ; 47-60 s. Anonim. 2003c. Removal of PAH from vegetable oil. http://www.aktivt-kul.dk/pah.htm Anonim. 2003d. Polynuclear aromatic hydrocarbons removal. http://www.xextex.com/testdata/xtex_pah.htm Anonim. 2004a. Outline of the amendment of the cabinet ordinance and the ministerial
ordinance for the law for the control of house hold products containing harmful substances. http://www.fas.usda.gov/ffpd/wto_sps_tbt_Notifications/Forest_Products/Japan111Add1.pdf
Anonim. 2004b. Safety (MSDS) data for benzo(a)pyrene.
http://ptcl.chem.ox.ac.uk/MSDS/BE/benzo(a)pyrene.html Anonim. 2004c. Food Standarts Agency. Update on EU discussions on chemical
contaminants. Annex II. Sample preparation and criteria for methods of analysis used in official checking of the levels of benzo(a)pyrene in foods.
Balenovic, J., Petrovic, I., Perkovac, M. 1995. Determination of polycyclic aromatic
hydrocarbons in vegetable oils. Proceeding of Euro Food Chemistry VIII, September 18-20, Vol 2, 275-281, Wien.
Barranco, A. Alonso-Salces, R. M., Bakkali, A., Berrueta, L. A., Gallo, B., Vicente, F.,
Sarobe, M. 2003a. Solid-phase clean-up in the liquid chromatographic determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oils. Journal of Chromatography A, 988; 33-40.
Barranco, A. Alonso-Salces, R. M., Berrueta, L. A., Gallo, B., Vicente, F., Sarobe, M.
2003b. Comparison of two sample clean-up methodologies for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oils. J. Sep. Sci., 26; 1554-1562.
Björseth, A., Becher, G. 1986. PAH in work atmospheres: occurrence and determination. Boca Raton, Fl: CRC Pres; 103-116 Bogan, B. W., Trbovic, V., Paterek, J. R. 2003. Inclusion of vegetable oils in Fenton’s chemistry for remediation of PAH-contaminated soils. Chemosphere, 50; 15-21. Bogusz, M. J., Hajj, S. A. E., Ehaideb, Z., Hassan, H., Al-Tufail, M. 2004. Rapid
determination of benzo(a)pyrene in olive oils samples with solid-phase extraction and low-pressure, wide-bore gas chromatography-mass spectrometry and fast liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography A, 1026; 1-7.
37
Camacho, M. L., Alcaide, I. V., Mendez, M. V. R. 2003. Elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons by bleaching of olive pomace oil. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 105; 9-16.
Cert, A., Moreda, W., Perez-Camino, M. C. 2000. Chromatographic analysis of minor constituents in vegetable oils. Journal of Chromatography A, 881; 131-148. Chen, Y. C., Chen. B. H. 2001. Stability of polycyclic aromatic hydrocarbons during heating. Journal of Food and Drug Analysis, 9(1); 33-39. Dıraman, E. 1994. Aspirin ve antioksidantların (butylated hydroxyanisole ve askorbik asit) farelerde (mus musculus) benzo(a)pyrene hidroksilaz aktivitesi üzerine etkileri. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Samsun. Gfrerer, M., Lankmayr, E. 2003. Microwave-assisted saponification for the determination of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons from pumpkin seed oils. Journal of Separation Science, 26; 1230-1236. Kaya, S., Pirinçci, İ., Bilgili, A. 1998. Veteriner Hekimliğinde Toksikoloji. Medisan Yayın Serisi:35, 1. Baskı, 452 s, Ankara. Kaya, S. 2002. Soframızdaki tehlike: 4.Gıdaların pişirilmesi, işlenmesi, saklanması sırasında oluşan zehirli-zararlı maddeler. Türk Veteriner Hekimleri Birliği Dergisi, 2(3-4). http://www.tvhb.org.tr/Dergi/Cilt2Sayi1/sofra.htm Larsson, B. K., Erikson, A. T., Cervenka, M. 1987. Polycyclic aromatic hydrocarbons in crude and deodorized vegetable oils. JAOCS, 64(3);365-370. Lee, M. L., Novotny, M. V., Barthle, K. D. 1981. Analytical chemistry of polycyclic Aromatic compounds. Academic Pres, USA. Menichini, E., Domenico, A.D., Bonanni, L., Corradetti, E., Mazzanti, L., Zucchetti, G.
1991. Reliability assessment of a gas chromatographic method for polycyclic aromatic hydrocarbons in olive oil. Journal of Chromatography, 555; 211-220.
Moreda, W., Perez-Camino, M. C., Cert, A. 2001. Gas and liquid chromatography of hydrocarbons in edible vegetable oils. Journal of Chromatography A, 936; 159-171. Moret, S., Piani, B., Bortolomeazzi, R., Conte, L. S. 1997. HPLC determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in olive oils. Z. Lebensm Unters Forsch A, 205; 116-120. Moret, S., Conte, L. S. 1998. Off-line LC-LC determination of PAHs in edible oils and
lipidic extracts. J. High resol. Chromatogr., 21(April); 253-257.
38
Moret, S., Conte, L. S. 2000. Polycyclic aromatic hydrocarbons in edible fats and oils: occurrence and analytical methods. Journal of Chromatography A, 882; 245-253 Moret, S., Dudine, A., Conte, L. S. 2000. Processing effects on the polyaromatic
hydrocarbon content of grapeseed oil. JAOCS, 77(12); 1289-1292. Moret, S., Cericco, V., Conte, L. S. 2001. On-line solvent evaporator for coupled
normal phase-reversed phase high-performance liquid chromatography systems: Heavy polycyclic aromatic hydrocarbons analysis. J. Microcolumn Separations, 13(1); 13-18.
Moret, S., Conte, L. S. 2002. A rapid method for polycyclic aromatic hydrocarbon determination in vegetable oils. Journal of Separation Science, 25; 96-100. Osborne, M. R., Crosby, N. T. 1987. Benzopyrenes. Cambridge University Press, 128-129, UK. Perrin, J. L., Poirot, N., Liska, P., Thienpont, A., Felix, G. 1993. Trace enrichment and HPLC analysis of PAHs in edible oils and fat products, using liquid chromatography on electron acceptor stationary phases in connection with reverse phase and fluorescence detection. Fat Sci Technol., 95; 46-51. Pollard, S.J.T., Sollars, C.J., Perry, R. 1993. The reuse of spent bleaching earth: a feasibility study in waste minimisation for the edible oil industry. Bioresource technology, 45; 53-58. Pupin, A. M., Toledo, M. C. F.1996. Benzo(a)pyrene in olive oils on the Brazilian market. Food Chemistry, 55(2); 185-188. Shuguang, L., Dinhua, P., Guoxiong, W. 1994. Analysis of polycyclic aromatic
hydrocarbons in cooking oil fumes. Archives of Environmental Health, 49(2); 119-122.
Speer, K., Steeg, E., Horstmann, P., Kühn, T., Montag, A. 1990. Determination and distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in native vegetable oils, smoked fish products, mussels and oysters and bream from the River Elbe. Journal of High Resolution Chromatography, Vol 13 (February);104-111. Stijn, F. V., Kerkhoff, M. A. T., Vandeginste, B. G. M. 1996. Determination of
polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oils and fats by on-line donor-acceptor complex chromatography and high-performance liquid chromatography with fluorescence dedection. Journal Chromatography A, 750; 263-273.
Troche, V. S., Falcon, G. M. S., Amigo, G. S., Yusty, L. M. A., Lozano, S. J. 2000.
Enrichment of benzo(a)pyrene in vegetable oils and determination by HPLC-FL. Talanta, 51; 1069-1076
39
Tuominen, J. 1990. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons by gas chromatography/mass spectrometry and method development in supercritical fluid chromatography. Technical Research Centre of Finland, Publications 60 Espoo, Finland Vreuls, J. J., Jong, G. J. D., Brinkman, U. A. T. 1991. On-line coupling of liquid
chromatography, capillary gas chromatography and mass spectrometry for the determination and identification of polycyclic aromatic hydrocarbons in vegetable oils. Chromatographia, 31(3/4); 113-118.
Weiβhaar, R. 2002. Rapid determination of heavy polycyclic aromatic hydrocarbons in
edible fats and oils. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 104; 282-285. Williams, P. T. 1990. Sampling and analysis of polycyclic aromatic compounds from Combustion systems. Journal of The Institue of Energy, 63; 22
40
EKLER
EK 1. Naturel sızma zeytinyağı örneğinin kromatogramı
EK 2. Riviera zeytinyağı örneğinin kromatogramı
EK 3. Prina yağı örneğinin kromatogramı
41
EK 1. Naturel sızma zeytinyağı örneğinin kromatogramı.
EK 2. Riviera zeytinyağı örneğinin kromatogramı.
42
EK 3. Prina yağı örneğinin kromatogramı.
43
ÖZGEÇMİŞ
Ankara’da 1978 yılında doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini Ankara’da tamamladı.
Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümünden 1999 yılında Gıda
Mühendisi ünvanıyla mezun oldu. 2002 yılından beri Tarım ve Köyişleri Bakanlığı
Ankara İl Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü Kalıntı Laboratuvarında çalışmaktadır.