APOBECファミリーとその抗ウイルス活性

第13回ウイルス学キャンプ in 湯河原

主催：ウイルス学キャンプ実行委員会

村松 正道

金沢大学 医 分子遺伝

平成28年8月30日

ニューウェルシティー湯河原

1. APOBECとは

2. HBVとAPOBEC

3. HPV16とAPOBEC

総論的

これまでにわかった事

未解決事象や問題点

4. 失敗や経験から学んだこと

deamination o

NH3

C

N

N

o DNA/RNA

NH2

C U C

N

N

o DNA/RNA

APOBEC family

Anti viral factor

(HIV-1)

APOBEC

HBV & HPV16

replication block

GCATATCCTCCGCCAACCGCACTCCA

APOBEC3

GUATATCUTUUGUUAACUGUACTCUA

Hypermutation

viral DNA

HBV

3.2kb

DNA virus Human hapatocytes

Hepatitis B virus (HBV)

cirrhosis

liver cancer

A3GのHBVへの抗ウイルス作用

IFNs A3G

A3G

UNG A3G UUUUU

A3G C−to-U

Plos Pathogens 2013

AIDの抗HBV作用（モデル）

TGF-b

TNF-a

IL-1b

AID

AID AID

C−to-U UUU

Liang et al PNAS 2013

Watashi et al JBC 2013

Liang et al Plos Pathogens

2016

pgRNA

RC-DNA

3.2kb

cccDNA

HBx,

HBs

p

p

☆患者病態では、どうなっている？

☆実際のウイルス排除にどの程度貢献しているか？

☆肝癌との関連性？

☆エスケープ変異体、薬剤耐性変異体との因果関係？

Cytokines APOBECs

hypermutate

hypermutate

HBV感染におけるAPOBEC未解決事象

degradation

deamination o

NH3

C

N

N

o DNA/RNA

NH2

C U C

N

N

o DNA/RNA

APOBEC family

APOBEC

HBV & HPV16

Anti viral factor

(HIV-1)

replication block

GCATATCCTCCGCCAACCGCACTCCA

APOBEC3

GUATATCUTUUGUUAACUGUACTCUA

Hypermutation

viral DNA

Human Papillomavirus type 16

(HPV16)

咽頭癌

年間3500人の

日本人女性が死亡。

タバコとともに

中咽頭癌の

主要原因

HPV16

排除 排除

自然排除

HPVによる発ガン機構

（10-30年の経過）

ウイルス持続感染

①ウイルスゲノム挿入

②ウイルス癌遺伝子

E6, E7の持続的発現

とp53, Rb抑制

③宿主ゲノム変異

episome ゲノム挿入

形質転換

仮説： APOBEC = 諸刃の剣

GCATATCCTCCGCCAACCGCACTCCA

AID・APOBEC

GCATATCCTCCGUCAACCGCACTCCA

感染防御能 発がん

病原体の多い環境では、

発がんリスクに目をつぶっても

あまりあるメリットを提供している。

HPV16

排除 排除

自然排除

APOBECが関わるとしたら？

（10-30年の経過）

ウイルス持続感染

抗ウイルス因子

としての

APOBECの役割

急性期 慢性期

変異源としてのAPOBECの役割

①ウイルスゲノム挿入

②ウイルス癌遺伝子

E6, E7の持続的発現

とp53, RB抑制

③宿主ゲノム変異

現時点では

この仮説は、

部分的知見があるのみ。

Pseudovirion系はあるものの

動物モデル

in vitro自然感染モデル not available

HPV16研究の現状

発ガン初期 event の研究にW12が用いられている。

感染初期

の研究は

難しい。

HPV16前癌病変由来：W12

W12

antiviral cytokine

IFN-b

W12

RT-qPCR HPV16 episome

HPV16+前癌病変

Wang et al JVI 2014

HPV16 episome

IFN-dependent hypermutation in W12 cells

W12 IFN-b

W12

3D-PCR

℃

non-treat

IFN-b

IFN処理でhypermutation観察可能。

G

C

G

C

C

G

A

T

T

A

C

G

G

C

A

T T

A

A

T

T

A

T

A

AT rich DNA

APOBEC hypermutation

(= Hypermutated DNA)

PCR変成温度

Overexpression of APOBECs induces hypermutation on HPV16 E2 gene

IF

Nb

E2 3D-PCR

GCATCCTAATTT!

CGTAGGATTAAA!

GCATUCTAATTT!

CGTAGGATTAAA!

GCAT--CTAATTT!

CGTAGGATTAAA!

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GCAT　CTAATTT!

CGTAGGATTAAA!>&; !( /%?@?3%

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L

L

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R9!

R8!

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IFN-b

+UGI overexpression

Wang et al JVI 2014

overexpression

Southern blot

HIVの時と比較すると

Mutationの頻度も、

２桁以上、低い事が判明。

ウイルス複製量は？

Wang et al JVI 2014

APOBEC3 抗ウイルス活性

Hypermutation

Hypermutation依存性

HIV-1

ウイルス成分に結合して

複製阻害する。

HIV-1での研究では、、

Hypermutation非依存性

293T

lipofection

pHPV16 (L1 + L2) ( capsid expressing vector)

p-Luciferase

Pseudovirion

+ APOBEC3

GFP

Pseudovirion

0

20

40

60

80

100

120

GFP A3A A3C A3F A3G

Infectivity

Infection Hela

100%

Lu

cife

rase

Ahasan et al BBRC 2015

ウイルス粒子集合

エントリー

パピローマウイルス

排除 排除

自然排除

APOBECが関わるとしたら？

急性期

（10-30年の経過）

ウイルス持続感染

抗ウイルス因子

としての

APOBECの役割

慢性期

変異源としてのAPOBECの役割

①ウイルスゲノム挿入

②ウイルス癌遺伝子

E6, E7の持続的発現

とp53, RB抑制

③宿主ゲノム変異

HPV16+ CIN1 臨床検体

3D-PCR

HPV16 viral DNA Hypermutation

G

C

G

C

C

G

A

T

T

A

C

G

G

C

A

T T

A

A

T

T

A

T

A

AT rich DNA

APOBEC hypermutation

臨床検体でも

ウイルスDNAにAPOBEC活性産物を検出できる。

(= Hypermutated DNA)

control

DNA

hypermutated

Hypermutation

amplification at lower Tm

＝

Wakae et al. Virology 2015

UGI A3A

- -

+ -

+ -

+ +

UGI A3A

- -

+ -

+ -

+ +

TP53 HPV16 E2

87

.0

86

.7

86

.1

85

.1

83

.9

83

.1

82

.4

82

.0

(℃)

87

.5

86

.9

86

.5

86

.1

85

.2

84

.5

84

.3

(℃)

↗ A G C T

A 0

G 56

C

T

178bp x 6 clones

↗ ︎ A G C T

A 0

G 74

C 24

T

165bp x 7 clones

↗ ︎ A G C T

A 0

G 0

C 49

T

165bp x 4 clones

APOBEC3A

HPV16+

UNG阻害

293T細胞

3D-PCR

APOBEC3Aは、宿主ゲノムにもhypermutationを入れうる。 Kondo et al. Oncogene in press

宿主ゲノムDNAにはhypermutationは起こりうるか？

HPV16

排除 排除

自然排除

現在、作業仮説の妥当性を検証中

急性期

（10-30年の経過）

ウイルス持続感染

抗ウイルス因子

としての

APOBECの役割

慢性期

変異源としてのAPOBECの役割

①ウイルスゲノム挿入

②ウイルス癌遺伝子

E6, E7の持続的発現

とp53, RB抑制

③宿主ゲノム変異

APOBECのプロジェクト紹介

は

ここまで。

以後は、失敗談へ

これまでに失敗や経験から学んだ事

1, 埋没するぐらい実験すべし！

しかし目指すものを忘れるな！

２, がむしゃらにサイエンスに打ち込んでください。

その姿勢はいずれは評価されます。

経験 1

経験 2

episode 1

o

NH3

C

N

N

o DNA/RNA

NH2

C U C

N

N

o DNA/RNA

deamination

cytidine deaminase motif

Muramatsu et al, JBC (1999), Cell (2000)

AID単離時の判断ミス

Anti viral factor

(HIV-1)

抗原刺激

Somatic hypermutation

V

クラススイッチ組換え

C C C C Cb Ca C

S S S Sb Sa S V

抗体重鎖 遺伝子

V

?

抗体の親和性成熟 IgG, IgA, IgE産生

抗原刺激

Somatic hypermutation

V

クラススイッチ組換え

C C C C Cb Ca C

S S S Sb Sa S V

抗体重鎖 遺伝子

V

AID

抗体の親和性成熟 IgG, IgA, IgE産生

刺激あり

B細胞 刺激なし

B細胞

cDNA cDNA

ハイブリ

クラススイッチは

刺激誘導性現象なので

リコンビナーゼも

刺激誘導性であるはず。

初回実験でAIDが強力に発現誘導される未知遺伝子として単離できていた。しかし発現が変動しない

ハウスキーピング遺伝子も同時に多数とれてしまっていることが判明した。

cDNA subtraction法

結果、バックグランドは下がったが、

発現誘導される遺伝子はたいして増えなかった。

サブトラクションの切れ味が悪いと判断。

バックグランドを下げる最適化を２年近く続けた。

２年前にとれていたAIDを解析することになった。

これまでに失敗や経験から学んだ事

1, 方法論に凝りだすと目指すものを忘れがち！

何が最終目標か常に意識すべし！

２, がむしゃらにサイエンスに打ち込んでください。

その姿勢はいずれは評価されます。 経験 2

これまでに失敗や経験から学んだ事

1, 方法論に凝りだすと目指すものを忘れがち！

何が最終目標か常に意識すべし！

２, がむしゃらにサイエンスする姿勢は

必ず評価される。

Acknowledgements

分子遺伝研究室のみなさん

産婦人科の共同研究者 M. Nakamura, S. Kyo, and H. Fujiwara

耳鼻咽喉、頭頸部外科の共同研究者

S. Kondo, T. Yoshizaki

金沢大学