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Apport de la biologie moléculaire en onco-hématologie : exemple de la Leucémie Myéloïde Chronique
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Description 1ère patiente avec probable LMC (1827)
Alfred Velpeau (1795-1867)
Alfred Donné (1808-1878)
1844 : Description d’un cas similaire (« sang semi-purulent ») + observations microscopiques.La majorité des cellules sont « incolores » (globules blancs) et non rouges.
Historique LMC : découverte (1)
Autopsie • Hépatosplénomégalie• Aspect du Sang :
Symptômes • Fièvre• Fatigue• Abdomen gonflé
« Epais comme du gruau, davantage semblable à du pus qu’à du sang »
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Rudolf Virchow (1821-1902)
1845 Virchow, R. Frorieps Notizen, 36, 151-156
«Weisses Blut » Leucémie
La leucémie est une maladie autonome et progressive (=cancer ).
Historique LMC : découverte (3)
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Ernst Neumann (1834-1918)
• Les leucocytes sont produits dans la moelle osseuse
• Par une cellule unique capable d’auto-renouvellement
Croyances du XIXème siècle : Les globules rouges sont issus des globules blancs. Les globules blancs sont produits par les ganglions lymphatiques ou par la rate.
Historique LMC : Contexte
Claire Abbal/ARL-22.03.11
CSH
MonocytaireMyéloïde Erythroïde
Granulocytes Monocytes Erythrocytes
DIFFERENCIATION
Thrombocytes
Mo
elle
Oss
eu
seSa
ng
Mégacaryocytaire
lymphopoïèse
Progéniteur Myéloïde Commun
… … … …
Hematopoïèse
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Paul Ehrlich(prix Nobel 1908)
Invention de la coloration cellulaire
(1879)
Frottis sanguinLMC
Myélémie
+
Granulocytose
LMC : Caractérisation cellulaire du frottis sanguin
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Image Cytogenetics Gallery: Pathology Department University of Washington
P. Nowell &D. Hungerford
LMC et Chromosomes (1)
Découverte du chromosome de Philadelphie (Phi) (1960)
Claire Abbal/ARL-22.03.11
• La translocation t(9;22) génère un gène de fusion : BCR-ABL
• Le BCR-ABL code pour une protéine chimérique « fonctionnelle »
Découverte de la t(9;22) (1973)Janet D. Rowley
LMC , chromosomes et gènes
Claire Abbal/ARL-22.03.11
BCR-ABL
StimulationProlifération
Inhibition Apoptose
Instabilité génomique
Phénotype Malin CANCER
Adapté de DEININGER W.N. et al.,Blood, 2000, 96, 3343
Inhibition suppresseurs
tumeur
Effets de la protéine chimérique BCR-ABL
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Le BCR-ABL exerce ses effets via son activité Tyrosine Kinase (TK)
Proliferation
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Leu
cocy
tose
Nombre élevé
Myé
lém
ie
Nombre élevéPassage dans
le sang
BCR-ABL
Physiopathologie LMC
CSH CSL
Prolifération, immortalité
Différenciation OK
DIFFERENCIATION
Sang
Cellule souche hématopoïétique
Cellule souche leucémique BCR-ABL+
PromyélocytesMyélocytes
MétamyélocytesNon
segmentés
CellulesBCR-ABL+
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Elimination des érythrocytes
(choc hypotonique)
Cell. mononucléées+ Granulocytes
Sang Périphérique
Lysat cellulaire « ARN-stabilisé »
ARN
ADNc
Extraction
Transcriptioninverse
BCR-ABL+ ???Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Lyse préservant ARN
LMC : prise en charge du prélèvement
Claire Abbal/ARL-22.03.11
e1-a2
e14-a2
e19-a2
e13-a2
P1 (e1) P2 (e3)
P2 (e3)P’1 (e12-e13)
P2 (e3)P’1 (e12-e13)
P2 (e3)P’1 (e12-e13)
Détection du BCR-ABL au diagnostic
MBCR-ABL
BCR-ABL
521 pb
957 pb
342 pb
417 pb
PCR : amplification enzymatique d’une séquence d’ADN délimitée par des amorces homologues et spécifiques
mBCR-ABL
Claire Abbal/ARL-22.03.11
K562 (e14-a2) in HL-60
Rare e19-a2 « BCR-ABL »(960bp)
800
100 bp50 bp
Marqueurs de PM
150 200
1000
800
400
e14-a2(417 bp)
Claire Abbal/ARL-22.03.11
TRAITEMENTS (1980-2001)
Les Phases de la LMC
Chronique Accélération Blastique
Durée 5 ans 6 mois 3 mois
• IFN- ± Ara-C : non curatif + problèmes de tolérance
• Greffe allogénique : risquée, réservée aux <55 ans.
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Et si on bloquait spécifiquement le BCR-ABL ?
ApoptosisProliferation
+ Inhibiteur de Tyr Kinase (TKI)
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Edition du 28 Mai 2001
Imatinib Mesylate (Glivec®; Novartis)
• Le Glivec normaliseLa FS des patients LMCEn quelques semaines
• Mieux toléré que IFN
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Les inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) : une thérapie ciblée.
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Suivi de la réponse au traitement
Radich JP. Blood. 2009;114:3376-3381. Dx, diagnosis; FISH, fluorescence in situ hybridization; RT-PCR, real-time polymerase chain reaction.
Ch
arge
en
cel
lule
s le
ucé
miq
ues
(lo
g10
)
Dx
~5 log reduction
1-2-log reduction
CytogeneticsFISH
RT-PCR
Mois de Traitement
Temps© 2009 by American Society of Hematology (ASH). Reproduced with permission of ASH via Copyright Clearance Center.
RQ-PCR
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La RQ-PCR mesure la quantité de BCR-ABL en nombre de copies.
PROBLEMEBCR-ABLmes. ≠ BCR-ABLréel
CAR Dégradation d’ARN (proportionnelle au temps) Efficacité des étapes d’extraction d’ARN, de RT … Imprécision de mesure (dosage ARN, RQ-PCR)Imprécision du pipetage
Suivi de la réponse au traitement
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Suivi de la réponse au traitement
BCR-ABLréel=BCR-ABLmes x F(err)
ABLréel=ABLmes x F(err)
Mesure simultanée de l’expression d’un gène « housekeeping » : ABLNormalisation du BCR-ABL par l’ABL.
SOLUTION
Comme ABL est constant (temps, individus), le s valeurs BCR-ABL peuvent être comparées: d’un point de suivi à un autre chez un même patient d’un patient à l’autre (études cliniques)
à condition que les analyses comparées aient été faites dans le même laboratoire.
(BCR-ABL/ABL)local x FClocal = BCR-ABL % IS
Standardisation Internationale
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Molecular Response (IS)
Decreasing residualleukaemia
BCR-ABL
%, I
S
Total N
um
be
r of Le
ukae
mia
Ce
lls
RQ-PCR non detectedComplete Molecular Response
100
101
0.10.01
0.001
0
1012
1011
1010
109
108
107
106
105
104
103
102
101
0
Major Molecular Response
Diagnostic
Claire Abbal/ARL-22.03.11
P = .0186%
95%
62%
58%
P = .0186%
95%
62%
58%
≤ 0.1% (n = 164)
>0.1-1% (n = 47)
>1-10% (n = 25)
>10% (n = 13)
BCR-ABL % (IS)
Wit
ho
ut
Eve
nt,
%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Months Since Start of Treatment
0 12 24 36 48 60 72 84
IRIS: Achievement of MMR by 18 Months Associated With Improved EFS
Hughes TP, et al. Blood. 2008;112:129-130 [abstract 334] (oral).
* MMR defined as BCR-ABL% (IS) ≤ 0.1.
EFS, event-free survival; MMR, major molecular response.
Claire Abbal/ARL-22.03.11
0.001
0.01
0.1
1
10
100
Cf co
mm
en
taire
08
.01
.20
07
29
.08
.20
07
14
.11
.20
07
05
.03
.20
08
26
.06
.20
08
15
.01
.20
09
BC
R/A
BL
%
sang
moelle
seuil de détection
Mme B, LMC, M
StopImatinib
(effets 2ndaires)
Nilotinib
Claire Abbal/ARL-22.03.11
M A, LMC
0.001
0.01
0.1
1
10
100
Dia
g
MR
D2
MR
D4
MR
D6
MR
D8
MR
D1
0
MR
D12
MR
D14
MR
D1
6
MR
D1
8
BC
R/A
BL
/A
BL
%
sang
moelle
seuil de détection
valeur corrigée
Imatinib (mg/j) Dasatinib (mg/j)
400 600 800 600 800 100
11 m 9 m 10 m 6 m 2 m 15 m
Claire Abbal/ARL-22.03.11
0.0001
0.001
0.01
0.1
1
10
100
03
.08
.04
13
.10
.04
11
.11
.04
05
.01
.05
30
.03
.05
23
.05
.05
23
.06
.05
24
.08
.05
03
.11
.05
18
.12
.20
08
BC
R/A
BL
%
sang
moelle
seuil de détection
Mme S, LMC MBCR-ABL,
Réfractaire au glivec, greffée en 2005
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Mise en évidence et identification d’une mutation
PCR de la portion génique codant pour le domaine KD du BCR-ABL et séquençage
Intérêt : une mutation résistante à un TKI peut être sensible à un autre TKI adaptation thérapeutique selon l’identité de la mutation
Mutations in KD domain of BCR-ABL confer resistance to TKIs
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Différents types de mutation
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Orientation clinique selon le type de mutation
T315I greffe cell. souche allogénéique ou nouvelle molécule en test
Q252H, V299L, F317 Nilotinib plutôt que Dasatinib
Y253H, E255K/V, F359V/C Dasatinib plutôt que Nilotinib
Carole GERBEX Frédéric Bauer
Marzia Terzaroli-Wirz Stéphane Mathieu
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Laboratoire d’Hématologie Moléculaire BH18-632
Dr C. AbbalMme M. Terzaroli-WirzMme C. GerbexM. Frédéric BauerM. Stéphane Mathieu
Claire Abbal/ARL-22.03.11