aspetti microbiologici: dalla raccolta dei campioni allinterpretazione critica dei risultati 24...
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Aspetti microbiologici:
dalla raccolta dei campioni all’interpretazione critica dei risultati
24 Novembre 2010 dott.ssa Claudia Venturelli
obiettivi1. RICERCA ED ERADICAZIONE
DELL’AGENTE INFETTIVO 2. IDENTIFICAZIONE DELLA PROBABILE
FONTE D’ INFEZIONE:• Respiratoria • Addominale• Cutanea • Vie urinarie• SNC • Protesi e cateteri
La DiagnosiColture appropriate devono essere sempre ottenute prima di iniziare la terapia antibiotica.Per ottimizzare l'identificazione degli organismi che causano l'infezione, devono essere prelevate almeno due emocolture di cui una per via percutanea ed una prelevata attraverso ciascun catetere vascolare, a meno che il catetere non sia stato introdotto di recente (< 48 ore). E’ raccomandato il prelievo prima della terapia antibiotica e secondo quanto richiesto dalla clinica, di colture da altri siti come urina, fluido cerebrospinale, ferite, secrezioni delle vie respiratorie o altri fluidi corporei.
La terapia antibiotica
La terapia antibiotica deve essere iniziata possibilmente entro la prima ora dal riconoscimento della sepsi grave, dopo il prelievo delle colture appropriate.
La terapia antibiotica
Il regime antimicrobico iniziale deve sempre essere rivalutato dopo 48-72 ore sulla base dei dati microbiologici e clinici, con lo scopo di impiegare antibiotici a spettro più stretto per limitare lo sviluppo di resistenze, ridurre la tossicità, ridurre i costi. (DE-ESCALATION)
Il controllo del focus infettivo
In ogni paziente con sepsi grave si deve valutare se è presente un focus infettivo sensibile alle misure di controllo, nello specifico il drenaggio di un ascesso o di un focus locale di infezione, l'asportazione di tessuto necrotico infetto, la rimozione di un presidio potenzialmente infetto o del controllo definitivo di un focus che si sta infettando per contaminazione microbica .
Bundle (fascio/pacchetto):a. insieme di interventi applicati ad un processo morboso che, se usati contemporaneamente, danno un outcome migliore rispetto alla applicazione individuale.
Sepsis resuscitation bundle
0-6 ore Sepsis management bundle
entro 24 ore
Non appena il paziente avverte il brivido e /o segni e sintomi di febbre
La rapidità di esecuzione in rapporto all’evento cruciale , perché …
1. La batteriemia è nella maggior parte dei casi un evento acuto e fuggevole
2. La clearance microbica è molto rapida
3. Il picco febbrile segue la poussee batteriemica di 30-60 min.
Quanti prelievi effettuare ?
Effettuare almeno 2 prelievi :1 da vena periferica1 da CVCParalleli = Allo stesso tempo Non scartare la prima quantità di sangue
prelevato perché è quella con la più alta concentrazione di microbi
Contraddistinguere ciascun prelievo con l’etichetta corrispondente alla modalità di prelievo.
Indicare su ciascun prelievo l’ora
CVC CVC VenaPeriferica
VenaPeriferica
Modalità di prenotazione in
Hospital Web
delle emocolture parallele e seriate
Cosa fare nel caso di cateteri a due vie ?
Nel caso di cateteri a piu’ lumi (ramo bianco e rosso) eseguire 3 prelievi:
1 da vena periferica 1 dal lume rosso 1 dal lume bianco
Tutti allo stesso tempo
Ricordarsi di applicare le corrispondenti
etichette correttamente ed indicare il tipo di lume sul flacone
Come conservare e inviare i flaconi alla Microbiologia ?
I flaconi, tenuti a temperatura ambiente, dovrebbero pervenire alla Microbiologia il prima possibile ed essere posti immediatamente negli appositi incubatori
L’emocoltura deve essere ripetuta nei giorni successivi ?
No. Non ci sono indicazioni per il prelievo nei giorni successivi per il follow up, perché quest’ultimo si basa sui dati clinici.
Ci sono due eccezioni:- l’endocardite (la persistenza dell’infezione può
richiedere una modifica della terapia)- le sepsi da S. aureus in cui il prelievo dopo 2 e 4 giorni
può fornire utili indicazioni di complicanze infettive insorte per via ematogena (es. endocardite o osteomielite) o per estensione dell’infezione in altre sedi (tromboflebite settica, ascessi).
Non eseguire colture di routine dei cateteri rimossi da pazienti in unita intensiva.
Analizzare microbiologicamente solo quei cateteri sospettati di essere la fonte dell’infezione o la causa della sepsi
Infatti fino al 20% dei cateteri venosi centrali sono colonizzati
alla rimozione; la maggior parte non sono associati con infezioni locali o batteriemie/fungemie.
Questo sottoporrebbe a lavoro inutile e al rischio di terapie antibiotiche inappropriate
LIQUIDI BIOLOGICI (peritoneale, ascitico, biliare)Eseguire il prelievo prima della terapia antibiotica
CAMPIONI DI LIQUIDI CORPOREI RACCOLTI DA ASPIRAZIONE PERCUTANEA1. Pulire il sito della puntura con alcool e antisepsi del sito di aspirazione.2. Aspirare in asepsi il campione di liquido necessario con siringa e ago sterili. 3. Introdurre immediatamente una parte di liquido nei flaconi per aerobi ed anaerobi.4.Un prelievo Adeguato è costituito da almeno 0,5 cc di fluido o tessuto trasportato al
laboratorio per la ricerca degli anaerobi
CAMPIONI DI LIQUIDI CORPOREI RACCOLTI DA TUBI DI DRENAGGIOLa raccolta di liquidi da drenaggio deve essere scoraggiata in favore di una diretta aspirazione
dall’area drenante1. Disinfettare il tubo con una soluzione disinfettante, lasciare asciugare ed aspirare il liquido.2. Introdurre il campione nei contenitori sterili come da protocollo di laboratorio.3. La coltura di fluidi da drenaggi posizionati da piu’ di 2 giorni potrebbe non essere
attendibile.
TRASPORTO DEL CAMPIONE1. Inviare in laboratorio quanto prima possibile. 2. Non refrigerare.
Sepsi addominali: quando e quali colture?
Si raccomanda l’esecuzione di un solo prelievo in quantità sufficiente da inviare in microbiologia per la ricerca degli anaerobi ed aerobi in apposito terreno di trasporto
Il tampone non costituisce un idoneo campione per la ricerca degli anaerobi
SodomkinJS, et al. Clin Infect Dis.2003; 37: 997-1005
Sepsi addominali: quando e quali colture?
I prelievi dai drenaggi addominali possono condurre a risultati errati per la contaminazione della porzione distale del drenaggio, con conseguente copertura antibiotica non necessaria
SodomkinJS, et al. Clin Infect Dis.2003; 37: 997-1005
Ascessi ed essudati da ferita chirurgica
INDICAZIONI GENERALI Raccogliere i campioni preferibilmente prima di
iniziare la terapia antibiotica Pulire la cute circostante con soluzione fisiologica
sterile.Per ferite chiuse e aspirati: Antisepsi della cute con soluzione di clorexidina 2% o alcool 75% .
Per ferite aperte: prelevare un frammento lavando con soluzione fisiologica sterile prima della raccolta. Prelevare tessuto infetto piuttosto che un frammento superficiale. Evitare la raccolta con tampone per la scarsa significatività, se è possibile eseguire un aspirato o un prelievo bioptico.
CONTENITORI: Flaconi per aerobi e anaerobi
TECNICA DI RACCOLTA
Ascessi chiusi: Aspirare il materiale infetto con ago e siringa, inserire l’ago nel tessuto in
varie direzioni (se possibile).
Se l’aspirazione non porta alla raccolta del campione, si può valutare l’opportunità di iniettare nel sottocute della soluzione salina sterile e aspirare nuovamente.
Inoculare il contenuto nei flaconi sterili per aerobi e anaerobi
Pus: Aspirare la porzione profonda della lesione o l’essudato, con siringa e
ago sterili. Inviare come per ascessi chiusi.
Tessuti e campioni bioptici: Raccogliere una quantità sufficiente di tessuto evitando le aree
necrotiche. Raccogliere i frammenti di tessuto piccoli nel flacone per aerobi e per
anaerobi
Utilizzare i tamponi solo se non può essere ottenuto tessuto o aspirato
Per i prelievi da ferita :Rimuovere i frammenti superficiali tramite irrigazione e pulire con soluzione salina sterile; se la ferita è asciutta raccogliere due campioni imbevuti di soluzione salina sterile; ruotare delicatamente il tampone sulla superficie della ferita per 5 volte, specialmente dove c’è pus o nelle aree infiammate
TRASPORTO DEL CAMPIONE Non refrigerare o incubare prima o durante il trasporto. Se non è possibile inviare subito il campione al laboratorio,
mantenerlo a temperatura ambiente. Consegnare gli aspirati ed i tessuti al laboratorio entro 30
minuti e comunque il prima possibile
Sistema di prelievo/raccolta specifico per anaerobi : prelievo con siringa
Sistema di prelievo/raccolta specifico per anaerobi con tampone
Nuovi scenari nella diagnosi microbiologica
di sepsi
Company ProductName
MainMethod
Blood prepMethod
DetectionPathogens
DetectionMethod
Test Times
SeegeneSeeplex® Sepsis Test
Multiplex PCRWhole bloodNo culture
54 Bacteria 6 Fungi(Resistances: 3)
Automated CE or Agarose
4 - 6 hr
Roche SeptiFastReal-timePCR
Whole blood(column)
19 bacteria 6 fungi(Resistances :1)
Real-Time(melting curve)
6 hr
BAGHealth Care
Hyplex®Blood Screen
Multiplex-PCR-ELISA
Blood culture(column)
10 bacteria (Resistances :1)
ELISA 4.5 - 6 hr
SIRS LAB VYOO™ Multiplex PCR LOOXSTER®34 bacteria 6 fungi(Resistances :5)
GelChipsequencing
6 hr
MolzymSepsiTest™Blood
qPCR MolYsis28 bacteria 5 fungi
Sequencing 4 - 6 hr
BACTfishBACTfish™Sepsis kit
in situHybridization
9 bacteria3 fungi
Fluorescentmicroscope
1 hr
MobidiagSepsis
ProveIt™ Lab-on-chip
Blood culture(column)
13 bacteria (Resistances :1)
chip 3 hr
Current Sepsis Test Providers
3. Il regime antimicrobico iniziale dovrebbe sempre essere rivalutato dopo 48-72 ore sulla base dei dati microbiologici e clinici, con lo scopo di impiegare antibiotici a spettro più stretto per limitare lo sviluppo di resistenze, ridurre la tossicità, ridurre i costi.
Grado E
MIC = misura della attività antimicrobica “in vitro”
Utilità per il clinico Valutazione comparativa della
possibile efficacia “in vivo”
quale farmaco utilizzare ?
Interpretazione MIC (mg/L)
Ceftazidime S 4
Imipenem S 1
Piperacillina S 32
Ciprofloxacina R 8
Gentamicina S 2
Tobramicina S 1
Amikacina S 1
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1| 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Piperacillina
Ceftazidime
Cefepime
Imipenem
Meropenem
Aztreonam
Gentamicina
Tobramicina
AmikacinaCiprofloxacina
Levofloxacina
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
MIC (mg/L) InterpretazioneRange MIC=
S
Ceftazidime 4 S < 1 - 8
Imipenem 1 S < 0.5 - 4
Piperacillina 32 S < 0.5 - 64
Ciprofloxacina 8 R < 0.25 - 4
Gentamicina 2 S < 0.5 - 4
Tobramicina 1 S < 0.5 - 4
Amikacina 1 S < 0.5 - 16
Pseudomonas aeruginosa
Trend % I/R Escherichia coli 2009-ott.2010
Tutti Materiali ND
ESBL
Trend % I/R P.aeruginosa 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND
Trend % I/R Klebsiella pneumoniae 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND
Produzione di ESBL (CTX-M-15)+
OMP K36
Produzione di ESBL (CTX-M-15)+
OMP K36
ERT
IMIMEM
2007-2008: Klebsiella pneumoniae da vari ospedali
Diffusione clonaleDiffusione clonale
D’Andrea et al., 19th ECCMID
Ampicillina > 16Amoxi/Clav > 16Pip/Tazo > 64Cefotaxime > 16Ceftazidime > 32Cefepime > 16Aztreonam > 16Imipenem 1-2Meropenem 2-4Ertapenem > 8Tigeciclina 1-2Colistina < 1 Isolatoproduttore di ESBL
Amikacina > 32Gentamicina > 8Tobramicina > 8TMP/SXT > 2Ciprofloxacina > 32Levofloxacina > 32
89 Klebsiella spp. 59 Enterobacter spp. (isolati non sensibili ai carbapenemi)
Woodford et al., JAC 2007; 50:582
ESBL oproduzione di AmpC
+perdita di porine
Produzione di carbapenemasi
a serina(KPC, SME, IMI)
Klebsiella pneumoniaeresistente ai carbapenemi
Resistenza emergente ai carbapenemi nelle Enterobacteriaceae
Produzione di
metallo--lattamasi
(VIM, IMP)
EARSS 2008
P. aeruginosa, Acinetobacter, altri GNNF, Enterobacteriaceae P. aeruginosa, Acinetobacter, altri GNNF, Enterobacteriaceae
VIM-1 a 18IMP-1 a 23
METALLO-BETA-LATTAMASI: UN PROBLEMA GLOBALE
Acinetobacter SIM-1
P. aeruginosaP. aeruginosa
SPM-1GIM-1
P. aeruginosaAIM-1
KHM-1 Citrobacter freundii
EMERGENZA DI KLEBSIELLA PNEUMONIAE PRODUTTORE DI KPC IN ITALIAGioconda Brigante1, Silvia Bracco1, Marco Maria D’Andrea2, Tommaso Giani2, Nicoletta Corbo1, Mario Tavola3, Gian Maria Rossolini2, Francesco Luzzaro1
1Laboratorio di Microbiologia e Virologia, Ospedale A. Manzoni, Lecco2Dipartimento di Biologia Molecolare, Sezione di Microbiologia, Università di Siena3Unità di Terapia Intensiva, Ospedale A. Manzoni, Lecco
Tra maggio e giugno 2009, Klebsiella pneumoniae produttore di KPC-2 è stata
riscontrata in 3 pazienti ricoverati presso la Terapia Intensiva dell’Ospedale A.
Manzoni (Lecco). Gli isolati erano caratterizzati da resistenza ad alto livello verso
cefalosporine, fluorochinoloni e piperacillina-tazobactam, mentre gentamicina (MIC, 2
mg/L), tigeciclina (MIC, 2 mg/L) e colistina (MIC, 0.5 mg/L) mantenevano la loro
attività. Per quanto riguarda i carbapenemi, gli isolati presentavano MIC elevate (> 1
mg/L) per tutte le molecole testate (ertapenem, imipenem e meropenem) e test di
Hodge positivo, indicando la possibile produzione di carbapenemasi. La presenza di
enzimi di tipo KPC è stata sospettata sulla base dei risultati dei test di conferma
fenotipici (test di sinergia con EDTA negativo, test di inibizione con acido boronico
positivo) e definitivamente confermata mediante sequenziamento genico.
AMCLI 2009
Suggested action plan for rapid implementation of infection control measures in settings with sporadic occurrence or complete absence of carbapenemase-producing Gram-negatives
NDM-1: una nuova MBL negli enterobatteri
Emergenza e rapida diffusione di E. coli produttore di carbapenemasi NDM-1
NDM-1
Resistenza multipla agli antibiotici in Escherichia coli produttore di carbapenemasi NDM-1
Trend % I/R Acinetobacter baumanni MDR 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND
In diminuzione i casi di Acinetobacter baumanni MDR
Trend % I/R Enterobacteriaceae (escluso E.coli) 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND
Differenze CLSI – EUCAST CARBAPENEMI e Enterobacteriaceae
CLSI 2010 EUCAST 2010
S ≤ I R ≥ S ≤ I R ≥
Doripenem - - - 1 2 - 4 8
Ertapenem 2 4 8 0.5 1 2
Imipenem 4 8 16 2 4 - 8 16
Meropenem 4 8 16 2 4 - 8 16
Breakpoints EUCAST più bassi rispetto al CLSI
Emocolture 2010 (1)
Emocolture 2010 (2)
Clone circolante di P.aerugionosa R ai carbapenemi
% I/R per Reparti
Caratteristiche Cliniche delle ESBL
Anche quando sensibili in vitro alle Cefalosporine di quarta generazione, si hanno fallimenti terapeutici in clinica
Generano difficoltà cliniche a causa della resistenza crociata con altre classi di antibiotici (p.es. Aminoglicosidi)
Sono associate ad epidemie ospedaliere caratterizzate da alte morbidità e mortalità
Determinano un sovrautilizzo di altri antibiotici ad ampio spettro
ESBLAmpC
inducibile
AmpC
plasmidica
Posizione dei geni di resistenza
Plasmidica Cromosomica Plasmidica
Più spesso trovata in
E. coli
Klebsiella spp.
P.mirabilis
altre
Enterobacter
C. freundii
S. marcescens
M. morganii
Providencia spp.
Proteus rettgeri
E. coli
Klebsiella spp.
Inibizione da Acido clavulanico SI NO NO
Cefoxitina - Cefotetan S R R
Test fenotipici A volte No ?Refertazione
Refertare tutte le Cefalosporine, Penicilline e Aztreonam come resistenti
Aggiungere commento ?
…. riepilogando :
β-lattamasi di tipo AmpC
cromosomica
costitutivaE. coli
ShigellaP.mirabilis
a basso livello
inducibile(transitoria)
EnterobacterC. FreundiiM. MorganiiProvidencia
SerratiaP.aeruginosa
derepressa(stabile)
plasmidicaE. coli
Klebsiella
ad alto livello(ceppi iperproduttori)
Problematiche Cliniche della -lattamasi AmpC
Alcune molecole ( aminocilline, cef. 1°g, a.clav.) sono forti induttori
Altre ( cef. 3°g., ureidopenicilline ) sono deboli induttori ma possono selezionare mutanti derepressi
La produzione di enzima indotta o costitutiva può causare fallimenti terapeutici
-lattamasi AmpC derepressa
Le Cefalosporine selezionano mutanti derepressi da popolazioni inducibile
Selezione si ha in circa il 20% delle batteriemia da Enterobacter
molti isolati di Enterobacter e di C. freundii sono oggi derepressi al primo isolamento
CEFTAZIDIMEa
e/oCEFOTAXIME
Screening positivo per la produzione di
ESBL
MIC 2 mg/L
Escherichia colib
Proteus mirabilisKlebsiella oxytocaKlebsiella pneumoniae
Test di conferma per la
produzione di ESBL
ESBL –
SI
NO
Specie che producono -lattamasi cromosomiche di classe C(per esempio, Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Morganella morganii, Providencia spp. )
Test di conferma per la
produzione di ESBL
Screening e conferma della produzione di ESBL nelle Enterobacteriaceae
Microbiologia Medica 2007; 22:281-290
BETA-LATTAMICI edEnterobacteriaceae
CLSI 2009
Regola esperta:in presenza di ESBL,refertare tutte le penicilline, le cefalosporine e l’aztreonam RESISTENTI
CLSI 2010 EUCAST 2010
S ≤ I R ≥ S ≤ I R ≥
Cefepime 8 16 32 1 2 - 4 8
Cefotaxime 1 2 4 = 1 2 4
Ceftazidime 4 8 16 1 2 - 4 8
Ceftriaxone 1 2 4 = 1 2 4
Aztreonam 4 8 16 1 2 - 4 8
Beta-lattamici ed Enterobacteriaceae
Differenze tra criteri interpretativi
secondo EUCAST e CLSI
S E R V I Z I O DI M I C R O B I O L O G I A E V I R O L O G I A ** LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA ** DIRETTORE DOTT. FABIO RUMPIANESI SIG. C UROLOGIA/156
A nato il :30/07/1951 prenotato il 17/11/2010 n. 459 prelievo del 17/11/2010 alle 18:06 Descrizione Esito ---------------------------------------------------------------------------- MICROBIOLOGIA Materiale: SANGUE Colturale batteri,miceti aerob. Automazione Bactec POSITIVO Microscopico da fl.Bactec aerobio Bacilli Gram-Negativi
Colturale batteri anaerobiosi Automazione Bactec POSITIVO Microscopico da fl.Bactec anaerob Bacilli Gram-Negativi Identificazione 1 anaerobiosi Klebsiella pneumoniae ssp pneumonia Antibiogramma 1 anaerobiosi Klebsiella pneumoniae ssp pneumonia Antibiogramma definitivo: la determinazione delle MIC per piperacillina/tazobactam, imipenem e meropenem sono state eseguite con metodo E-TEST. - range sensibilità M.I.C. - Amikacina 4 S <= 16 Amoxicillina/A.CLAV. >=32 R <= 8 Ampicillina >=32 R <= 8 Cefazolina >=128 R <= 8 Cefepime >=64 R <= 8 Cefotaxime >=64 R <= 8 Ceftazidime >=64 R <= 8 ESBL POS + Gentamicina >=16 R <= 4 Imipenem 0,25 S <= 4 Levofloxacin >=8 R <= 2 Meropenem 1,5 S <= 1 Norfloxacina >=16 R <= 4 Piperacillina >=128 R <= 16 Piperacillina/tazobactam >=256 R <= 128 Trimetoprim/Sulfam. >=320 R <= 40 Tygeciclina 2 S <=0,012 =>256