avaliação da vacina dna-hsp65 na indução de auto-agressão...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
ÁREA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
Avaliação da Vacina DNA-hsp65 na Indução de Auto-Agressão Tecidual
Deison Soares de Lima
Ribeirão Preto 2006
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DEISON SOARES DE LIMA
Avaliação da Vacina DNA-hsp65 na Indução de Auto-Agressão Tecidual
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Prof. Dr. Célio Lopes Silva
Ribeirão Preto 2006
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO OU PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de
Ribeirão Preto / USP
Lima, Deison Soares de
Avaliação da Vacina DNA-hsp65 na Indução de Auto-Agressão Tecidual Ribeirão Preto, 2006. 114 pp. 28cm Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, USP, Área de Concentração em Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Dr. Célio Lopes Silva 1. Tuberculose 2. Vacina de DNA. 3. Proteínas de Choque Térmico
– Hsp65 4. Auto-Imunidade.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me iluminado a cada dia desta jornada e permitir que mais um sonho se concretize; Ao Prof. Dr. Célio Lopes Silva, por ter me recebido em seu laboratório, pelo belo exemplo profissional que contribuiu imensamente à minha formação, pela orientação, ensinamento, disponibilidade, atenção, paciência e amizade dispensados a mim durante estes anos; À Dra. Verônica Coelho, pela co-orientação, dedicação, paciência e fundamental contribuição para minha formação científica; À Profa. Dra. Arlete Castelo também por ter me recebido de braços abertos e pela valiosa contribuição com sugestões para realização deste trabalho; À Profa. Dra. Vânia Bonato, pelo exemplo de dedicação e compromisso profissional e pela contribuição intelectual durante a realização deste trabalho; À Profa. Dra. Alexandrina Sartori, pela contribuição intelectual durante a realização deste trabalho; Aos Profs. Drs. Benedito Fonseca e Marcelo de Franco, pela prontidão em participar da avaliação deste trabalho e pela disponibilidade, atenção e contribuição com sugestões para a correção desta dissertação; À Dra. Eloísa Bonfá, pelas sugestões e por disponibilizar a estrutura de seu laboratório para realização das dosagens de anticorpos anti-DNA; À Izaíra Tincani Brandão e Ana Paula Masson, pelo auxílio técnico durante os experimentos, pela paciência e amizade; Aos Drs. Édson Garcia Soares e Luiz Benvenuti, pelas discussões e análises dos cortes histológicos; À Ana Maria da Rocha, pela dedicação, disponibilidade, paciência e pelo belo e fundamental auxílio técnico com a confecção dos cortes histológicos; À Margareti Vendramini, pela colaboração e pelo auxílio técnico na realização das técnicas para dosagem de anticorpos anti-DNA; Aos amigos do laboratório: Ana Paula Trombone, Carolina, Cássia, Carlos Rodrigo, Daniele, Eduardo, Fábio, Fabiani, Giovanna, Luis Henrique, Juliana, Júlio, Leila, Luciana, Marina, “Marininha”, Patrícia, Pryscilla, Ricardo, Rogério, Rubens, Sandra,
Sheila, Silvia, Tatiana, Thiago, Walter, Wendy e Willian pelos conhecimentos compartilhados, pela companhia e pelos momentos de descontração; Em especial, as amigas Patrícia e Tatiana, por termos passado por tudo juntos, desde os estudos para o exame seletivo; Em especial as amigas Patrícia e Tatiana por termos passado por tudo juntos, desde os estudos para a para o exame seletivo; À amiga e para sempre professora, Adriana Malheiro, por ter orientado meus primeiros passos na vida acadêmica, desde a graduação; À Profa. Dra. Lúcia Faccioli, por ter sido a primeira a me acolher como estagiário em seu laboratório; Aos docentes da Área de Imunologia Básica e Aplicada pela contribuição para minha formação; À secretária Ana Cristine, pelo exemplo de competência e dedicação à pós-graduação, pela amizade e por se preocupar como uma mãe com nós alunos; Ao Ronaldo e a Rosângela, pela amizade e pelos serviços prestados; Aos colegas da administração do Centro de Pesquisas em Tuberculose (CPT) Ana, Carlos, Helena, Marcos e Vanessa pela prontidão e serviços prestados que foram essenciais para realização deste trabalho. E ao Rogério, pelo auxílio com a impressão deste trabalho e por sempre estar disposto em ajudar; À todos os colegas da pós-graduação e aos funcionários do departamento pelas conversas do dia-a-dia e pelo agradável convívio; Aos meus sogros, Luis Carlos e Lúcia pelos momentos de descontração e principalmente pela compreensão, apoio e amizade; Aos familiares e amigos: Dener, Marisa, Mayara, Bruno L., Alysson, Deila, Giovane, Caíque, Caio, Maria, Rocha, Iolanda, Matheus, Leandro, Bruno A., Bruninho, Leandro L., Marcela F., Alexandre e Marcela, pelos momentos de descontração e por estarem sempre ao meu lado; À Rede-TB e a FAEPA pelos auxílios concedidos para divulgação deste trabalho em eventos científicos, e à CNPq pela concessão da bolsa de mestrado.
A todos...
Muito Obrigado!!!
SUMÁRIO
ABREVIATURAS.........................................................................................................i
RESUMO....................................................................................................................iv
ABSTRACT...............................................................................................................vii
1- INTRODUÇÃO........................................................................................................1
1.1 – Tuberculose............................................................................................................ 2
1.2 - Imunidade a Tuberculose ...................................................................................... 3
1.3 - Vacina contra Tuberculose .................................................................................... 5
1.4 - Proteínas de Choque Térmico .............................................................................. 9
1.5 - Proteínas de Choque Térmico e Auto-Imunidade ............................................. 10
2 - OBJETIVOS.........................................................................................................15
2.1 - Objetivo Geral: ...................................................................................................... 15
2.2 - Objetivos Específicos: .......................................................................................... 15
3 - DELINEAMENTO EXPERIMENTAL....................................................................17
3.1 - Protocolo experimental A..................................................................................... 17
3.2 - Protocolo experimental B..................................................................................... 19
4 - MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................22
4.1 – Animais ................................................................................................................. 22
4.2 - Vacina de DNA-hsp65.......................................................................................... 22
4.3 - Obtenção dos plasmídeos recombinantes pVAX-Hsp65 e pVAX ................... 23
4.4 - Avaliação da integridade dos plasmídeos ......................................................... 24
4.5 - Análise da pureza das vacinas gênicas ............................................................. 25
4.6 – Imunizações ......................................................................................................... 26
4.8 - Desafio dos animais com Mycobacterium tuberculosis .................................... 27
4.9 - Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para dosagem de anticorpos anti-Hsp65 e
anti-Hsp60...................................................................................................................... 27
4.10 - Ensaio de Imunofluorescência Indireta (IFI) para determinação de
anticorpos anti-DNA ...................................................................................................... 28
4.11- Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para dosagem de anticorpos anti-DNA.... 28
4.12 - Análise histopatológica ...................................................................................... 29
4.13 - Análise estatística .............................................................................................. 30
5 – RESULTADOS....................................................................................................32
5.1 - Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 ............. 32
Protocolo A ............................................................................................................. 32
5.2 - Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60 ...................... 34
Protocolo A ............................................................................................................. 34
5.3 - Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 ............. 36
Protocolo B ............................................................................................................. 36
5.4 - Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60 ...................... 38
Protocolo B ............................................................................................................. 38
5.5- Determinação da produção de anticorpos anti-DNA por IFI ............................. 40
5.6 - Determinação da produção de anticorpos anti-DNA por ELISA ...................... 42
5.7 - Avaliação Histopatológica.................................................................................... 44
6 – DISCUSSÃO.......................................................................................................77
7 – CONCLUSÕES ...................................................................................................89
8 -- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................91
9 – ANEXO..............................................................................................................105
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Mapa esquemático do vetor plasmideal pVAX1....................................22 Figura 2: Perfil eletroforérico do DNA plasmideal purificado – pVAX e pVAX-
hsp65.................................................................................................................24 Figura 3: Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 -
Protocolo A.........................................................................................................33 Figura 4: Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60 -
Protocolo A........................................................................................................35 Figura 5: Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 -
Protocolo B.. ......................................................................................................37 Figura 6: Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60.............39 Figura 7: Determinação de anticorpos anti-DNA (Imunofluorescência)................41 Figura 8: Determinação da produção de anticorpos anti-DNA (ELISA).................43 Figura 9: Avaliação histológica do Pâncreas - Protocolo A...................................47 Figura 10: Avaliação histológica do Pâncreas - Protocolo B.................................48 Figura 11: Avaliação histológica da Articulação - Protocolo A..............................49 Figura 12: Avaliação histológica da Articulação - Protocolo B..............................50 Figura 13: Avaliação histológica do Tecido Encefálico - Protocolo A....................51 Figura 14: Avaliação histológica do Tecido Encefálico - Protocolo B....................52 Figura 15: Avaliação histológica da Tireóide - Protocolo A...................................53 Figura 16: Avaliação histológica da Tireóide - Protocolo B...................................54 Figura 17: Avaliação histológica do Fígado - Protocolo A.....................................55 Figura 18: Avaliação histológica do Fígado - Protocolo B.....................................56 Figura 19: Avaliação histológica do Rim - Protocolo A.........................................57 Figura 20: Avaliação histológica do Rim - Protocolo B..........................................58
Figura 21: Avaliação histológica da Adrenal - Protocolo A....................................59 Figura 22: Avaliação histológica da Adrenal - Protocolo B....................................60 Figura 23: Avaliação histológica do Coração - Protocolo A...................................61 Figura 24: Avaliação histológica do Coração - Protocolo B...................................62 Figura 25: Avaliação histológica do Músculo Esquelético - Protocolo A...............63 Figura 26: Avaliação histológica do Músculo Esquelético - Protocolo B...............64 Figura 27: Avaliação histológica do Globo Ocular - Protocolo A...........................65 Figura 28: Avaliação histológica do Globo Ocular - Protocolo B...........................66 Figura 29: Avaliação histológica da Pele - Protocolo A.........................................67 Figura 30: Avaliação histológica da Pele - Protocolo B.........................................68 Figura 31: Avaliação histológica dos Intestinos delgado e grosso - Protocolo A.......69 Figura 32: Avaliação histológica dos Intestinos delgado e grosso - Protocolo B.......70 Figura 33: Avaliação histológica do Pulmão - Protocolo A........................................71 Figura 34: Avaliação histológica do Baço - Protocolo A........................................72 Figura 35: Avaliação histológica do Timo - Protocolo A........................................73 Figura 36: Avaliação histológica do Linfonodo Poplíteo - Protocolo A..................74 Figura 37: Avaliação histológica do Linfonodo Inguinal - Protocolo A...................75
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ii
ABREVIATURAS
ACF: Freund's Complete Adjuvant - Adjuvante Completo de Freund
Ag85B: Antigen 85B - Antígeno 85B
AIDS: Acquired Immunodeficiency Syndrome - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
APC: Antigen Presenting Cell – Célula Apresentadora de Antígeno
BAAR: Bacilo Álcool Ácido Resistente
BCG: Bacilo de Calmette-Guérin
CpG: Dinucleotídeos citosina-guanina, seqüências CG imunomodulatórias.
CR: Complement Receptor - Receptor de Complemento
DMT: Dimicolato de trealose
DNA: Deoxyribonucleic Ácid - Ácido Desoxiribonucléico
dsDNA: Fita dupla de DNA
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – Ensaio Immunoenzimático de Adsorção
ESAT-6: 6-kDa Early Secreated Antigen Target
GAD: Descarboxilase do Ácido Glutâmico
H. pylori: Helicobacter pylori
HIV: Human Immunodeficincy Virus – Vírus da Imunodeficiência Humana
HSP: Heat Shock Proteins – Proteínas de Choque Térmico
Hsp65: Proteínas de Choque Térmico de 65 kilodaltons
IFI: Imunofluorescência Indireta
IFN-γγγγ : Interferon-gama
IgG: Immunoglobulin G – Imunoglobulina G
IL: Interleukin – Interleucina
LAL: Lisado de amebócito de Limulus sp
LAM: Liporabinomanan – Liporabinomanana
LES: Lupus Eritematoso Sistêmico
LPS: Lipopolissacarídeo
iii
M. leprae: Mycobacterium leprae
M. tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis
MALT: Tecido Linfóide Associado a Mucosa
MHC: Major Histocompatibility Complex – Complexo Principal de Histocompatibilidade
NK: Natural Killer
NO: Nitric Oxide – Óxido Nítrico
NOD: Nonobese Diabetic – Diabético não obeso
NTN: Nefrite Nefrotóxica
OMS: Organização Mundial da Saúde
PBM: Proteína Básica Mielínica
PBS: Phosphate Buffered Salin – Salina Tamponada com Fosfato
PPD: Derivado protéico purificado da tuberculina
RNA: Ribonucleic Acid – Ácido Ribonucleico
SFB: Soro Fetal Bovino
SPF: Specific Pathogen Free – Livre de Patógenos Específicos
ssDNA: Fita simples de DNA
STZ: Streptozotocin – Streptozotocina
TAO: Oftalmopatologia Associada a Tireóide
TB: Tuberculose
TCR: T Cell Receptor – Receptor da Célula T
TGF: Tumoral Growth Factor – Fator de Crescimento Tumoral
Th: T helper – linfócito T auxiliar
TLR: Toll Like Receptors – Receptor do Tipo Toll
iv
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v
RESUMO
Nos últimos anos nosso grupo vem estudando uma vacina gênica que codifica
a proteína de choque térmico de 65kDa (Hsp65) de Mycobacterium leprae. Esta
vacina (DNA-hsp65) tem apresentado eficácia tanto em modelos de profilaxia quanto
de terapia contra a Tuberculose (TB) experimental.
No entanto, existe grande preocupação quanto ao risco de desenvolvimento
de doenças auto-imunes decorrente do uso dessa vacina gênica em humanos. Tal
preocupação se justifica pelo fato de que o próprio DNA bacteriano do vetor
plasmideal age como fator imunoestimulatório, e principalmente porque as HSPs são
filogeneticamente conservadas durante a evolução e estão presentes em células
procarióticas e eucarióticas, mostrando alta homologia entre as espécies. Em razão
disso, há diversos trabalhos na literatura sugerindo que as HSPs podem ter um
papel na patogênese de doenças auto-imunes.
Desse modo, a possibilidade da vacina induzir auto-imunidade patológica
baseia-se na hipótese do mimetismo molecular, sendo possível que a vacinação
com DNA-hsp65 induza a ativação de linfócitos capazes de reconhecer, por
reatividade cruzada, a Hsp60 do próprio organismo, levando ao desenvolvimento de
doenças auto-imunes. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar se a vacina
DNA-hsp65 induz ou não auto-agressão tecidual. Para isto, analisamos parâmetros
imunológicos como produção de anticorpos anti-DNA, anti-Hsp65 e anti-Hsp60 além
de analisarmos histologicamente 18 órgãos de animais vacinados com DNA-hsp65 e
também de animais vacinados e infectados com M. tuberculosis.
Os resultados obtidos neste trabalho não evidenciaram a indução de qualquer
quadro patológico auto-imune até 6 meses depois da última imunização. Não houve
detecção de anticorpos anti-DNA, e embora tenha sido observada a produção de
anticorpos anti-Hsp65 e anti-Hsp60, estes anticorpos não provocaram alterações
teciduais, como observado nas análises histológicas dos órgãos estudados. Sendo
assim, estes resultados nos permitem afirmar que, apesar da alta homologia
interespécie das proteínas HSPs, a vacina DNA-hsp65 não induziu auto-agressão
tecidual em camundongos sadios ou infectados nos períodos de tempo analisados,
sugerindo que ela possa ser segura para utilização em mamíferos superiores.
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vii
ABSTRACT
In the last years our group was studying a genic vaccine that codifies the heat
shock protein of 65kDa (Hsp65) of Mycobacterium leprae. This vaccine (DNA-hsp65),
has presented efficacy in prophylactic and therapeutic models against Tuberculosis
(TB).
However, there is a great concern about the risk of autoimmune diseases
development due to the use of this DNA vaccine in humans. Such concern is justified
by the fact that the bacterial DNA of plasmideal vector act as an immunoestimulatory
factor and mainly because the HSPs are philogenetically conserved during evolution
and are present in procariotic and eucariotic cells, showing high homology between
the species. In this sense, there are many reports in literature suggesting that HSPs
can have a role in the pathogenesis of autoimmune diseases.
The possibility of the vaccine to induce pathological autoimmunity is based on
the hypothesis of molecular mimicry, because the vaccination with DNA-hsp65 could
induce the activation of lymphocytes able to recognize the self-Hsp60 protein by
cross reactivity, leading to development of autoimmune diseases. In this context, the
objective of this project was to evaluate if the DNA-hsp65 vaccine induces or not
tissue auto-aggression. We analyzed immunologic parameters including production
of anti-DNA, anti-Hsp65 and anti-Hsp60 antibodies, besides the histological analysis
of 18 organs of DNA-hsp65 vaccinated mice as well as vaccinated and M.
tuberculosis infected animals.
The results did not show any alteration of autoimmune disorder until 6 months
after last immunization. There was not anti-DNA antibodies detection and although
anti-Hsp65 and anti-Hsp60 antibodies were observed, these antibodies did not
induce tissue alterations as observed in the histological analyses of the studied
organs. Thus, these results allow us to affirm that, despite the high homology inter-
specie of HSP proteins, the DNA-HSP65 did not induce tissue auto-aggression in
healthy or infected mice during the analyzed periods of time, suggesting that it could
be safe to use in superior mammals.
1
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Introdução
2
1- INTRODUÇÃO
1.1 – Tuberculose
A tuberculose, doença principalmente respiratória causada pelo bacilo
Mycobacterium tuberculosis, é responsável por 2 milhões de mortes ao ano
permanecendo como uma das maiores causas de mortalidade por doenças
infecciosas no mundo, ao lado da AIDS (do inglês, Acquired Immunodeficiency
Syndrome) e da malária (WHO 2005; VON REYN & VUOLA, 2002; ANDERSEN,
2001). Dados da Organização Mundial da Saúde indicam que ocorrem de 8 a 9
milhões de novos casos de tuberculose anualmente e, cerca de um terço da
população mundial encontra-se infectada pelo bacilo. O Brasil ocupa o 15º lugar
entre os 22 países nos quais se estima que ocorram 80% dos casos de tuberculose
no mundo (WHO 2005; ROOK et al., 2005a e 2005b; VON REYN & VUOLA, 2002;
ANDERSEN, 2001; DYE et al., 1999).
M. tuberculosis é um patógeno intracelular facultativo de crescimento lento
(NOLTE & METCHOCK, 1995; HOLT et al., 1994). A transmissão da tuberculose
ocorre através da inalação de partículas contendo a bactéria, que são expelidas em
forma de aerossol por indivíduos com a doença ativa (RILEY et al., 1959).
Apesar das estatísticas mostrarem um grande número de indivíduos
infectados, uma parcela relativamente pequena dos indivíduos desenvolve a doença.
Noventa por cento das pessoas infectadas desenvolvem uma forma latente e
assintomática. Uma pequena porcentagem desses indivíduos (aproximadamente
10%) pode apresentar reativação da infecção, que poderia ser decorrente de um
processo infeccioso secundário, de um quadro de imunossupressão, desnutrição,
elevado grau de exposição ao bacilo, entre outros fatores. Essas situações podem
resultar em tuberculose ativa. Por outro lado, 5 a 10% dos indivíduos infectados
desenvolvem a doença progressiva logo após a infecção primária (ROOK et al.,
2005b; FLYNN & CHAN, 2005; BOOM et al., 2003).
A profilaxia da tuberculose é realizada pela administração da vacina BCG
(Bacilo de Calmette-Guérin) que foi desenvolvida pelos pesquisadores Albert
Calmette e Camille Guérin no Instituto Pasteur, em 1921 (CHUNG & BIGGERS,
2001; BANNON, 1999; BLOOM et al., 1989). Essa vacina é constituída por uma
Introdução
3
cepa virulenta de Mycobacterium bovis que foi atenuada através da realização de
várias subculturas in vitro do bacilo.
Apesar disso, a reemergência da tuberculose nos últimos tempos pode ser
atribuída a fatores relacionados a problemas sócio econômicos e de saúde pública
como, por exemplo, o declínio nas condições de vida da população mundial, declínio
de recursos destinados às ações de controle da doença e problemas de ordem
política e organizacional, enfrentados pelos sistemas de saúde pública em todo o
mundo. Em países desenvolvidos, a incidência de tuberculose tem aumentado em
função do elevado número de casos de co-infecção com HIV.
Além destes fatores, existem os problemas ligados à dificuldade de adesão
de grande parcela dos pacientes aos esquemas terapêuticos. O tratamento da
tuberculose é realizado por meio de quimioterapia, que combina o uso de diferentes
antibióticos e tem duração de no mínimo seis meses. Por isso, é muito alto o número
de casos de abandono do tratamento e, em razão disto, nos últimos anos, tem
aumentado número de pacientes portadores de cepas resistentes a múltiplas drogas
(WHO 2005; ZHU et al., 2005).
1.2 - Imunidade a Tuberculose
Como comentado anteriormente, a infecção por M. tuberculosis ocorre
através das vias aéreas superiores, por meio da inalação de gotículas contendo o
bacilo, suspensas no ar, dispersas por um indivíduo infectado (bacilífero). Com a
chegada dos bacilos nos pulmões, é desencadeada uma resposta imune baseada
principalmente em mecanismos inatos, inicialmente com a ativação de macrófagos
alveolares e de componentes do sistema complemento (via alternativa e das
lectinas). Após a interação com macrófagos, os bacilos são rapidamente
fagocitados.
Entretanto, durante o processo evolutivo da interação parasita-hospedeiro, o
M. tuberculosis desenvolveu estratégias para escapar dos mecanismos microbicidas
dos macrófagos. As próprias micobactérias induzem a ativação do sistema
complemento gerando componentes que as opsonizam, facilitando, dessa forma, a
sua fagocitose através da sua interação com os receptores Mac1 (CR3)
(SCHLESINGER et al., 1990), CR1 e CR4 (HIRSCH et al., 1994) nos macrófagos.
Introdução
4
Esse processo impede o mecanismo oxidativo, ou seja, a liberação de ROIs
(Reagente Intermediário do Oxigênio), que são tóxicos para M. tuberculosis
(WRIGHT et al., 1983). Além disso, as micobactérias também produzem as enzimas
catalase e superóxido dismutase, que são capazes de degradar espécies reativas do
oxigênio (COLE et al., 1998).
Também tem sido descrito que o bacilo da tuberculose tem a capacidade de
escapar do fagolisossoma ou impedir a fusão do endossoma ao fagolisossoma
(RUSSEL, 1995). Esse escape pode ocorrer através da interação preferencial com
alguns dos receptores de macrófagos (ARMSTRONG et al., 1975) e pela presença
de determinados glicolipídios na superfície micobacteriana, como o dimicolato de
trealose (DMT) (CLEMENS & HORWITZ, 1995). Componentes da parede celular,
como a lipoarabinomanana (LAM) também atuam na desativação dos macrófagos
(STROHMEIER, 1999).
Através destes mecanismos de escape, a micobactéria é capaz de persistir no
indivíduo infectado e desencadear a tuberculose mais tardiamente. Assim, a
ativação de uma resposta imune adaptativa é essencial para o controle da infecção.
Macrófagos e células dendriticas desempenham importantes funções na ativação de
uma resposta específica constituída por células T (FLYNN et al. 2004).
Está bem estabelecido que a resposta protetora na tuberculose está
relacionada ao desenvolvimento da resposta de perfil Th1, com secreção de
citocinas IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18 e TNF-α (COOPER, 1997; FLYNN, 1995). O IFN-γ,
é uma das principais citocinas associadas à resposta protetora durante a infecção
por micobactérias, sendo produzido por células T CD4+, CD8+, NK (COOPER, 1993;
FLYNN, 1993; YANG & MITSUYAMA, 1997). O principal papel atribuído ao IFN-γ e
outras citocinas de padrão Th1 citadas acima, na resposta do hospedeiro contra a
tuberculose consiste na ativação e recrutamento de macrófagos capazes de
controlar a infecção por micobactérias (BONECINI ALMEIDA et al., 1998, SATO et
al., 1998). Além disso, ZHANG et al. (1994) mostraram que a secreção de IL-12 por
macrófagos pleurais humanos é também importante. Essa citocina induz a ativação
de células NK, estimulando-as a produzir IFN-γ (D’ ANDREA et al., 1992) ou
aumentando sua capacidade citotóxica diretamente sobre as células infectadas e,
além disso, estimula a diferenciação de linfócitos T CD4+ para o padrão Th1
(SERBINA et al., 2000; SILVA et al., 2001).
Introdução
5
Além das células CD4+ e macrófagos, um importante papel na resposta
protetora contra tuberculose tem sido atribuído às células T CD8+ citotóxicas. Esses
linfócitos medeiam a lise de células infectadas por meio da formação de poros pela
perforina e pela ação das moléculas efetoras granulisinas e granzimas, ou, ainda,
por mecanismo de Fas-FasL (Revisado por SILVA et al., 2001). Células T CD8+ de
camundongos infectados produzem IFN-γ em resposta ao reconhecimento de
antígenos de M. tuberculosis apresentados por células dendríticas ou macrófagos
(SERBINA & FLYNN, 1999). Além disso, cultura de linfócitos, provenientes de
pulmão de animais infectados, na presença de células dendríticas também
infectadas é capaz de ativar células T CD8+ que reconhecem e lisam macrófagos
infectados por M. tuberculosis (SERBINA et al., 2000). Portanto, as principais células
envolvidas na resposta imune contra a tuberculose, consistem de células T CD4+,
CD8+ citotóxicas produtoras de IFN-γ.
Outras células T que expressam o receptor γ� também desempenham
importante papel na resposta contra tuberculose secretando citocinas tais como
TNF-� e IFN-γ, além de exercer atividade citotóxica contra macrófagos infectados
(BOOM, 1999; DEILE et al., 2001; THOMA-USZYNSKI et al., 2000; TSUKAGUCHI et
al., 1995). Finalmente, foi mostrado que células T duplo negativas (CD4-CD8-) têm
importante função no controle de infecção intracelular por M. tuberculosis e podem
contribuir para o sucesso da vacinação (SIOBHAN et al. 2005).
1.3 - Vacina contra Tuberculose
Atualmente, a imunoprofilaxia continua sendo o método mais eficaz para a
contenção da tuberculose. Esta é feita através de vacinação com BCG que foi
introduzida para o uso humano em 1921, a qual é recomendada pela OMS para
todas as crianças com menos de 1 ano de idade. Anualmente, 100 milhões de recém
nascidos recebem esta vacina e, até hoje, mais de 3 bilhões de doses já foram
administradas, o que faz dessa vacina, a mais usada no mundo (ABOLHASSANI et
al, 2000). Entretanto o efeito protetor da vacina BCG tem sido bastante controverso,
sendo que dados epidemiológicos revelaram que sua eficácia na proteção varia de 0
a 80% nos diferentes países onde a vacina é empregada (FINE, 1995). Outro fator
limitante é que a imunidade induzida pelo BCG diminui em um período de 10 a 15
Introdução
6
anos após a sua aplicação (KAUFMAN, 1990), além de prejudicar a interpretação do
teste de hipersensibilidade tardia cutânea ou teste de PPD, utilizado com fins de
diagnóstico e epidemiológicos (FINE, 1999; LOWRIE et al, 1995; LOWRIE et al,
1997).
Vale ressaltar que pelo fato da vacina BCG ser constituída por uma cepa viva
atenuada, há uma grande preocupação com relação à segurança do uso dessa
vacina em indivíduos imunocomprometidos, uma vez que a co-infecção TB-HIV
torna-se cada vez mais comum (GRANGE, 1994; PERRONNE, 1994). Assim, existe
uma grande necessidade do desenvolvimento de novas alternativas de imunização
mais seguras e eficazes contra a tuberculose.
Nas últimas décadas, principalmente após a descoberta de novas
metodologias de identificação e purificação de antígenos e da introdução da
tecnologia do DNA recombinante, surgiram novas estratégias vacinais. Estas
tecnologias têm permitido o desenvolvimento de vacinas de DNA e vacinas de
microorganismos vivos modificados.
Dentre as vacinas de microorganismos vivos em estudo, uma das estratégias
utilizadas é a modificação genética do BCG, introduzindo genes que codificam
antígenos relevantes capazes de induzir uma resposta imune contra tuberculose.
Conhecido como BCG recombinante (rBCG), estão em estudo o rBCG30, que
expressa o Ag85B de M. tuberculosis (HORWITZ et al, 2005), e o rBCG-hly, que
expressa a enzima listeriolisina de Listeria monocitogenes (HESS et al, 1998).
Também tem sido proposta a utilização de micobactérias mutantes autotróficas, que
seriam cepas de M. tuberculosis atenuadas, que não conseguem se multiplicar nos
indivíduos vacinados por apresentarem necessidades especiais de nutrientes, só
encontradas em meios de cultura artificiais (GULERIA et al, 1996, PEREZ et al,
2001, SMITH et al, 2001).
Por outro lado, as vacinas gênicas, são baseadas no uso de seqüências de
nucleotídeos que codificam antígenos imunodominantes de um determinado agente
infeccioso, clonadas em plasmídeos bacterianos.
Esta estratégia de vacinação, além de evitar muitos problemas associados às
vacinas vivas, tais como, reversão da virulência, instabilidade térmica e contra-
indicação para indivíduos imunodeprimidos, destaca-se pela possibilidade de
processamento e apresentação de antígeno por ambas as moléculas de MHC (do
inglês, Major Histocompatibility Complex / Complexo Principal de
Introdução
7
Histocompatibilidade) de classe I e classe II, ativando assim, células T CD8+
citotóxicas e células T CD4+ auxiliares, respectivamente (HAN et al., 2002).
Linfócitos B também podem ser ativados no processo de vacinação, proporcionando
assim uma resposta imune humoral e celular (GURUNATHAN et al., 2000; LIU,
2003; DONNELLY el al., 2005). Estudos realizados em nosso laboratório, usando a
vacina pcDNA3-hsp65 mostraram que após a injeção intramuscular, células B da
medula óssea e linfonodos drenantes são capazes de capturar o plasmídeo e
expressar a proteína, sugerindo um papel de APC para essas células nesse modelo
(COELHO-CASTELO et al., 2003).
Além disso, as vacinas de DNA são importantes indutoras de uma resposta
imunológica do padrão Th1, pois contêm seqüências CpGs não metiladas presentes
no DNA procariótico que agem como adjuvantes por apresentarem capacidade
imunoestimuladora (KLINMAN et al., 1999). A capacidade de imunomodulação das
vacinas de DNA está relacionada com a via de administração da mesma. Assim,
vacinas administradas por via intramuscular (i.m) estimulam uma resposta
preferencialmente Th1 enquanto vacinas administradas através do processo de
biobalística (gene-gun) por via intradérmica (i.d.) estimulam mais uma resposta de
padrão Th2. Outra forma de imunomodulação observada com a vacina de DNA-
hsp65 é decorrente da rota de administração, podendo diminuir ou aumentar a
proteção observada (ROSADA, R.S. et al., manuscrito em preparação).
Visando atingir a proteção contra a tuberculose, uma grande variedade de
antígenos tem sido estudada sob a forma de vacinas de DNA. Assim, as vacinas
baseadas em genes que codificam proteínas da família da Ag85 (HUYGEN et al,
1996), ESAT-6, Hsp70, proteína de 36 kDa e MPT83 (LOWRIE et al, 1997), Pho S
(ZHU et al, 1997), PLCa (GONSALVES et al, 2001) e Hsp65 (SILVA et al, 1994) ou
uma combinação das mesmas têm sido alvo de muitas investigações.
Estudos realizados no Centro de Pesquisas em Tuberculose (CPT) da FMRP-
USP demonstraram que a vacinação por via intramuscular (i.m.) com DNA-hsp65 foi
capaz de proteger camundongos contra subseqüente desafio com a cepa virulenta
H37Rv de M. tuberculosis (LOWRIE et al, 1994; TASCON et al, 1994). Esta proteção
foi atribuída principalmente a linfócitos T antígeno-específicos, produtores de IFN-γ,
com atividade citotóxica e resposta imune do tipo Th1 (BONATO et al, 1998; SILVA
& LOWRIE, 2000). Além disso, em estudos adicionais, utilizando camundongos
infectados com M. tuberculosis e posteriormente tratados com a vacina DNA-hsp65,
Introdução
8
foi mostrado um declínio significativo no número de bactérias no pulmão e no baço,
com predomínio de uma resposta Th1 (LOWRIE et al, 1999; BONATO et al., 2004).
Portanto, essa vacina pode ser utilizada tanto na profilaxia quanto na terapia da
tuberculose.
Apesar destes efeitos promissores, existe uma grande preocupação com
relação à capacidade desses DNAs plasmideais se incorporarem ao genoma do
hospedeiro. Isso dificultaria a liberação e uso dessas vacinas em larga escala.
Recentemente, nós demonstramos que a vacina pcDNA3-hsp65 não se incorpora no
genoma do hospedeiro, sugerindo a biossegurança da mesma (COELHO-CASTELO
et al., 2006).
No entanto, outra possibilidade e preocupação de nosso grupo, é que a
vacinação com DNA, por si só, poderia levar ao desenvolvimento de anticorpos anti-
DNA, podendo induzir doenças, como por exemplo, o Lupus Eritematoso Sistêmico.
Sendo assim, o fato de utilizarmos como vacina, uma seqüência de DNA bacteriano,
o qual expressa sequências CpG que são imunoestimuladores de células B, células
T, macrófafos e células dendríticas, possivelmente, poderia estar ativando
mecanismos importantes na indução de quadros inflamatórios ou auto-imunes
(PISETSKY et al, 1991; KRIEG et al, 1995; KRIEG, 2002).
Além disso, foi observado que a administração de vacina de DNA, conténdo
CpG, em camundongodos com encefalomielite, causou a exacerbação da doença
em uma maneira dose dependente (TSUNODA et al., 1999). Ademais, foi
demonstrado que camundongos imunizados com DNA (CpG) carreando antígeno
derivado de clamídia, que apresenta mimetismo molecular à antígenos cardíacos,
desenvolveram miocardite auto-imune (BACHMAIER et al., 1999). Outro estudo
demonstrou que camundongos primados com injeção de DNA (CpG),
desenvolveram quadros bem mais severo de artite auto-imune em resposta à
posterior imunização com colágeno, quando comparado com animais que receberam
apenas administração de colágeno (MIYATA et al., 2000).
Juntos, estes relatos demonstram que seqüências CpG de vacinas de DNA,
podem auxiliar na indução ou exacerbação de uma resposta auto-imune.
Introdução
9
1.4 - Proteínas de Choque Térmico
Em 1962, os genes que codificam as Proteínas de Choque Térmico (do
inglês, “Heat Shock Protein - HSPs”) foram identificadas ao acaso quando Ritossa et
al., notaram que altas temperaturas induziam a expressão de genes de um padrão
incomum em cromossomos “polytene” de glândulas salivares de Drosophila
melanogaster (RITOSSA, 1962). Porém, apenas em 1974 o produto destes genes foi
chamado de “Heat Shock Proteins” (TISSIERES et al., 1974). As HSPs são
moléculas evolutivamente conservadas e expressas em todas as formas de vida
como eucariotos, procariotos e plantas. Além disso, estas proteínas são encontradas
em vários compartimentos intracelulares como citosol de procariotos e eucariotos,
núcleo, retículo endoplasmático, mitocôndria e cloroplastos (LINDQUIST, 1998).
Sob condições fisiológicas, as HSPs constituem de 5-10% do conteúdo
protéico de uma célula normal, mas podem aumentar sua concentração intracelular
duas ou três vezes sob condições adversas. Tanto células de procariotos quanto de
eucariotos aumentam a síntese de HSPs quando submetidas a vários tipos de
estresse, tais como estresse térmico, químico, físico, hipóxia, toxinas, privação de
glicose entre outros (LINDQUIST et al., 1998). Nestes casos, a síntese de HSP é
aumentada para proteger as células de possíveis danos durante períodos de
estresse causados por infecções, inflamações ou eventos similares. Elas encontram-
se entre as proteínas mais conservadas filogeneticamente e são agrupadas em
famílias conforme seus pesos moleculares, sendo caracterizadas como: família
Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp110 e as famílias de baixo peso molecular como a Hsp14
e Hsp18 (LINDQUIST et al., 1998).
As HSPs exercem funções vitais na homeostase celular, atuando como
chaperonas, transportando peptídios, participando do dobramento, desdobramento e
montagem de proteínas, prevenindo desnaturação e agregação protéica, e
exercendo atividade ATPase (LINDQUIST et al.,1986).
Estudos sobre as funções imunológicas das HSPs começaram a surgir na
década de 80, quando foi observado que preparações homogêneas de HSPs
isoladas de células cancerígenas eram capazes de induzir imunidade contra câncer,
enquanto que preparações correspondentes de tecidos normais, não o fizeram
(SRIVASTAVA et al., 1998). Posteriormente, foi descoberto que este fenômeno era
decorrente da função de chaperonina das HSPs, que têm a capacidade de formar
Introdução
10
complexos com peptídeos tumorais ou antigênicos. Estes complexos, uma vez no
meio extracelular, podem interagir com receptores como TLR 2 ou TLR4, CD14,
LOX1 ou CD40, culminando com a ativação inespecífica da APC, ou seja,
independente do peptídeo, levando à secreção de mediadores inflamatórios. Outra
possibilidade é que estes complexos possam interagir com o receptor CD91
culminando com o processamento e apresentação do peptídeo complexado pela
HSP, tanto em contexto de apresentação cruzada por moléculas de MHC classe I
(SRIVASTAVA et al., 2001), quanto de classe II (MATSUTAKE & SRIVASTAVA,
2000). O resultado disso é a ativação de células T, tanto CD8+ quanto CD4+
específicas para o peptídeo complexado. Este mecanismo via CD91 também foi
observado em células humanas (CASTELLI et al., 2001). Esta habilidade de HSPs
extracelulares serem introduzidas em uma via de apresentação endógena,
carreando peptídeos, com conseqüente geração de resposta celular citotóxica,
atribui a elas, uma importante atividade adjuvante. Além disso, a presença de HSPs
no meio extracelular, pode agir como um sinal de perigo para APCs como
conseqüência de uma injúria mecânica ou infecciosa (SOMERSAN et al., 2001).
Como foi descrito, a vacina de DNA testada pelo nosso grupo contra a
tuberculose experimental, contém o gene da proteína de choque térmico de 65 kDa
de M. leprae usado como antígeno. Apesar de uma de suas principais funções ser a
de auxiliar no dobramento de peptídeos importados do citoplasma para a
mitocôndria, protegendo-os na sua cavidade, outras funções começam a ser
descritas, como a atividade de peptidase, atividade esta que pode ter relevância no
processamento e apresentação de antígenos endógenos e, conseqüentemente, na
resposta imunológica (PORTARO et al., 2002).
1.5 - Proteínas de Choque Térmico e Auto-Imunidade
As HSPs estão entre os antígenos imunodominantes encontrados nas
micobactérias, principalmente as proteínas de 14, 18, 65 e 70 kDa. Em
camundongos infectados com M. tuberculosis, 10 a 20% de todas as células T
respondem especificamente para o antígeno Hsp65 (KAUFMANN et al., 1987). A
proteína Hsp65 de M. leprae tem recebido maior atenção devido ao seu amplo
envolvimento com células e mediadores do sistema imune nas infecções
micobacterianas (SILVA et al., 1994b). A resposta imune humoral contra Hsp65 pode
Introdução
11
ser direcionada para epítopos comuns entre outras HSPs, como a de M. tuberculosis
bem como a da Hsp60 humana e bacteriana (ANDERSEN & HERON, 1993).
Jones et al., (1993), em um estudo de sequênciamento, identificou 86
peptídeos humanos presentes em diversas proteínas que apresentam regiões
similares a seqüências expressas pela Hsp60 humana (hHsp60). Dezenove desses
peptídeos são encontrados em proteínas que em determinadas situações,
comportam-se como auto-antígenos conhecidos, como por exemplo, a tireoglobulina,
citoqueratina, ácido glutâmico descarboxilase (GAD), proteína básica mielínica,
proteína ligante de DNA, entre vários outros. Portanto, em função dessa similaridade
entre antígenos, é sugerido a possibilidade de que, uma resposta imune dirigida
contra Hsp65 de microorganismos poderia reconhecer a hHsp60 e auto-antígenos
levando ao desenvolvimento de patologias auto-imunes. Sendo assim, em função da
imunodominância e do alto grau de homologia entre as HSPs humanas e
micobacterianas, surgiram hipóteses de que a Hsp60 poderia estar envolvida em
várias doenças inflamatórias e auto-imunes (JONES et al., 1993, COHEN et al.,
1991). Estas hipóteses basearam-se principalmente no fenômeno conhecido como
mimetismo molecular (OLDSTONE et al., 1987). Esse mimetismo entre antígenos
presentes no microambiente e as proteínas do choque térmico expressas por células
do hospedeiro, poderia desencadear doenças auto-imunes tais como: artrite
induzida por adjuvante em ratos, artrite reumatóide (RES et al., 1988; VAN EDEN et
al., 1991), diabetes tipo I (ELIAS et al., 1991; GUPTA et al., 1991), esclerose múltipla
(BIRNBAUM et al., 1993), aterosclerose (WICK & XU, 1999), entre outras.
Em humanos, existem vários relatos de reatividade contra as HSPs ou
aumento da sua expressão em doenças auto-imunes. Por exemplo, linfócitos Tγδ
reativos à Hsp65 estão presentes na sinóvia de pacientes com Doença Reumatóide
(SHEN et al., 1992) e também nas lesões neuronais de pacientes com Esclerose
Múltipla, próximos aos oligodendrócitos que expressam Hsp60 (SELMAJ et al.,
1992). Aumento nos níveis de anticorpos anti-Hsp65 micobacteriana foi observado
em pacientes com Psoríase, sendo proposto que a atividade desses anticorpos
poderia ser usada como marcador no monitoramento da doença (RAMBUKKANA et
al., 1993). Células de pacientes com Doença de Behçet proliferam contra o peptídeo
336-351 da Hsp60 humana (SAKANE et al., 1997). Na Artrite Reumatóide Juvenil é
relatado que os pacientes apresentam anticorpos anti-Hsp60 e linfócitos do líquido
sinovial são reativos às Hsp60 e Hsp65.
Introdução
12
Em estudo de camundongos com Nefrite Nefrotóxica (NTN), foi mostrado que
a Hsp60 é liberada pelo rim e excretada na urina. Segundo o autor, estes achados
indicam que a Hsp60 age como sinal de perigo e sugere que tais sinais podem estar
envolvidos no agravamento da doença renal (LANG et al., 2005). ULRICH et al.
(1999) mostraram que a transferência de células T reativas a Hsp60 em
camundongos, foi capaz de induzir inflamação intestinal. Foi mostrado também, que
a patogênese da rejeição crônica de tecido cardíaco, envolve resposta de estresse e
a participação de células T autorreativas infiltrantes que agem sob mecanismos
dependente de HSPs (DUQUESNOY et al., 1999).
Além do envolvimento das Hsp60 e Hsp65 em quadros auto-imunes, outras
HSPs também relacionam-se a essas doenças. PAGGI et al. (1995) detectaram a
presença de anticorpos anti-Hsp70 em indivíduos com doença auto-imune
tireóideana, mostrando uma associação entre a proteína e o processo auto-imune.
Foi detectado um aumento de Hsp70 em fibras do músculo ocular de pacientes com
Oftalmopatia Associada à Tireóide (TAO) principalmente na fase aguda da doença
(HYROMATSU et al., 1995).
Esses dados obtidos de pacientes portadores de diferentes doenças auto-
imunes, juntamente aos estudos em modelos experimentais (VAN EDEN, 1988 e
1989), levam-nos a refletir sobre a segurança da vacina DNA-hsp65, nesse aspecto.
Por outro lado, recentemente vários trabalhos vêm mostrando o envolvimento
das HSPs na modulação de doenças auto-imunes. Em um estudo de
imunohistoquímica, forte reatividade para Hsp72, além da presença de infiltrado
inflamatório foi detectada em folículos linfóides de pacientes com Doença de Graves
e Tireóidite de Hashimoto (HEUFELDER et al., 1992). No entanto, neste estudo os
autores concluem que o aumento da expressão de HSPs poderia representar um
fator imunomodulatório de relevância no processo auto-imune. Estudos com vacinas
codificando Hsp60 induzem a ativação de células T regulatórias anti-Hsp60 que
previnem ou tratam Artrite Adjuvante (QURESHI et al., 1999). Outros estudos têm
sugerido que células T Hsp65-específicas apresentam reatividade cruzada contra
Hsp60 própria induzindo efeitos protetores e um melhor prognóstico de Artrite
Reumatóide (ELIAS et al., 1998) e Artrite Juvenil Crônica (QUINTANA et al., 2002;
RAZ et al., 2001). Estes estudos correlacionando HSPs e regulação tem sido
descrito em outras doenças auto-imunes como diabetes tipo I, esclerose múltipla,
encéfalomielite entre outras.
Introdução
13
Embora resultados de nosso laboratório, usando modelos específicos de
doenças auto-imune, não tenham levado a um agravamento das doenças após
esquema vacinal ou terapêutico (SANTOS JR. et al., 2006; SANTOS JR et al.,
manuscrito submetido), outras abordagens se fazem necessárias no sentido de
avaliar se esta vacina poderia induzir processos inflamatórios ou auto-imunes em
hospedeiros saudáveis, não pré-dispostos à auto-imunidade, com o intuito de
mimetizar o que aconteceria com a utilização clínica da vacina.
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Objetivos
15
2 - OBJETIVOS
2.1 - Objetivo Geral:
Avaliar se a imunização com a vacina DNA-hsp65 induz resposta auto-imune
ou lesões teciduais inflamatórias em camundongos saudáveis e infectados com M.
tuberculosis através da análise histopatológica de diferentes órgãos.
2.2 - Objetivos Específicos:
1) Avaliar se a imunização com o plasmídeo pVAX-hsp65 induz a produção
de anticorpos anti-Hsp65 de M. leprae pela técnica de ELISA;
2) Avaliar se a imunização com o plasmídeo pVAX-hsp65 induz a produção
de anticorpos anti-Hsp60 humana pela técnica de ELISA;
3) Avaliar se a imunização com o plasmídeo pVAX-hsp65 induz a produção
de anticorpos anti-DNA pelas técnicas de Imunofluorescência Indireta e ELISA;
4) Avaliar através de análise histopatológica a presença de infiltrado
inflamatório e/ou lesão em diferentes órgãos de camundongos vacinados e
controles.
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Delineamento Experimental
17
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3 - DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Foram estudados três grupos de animais em dois protocolos experimentais
sendo:
� grupo vacina: animais imunizados com a vacina pVAX-hsp65 (DNA-hsp65);
� grupo vetor: animais imunizados apenas com pVAX (DNAv) e
� grupo controle: animais injetados apenas com PBS.
Estes três grupos foram analisados nos seguintes protocolos:
� Protocolo A: animais sadios apenas imunizados;
� Protocolo B: animais imunizados e posteriormente infectados com M.
tuberculosis.
3.1 - Protocolo experimental A
Camundongos BALB/c (6 a 8 semanas de idade) foram imunizados com
pVAX-hsp65 (grupo vacina) ou com pVAX (grupo vetor) por via intramuscular.
Como controle, um grupo recebeu apenas administração de PBS (grupo controle).
A dose administrada foi de 100 µg de DNA por animal, em uma solução de sacarose
a 25%, sendo 50 µg de DNA em cada músculo quadríceps direito e esquerdo. O
processo total de imunização envolveu 3 doses com intervalos de 2 semanas entre
as imunizações, totalizando então, 300 µg de DNA administrado por animal. Estes
experimentos foram realizados em triplicata, totalizando um número de 9
camundongos de cada grupo em cada tempo.
O sacrifício dos animais foi realizado com 15, 45 e 180 dias após a última
dose da vacina.
• 1° Sacrifício = Tempo 1 (T1): 15 dias após a última dose.
• 2° Sacrifício = Tempo 2 (T2): 45 dias após a última dose.
• 3° Sacrifício = Tempo 3 (T3): 180 dias após a última dose.
Delineamento Experimental
18
1ª dose 2ª dose 3ª dose 1º Sacrifício
(T1) 2º Sacrifício
(T2)
Imunização (100µg/ 100µl)
dia 0 15 30 45 75 210
15 dias 15 dias 15 dias 30 dias 135 dias
Coleta de sangue Coleta de órgãos
hsp65
Análise Histopatológica
3º Sacrifício (T3)
Dosagem de Anticorpos
Sacrifício
(coleta de soro pré-imune)
Delineamento Experimental
19
3.2 - Protocolo experimental B
Foi realizado o mesmo processo de imunização citado no protocolo
anterior, porém, 15 dias após a última imunização, os animais foram infectados
com 1x105 bacilos (Mycobacterium tuberculosis - H37Rv) por via intratraqueal.
O sacrifício dos animais foi realizado com 30 e 70 dias após o desafio.
• 1° Sacrifício = Tempo 1 (T1): 30 dias após a infecção.
• 2° Sacrifício = Tempo 2 (T2): 70 dias após a infecção.
Delineamento Experimental
20
Imunização (100µg/ 100µl)
Desafio
2ª dose 3ª dose 1º Sacrifício
(T1) 15
dias 15
dias 15
dias
Desafio 30
dias 40
dias dia 0 15 30 45 75 115
Coleta de sangue Coleta de órgãos
1x105 bacilos
2º Sacrifício (T2)
hsp65
1ª dose
Análise Histopatológica
Dosagem de Anticorpos
Sacrifício
(coleta de soro pré-imune)
21
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Materiais e Métodos
22
4 - MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 – Animais
Foram utilizados camundongos BALB/c, SPF (do inglês, Specific Patogen
Free / Livre de Patógenos Específicos), fêmeas, com 6 a 8 semanas de idade,
provenientes do Biotério de Animais Isogênicos da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, FMRP-USP. Os animais infectados com cepa virulenta de M.
tuberculosis foram mantidos em isoladores de animais, em laboratório de
biossegurança nível III, com temperatura, umidade, fluxo de ar e ciclo de luz claro /
escuro controlados, com livre acesso à água e ração.
4.2 - Vacina de DNA-hsp65
A vacina de DNA-hsp65 contém um inserto de 3000 pares de bases, que
codifica a proteína de choque térmico (HSP) de M. leprae, subclonado no sítio
BamHI e NotI do vetor pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A figura abaixo
esquematiza o vetor plasmideal pVAX1.
Figura 1: Mapa esquemático do vetor plasmideal pVAX1. Representação dos principais sítios funcionais como: gene de resistência a antibióticos (kanamicina), seqüência promotora (Pcmv), seqüência de origem de replicação (pUC ori), sítio de piliadenilação (BGH pa) e seus vários sítios de restrição.
Materiais e Métodos
23
4.3 - Obtenção dos plasmídeos recombinantes pVAX-Hsp65 e pVAX
Os plasmídeos pVAX-hsp65 e pVAX (vetor) foram purificados por
cromatografia de troca iônica, utilizando-se QIAGEN Giga Plasmid Purification Kit
(Qiagen Inc., Santa Clarita, CA, USA). Para a realização desse protocolo, uma
colônia de bactérias E. coli DH5α™ transformada com o plasmídeo recombinante
pVAX-hsp65 ou plasmídeo pVAX foi retirada de uma placa recém preparada
contendo meio LB Agar (SIGMA, Germany) contendo kanamicina (Cilinon� GIBCO
BRL, Scotland ) na concentração de 100 µg/ml. Esta colônia foi inoculada em 5,0 ml
de caldo LB BROTH BASE (GIBCO BRL, Scotland) com kanamicina (100 µg/ml) e
incubada durante 8 horas a 37oC sob agitação vigorosa (250 rpm), em incubadora
com agitação (Incubador shaker series 25, New Brunswick, Edison, New Jersey,
USA). A cultura inicial foi diluída 1/500 em 2,5 litros de caldo LB BROTH BASE,
contendo kanamicina (100 µg/ml), e incubada a 37°C sob agitação (250 rpm)
durante 16 horas. Após a incubação, o material foi centrifugado a 5.000 rpm por 15
minutos a 4°C e o sedimento ressuspenso em 125 ml de tampão P1 (Tris-HCl 50
mM pH 8,0; EDTA 10 mM e RNAse 100 µg/ml). Em seguida, foram adicionados 125
ml de tampão P2 (NaOH 200 mM; SDS 1%) e após 5 minutos foram adicionados 125
ml do tampão P3 (acetato de potássio 3,0 M pH 5,5). O material foi filtrado e mantido
no gelo por 30 minutos. O filtrado foi aplicado à resina da QIAGEN previamente
equilibrada com tampão QBT (NaCl 750 mM; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15% e
Triton X-100 0,15 %). Após a aplicação do filtrado, a resina foi lavada com 600 ml de
tampão QC (NaCl 1,0 M; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15 %) e o DNA plasmideal
eluído com 30 ml de tampão QF (NaCl 1,25 M; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15 %).
O DNA eluído foi precipitado em 52,5 ml de isopropanol e, em seguida, centrifugado
a 14000 rpm por 45 minutos a 4°C e o sedimento ressuspenso em 0,5 - 1,0 ml de
água.
A quantificação dos plasmídeos pVAX-hsp65 e pVAX foi realizada por
espectrofotometria no aparelho GeneQuant IITM (Amershan-Pharmacia, BioSciences,
USA), nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm.
Materiais e Métodos
24
4.4 - Avaliação da integridade dos plasmídeos
Como o plasmídeo pVAX e o inserto do gene Hsp65 têm tamanhos
semelhantes (�3000 pb) foi utilizada a enzima de restrição BamHI (Invitrogen), que
nesse caso, digere os plasmídeos (pVAX-hsp65 e pVAX) em apenas um único sítio
de restrição, não removendo o inserto (hsp65). Isso lineariza os plasmídeos, o que
permite a confirmação das amostras que possuem o plasmídeo pVAX-hsp65 (�6000
pb) ou pVAX (�3000 pb). Para tanto, um micrograma de cada plasmídeo foi
incubado com BamHI (1 unidade/µg de DNA) a 37oC por 3 horas. Em seguida, os
produtos da digestão de cada amostra, e também os plasmídeos não digeridos,
foram submetidos a eletroforese em gel de agarose (GIBCO BRL) a 1%. No preparo
deste gel, as amostras foram ressuspendidas em tampão de eletroforese 6 vezes
concentrado (0,25 % azul de bromofenol; 40 % de sacarose em água) e o material
submetido à eletroforese em tampão TAE (Tris-acetato 40 mM; EDTA 1 mM pH 8,3).
A corrida foi realizada a 76 V por 1 hora utilizando o aparelho da Life Tecnologies
Inc., Modelo 250 (BRL). O padrão de 1Kb Plus DNA Ladder (GIBCO BRL, Scotland)
foi utilizado como marcador de peso molecular. O gel foi corado com 0,5 µg/ml de
brometo de etídio (Gibco BRL) e a visualização das bandas foi feita em luz
ultravioleta no ImageMaster VDS (Pharmacia Biotech).
s.
Figura 2: Perfil eletroforérico do DNA plasmideal purificado – pVAX e pVAX-hsp65. Os plasmídeos foram purificados com kit comercial QIAGENTM, de acordo com as instruções do fabricante, digeridos ou não com a enzima BamHI e submetidos a eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Canaleta 1: padrão de peso molecular 1kb PLUS DNA Ladder (GIBCO); Canaleta 2: pVAX íntegro; Canaleta 3: pVAX digerido; Canaleta 4: pVAX-hsp65 íntegro e Canaleta 5: pVAX-hsp65 digerido. Pb = pares de bases.
pb
6000
3000 2000 1650
1 2 3 4 5
Materiais e Métodos
25
4.5 - Análise da pureza das vacinas gênicas
Foi realizada a determinação da presença de endotoxinas bacterianas nas
vacinas obtidas por “maxiprep”. O teste empregado foi o teste cromogênico do lisado
de amebócito de Limulus polyphemus (LAL) que é um teste quantitativo para
mensuração de endotoxinas de bactérias gram-negativas utilizando o “QCL-100 LAL
kit” (Cambrex). Primeiramente, a endotoxina foi reconstituída através da adição de 1
ml de água fornecida pelo próprio kit seguido de agitação vigorosa e
homogeneização em vórtex, por 15 min continuamente antes do uso. Utilizando uma
seringa de 10 ml, foi reconstituído o substrato cromogênico com a adição de 6,5 ml
de água do kit. O frasco foi protegido da luz com papel alumínio e posteriormente foi
incubado, junto com uma placa de 96 poços, em estufa a 37ºC até o momento do
uso. A seguir, o LAL foi reconstituído pela adição de 1,4 ml de água com ajuda de
uma seringa. Uma vez com os reagentes reconstituídos, retirou-se a placa de 96
poços da estufa e preparou-se a curva padrão através de diluições sucessivas da
endotoxina partindo de uma concentração 1 Unidade de Endotoxina por ml (UE/ml)
até 0,1 UE/ml, utilizando sempre a água fornecida pelo kit. Posteriormente foram
depositadas as amostras em poços diferentes da placa. A seguir foram adicionados
a todos os poços 50 µl do LAL e a placa incubada a 37ºC por 10 min.
Com auxílio de uma micropipeta, foram depositados 100�L do substrato
cromogênico em todos os poços (amostras e curva), seguidos de homogeneização e
incubação a 37ºC por 6 min. Posteriormente, foram acrescentados em todos os
poços 100 �L de uma solução de ácido acético 25% para interromper a reação.
Finalmente, foi feita a determinação das densidades ópticas (D.O.) em
espectrofotômetro a 405nm e os resultados determinados, correlacionando a curva
padrão com a diluição das amostras, tendo em consideração a absorbância e a
concentração de endotoxina para esse ponto de cada uma das amostras, em
relação à curva padrão. A fórmula aplicada para calcular a quantidade de LPS por
micrograma de DNA foi:
UE/ml X diluição UE/µg DNA = ________________________
amostra µg/ml
Materiais e Métodos
26
Foram consideradas amostras livres de endotoxina, aquelas que apresentam
valores menores que 0,1 UE/µg DNA.
4.6 – Imunizações
Os plasmídeos pVAX-hsp65 e pVAX tiveram suas concentrações acertadas
para 2 µg/µL em PBS. A estas preparações, foi acrescida uma solução de sacarose
(concentração final de 25%), visando promover um influxo celular para o local da
imunização. Os animais foram imunizados no músculo quadríceps femural (i.m), em
intervalos de 15 dias entre uma dose e outra. Cada animal recebeu 3 doses de 100
µg de DNA, sendo 50 µg em cada músculo (totalizando 300 µg ao final das três
doses).
4.7 - Preparo do inóculo de Mycobacterium tuberculosis
A suspensão de M. tuberculosis, linhagem H37Rv (ATCC 27294), foi obtida a
partir de uma alíquota congelada a -70º C, na qual foi verificada viabilidade superior
a 85% (incubação de uma amostra com diacetato de fluoresceína e brometo de
etídio) (McDonough & Kress, 1995). Uma alíquota de 50 µL foi semeada em meio
Lowenstein-Jensen (DIFCO) seguindo-se incubação de 20 a 30 dias, a 37º C. Uma
alça da cultura em meio Lowenstein-Jensen foi adicionada a 10 ml de meio 7H9
enriquecido com Middlebrook ADCTM (BD Biosciences, Spark, USA) sendo incubada
por 7 a 10 dias, a 37º C. A viabilidade foi novamente verificada com auxílio de
microscópio de fluorescência (Leica), onde as bactérias viáveis apresentam
coloração verde enquanto que as bactérias mortas coram-se com a solução de
brometo, apresentando-se com uma coloração avermelhada. O número de bacilos
da suspensão foi determinado através da densidade óptica da cultura a 540 nm. A
suspensão foi centrifugada a 3500 rpm por 20 minutos, o sedimento foi ressuspenso
em 1 ml de salina estéril e agitado vigorosamente em tubo cônico com pérolas de
vidro estéreis por 2 minutos. Acertou-se a concentração de bacilos (1x106 bacilos/ml)
presentes no volume de cultura centrifugado por diluição com salina. Todos os
procedimentos de cultura da micobactéria, preparo do inóculo e desafio dos animais
foram realizados em laboratório de nível de biossegurança III.
Materiais e Métodos
27
4.8 - Desafio dos animais com Mycobacterium tuberculosis
Cada animal foi desafiado com 100µL de suspensão contendo 1x105 bacilos
de M. tuberculosis H37Rv por via intratraqueal (i.t), 15 dias após a última
imunização. Para esse procedimento, os animais foram previamente anestesiados
com uma solução de tribromoetanol (ACROS ORGANICS) a 2,5% em PBS por via
intraperitoneal (i.p). Após a anestesia, realizou-se o procedimento cirúrgico para
exposição da traquéia dos animais e inoculação da bactéria.
4.9 - Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para dosagem de anticorpos anti-Hsp65
e anti-Hsp60
Placas de poliestireno (Maxisorp Nunc-Immuno Plates, Rochester, NY, USA)
de 96 poços, foram recobertas com 0,1 ml das proteínas Hsp65 (produzida em
nosso laboratório) ou Hsp60 (Lionex - Alemanha) recombinantes (5 µg/ml) diluídas
em tampão de ligação (Na2CO3 14,3 mM e NaHCO3 10,3 mM pH 9,6), e incubadas
durante a noite a 4ºC. Posteriormente, as placas foram lavadas (0,05% de Tween 20
em PBS pH 7,2-7,4) e bloqueadas por 1 hora a 37ºC (200 µL por poço de PBS com
1% de gelatina, pH 7,2-7,4). Após lavagem, foram adicionadas as amostras (soros
diluídos seriadamente 1:100, 1:500 e 1:1000) e incubadas por 2 horas a 37°C. As
placas foram novamente lavadas e incubadas com anti-IgG1 (A85-1, Sigma) ou anti-
IgG2a biotinilados (R19-15, Sigma) para a determinação de isotipos de anticorpos
anti-Hsp65 e incubadas com anti-IgG total biotinilado para detecção de anti-Hsp60
(PharMingen, San Diego, CA, USA). A revelação foi feita pela incubação à
temperatura ambiente por 30 minutos com StreptAB kitTM (Dako, Carpinteria, CA,
USA), seguida da adição do substrato OPD (Sigma, St. Louis, MO, USA). A reação
foi finalizada pela adição de 50 µL de ácido sulfúrico a 16% (Merck &.Co. Inc.) A
Densidade óptica foi obtida em leitor de microplacas com filtro de 490 nm (Quant
Bio-Tek Instruments Inc.). Todos os anticorpos utilizados foram adquiridos da
PharMingen e utilizados de acordo com as instruções do fabricante.
Materiais e Métodos
28
4.10 - Ensaio de Imunofluorescência Indireta (IFI) para determinação de
anticorpos anti-DNA
A realização desta técnica ocorreu na Faculdade de Medicina de São Paulo,
na Disciplina de Reumatologia, com a colaboração da técnica Margareti Vendramini
e coordenação da Dra. Eloísa Bonfa. Neste ensaio foi utilizada cultura de Crithidia
luciliae, um hemoflagelado que possui o cinetoplasto, estrutura rica em DNA, o qual
é exposto como substrato, para reação com possíveis anticorpos anti-DNA
presentes na amostra. A manutenção da cultura de Crithidia foi feita pela suspensão
de hemoflagelados em meio estéril de Fyts. Após incubação por 48 horas a 28ºC, os
microorganismos foram centrifugados a 700 rpm por 10 minutos, lavados 3 vezes
com solução salina 0,5 M tamponada com fosfato e pH ajustado para 7,2 e
ressuspendidos em água contendo albumina sérica bovina a 0,1%. Transcorridos 10
minutos, aplicaram-se 10 µl da suspensão contendo os microorganismos. As
lâminas foram sucessivamente expostas ao ar para secarem, sendo fixadas com
etanol absoluto 10 minutos e estocadas a -20ºC.
A produção de anticorpos anti-DNA foi avaliada por IFI em amostras de soro
diluídas a 1/10 e 1/20 em PBS-azida (NaN3 MERCK 6688 A 100 65). Após a
diluição, as amostras foram colocadas em lâminas previamente preparadas com o
substrato de Crithidia luciliae e incubadas a 37ºC por 45 minutos. Feita a incubação,
as lâminas foram lavadas para a retirada do excesso da amostra e, posteriormente,
foram mergulhadas em cuba com PBS-azida por 10 minutos. Logo após a secagem
das mesmas, foram aplicados 20 µl do anticorpo conjugado (Sigma 102K9150) anti-
mouse e feita a incubação por 40 minutos a 37ºC. Posteriormente, as lâminas
foram lavadas e preparadas para observação ao microscópio de fluorescência. Na
análise, a positividade da reação se caracteriza pela intensa cor verde fluorescente
destacando o cinetoplasto, enquanto que a reação negativa apresenta-se verde ou
vermelha fosca não destacando o material cromossômico.
4.11- Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para dosagem de anticorpos anti-DNA
Placas de poliestireno (Maxisorp Nunc-Immuno Plates, Rochester, NY, USA)
de 96 poços, foram pré-tratadas com 50 µl de poli-L-lisina (Sigma, Sto. Louis-USA) a
50 µg/ml em PBS a 37ºC por 2 horas. Após a lavagem das placas por 2 vezes com
Materiais e Métodos
29
PBS, os orifícios das placas foram recobertos com 50 µl de DNA nativo de timo de
bezerro (nDNA) (Sigma, Sto. Louis-USA) a 0,125 µg/µl em PBS por 16 horas a 4ºC.
As placas foram, então, lavadas e bloqueadas com uma solução contendo BGG
(gamaglobulina bovina fetal 2%) em PBS (75 µl por orifício) por 2 horas à
temperatura ambiente. As amostras de soro foram diluídas a 1:50 em PBS com
tween 20 a 0,1% e gamaglobulina fetal (2%) e foram adicionadas aos orifícios e
incubadas por 2 horas à temperatura ambiente. Posteriormente, as placas foram
lavadas e incubadas com IgG de cabra anti-IgG de camundongo marcada com
fosfatase alcalina, diluída em PBS/tween e soro bovino fetal 20% e incubado por 1
hora. A lavagem foi repetida e a reação foi revelada com a adição do substrato p-
nitrofenilfosfato (Sigma, St. Louis, MO, USA) 1mg/ml de tampão glicina (pH-10,5). A
reação foi interrompida com a adição de 50 µl de NaOH 3 M. A Densidade óptica foi
obtida em leitor de microplacas com filtro de 405 nm (Quant Bio-Tek Instruments
Inc.).
4.12 - Análise histopatológica
Para esta análise, foram obtidas amostras de 18 tipos de órgãos como
pâncreas, articulação, coração, músculo esquelético, cérebro, tireóide, fígado,
pulmão, rim, supra-renal, baço, timo, linfonodo poplíteo e linfonodo inguinal, intestino
delgado e intestino grosso, pele, e globo ocular. Estes órgãos, removidos por
ocasião do sacrifício dos animais (em cuba com éter), foram fixados em tampão
fosfato contendo 10% de formalina durante 6 horas e, em seguida, foram
submetidos ao processo de desidratação em álcool 70% e clarificação em xilol. Os
tecidos foram inclusos em blocos de parafina e, em seguida, foram realizados cortes
histológicos de 5 µm de espessura com auxílio de um micrótomo. Os cortes foram
dispostos em lâminas e incubados a 58-60oC para fixação e, em seguida, lavados
em xilol para retirar o excesso de parafina e re-hidratados com concentrações
decrescentes de álcool (do absoluto ao 80%). Os cortes re-hidratados foram corados
com hematoxilina-eosina (HE), desidratados em concentrações crescentes de álcool
(80% ao absoluto), lavados com xilol e cobertos com lamínulas para análise dos
componentes celulares presentes. As lâminas foram examinadas em microscópio
óptico (Leica, Germany) e as imagens adquiridas através de câmera digital (Sony
DXC-107A) acoplada ao microscópio. A confecção destas lâminas histológicas foi
Materiais e Métodos
30
realizada pela técnica Ana Maria da Rocha e analisadas cegamente pelos
patologistas Prof. Dr. Edson G. Soares (FMRP-USP) e Dr. Luiz Benvenuti (Instituto
do Coração-InCor / HC-FMUSP). As lâminas que apresentaram leituras discordantes
foram reavaliadas, sendo definido um consenso entre os patologistas. Em cada
tecido analisado foram avaliadas: (I) presença de comprometimento tecidual (II)
presença de infiltrado inflamatório, (III) presença de focos hemorrágicos e edemas,
entre outros.
4.13 - Análise estatística
A análise estatística dos resultados obtidos foi realizada pelo teste “one way
ANOVA”, seguida do teste Bonferroni, o qual permite a comparação de três ou mais
grupos experimentais independentes, onde foram consideradas estatisticamente
significantes as diferenças com p<0,05. O software utilizado, foi GraphPad Prism
versão 4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
31
++����������������
Resultados
32
5 – RESULTADOS 5.1 - Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65
� Protocolo A
A produção de anticorpos foi avaliada pela técnica de ELISA em soros pré-
imunes (dia 0 ) e em soros coletados 15, 45 e 180 dias após a última imunização de
camundongos que receberam injeções com PBS, DNAv (pVAX-vetor) ou DNA-hsp65
(pVAX-hsp65). A resposta imune humoral foi determinada através da produção de
anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 (Figuras 3A e 3B, respectivamente).
Inicialmente, observamos que a vacina de DNA-hsp65 induziu a produção de
altos títulos de anticorpos anti-Hsp65, tanto do isotipo IgG1 quanto IgG2a, sendo
estatisticamente significativo em relação aos demais grupos experimentais, como
PBS, vetor e amostras do momento pré-imune. Entretanto, observamos que 180 dias
após a imunização, os títulos de anticorpo IgG1 diminuíram de maneira significativa
nos animais imunizados com DNA-hsp65, quando comparados aos títulos de
anticorpos produzidos 15 e 45 dias após a imunização (Figura 3A). Por outro lado,
foi observado que animais injetados com DNA-hsp65 produziram altos títulos de
IgG2a nos três tempos avaliados (Figura 3B).
Resultados
33
A
B
Figura 3: Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100µg de DNA-hsp65 ou DNAv em 3 doses com intervalos de 2 semanas entre uma dose e outra. O grupo controle recebeu PBS nas imunizações. Os níveis de anticorpos IgG1 (A) e IgG2a (B) anti-Hsp65 foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 100 vezes) no momento pré-imune e nos tempos de 15, 45 e 180 dias depois da última imunização. Os resultados estão representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (490 nm) das amostras de três experimentos independentes com o n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,05 de todos os grupos em relação ao pré-imune, � p < 0,05 comparando-se os tempos dentro do mesmo grupo e � p < 0,05 comparando-se os grupos dentro do mesmo tempo.
0 50 100 150 200 2500
1
2
3controlevetorvacina
*
*
*
�
�
Tempo (dias)
� ��
IgG
1 an
ti-H
sp65
(DO
490
nm
)
0 50 100 150 200 2500
1
2
3controlevetorvacina
***
Tempo (dias)
���
IgG
2a a
nti-
Hsp
65(D
O 4
90 n
m)
Resultados
34
5.2 - Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60
� Protocolo A
Assim como descrito no Protocolo A para determinação de anticorpos anti-
Hsp65, seguimos o mesmo delineamento de imunizações e tempos analisados para
determinação de anticorpos IgG total anti-Hsp60 humana.
Como podemos observar na figura 4, nos dias 15 e 45 após a última dose da
vacina (tempos 1 e 2, respectivamente), somente os camundongos que foram
imunizados com DNA-hsp65 produziram níveis significativos de anticorpos anti-
Hsp60 quando comparados aos níveis de anticorpos detectados em amostras de
soros pré-imunes (dia 0). Também podemos observar que ao comparar os diferentes
grupos dentro do mesmo tempo, apenas animais que foram imunizados com DNA-
hsp65 apresentaram um aumento significativo de anticorpos anti-Hsp60, somente
nos tempos de 15 e 45 dias após a última dose, quando comparados aos grupos
controle e vetor. Entretanto, os títulos destes anticorpos diminuíram após 180 dias
da última dose da vacina (Figura 4).
Resultados
35
Figura 4: Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100µg de DNA-hsp65 ou DNAv em 3 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu PBS nas imunizações. Os níveis de anticorpos IgG total anti-Hsp60 foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 100 vezes) no momento pré-imune e nos tempos de 15, 45 e 180 dias depois da última imunização. Os resultados estão representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (490 nm) das amostras de três experimentos independentes com n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,05 de todos os grupos em relação ao pré-imune e � p < 0,05 comparando-se os grupos dentro do mesmo tempo.
0 50 100 150 200 2500.00
0.25
0.50 controlevetorvacina
* *��
Tempo (dias)
IgG
Tot
al a
nti-
Hsp
60(D
.O 4
90 n
m)
Resultados
36
5.3 - Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65
� Protocolo B
Neste protocolo, a produção de anticorpos foi avaliada pela técnica de ELISA
a partir de soros pré-imunes (dia 0) e também em soros de camundongos que
receberam injeções com PBS, DNAv ou DNA-hsp65 sendo posteriormente
infectados com M. tuberculosis por via intra-traqueal. No dia da infecção (momento
pré-infecção) e passados 30 e 70 dias após a infecção, foram coletadas amostras de
soro dos animais. A resposta imune humoral foi determinada através da produção de
anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 (Figuras 5A e 5B, respectivamente).
Inicialmente, podemos observar que camundongos imunizados com DNA-
hsp65 apresentaram um aumento significativo tanto de IgG1 quanto de IgG2a nos
três tempos avaliados, quando comparados com os níveis de anticorpos em
amostras pré-imunes. Além disso, amostras de animais do grupo controle e grupo
vetor também foram significativamente maiores 70 dias após o desafio (dia 115),
quando comparadas às amostras pré-imunes (Figuras 5A e 5B).
Foi observado também, que 15 dias após a última dose da vacina (momento
pré-infecção) e 30 dias após a infecção, animais que foram vacinados apresentaram
níveis significativamente maiores dos dois isotipos anti-Hsp65, quando comparado
àqueles dos grupos controle e vetor. No entanto, no isotipo IgG2a de camundongos
vacinados, foi observada uma significativa queda 30 dias após a infecção em
relação ao momento pré-infecção (15 dias após a vacinação) (Figura 5).
Os animais que receberam PBS e vetor plasmideal nas imunizações
mostraram um significante e abrupto aumento de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-
Hsp65 no segundo tempo avaliado de 70 dias após a infecção, em relação ao tempo
de 30 dias após a infecção de seus respectivos grupos, chegando a equiparar-se
aos níveis de anticorpos detectados no grupo vacina (Figura 5).
Resultados
37
Figura 5: Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100µg de DNA-hsp65 ou DNAv em 3 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu PBS nas imunizações. Quinze dias após a última dose, os animais foram desafiados com 5 x 105 bacilos de M. tuberculosis por via intra-traqueal. Os níveis de anticorpos IgG1 (A) e IgG2a (B) anti-Hsp65 foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 100 vezes) nos tempos 0 (pré-imune), 45 (pós-imune), 75 (30 dias pós infecção) e 115 (70 dias pós infecção) dias. Os resultados estão representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (490 nm) das amostras de três experimentos independentes com o n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,05 de todos os grupos e tempos em relação ao pré-imune, � p < 0,05 comparando-se os tempos dentro do mesmo grupo e � p < 0,05 comparando-se os grupos dentro do mesmo tempo. A seta indica o dia da infecção.
0 20 40 60 80 100 1200
1
2
3
4
vetorvacina
controle
Tempo (dias)
***
**
��
�
�Ig
G1
anti
-Hsp
65(D
O 4
90 n
m)
B
A
0 20 40 60 80 100 1200
1
2
3
4
vetorvacina
controle
Tempo (dias)
*�
�
*
***
� �
�
IgG
2a a
nti-
Hsp
65(D
O 4
90 n
m)
Resultados
38
5.4 - Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60
� Protocolo B
Como descrito no Protocolo B para determinação de anticorpos anti-Hsp65,
seguimos o mesmo delineamento de imunizações e tempos analisados para a
determinação de anticorpos IgG total anti-Hsp60 (Figura 6).
Como podemos observar na figura 6, houve um aumento significante nos
níveis de anticorpo IgG anti-Hsp60 no soro proveniente de animais que foram
imunizados com DNA-hsp65 no tempo de 70 dias após a infecção (dia 115) em
relação ao soro pré-imune (dia 0). Além disso, apesar de não haver diferença
estatística, a produção de anticorpo anti-Hsp60 no soro de animais que receberam
PBS e DNAv apresentou-se aumentada em relação ao soro pré-imune 70 dias após
a infecção (dia 115). No entanto, esses títulos de anticorpos foram significativamente
menores do que aqueles encontrados no soro de animais que foram imunizados com
DNA-hsp65.
Resultados
39
Figura 6: Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100µg de DNA-hsp65 ou DNAv em 3 doses com intervalos de 2 semanas entre uma dose e outra. O grupo controle recebeu PBS nas imunizações. Quinze dias após a última dose, os animais foram desafiados com 5 x 105 bacilos de M. tuberculosis por via intra-traquel. Os níveis de anticorpos IgG total anti-Hsp60 foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 100 vezes) nos tempos 0 (pré-imune), 45 (pós-imune), 75 (30 dias pós infecção) e 115 (70 dias pós infecção) dias. Os resultados estão representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (490 nm) das amostras de três experimentos independentes com o n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,05 de todos os grupos em relação ao pré-imune, � p < 0,05 comparando-se os tempos dentro do mesmo grupo e � p < 0,05 comparando-se os grupos dentro do mesmo tempo. A seta indica o dia da infecção.
0 20 40 60 80 100 1200.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5controle
vacinavetor
*��
Tempo (dias)
IgG
Tot
al a
nti-
Hsp
60(D
.O 4
90 n
m)
Resultados
40
5.5- Determinação da produção de anticorpos anti-DNA por
Imunofluorescência Indireta
A análise da produção de anticorpos anti-DNA foi realizada pela técnica de
Imunofluorescência Indireta (IFI) pela reação com DNA de Crithidia luciliae, a qual,
quando positiva, apresenta-se sob uma coloração verde fluorescente intensa,
destacada por um ponto fluorescente, que é o cinetoplasto (material rico em DNA)
da Crithidia luciliae. Como controle positivo, utilizamos soro de animais NZB/NZW F1
que é uma linhagem de camundongos que desenvolvem lupus eritematoso
sistêmico, doença esta que tem como característica a produção de anticorpos anti-
DNA (Figura 7A). Por outro lado, quando a reação é negativa, a mesma se encontra
sob uma coloração verde ou vermelha fosca, a qual não destaca a estrutura com
DNA. Como controle negativo utilizamos amostras de soros pré-imunes de
camundongos BALB/c (Figura 7B).
Todas as amostras experimentais, tanto do protocolo A quanto do B deste
projeto, não apresentaram positividade para a reação, ficando claro que a
imunização com o DNA-hsp65 não foi capaz de induzir a produção destes auto-
anticorpos (Figura 7C).
Resultados
41
C
Figura 7: Determinação de anticorpos anti-DNA por IFI. Controle positivo para anticorpos anti-DNA em amostras de soros de camundongos NZB/NZW (A); controle negativo para anticorpo anti-DNA em amostras de soros pré-imunes de camundongos BALB/c (B); e amostra de um dos resultados negativos representativo das amostras experimentais para anticorpo anti-DNA (C). Na figura A, a seta aponta um exemplo de cinetoplato corado positivamente.
A
B
Resultados
42
5.6 - Determinação da produção de anticorpos anti-DNA por ELISA
Após obtermos os resultados de anticorpos anti-DNA pela técnica de IFI,
decidimos realizar a técnica de ELISA para o mesmo fim, por ser um ensaio mais
sensível além de permitir resultados quantitativos.
Observamos, mais uma vez, que todas as amostras analisadas tanto do
Protocolo A (Figura 8A) quanto do Protocolo B (Figura 8B) não mostraram presença
destes anticorpos. Isto fica claro ao compararmos os resultados das amostras
experimentais com as amostras de soro pré-imune e amostras de animais NZB/NZW
F1 usadas como controle positivo, que foram significativamente maiores em relação
a todos grupos e tempos analisados (Figuras 8A e B). Podemos observar que no
Protocolo B, as análises realizadas em amostras referentes ao tempo de 70 dias
após a infecção (T2) dos três grupos avaliados, mostraram um discreto aumento em
comparação ao tempo anterior e amostras pré-imunes, porém, não significativo.
Resultados
43
NZB/W
pré-im
.T1 T2 T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
controle vetor vacina
***
Ant
icor
pos
anti
-DN
A(D
O 4
05 n
m)
NZB/W
pré-im
. T1 T2 T1 T2 T1 T20.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
controle vetor vacina
***
Ant
icor
pos
anti
-DN
A(D
O 4
05 n
m)
Figura 8: Determinação da produção de anticorpos anti-DNA. A análise foi realizada pela técnica de ELISA no soro dos animais (diluído 50 vezes) referentes ao Protocolo A (A) e Protocolo (B). Soros de animais NZB/NZW foram utilizados como controle positivo. Os resultados são representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (405 nm) das amostras de três experimentos independentes com o n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,001 do controle positivo em relação a todos os outros tempos e grupos analisados.
A
B
Resultados
44
5.7 - Avaliação Histopatológica
A avaliação histopatológica foi realizada pela coloração de Hematoxilina e
Eosina (HE) em diferentes órgãos de camundongos tanto do Protocolo A quanto do
Protocolo B. Foram analisados 18 órgãos que se encontram listados na tabela 1.
Nos órgãos obtidos de animais submetidos ao Protocolo A foi observado que,
de maneira geral, em vários animais, independentemente de grupo ou tempo
avaliado, foi freqüente a presença de discretas alterações pulmonares. Essas
alterações foram caracterizadas por raros, mínimos ou discretos focos inflamatórios
com presença de macrófagos, linfócitos e, às vezes neutrófilos, além de focos
hemorrágicos e congestos. Em outros poucos casos, observaram-se mínimas
alterações no fígado, rim, articulação e músculo esquelético, porém, alterações
estas, não significativas e não sugestivas de quadro patológico.
Assim como foi observado nos resultados referentes às amostras do
Protocolo experimental A, amostras provenientes de animais do Protocolo B também
apresentaram alterações independentemente de grupo ou tempo analisados.
Obviamente, um intenso comprometimento pulmonar foi observado em todos
animais, salvo algumas exceções, em que o procedimento de infecção não foi bem
sucedido. Observaram-se também, raros casos de amostras de músculo esquelético
e freqüentes casos de fígado, que apresentaram discretos e mínimos focos de
infiltrado celular, porém, não sugestivos de alterações patológicas. Além disso, fica
claro o não envolvimento da vacina DNA-hsp65 na indução destas alterações, uma
vez que estas foram também observadas nos grupos controle e vetor.
Imagens representativas de todos os órgãos; nos grupos, tempos e protocolos
analisados estão representadas nas fotos a seguir (Figuras 9 - 37). Além disso, em
anexo (página 105), esta representada uma tabela com a descrição completa das
leituras (cegas) realizadas pelos patologistas Dr. Édson Soares (FMRP-USP) e Dr.
Luiz Benvenuti (InCor). Nestes resultados, podemos observar que os órgãos
provenientes de animais que foram imunizados encontram-se nas mesmas
condições dos órgãos de animais dos grupos controle e vetor, não apresentando
alterações indicativas de auto-imunidade.
As amostras de pulmões e órgãos linfóides como baço, timo, linfonodo
poplíteo e linfonodo inguinal, provenientes de animais do protocolo experimental B,
Resultados
45
os quais foram submetidos à infecção, não foram representadas, pois, segundo
conversa com o patologista Dr. Édson Soares, as alterações encontradas nestes
órgãos são, obviamente, decorrentes da infecção, não se correlacionando com
alterações sugestivas de auto-imunidade.
Resultados
46
Tabela 1: Lista dos 18 órgãos analisados histologicamente
Pâncreas Articulação Cérebro
Tireóide Fígado Rim
Adrenal Coração Músculo esquelético
Globo ocular Pele Intestino delgado
Intestino grosso Pulmão Baço
Timo Linfonodo poplíteo Linfono ingnal
Tabela 2: Quantidade de animais avaliados na histopatologia em cada tempo e grupo dos protocolos experimentais.
Tempos
Grupos
T1 T2 T3
PBS
n = 9 n = 9 n = 9
Vetor
n = 8 n = 9 n = 9 Protocolo A
Vacina
n = 9 n = 9 n = 9
PBS
n = 9 n = 9 ----
Vetor
n = 9 n = 9 ---- Protocolo B
Vacina
n = 9 n = 9 ----
Resultados
47
Figura 9: Avaliação histológica do Pâncreas. Representação das estruturas pancreáticas em perfeitas condições, apresentando tanto a parte exócrina quanto a endócrina intactas, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x. IL (ilhotas de langerhans), AP (ácinos pancreáticos).
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
IL
AP
Resultados
48
Figura 10: Avaliação histológica do Pâncreas. Representação das estruturas pancreáticas em perfeitas condições, apresentando tanto a parte exócrina quanto a endócrina intactas, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x. IL (ilhotas de langerhans), AP (ácinos pancreáticos).
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
IL
AP
Resultados
49
Figura 11: Avaliação histológica da Articulação. Representação das cartilagens articulares (CA) e espaços articulares (EA) apresentando-se íntegros, sem a presença de infiltrados celulares nem a formação de tecido conjuntivo de reparo. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. (MO) medula óssea.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
MO
EA
CA
Resultados
50
Figura 12: Avaliação histológica da Articulação. Representação das cartilagens articulares (CA) e espaços articulares (EA) apresentando-se íntegros, sem a presença de infiltrados celulares nem a formação de tecido conjuntivo de reparo. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. (MO) medula óssea.
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
MO EA
CA
Resultados
51
Figura 13: Avaliação histológica do Tecido Encefálico. Representação das camadas constituintes do tecido cerebral e cerebelar em prefeitas condições, bem delimitadas e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CG (camada granulosa), SB (substância branca) e SC (substância cinzenta).
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
SB
CG
SC
Resultados
52
Figura 14: Avaliação histológica do Tecido Encefálico. Representação das camadas constituintes do tecido cerebral e cerebelar em prefeitas condições, bem delimitadas e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CG (camada granulosa), SB (substância branca) e SC (substância cinzenta).
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
SB
CG
SC
Resultados
53
Figura 15: Avaliação histológica da Tireóide. Representação das estruturas tireóideanas em prefeitas condições, apresentando os folículos tireóideanos (FT) contendo substância coloidal (C) sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
FT C
Resultados
54
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
Figura 16: Avaliação histológica da Tireóide. Representação das estruturas tireóideanas em prefeitas condições, apresentando os folículos tireóideanos (FT) contendo substância coloidal (C) sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.
FT
C
Resultados
55
Figura 17: Avaliação histológica do Fígado. Representação do parênquima hepático preservado. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
Resultados
56
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
Figura 18: Avaliação histológica do Fígado. Representação do parênquima hepático preservado. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.
Resultados
57
Figura 19: Avaliação histológica do Rim. Representação da camada cortical renal (CC) com a presença de glomérulos renais (GR) e túbulos renais (TR) em condições estruturais normais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
GR CC
TR
Res
ulta
dos
58
cont
role
T1
co
ntro
le T
2
veto
r T
1
veto
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2
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1
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corr
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mos
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tada
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Pro
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lo B
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1 e
T2
corr
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tem
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grup
os e
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imen
tais
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ão in
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dos
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ada
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E) e
as
imag
ens
obtid
as c
om a
obj
etiv
a de
20x
.
GR
CC
TR
Resultados
59
Figura 21: Avaliação histológica da Adrenal. Representação das camadas adrenais em perfeitas condições estruturais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CG (camada glomerulosa), CF (camada fasciculada), CR (camada reticulada) e CM (camada medular).
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3 CG
CF
CR
CM
Resultados
60
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
Figura 22: Avaliação histológica da Adrenal. Representação das camadas adrenais em perfeitas condições estruturais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CG (camada glomerulosa), CF (camada fasciculada), CR (camada reticulada) e CM (camada medular).
CG
CF
CR
CM
Resultados
61
Figura 23: Avaliação histológica do Coração. Representação do parênquima cardíaco apresentando fibras musculares cardíacas em cortes longitudinais e transversais sem alterações estruturais nem presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
Resultados
62
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
Figura 24: Avaliação histológica do Coração. Representação do parênquima cardíaco apresentando fibras musculares cardíacas em cortes longitudinais e transversais sem alterações estruturais nem presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.
Resultados
63
Figura 25: Avaliação histológica do Músculo Esquelético. Representação de fibras de músculo esquelético em cortes longitudinais e transversais apresentando-se íntegras, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
Resultados
64
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
Figura 26: Avaliação histológica do Músculo Esquelético. Representação de fibras de músculo esquelético em cortes longitudinais e transversais apresentando-se íntegras, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.
Resultados
65
Figura 27: Avaliação histológica do Globo Ocular. Representação das camadas celulares do globo ocular em perfeitas condições estruturais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CV (corpo vítreo).
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
CV
Resultados
66
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
Figura 28: Avaliação histológica do Globo Ocular. Representação das camadas celulares do globo ocular em perfeitas condições estruturais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CV (corpo vítreo).
CV
Resultados
67
Figura 29: Avaliação histológica da Pele. Representação do tecido cutâneo em perfeitas condições, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. TM (tecido muscular), TC (tecido conjuntivo) e GS (glândulas sebáceas) envoltas às bainhas de folículos pilosos.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
GS
TC
TM
Resultados
68
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
Figura 30: Avaliação histológica da Pele. Representação do tecido cutâneo em condições normais, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. TM (tecido muscular), TC (tecido conjuntivo) e GS (glândulas sebáceas) envoltas às bainhas de folículos pilosos.
GS
TM TC
Resultados
69
Figura 31: Avaliação histológica dos Intestinos delgado e grosso. Representação de estruturas intestinais como vilosidades (VL), glândulas intestinais (GI) e camada de músculo liso (ML) em condições normais, sem a presença de infiltrado celular. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
VL
GI
VL
GI
ML
Resultados
70
controle T1 controle T2
vetor T1 vetor T2
vacina T1 vacina T2
Figura 32: Avaliação histológica dos Intestinos delgado e grosso. Representação de estruturas intestinais como vilosidades (VL), glândulas intestinais (GI) e camada de músculo liso (ML) em condições normais, sem a presença de infiltrado celular. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.
VL
GI
ML
VL
Resultados
71
Figura 33: Avaliação histológica do Pulmão. Representação do parênquima pulmonar preservado e estruturas pulmonares como alvéolos (AL) e bronquíolos respiratórios (BR) com ou sem presença de pequenos e mínimos infiltrados celulares focais perialveolares, sem significância patológica (indicados pelas setas). Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T3
AL
BR
Resultados
72
Figura 34: Avaliação histológica do Baço. Representação das regiões esplênicas como polpa vermelha (PV), folículo linfóide (FL) e centro germinativo (CG) pouco evidente em condições normais. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
FL
CG
PV
Resultados
73
Figura 35: Avaliação histológica do Timo. Representação das camadas cortical (C) e medular (M) em condições normais. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
C
M
Resultados
74
Figura 36: Avaliação histológica do Linfonodo Poplíteo. Representação do tecido linfóide em condições normais. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. NC (nódulo cortical), M (camada medular).
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
NC
M
Resultados
75
Figura 37: Avaliação histológica do Linfonodo Inguinal. Representação do tecido linfóide em condições normais. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. NC (nódulo cortical), M (camada medular).
controle T1 controle T2 controle T3
vetor T1 vetor T2
vetor T3
vacina T1 vacina T2 vacina T3
NC
76
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Discussão
77
6 – DISCUSSÃO
Nesse trabalho, mostramos que a vacinação com DNA-hsp65 não induziu
doença auto-imune nem inflamação significativa em qualquer órgão analisado e nem
a produção de anticorpos anti-DNA. Apesar da produção de anticorpos contra Hsp65
micobacteriana e Hsp60 humana, não houve lesão inflamatória nos órgãos
analisados associada à vacina, sugerindo que tais anticorpos não levaram à
formação de imuno-complexos, nem reagiram contra HSPs endógenas induzindo o
desenvolvimento de quadros inflamatórios relevantes nos tecidos avaliados. Em
conjunto, esses resultados são importantes, pois demonstram a biossegurança
dessa vacina, excluindo, que a injeção de DNA-hsp65 desencadeie a quebra de
tolerância para proteínas endógenas resultando em quadros de auto-imunidade.
As HSPs são importantes proteínas que desempenham várias funções no
meio intracelular além de agirem como chaperonas moleculares, importantes para
sobrevivência de células eucarióticas e procarióticas. As HSPs são classificadas em
diferentes famílias de acordo com seu peso molecular. Estas famílias são altamente
conservadas através da evolução e alguns membros de determinadas famílias
apresentam seqüências altamente homologas entre sua variação eucariótica e
procariótica. Isto resulta em reação imunológica cruzada entre homólogos mamíferos
e bacterianos.
As importantes e indispensáveis funções das proteínas HSPs em processos
intracelulares talvez expliquem sua notável conservação evolutiva entre as espécies.
A localização intracelular das HSPs de mamíferos em condições normais, a
típica liberação de HSPs por agentes infecciosos (RANFORD et al., 2000) e a
capacidade de ambas as HSPs (humana e microbiana) em elicitar respostas pró-
inflamatórias inata e adaptativa, indicam uma ligação destas proteínas com
respostas imunes a infecções e a tecidos necróticos que podem favorecer o
desenvolvimento de doenças auto-imunes.
Seguindo a liberação de HSPs por microorganismos em condições de
estresse ou por tecidos necrosados (reações auto-imunes), ocorre o reconhecimento
das mesmas por receptores de superfície (TLR2, TLR4, CD14, CD91, CD94, LOX1)
em células do sistema imune do hospedeiro, ou como auto-antígenos (OHASHI et
al., 2001; BASU et al., 2001; SRIVASTAVA et al., QUINTANA et al., 2005). Dessa
Discussão
78
forma, estas proteínas podem agir como sinal de perigo para o sistema imune. A
primeira evidência de uma função das HSPs como antígeno em resposta
inflamatória foi obtida na década de 1980 em um modelo de Artrite Reumatóide em
ratos, induzida por adjuvante e micobactéria morta pelo calor (VAN EDEN et al.,
1988). Neste trabalho, foram isoladas células T de ratos com a doença que
respondiam à Hsp60 em cultura. Desde então, reatividade as HSPs tem sido
descrito em modelos experimentais de doenças inflamatórias modelos e no próprio
homem. Também foi mostrado, em modelo experimental de aterosclerose, onde
coelhos normocolesterolêmicos imunizados com a proteína Hsp65 em adjuvante ou
M. tuberculosis (sabidamente rico em Hsp65), desenvolveram aterosclerose mesmo
sob uma dieta normal (XU et al., 1992).
Por outro lado, recentemente vários estudos têm demonstrado que células T
reativas as HSPs, tem um fenótipo imunorregulador. Tal fato indica que estas
proteínas, em particular Hsp60 e Hsp70 constituem um grupo de auto-antígenos com
o potencial de desencadear mecanismos imunorregulatórios, os quais podem
suprimir a resposta imune que ocorre em doenças inflamatórias em humanos, tais
como Artrite Reumatóide, Diabetes entre outras (Revisado por VAN EDEN, 2005).
Neste estudo, avaliamos se a vacina de DNA que codifica a proteína Hsp65
de M. leprae seria capaz de induzir a produção de auto-anticorpos que pudessem
implicar, mesmo que potencialmente, em auto-agressão tecidual, através de
avaliação histopatológica de diferentes órgãos simultaneamente e em diferentes
tempos de evolução. Para tanto, utilizamos linhagem de camundongos BALB/c, com
o objetivo de simular a utilização da vacina em indivíduos sadios, diferentemente de
outros trabalhos que abordam correlações entre HSPs e auto-imunidade.
Geralmente, tais trabalhos estudam modelos de auto-imunidade em linhagens de
camundongos pré-dispostos geneticamente ao desenvolvimento da doença, como
por exemplo, camundongos NOD que desenvolvem diabetes espontaneamente, ou
então, modelos de auto-imunidade induzidos quimicamente, como no caso da
utilização de STZ (estreptozotocina) que induz o desenvolvimento de diabetes.
Um aspecto que pode fornecer tendência ao aparecimento de doenças auto-
imunes é dado pelos títulos de anticorpos anti-DNA. Esses anticorpos são
marcadores sorológicos para alguns tipos de doenças auto-imunes, principalmente,
Lupus Eritematoso Sistêmico (LES). Como já se sabe, a única propriedade
imunológica do DNA é dependente de sua seqüência de nucleotídeos e seu estado
Discussão
79
de metilação, que pode ser imuno-estimulatória, ativando células como linfócitos B e
T entre outras (WAGNER, 1999; PISETSKY, 2000; YAMAMOTO et al., 2000; JUNG
et al., 2002). Em particular, o DNA bacteriano tem uma ampla atividade estimulatória
em função de seu conteúdo de motivos CpG, ao passo que, DNA de mamíferos não
tem a mesma atividade, podendo inclusive, inibir respostas direcionadas ao DNA
bacteriano (PISETSKY et al., 2000; CHEN et al., 2001; YAMADA et al., 2002). Além
disso, DNA bacteriano pode induzir uma forte resposta de anticorpos após
imunização, enquanto o DNA de mamíferos não tem esta habilidade (GILKESON et
al., 1995). Ademais, proteínas nucleares como histonas têm a capacidade de formar
complexos com DNA, sugerindo que tais complexos expõem regiões do DNA que
podem agir como epítopos para células B. Alternativamente, o DNA,
independentemente de proteínas complexadas, também pode ser reconhecido,
sendo que, em ambos os casos, a resposta é direcionada ao próprio DNA
(MESSINA et al., 1991). DEMETRIOS et al. (1992), mostraram por
imunofluorescência em cortes de tecido, depósitos intranucleares de anticorpos anti-
DNA em células de rim, baço, coração e fígado de camundongos normais, levando à
formação de infiltrados celulares no local.
Em estudos realizados em nosso laboratório, foi mostrado que a
administração in vivo de DNA nu, como no caso da vacina em questão, que é
administrada por via intramuscular, pode deixar o DNA-hsp65 plasmideal detectável
por até 6 meses pós imunização, sendo detectado em vários órgãos analisados
como pulmão, fígado, medula óssea, músculo esquelético, rim, linfonodo, baço e
timo, mostrando desse modo, uma ampla capacidade de biodistribuição do vetor
plasmideal (COELHO-CASTELO et al., 2006). Correlacionando isto ao fato de que o
DNA bacteriano e algumas HSPs, como a Hsp90, podem formar complexos imunes
que interagem com TLR9 estimulando células do sistema imune inato (KRIEG,
2002), esses complexos poderiam, hipoteticamente, ativar células B a produzir
anticorpos anti-DNA.
Sendo assim, analisamos amostras de soro de animais imunizados com DNA-
hsp65 quanto à presença de anticorpos anti-DNA, pelos métodos de
Imunofluorescência Indireta (IFI) e ELISA. No protocolo A, em que os animais
receberam apenas as imunizações, não foi detectada a presença destes auto-
anticorpos em nenhuma das técnicas empregadas (Figuras 7C e 8A). Da mesma
forma, não houve produção de tais anticorpos nos animais submetidos ao protocolo
Discussão
80
B (Figuras 7C e 8B). Neste protocolo, além de vacinados os camundongos foram
infectados com a micobactéria. Com isto, a agressão tecidual induzida pela infecção
poderia levar o DNA genômico tanto do hospedeiro quanto da micobacteria a um
contato com células imunes do hospedeiro. Assim, 70 dias após a vacinação e
infecção (Protocolo B), foi detectado um discreto, mas não significativo, aumento
desses anticorpos pela técnica de ELISA nos três grupos analisados.
Em estudo de correlação entre a infecção micobacteriana e auto-imunidade,
foi observado que anticorpos monoclonais anti-tuberculose reagiram com ssDNA,
dsDNA e outros polinucleotídeos, enquanto que anticorpos anti-DNA derivados de
pacientes e camundongos com LES reagiram com glicolipídeos expressos na parede
celular da micobactéria. Isto sugere que uma infecção micobacteriana poderia
estimular a produção de anticorpos potencialmente reativos ao DNA do hospodeiro
(SHOENFELD et al., 1986). Talvez, se analisássemos o Protocolo B em períodos de
tempo maiores, possivelmente poderíamos obter resultados pertinentes a este
estudo. No entanto, como foi descrito acima, os dados obtidos no grupo de animais
imunizados foram iguais aos obtidos nos demais grupos. Isso mostra que mesmo em
caso de infecção, que possivelmente, poderia auxiliar a produção de anticorpos anti-
DNA, a vacina não teve nenhuma ação no sentido de amplificar tal possibilidade.
Portanto, podemos concluir que tanto na imunização quanto em uma situação
de doença (após a infecção) a vacina DNA-hsp65 não induziu aumento nos títulos
de anticorpos anti-DNA, o que é um dado relevante no que diz respeito a segurança
desta construção, visando, futuramente, seu uso clínico.
Por outro lado, foi detectada significante produção de anticorpos anti-Hsp65
em animais imunizados. A avaliação da produção de anticorpos específicos anti-
Hsp65 induzida pela vacina DNA-hsp65 foi importante, primeiramente, para mostrar
que o DNA plasmideal codificando a proteína Hsp65 de M. leprae foi realmente
transfectado e/ou capturado por APCs, com conseqüente transcrição, tradução e
produção da proteína recombinante, que posteriormente levou a produção de
anticorpos anti-Hsp65 detectados nos ensaios de ELISA. Isto vai ao encontro com
estudos de expressão que mostraram que após injeção intramuscular, o DNA é
capturado por miócitos locais (STAN et al., 2001) e células dendríticas (AKBARI et
al., 1999). Nestes, o plasmídeo é mantido como um epissoma, o qual permite a
expressão do antígeno codificado (GURUNATHAM et al., 2000). O antígeno é então
secretado (TRIPATHY et al., 1996; CHASTAIN et al., 2001) e/ou apresentado por
Discussão
81
miócitos no sítio da injeção (STAN et al., 2001) ou por células dendríticas nos
linfonodos drenantes (AKBARI et al., 1999). Conseqüentemente, depois de uma ou
repetidas injeções de DNA, resposta imune humoral para a proteína codificada é
montada e linfócitos de memória são induzidos (GURUNATHAM et al., 2000).
O fato de que o título destes anticorpos esteja significativamente aumentado
apenas no grupo de animais que receberam imunização com DNA-hsp65 sugere sua
especificidade para a Hsp65 (de M. leprae) codificada pela vacina. Além disso, não
houve diferença do título de anticorpos anti-Hsp65 entre os grupos controles (que
receberam o vetor DNAv ou PBS) e amostras de soro coletados antes da
imunização (Figuras 3 e 4), reforçando a especificidade dos anticorpos produzidos
após o esquema de vacinação.
Outro ponto que podemos observar foi que os títulos de anticorpos IgG1 e
IgG2a anti-Hsp65 do grupo de animais vacinados com DNA-hsp65, mantiveram-se
aumentados até 180 dias após a última imunização, sugerindo, portanto, que a
vacina induziu um padrão misto de resposta que permaneceu por tempo prolongado.
Isto corrobora com dados anteriores do grupo que mostraram que a vacina com DNA
nu codificando a proteína Hsp65, quando administrada por via intramuscular, é
capaz de induzir este padrão misto de anticorpos IgG1/IgG2a (LIMA et al., 2003).
Considerando que a vacina em questão é estudada no combate à tuberculose, cuja
resposta protetora é preferencialmente Th1, este padrão de anticorpos é
interessante, uma vez que o “background” do camundongo BALB/c é Th2
(McCLUSKIE et al., 1999; GULER et al., 1997).
Sendo assim, a indução tão significativa desses anticorpos, poderia, pelo
menos potencialmente, levar a indução de mecanismos importantes em processos
deletérios como já foi abordado em outros estudos. Em um estudo onde foi
pesquisada a presença de anticorpos anti-HSPs em pacientes com doença auto-
imune relacionada a infecção por Helicobacter pylori, foi detectado altos níveis de
anticorpos anti-Hsp65 micobacteriana, sugerindo uma reação cruzada com HSPs
autólogas no sítio da infecção (KALABAY et al., 2002). Em outro estudo, várias
doenças de pele como Postulose Palmoplantar (PPP), Psoríase, Púrpura
Anafilactóide, Doença de Behçet, Dermatite Atópica, Urticária e Herpes Zoster,
apresentaram altos níveis de anticorpos anti-Hsp65 de Mycobacterium leprae (IZAKI
et al., 1994).
Discussão
82
Uma vez detectado que a vacina DNA-hsp65 induziu a produção de
anticorpos anti-Hsp65 de M. leprae e, considerando a alta homologia existente entre
as HSPs microbianas e humanas (~ 60% de homologia), foi de grande importância
avaliar se esses anticorpos reagiriam cruzadamente contra a Hsp60 humana. Vale
ressaltar, que apesar de termos avaliado a reatividade contra Hsp60 humana, pode-
se inferir que o mesmo poderia ser observado contra Hsp60 murina, uma vez que
existe uma homologia de aproximadamente 95% entre essas duas proteínas
(Revisado por QUINTANA & COHEN, 2005). Sendo assim, esta reatividade cruzada
poderia desencadear mecanismos auto-imunes, potencialmente patológicos,
também contra a Hsp60 murina. Por isso, avaliamos os níveis séricos de anticorpos
anti-Hsp60 humana e constatamos que animais vacinados com o DNA-hsp65
apresentaram aumento significativo nos níveis desses anticorpos, em relação aos
grupos controles, 15 e 45 dias após a última dose da vacina (Figura 4). No entanto,
estes níveis foram muito menores que os níveis dos dois isotipos anti-Hsp65. Com
isto, podemos levantar a hipótese de que a reação cruzada existe, mas foi
significativamente inferior à resposta contra a Hsp65 de M. leprae.
Contudo, como colocado para anticorpos anti-Hsp65, fica a dúvida se tais
anticorpos, mesmo em baixos níveis, poderiam eventualmente participar de uma
resposta auto-imune. Esta preocupação se deve ao fato de que estes anticorpos ou
mesmo a proteína Hsp60 endógena estão implicados em uma série de eventos auto-
imunes em diferentes órgãos como (I) no fígado, onde foi mostrada a existência de
imunidade humoral com reatividade cruzada entre Hsp65 micobacteriana e Hsp60
humana em pacientes com Cirrose Biliar Primária (VILAGUT et al., 1997); (II) no
intestino, em que reatividade cruzada entre HspB de H. pylori e Hsp60 humana no
epitélio gastrointestinal, pode estar envolvido no desenvolvimento de linfoma de
MALT (KAWAHARA et al., 1999); (III) na glândula supra renal, onde análise
imunocitoquímicas de amostras de pacientes com Doença de Addison, revelaram
aumento de expressão de Hsp60, comparadas com indivíduos controles (KATRIONA
et al., 1995); (IV) Yamakawa et al. (1998), sugeriram que proteínas Hsp60 podem
estar envolvidas na patogênese de inflamação intra-ocular, entre vários outros
estudos que suportam esta hipótese. No entanto, como veremos a seguir, nossos
resultados histológicos discordam destes relatos.
Então, partindo dos dados de anticorpos anti-Hsp65 e anti-Hsp60 obtidos até
então, decidimos analisar o que aconteceria com os níveis desses anticorpos sob
Discussão
83
condições de estresse provenientes de uma infecção com M. tuberculosis. Nestas
condições, tivemos o intuito de mimetizar a utilização da vacina em indivíduos
saudáveis que posteriormente entrariam em contato com o bacilo, fato que poderia
atuar como uma segunda estimulação após a “sensibilização” mediada pela vacina.
Em infecções, a habilidade das HSPs endógenas interagirem com uma ampla
variedade de arranjos peptídicos permite a elas se ligarem a peptídeos microbianos,
aumentando a imunogenicidade destes antígenos (ANDERSON et al., 2002; QIN et
al., 2003; WEITGASSER et al., 2003). Além disso, o aumento da produção e
secreção de HSPs próprias induzidas por uma infecção, associada a função
adjuvante e imunodominante das mesmas, facilita a indução de uma resposta imune
contra o patógeno invasor. Sob estas condições, as HSPs também podem participar
de um “feed back” positivo perpetuando a inflamação, ou seja, HSPs induzidas e
liberadas pela infecção podem ligar produtos microbianos e aumentar suas
atividades inflamatórias, levando a liberação de fatores pro-inflamatórios que irão
induzir a produção de mais HSPs, e assim, sucessivamente (Revisado por
Quintana, 2005). Este processo poderia conectar a infecção ao desenvolvimento de
um quadro auto-imune.
Além disso, todos os tipos de tecidos expressam altas concentrações de
HSPs endógenas em resposta a estímulos provenientes de estresse mecânico ou
químico. Agentes infecciosos podem agir contribuindo para a indução desse
estresse levando a liberação de Hsp60 solúvel (sHsp60) tanto proveniente do
patógeno quanto do hospedeiro (XU et al., 2000). Dentro disto, foi sugerido que a
etiopatogenia da Arterite de Takayasu, uma doença de origem auto-imune
(NITYANAND et al., 1997; SEKO et al., 2000); possivelmente seja induzida pela
infecção com M. tuberculosis (MORRISON et al., 1989; KOTHARI et al., 1995).
Neste contexto, CHAUHAN et al. (2004) mostraram a presença de células T reativas
à Hsp65 micobacteriana e Hsp60 humana tanto quanto a presença de anticorpos
específicos para as duas proteínas, sugerindo uma arterite auto-imune induzida pela
infecção, possivelmente pelo mimetismo molecular entre mHsp65 e hHsp60 ou
outros antígenos tecido específico. KOL et al., (1998), mostraram a existência de co-
localização entre Hsp60 clamidial e Hsp60 humana em lesões ateroscleróticas.
Com isto, o passo seguinte foi avaliarmos a produção de anticorpos anti-
Hsp65 e anti-Hsp60 em animais vacinados e posteriormente infectados, o que
revelou um perfil de produção semelhante, para os dois anticorpos (Figuras 5 e 6).
Discussão
84
No grupo de animais vacinados com DNA-hsp65 e desafiados, os níveis de
anticorpos apresentaram-se altos, entretanto, nos grupos controle (que receberam
DNAv ou PBS) os níveis desses anticorpos tiveram um súbito aumento apenas aos
70 dias após a infecção. Tal fato sugere que, possivelmente, o aumento das HSPs
oriundas do patógeno ou do próprio tecido lesionado pela infecção bacteriana, tenha
induzido um aumento nos títulos de anticorpos anti-HSPs. Assim, pode-se inferir,
que esta produção abrupta corresponda a anticorpos totais contra HSPs da
micobactéria, não sendo, porém, apenas anticorpos específicos para Hsp65, mas
sim anticorpos que reagem cruzadamente com a Hsp65 de M. leprae codificada pela
vacina.
Até aqui, descrevemos nossas análises da resposta humoral onde tentamos
detectar a presença de auto-anticorpos induzidos pela vacina. Em resumo,
observarmos nos dois protocolos analisados, que a mesma induziu a produção de
anticorpos anti-Hsp65 e um discreto, porém significativo, aumento de anti-hHsp60.
Em razão destes resultados e de indícios na literatura correlacionando tais
anticorpos em quadros inflamatórios e auto-imunes, é razoável pensar que os
mesmos poderiam implicar no desenvolvimento de alguma auto-agressão tecidual.
Sendo assim, partimos para uma ampla avaliação histopatológica no sentido de
avaliarmos se estes anticorpos poderiam, ou não, estar associados ao
desenvolvimento de alterações em diferentes órgãos.
Foram analisados 18 órgãos dentre os quais, em sua maioria, apresentam
históricos de envolvimento com doenças de fundo auto-imune, como: pâncreas
(diabetes), tireóide (tireoidite de Hashimoto), articulação (artrite), cérebro (esclerose
múltipla), pele (psoriase), coração (miocardite e aterosclerose), rim
(glomérulonefrite), olho (uveite), adrenal (doença de Addison), intestino (doença de
Crohn), fígado (hepatite), linfonodos (linfoma), assim como o músculo (miastenia),
importante também, por ser o local onde a vacina foi administrada, entre outros
órgãos. Estudos têm mostrado o envolvimento de HSPs na indução de muitas
dessas doenças. Ademais, como foi descrito na introdução, a possibilidade de
reatividade imune cruzada não se restringe apenas as HSPs, mas também a vários
outros auto-antígenos órgão específicos que apresentam similaridades com estas
proteínas (JONES et al., 1993).
Tais possibilidades justificam nosso propósito em fazer um estudo histológico
abrangente na tentativa de elucidar nossa dúvida e também da comunidade
Discussão
85
científica, sobre a hipótese de que esta vacina, que apresenta um grande potencial
para ser usada em humanos, possa desencadear efeitos colaterais indesejáveis.
Segundo a análise cega das amostras, realizada pelos patologistas Dr.
Edson G. Soares (FMRP-USP) e Dr. Luiz Benvenuti (InCor), não foi identificada
nenhuma alteração que indicasse processo auto-imune. As alterações que foram
descritas em alguns cortes (Anexo) foram provavelmente, causadas por traumas na
manipulação, infecção ambiental não correlacionada (sem significância patológica)
ou agressão química no momento do sacrifício (cuba com éter) no caso dos
pulmões. Os casos de infiltrado celular observado em alguns cortes apresentaram-
se raros, mínimos e focais, não apresentando nenhum potencial de significância
patológica. Vale ressaltar que as alterações apresentadas foram observadas
independentemente de grupo ou tempo analisado, o que ressalta a hipótese de que
tais alterações não foram induzidas pela imunização.
Para o Protocolo B, vale as mesmas observações do Protocolo A, com
exceção do alto comprometimento pulmonar em decorrência da infecção.
Sendo assim, analisando os animais que foram imunizados com a vacina,
infectados ou não, os quais mostraram altos títulos de anticorpos anti-Hsp65 e
presença de anticorpos anti-Hsp60, fica claro que estes anticorpos não estão
envolvidos em nenhum processo inflamatório que possa caracterizar uma reação
auto-imune, e principalmente, que a vacina DNA-hsp65 não e capaz de induzir o
desenvolvimento de auto-agressão tecidual.
Com isso, o fato da vacina DNA-hsp65 ter induzido anticorpos anti esta
proteína, não indica diretamente que os mesmos poderão reagir com proteínas
endógenas desencadeando mecanismos auto-imunes. Provavelmente, a ação de
células com perfil regulatório sobrepõem-se sobre a ação de clones potencialmente
auto-reativos impedindo que causem alterações. Isto possivelmente reflete os
resultados histológicos apresentados neste trabalho.
Estes resultados corroboram com dados obtidos pelo grupo em estudos com
essa vacina em modelos experimentais de auto-imunidade como Encéfalomielite
Auto-Imune, onde foi observado que esta vacina não induziu o agravamento da
doença induzida com injeção de Proteína Básica Mielínica (PBM) em Adjuvante
Completo de Freund (ACF) (trabalho em desenvolvimento). Modelos experimentais
de Artrite induzida por pristane em camundongos geneticamente pré-dispostos a
mínima e máxima Reação Inflamatória Aguda (AIR-min e AIR-max,
Discussão
86
respectivamente), demonstraram que animais que receberam a vacina DNA-hsp65
apresentaram significativamente menores níveis de IL-6 e IL-12 e maiores de IL-10
resultando em uma ação protetora contra a doença (SANTOS et al., 2005). Em
outro estudo, foi demonstrado que a vacina não teve nenhum efeito diabetogênico,
mas pelo contrário, protegeu camundongos NOD contra o desenvolvimento de
diabete severa. Neste estudo, efeito protetor da vacina foi acompanhado por
imunomodulação órgão específico, caracterizado pela diminuição do influxo de
células CD4+ e CD8+, assim como aumento da marcação para as citocinas TGF-� e
IL-10 nas ilhotas pancreáticas (SANTOS JUNIOR, artigo submetido). Além disso, a
vacina de DNA-hsp65 também conferiu proteção em modelo experimental de diabete
induzida por STZ. Neste estudo foi observada a ativação de células reguladoras,
caracterizadas pelos marcadores CD25hiCD103+ e CD25hiCTLA-4+, além do
aumento significativo nos níveis de IL-10 produzidos por células do baço de animais
vacinados (SANTOS JUNIOR, em redação). Ademais, em ensaios clínicos de fase I
com esta vacina, não foi detectado nenhum efeito tóxico da mesma, em 21 pacientes
terminais com câncer epidermóide de cabeça e pescoço (MICHALUART et al., artigo
em redação).
Alguns relatos podem ajudar a entender um pouco mais estas idéias. Foi
mostrado que Hsp65 micobacteriana expressa epítopos com diferentes funções
imunes. A reação cruzada de seu epítopo 180-188 com auto-antígenos da
cartilagem pode induzir resposta artritogênica. Por outro lado, a reação cruzada com
Hsp60 endógena pode induzir a regulação da doença. (Revisado por QUINTANA &
COHEN, 2005). Talvez uma explicação para isto, seria que HSPs microbianas,
provenientes da flora intestinal, poderiam servir como uma fonte de células T
regulatórias HSP-específicas. De fato, MOUDGIL et al., (2001) demonstraram que
micróbios ambientais podem induzir células T regulatórias Hsp65-específicas que
reagem cruzado com epítopos regulatórios da Hsp60 endógena, o que seria este,
um modelo de regulação naturalmente adquirido.
Ensaio clínico com peptídeo p277 de Hsp60 tem sido testado em pacientes
com diabetes tipo I e os resultados tem indicado que células T peptídeo específicas
trocaram sua produção de citocinas pró-iflamatórias para produção de citocinas
antinflamatórias tais como IL-4 e IL-10 (RAZ et al., 2001).
Este envolvimento das HSPs em mecanismos imunorregulatórios vem sendo
amplamente estudados e talvez possam esclarecer melhor estes relatos em um
Discussão
87
futuro próximo. De fato, os objetivos de recentes projetos em nosso laboratório, são
de tentar elucidar os mecanismos pelos quais a Hsp65 de M. leprae apresenta para
provocar efeitos de ativação e regulação da resposta imune, bem como efeitos
protetores e profiláticos na tuberculose.
Portanto, os resultados obtidos neste trabalho refletem uma análise
abrangente de uma possível indução de auto-agressão tecidual decorrente da
vacinação com DNA-hsp65. Esta abordagem foi realizada sob uma cuidadosa
análise histopatológica realizada por longos períodos de tempo, onde não foi
constatada nenhuma alteração induzida pela vacina. No entanto, futuramente,
nossos dados poderão ser complementados com avaliações da resposta imune
celular como, por exemplo, detecção de células T específicas a Hsp65, produção de
citocinas, atuação de células T regulatórias envolvidas neste processo de vacinação,
entre outras. No entanto, os resultados deste estudo contribuem de forma
significativa ao esclarecimento sobre a biossegurança da utilização da vacina DNA-
hsp65, abrindo perspectivas para seu uso clínico na profilaxia e tratamento de
pacientes com tuberculose e outras enfermidades.
88
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Conclusões
89
7 – CONCLUSÕES
Os resultados apresentados neste trabalho mostraram que:
1) A vacina DNA-hsp65 não foi capaz de induzir a produção de anticorpos anti-
DNA;
2) Camundongos apenas vacinados ou vacinados e infectados apresentaram um
discreto, porém significativo aumento de anticorpos IgG total anti-Hsp60;
3) Camundongos apenas vacinados ou vacinados e infectados apresentaram
altos níveis de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65;
4) Não foi observada nenhuma alteração tecidual sugestiva de quadro auto-
imune induzida pela vacina.
90
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Referências Bibliográficas
91
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104
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Anexo
105
9 – ANEXO
� Leituras histológicas:
Descrição das leituras histológicas realizadas pelos patologistas Dr. Édson
Soares (FMRP) e Dr. Luiz Benvenuti (InCor). As lâminas que apresentaram leituras
diferentes foram reavaliadas, no sentido de se definir um consenso entre as duas
análises.
As nomenclaturas a seguir referem-se aos seguintes itens:
A ou B - protocolo analisado;
PBS, VET ou VAC - grupo experimental;
T1, T2 ou T3 - tempo de sacrifício;
1 a 9 - número do animal avaliado (em um n total de 9 animais).
NA - animais em que as amostras de órgãos não apresentaram alterações
Sendo assim, B-VAC-T2-7 refere-se ao sétimo animal analisado, que foi
submetido ao protocolo B (vacinado e infectado), recebeu DNA-hsp65 (pVAX-hsp65)
nas imunizações e foi sacrificado no tempo 2 (70 dias após a infecção).
Anexo
106
Leituras Histológicas Protocolo A FMRP InCor
Tempo 1 A-PBS-T1-1: *Pulmão: Focos casuais de infiltrado linfocítico peribronquial.
A-PBS-T1-1: NA.
A-PBS-T1-2: NA. A-PBS-T1-2: NA. A-PBS-T1-3: *Pulmão: Discreta congestão -Pequenos focos de infiltrado linfocitário
-Alguns macrófagos situados no parênquima pulmonar e em regiões peribronquiais. *Intestinos degradados em decorrência de uma má fixação.
A-PBS-T1-3: NA.
A-PBS-T1-4: NA. A-PBS-T1-4: NA. A-PBS-T1-5: NA. A-PBS-T1-5: NA. A-PBS-T1-6: *Pulmão: -Raríssimos linfócitos peribronquiais - Discreta congestão com focos hemorrágicos *Intestinos delgado e grosso: sofreram autólise (provavelmente por terem boiado e não fixado).
A-PBS-T1-6: NA.
A-PBS-T1-7: *Fígado: Presença de um foco de infiltrado inflamatório mononuclear.
A-PBS-T1-7: *Fígado: Mínimo e focal infiltrado inflamatório mononuclear.
A-PBS-T1-8: NA. A-PBS-T1-8: NA. A-PBS-T1-9: NA. A-PBS-T1-9: NA.
Tempo 2 A-PBS-T2-1: NA. A-PBS-T2-1: NA. A-PBS-T2-2: *Articulação: Mínimo foco de sinovite. A-PBS-T2-2: *Articulação: Sinovite crônica focal. A-PBS-T2-3: *Pulmão: - Focos de infiltrado linfocítico com alguns macrófagos. - Formou-se um granuloma tipo “corpo estranho” em algo que o camundongo aspirou (parecendo fibra vegetal).
A-PBS-T2-3: *Pulmão: Reação gigantecelular a corpo estranho focal.
PBS
A-PBS-T2-4: *Pulmão: - Discretos focos de infiltrado linfocítico (mínimos focos no parênquima) -Esparsos focos hemorrágicos.
A-PBS-T2-4: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar.
Anexo
107
A-PBS-T2-5: *Pulmão: Congestão e focos hemorrágicos discretos e difusos. *Fígado: Um foco hemorrágico (provavelmente traumático).
A-PBS-T2-5: NA.
A-PBS-T2-6: *Pulmão: Apresentou apenas uma discreta congestão. *Intestinos delg. e grosso: sofreram autólise (provavelmente por terem boiado e não fixado)
A-PBS-T2-6: NA.
A-PBS-T2-7: *Pulmão: - Raros focos inflamatórios linfocitários perivasculares (infecção inespecífica, porem lesão não importante).
A-PBS-T2-7: NA.
A-PBS-T2-8: NA. A-PBS-T2-8: NA. A-PBS-T2-9: *Pulmão: Raros focos linfocíticos perivasculares. A-PBS-T2-9: *Pulmão: Focos de hemorragia recente alveolar.
Tempo 3 A-PBS-T3-1: *Pulmão: - Discretos focos de hemorragia e congestão A-PBS-T3-1: NA. A-PBS-T3-2: *Pulmão: - Importante congestão e hemorragia - Poucos focos linfocitários
A-PBS-T3-2: NA.
A-PBS-T3-3: *Músculo: Discreto foco de infiltrado linfóide. A-PBS-T3-3: *Músculo: Discreto infiltrado perivascular focal A-PBS-T3-4: *Fígado com pouca congestão. A-PBS-T3-4: NA. A-PBS-T3-5: *Pulmão: - Congestão e hemorragia. Infiltrados perivasculares com macrófagos e predomínio de linfócitos (discretos e raros). Presença de um gigantócito em um dos focos inflamatórios. Presença de alguns bacilos (infecção discreta), que apresentaram negatividade para pesquisa de BAAR (provavelmente infecção ambiental não correlacionada). *Fígado: Congestão e um foco hemorrágico (mínimo).
A-PBS-T3-5: *Pulmão: Presença de focos hemorrágicos alveoloares.
A-PBS-T3-6: NA. A-PBS-T3-6: NA. A-PBS-T3-7: *Pulmão: Focos linfoplasmocitário. Infiltrados plasmocitários focais (provavelmente infecção não relacionada)
A-PBS-T3-7: NA.
A-PBS-T3-8: *Pulmão: Focos linfocitários. A-PBS-T3-8: NA.
PBS
A-PBS-T3-9: *Pulmão: Mínimos focos linfocitários. A-PBS-T3-9: NA. Tempo 1
A-VET-T1-1: NA. A-VET-T1-1: NA. A-VET-T1-2: NA. A-VET-T1-2:*Intestino delgado: Hiperplasia linfóide reacional.
Vetor A-VET-T1-3: NA. A-VET-T1-3: NA.
Anexo
108
A-VET-T1-4: *Pulmão: Infiltrado linfocítico com alguns plasmócitos e raros neutrófilos na região perivascular e peribronquiolar alargando-se entre os septos interalveoláres.
A-VET-T1-4: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar.
A-VET-T1-5: *Pulmão: Discretos alargamentos septais acompanhados de congestão e infiltrado mononuclear com poucos neutrófilos.
A-VET-T1-5: NA.
A-VET-T1-6: *Pulmão: -Mínimo infiltrado perivascular e peribronquial - Raros focos hemorrágicos e congestão.
A-VET-T1-6: NA.
A-VET-T1-7: Músculo esquelético: Calcificação focal mínima. A-VET-T1-7: *Músculo esquelético: Focos de calcificação. A-VET-T1-8: *Pulmão: Congestão difusa, - Focos de hemorragia, - Focos de infiltrado inflamatório crônico, predominantemente linfocitário perivascular.
A-VET-T1-8: NA.
Tempo 2 A-VET-T2-1: *Pulmão: - Congestão discreta -Focos inflamatórios peribronquiais e perivasculares discretos com presença de linfócitos e macrófagos.
A-VET-T2-1: NA.
A-VET-T2-2: NA. A-VET-T2-2: NA. A-VET-T2-3: Pulmão: Mínimo infiltrado mononuclear perivascular.
A-VET-T2-3: *Pâncreas: Infiltrado focal sem sinal de agressão. *Fígado: +/- 3 focos com células mononucleares (não parece inflamação). * Pulmão: Infiltrado peribronquiolar, focos discretos, - esboço granulomatoso (não patológico). *Cérebro: Áreas de concentração neoronal (provavelmente devido a esquemia).
A-VET-T2-4: *Pulmão: -Focos de hemorragia e congestão. -Discretos focos de infiltrado linfóide.
A-VET-T2-4: NA.
A-VET-T2-5: *Pulmão: -Congestão com alguns focos hemorrágicos. - Discretos focos linfocitários.
A-VET-T2-5: NA.
A-VET-T2-6: *Pulmão: Apenas congesto. A-VET-T2-6: NA.
Vetor
A-VET-T2-7: NA. A-VET-T2-7: NA.
Anexo
109
A-VET-T2-8: *Coração: Focos de calcificação pericárdica. A-VET-T2-8: *Coração: Focos de calcificação do epicárdio (relacionado ao ventrículo direito).
A-VET-T2-9: *Pulmão: Raros focos linfocíticos peribrônquiais. A-VET-T2-9: *Pulmão: Discreta hiperplasia do tecido linfóide peribrônquico.
Tempo 3 A-VET-T3-1: *Pulmão: Raros e grandes focos hemorrágicos A-VET-T3-1: NA. A-VET-T3-2: *Pulmão: Pequenos focos hemorágicos e congestão - Discretos focos de infiltrado linfóide nas regiões perenquimatosa, perivascular e peribronquiolar.
A-VET-T3-2: * Pulmão: Discretos focos de infiltrado peribronquiolar.
A-VET-T3-3: *Pulmão: Hemorragia focal e mínimos focos de infiltrado linfóide.
A-VET-T3-3: NA.
A-VET-T3-4: NA. A-VET-T3-4: NA. A-VET-T3-5: *Pulmão: Foco hemorrágico (traumático). A-VET-T3-5: NA. A-VET-T3-6: NA. A-VET-T3-6: NA. A-VET-T3-7: NA. A-VET-T3-7: NA. A-VET-T3-8: NA. A-VET-T3-8: NA.
A-VET-T3-9: *Pulmão: Foco hemorrágico (provavelmente devido à manipulação) e um foco linfocitário.
A-VET-T3-9: *Pulmão: Discreto foco de hemorragia alveolar.
Tempo 1 A-VAC-T1-1: NA. A-VAC-T1-1: NA.
A-VAC-T1-2: *Pulmão: Discreto infiltrado linfocítico peribronquial acompanhado de poucos macrófagos e raros neutrófilos. *Intestinos delgado e grosso: sofreram autólise (provavelmente por terem boiado e não fixado).
A-VAC-T1-2: NA.
A-VAC-T1-3: *Pulmão: Grande área hemorrágica com congestão. A-VAC-T1-3: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar. A-VAC-T1-4: *Pulmão: Congestão discreta e poucos linfócitos peribronquiais e perivasculares.
A-VAC-T1-4: NA.
Vacina
A-VAC-T1-5: *Pulmão: Discreto infiltrado linfocítico peribronquial e perivascular Apenas um foco hemorrágico.
A-VAC-T1-5: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar.
Vetor
Anexo
110
A-VAC-T1-6: *Pulmão: Infiltrado linfocítico perivascular e peribronquial (predominantemente) com alguns macrófagos. - Hemorragia e congestão. *Intestino delgado: sofreu autólise (provavelmente por terem boiado e não fixado)
A-VAC-T1-6: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar.
A-VAC-T1-7: NA. A-VAC-T1-7: NA.
A-VAC-T1-8: *Pulmão: Vários focos de infiltrado linfocítico perivascular.
A-VAC-T1-8: NA.
A-VAC-T1-9: NA. A-VAC-T1-9: NA.
Tempo 2 A-VAC-T2-1: *Pulmão: Infiltrado mononuclear discreto - Congestão pulmonar discreta - Presença de linfócitos na região peribronquial e perivascular.
A-VAC-T2-1: NA.
A-VAC-T2-2: NA. A-VAC-T2-2: NA. A-VAC-T2-3: *Pulmão: Discretos focos peribronquiais (principalmente) de infiltrado constituído principalmente de linfócitos com alguns macrófagos - Congestão. *Fígado: Dois focos (mínimos) de infiltrado linfocítico no parênquima hepático. *Rim: Um foco de infiltrado linfocítico na transição córtico-medular.
A-VAC-T2-3: NA.
A-VAC-T2-4: *Pulmão: Congestão -Mínimos focos de infiltrado linfocítico peribronquiais.
A-VAC-T2-4: NA.
A-VAC-T2-5: *Pulmão: Congestão importante com focos de hemorragia vascular. -Discreto infiltrado linfocítico peribronquial.
A-VAC-T2-5: *Cérebro: Células. piquinóticas com arcos de contração
A-VAC-T2-6: NA. A-VAC-T2-6: NA. A-VAC-T2-7: *Pulmão: Focos linfocíticos perivasculares (raros). A-VAC-T2-7: NA. A-VAC-T2-8: *Pulmão: Pouco congesto
A-VAC-T2-8: NA.
Vacina
A-VAC-T2-9: NA.
A-VAC-T2-9: NA.
Anexo
111
Tempo 3 A-VAC-T3-1: * Pulmão: Reação linfocitária e macrofágica mínima. - Congestão e focos hemorrágicos.
A-VAC-T3-1: NA.
A-VAC-T3-2: *Pulmão: Infiltrado mononuclear e linfocítico discreto. - Presença de congestão, com focos hemorrágicos.
A-VAC-T3-2: NA.
A-VAC-T3-3: NA. A-VAC-T3-3: NA. A-VAC-T3-4: NA. A-VAC-T3-4: NA. A-VAC-T3-5: NA. A-VAC-T3-5: NA. A-VAC-T3-6: *Pulmão: Pequenos focos hemorrágicos e 2 focos de infiltrado linfocítico.
A-VAC-T3-6: NA.
A-VAC-T3-7: *Pulmão: Focos linfóides isolados. A-VAC-T3-7: NA. A-VAC-T3-8: NA. A-VAC-T3-8: NA.
A-VAC-T3-9: *Músculo esquelético: Foco linfocitário com presença de neutrófilos e linfócitos (provável local da injeção).
A-VAC-T3-9: *Músculo esquelético: Miosite focal.
Protocolo B Tempo 1 B-PBS-T1-1: *Fígado: Infiltrado linfocitário mínimo (apenas um foco).
B-PBS-T1-1: NA.
B-PBS-T1-2: NA. B-PBS-T1-2: NA. B-PBS-T1-3: NA. B-PBS-T1-3: NA. B-PBS-T1-4: NA. B-PBS-T1-4: NA. B-PBS-T1-5: NA. B-PBS-T1-5: *Rim: Microcalcificação focal no córtex. B-PBS-T1-6: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância).
B-PBS-T1-6: *Fígado: Raros focos de infiltrado inflamatório misto.
B-PBS-T1-7: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).
B-PBS-T1-7: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
B-PBS-T1-8: NA.
B-PBS-T1-8: NA.
PBS
B-PBS-T1-9: NA.
B-PBS-T1-9: NA.
Vacina
Anexo
112
Tempo 2 B-PBS-T2-1: *Fígado: Processo inflamatório linfocitário perivascular discreto (raros focos). * Intestino delg. com restos alimentares
B-PBS-T2-1: NA.
B-PBS-T2-2: *Fígado: Raríssimos focos de infiltrado linfocítico perivascular .
B-PBS-T2-2: NA.
B-PBS-T2-3: *Fígado: Congestão, raros e discretos focos de infiltrado linfocítico perenquiatoso com alguns perivasculares.
B-PBS-T2-3: NA.
B-PBS-T2-4: *Fígado: Mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).
B-PBS-T2-4: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
B-PBS-T2-5: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).
B-PBS-T2-5: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
B-PBS-T2-6: NA. B-PBS-T2-6: NA. B-PBS-T2-7: NA. B-PBS-T2-7: NA. B-PBS-T2-8: NA. B-PBS-T2-8: NA.
B-PBS-T2-9: NA. B-PBS-T2-9: NA.
Tempo 1 B-VET-T1-1: NA. B-VET-T1-1: NA. B-VET-T1-2: NA. B-VET-T1-2: NA. B-VET-T1-3: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).
B-VET-T1-3: *Fígado: Raros e pequenos focos de infiltrado inflamatório misto. *Coração: Microcalcificações focais no epicárdio.
B-VET-T1-4: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica). *Músculo esquelético: Infiltrado inflamatório linfocítico e macrofágico.
B-VET-T1-4: *Fígado: Focos de infiltrado inflamatório misto com esboço granulomatoso focal. *Músculo esquelético: Processo inflamatório misto com necrose de fibras (miosite).
B-VET-T1-5: NA. B-VET-T1-5: NA. B-VET-T1-6: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).
B-VET-T1-6: *Fígado: Focos de necrose e acumulo de células inflamatórias. *Músculo esquelético: Pequeno foco de processo inflamatório (miosite).
Vetor
B-VET-T1-7: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).
B-VET-T1-7: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
PBS
Anexo
113
B-VET-T1-8: NA. B-VET-T1-8: NA. B-VET-T1-9: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).
B-VET-T1-9: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
Tempo 2 B-VET-T2-1: NA. B-VET-T2-1: NA. B-VET-T2-2: *Fígado: Infiltrado e focos perivasculares e periquimatosos discretos.
B-VET-T2-2: *Fígado: Raros e pequenos focos de infiltrado inflamatório misto.
B-VET-T2-3: NA. B-VET-T2-3: NA. B-VET-T2-4: * Fígado: Mínimos focos linfóides perivasculares (sem significância patológica).
B-VET-T2-4: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
B-VET-T2-5: *Fígado: Raros agrupamentos linfocitários (sem significância patológica).
B-VET-T2-5: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
B-VET-T2-6: NA. B-VET-T2-6: NA. B-VET-T2-7: *Fígado: Raros focos linfocíticos (sem significância patológica).
B-VET-T2-7: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
B-VET-T2-8: NA. B-VET-T2-8: NA.
Vetor
B-VET-T2-9: NA. B-VET-T2-9: NA. Tempo 1
B-VAC-T1-1: NA. B-VAC-T1-1: NA. B-VAC-T1-2: NA B-VAC-T1-2: NA. B-VAC-T1-3: NA. B-VAC-T1-3: NA. B-VAC-T1-4: NA. B-VAC-T1-4: NA. B-VAC-T1-5: NA. B-VAC-T1-5: *Músculo esquelético: Pequenos focos de processo
inflamatório crônico (miosite). *Articulação: Pequeno processo inflamatório focal no sítio periarticular.
B-VAC-T1-6: *Músculo esquelético: Mínimos focos inflamatórios.
B-VAC-T1-6: *Músculo esquelético: Focos de processo inflamatório misto (miosite).
B-VAC-T1-7: *Fígado: Focos de infiltrado linfocítico nos espaços porta e parênquima. (foi feito o Zihel Nielsen da lâmina que deu negativo para pesquisa de BAAR).
B-VAC-T1-7: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
Vacina
B-VAC-T1-8: NA. B-VAC-T1-8: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
Anexo
114
B-VAC-T1-9: NA. B-VAC-T1-9: NA. Tempo 2
B-VAC-T2-1: NA. B-VAC-T2-1: NA. B-VAC-T2-2: *Fígado: Mínimos infiltrados. *Baço: Esplenite aguda focal leve.
B-VAC-T2-2: *Fígado: Raros e pequenos focos de infiltrado inflamatório misto. *Baço: Esplenite aguda focal.
B-VAC-T2-3: *Articulação: Medula óssea com infiltrado neutrofílico mínimo (sem significância patológica).
B-VAC-T2-3: * Fígado: Focos de infiltrado inflamatório mononuclear com esboço granulomatoso.
B-VAC-T2-4: *Fígado: Raros focos linfocitários portais sem significância.
B-VAC-T2-4: NA.
B-VAC-T2-5: NA. B-VAC-T2-5: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório. B-VAC-T2-6: *Músculo esquelético: Foco neutrofílico e linfocitário entre as fibras musculares (provável local da punção).
B-VAC-T2-6: *Músculo esquelético: Pequeno foco de processo inflamatório misto (miosite).
B-VAC-T2-7: NA. B-VAC-T2-7: NA. B-VAC-T2-8: NA. B-VAC-T2-8: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.
B-VAC-T2-9: NA. B-VAC-T2-9: NA.
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