avaliação da presença de micro-organismos e...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
ELOÁ CRISTINA BÍCEGO PEREIRA
Avaliação da presença de micro-organismos e suscetibilidade
antimicrobiana de Enterococcus faecalis isolados de canais radiculares de
dentes submetidos ao retratamento endodôntico por indicação protética
Piracicaba
2017
ELOÁ CRISTINA BÍCEGO PEREIRA
Avaliação da presença de micro-organismos e suscetibilidade
antimicrobiana de Enterococcus faecalis isolados de canais radiculares de
dentes submetidos ao retratamento endodôntico por indicação protética
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Piracicaba da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra em
Clínica Odontológica, na Área de Endodontia.
Orientadora: Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ELOÁ CRISTINA BÍCEGO PEREIRA ORIENTADA PELA PROFA. DRA. BRENDA PAULA FIGUEIREDO DE ALMEIDA GOMES
Piracicaba
2017
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Dissertação de Mestrado, em
sessão pública realizada em 21 de Fevereiro de 2017, considerou a candidata ELOÁ
CRISTINA BÍCEGO PEREIRA aprovada.
PROFa. DRa. BRENDA PAULA FIGUEIREDO DE ALMEIDA GOMES
PROF. DR. CARLOS AUGUSTO DE MORAIS SOUTO PANTOJA
PROF. DR. ALEXANDRE AUGUSTO ZAIA
A Ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo
de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho especialmente a Deus, que possibilitou todos estes
acontecimentos em minha vida.
AOS MEUS PONTOS DE APOIO
Aos meus pais Luis Estevão Pereira e Ersone Antônia Bícego Pereira. Por todo o
amor e apoio em todos os momentos e estiveram presentes em todas as minhas
conquistas, sempre me incentivando. Sem eles nada na minha vida seria possível.
Obrigada por todo amor e carinho.
Aos meus irmãos Estéfani Maiolini Bícego Pereira e Luis Maiolini Bícego Pereira. O
apoio e momentos de descontração são essenciais para nossa jornada. Obrigada pelo
companheirismo e compreensão em todos os momentos.
Aos meus avós Gerson Bícego, Edna Luciano Bícego e Silvia Maiolini Pereira. Que
me deram tanto amor e exemplo de fé e perseverança na vida. Obrigada por estarem
tão presentes em minha vida.
Agradeço a toda minha família, por todo o suporte, amor, carinho. Amo muito vocês.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À minha orientadora Profª Drª Brenda Paula Figueiredo De
Almeida Gomes. Agradeço por ter me escolhido como orientada, por ter
me ensinado tanto e por estar sempre me proporcionando tantas
oportunidades de crescimento. A senhora é uma pessoa iluminada, sempre
em busca de atualização, nos servindo de exemplo na vida científica e
pessoal. Temos muito que aprender com a senhora. Obrigada pela
dedicação do seu tempo e por ter me oferecido suporte nos momentos que
precisava. Sou muito grata e orgulhosa por tê-la como orientadora.
AGRADECIMENTOS
À Direção da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de
Campinas, na pessoa do seu diretor Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques.
A CAPES pela concessão da bolsa de Mestrado.
À Profa. Dra. Cinthia Pereira Machado Tabchoury coordenadora do Programa de
Pós-Graduação da FOP/UNICAMP e a Profa Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz,
coordenadora do curso de Pós-Graduação em Clínica Odontológica.
Aos professores da área de Endodontia, profa. Dra. Adriana de Jesus Soares, prof.
Dr. Alexandre Augusto Zaia, profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida
Gomes, prof. Dr. Caio Cezar Randi Ferraz e prof. Dr. José Flávio Affonso de
Almeida, por serem importantes para a minha formação durante a minha trajetória
acadêmica.
Aos funcionários Ana Godoy e Maicon Ricardo Zieberg Passini por estarem sempre
presentes e me ajudarem, assim como a Tiffany Abreu.
À Ana Paula Carone, Claudinéia Prata Pradela, Érica A. Pinho Sinhoreti, Lucas de
Almeida Cruz e Raquel Q. Marcondes Cesar, profissionais da secretaria da Pós-
Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de
Campinas.
A todos os funcionários da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade
Estadual de Campinas.
Aos colegas de mestrado da Endodontia, Augusto Rodrigues Lima, Bruna Alves T.
Ueno, Bruna Milaré Angelieri, Diogo Henrique da Silva, Flávia M. Saavedra e
Paula, Humberto Ramah Menezes de Matos, Jaqueline Mafra Lazzari Priscila
Amanda Francisco e Rafaela Casadei Chapola.
Aos colegas de doutorado da Endodontia Aline Cristine Gomes, Ana Carolina C. L.
de Cerqueira Neto, Aniele Carvalho Lacerda, Andréa Cardoso Pereira, Érika
Manuela Asteria Clavijo, Felipe Nogueira Anacleto, Maria Cristina Coelho de
Carvalho e Marlos Ribeiro Barbosa.
As minhas amigas Eloisa de Souza, Marina dos Santos Faria, Amanda Farias
Gomes, Caroline Nieto, Fernanda Maria Mazoni dos Reis, Daniela Cibim, Bruna
Massoni, Cassia Cestari Toia, Jafra Furtado, Suelem Chasse, por terem feito de
toda esta jornada mais feliz, com muitos momentos de descontração e companheirismo.
Aos alunos de Iniciação Cientifica Pedro Luis Gusmão, Rafaela Rocha Van
Linschoten, Flávia Salviano Alves e a Jéssica Rodrigues, por trabalharem comigo e
serem meus amigos. Sinto que crescemos juntos a cada dia.
Ao Marlos Barbosa Ribeiro pela sua amizade, ajuda e conselhos. Obrigada por me
ajudar a lapidar o meu trabalho.
Ao meu amigo Rodrigo Arruda Vasconcelos, obrigada pela sua amizade e por toda a
sua ajuda.
A todos os pacientes que confiaram em meu trabalho e colaboraram com minha
pesquisa, sem eles nada seria possível.
Aos professores que participaram da minha banca de qualificação, Dr. José Flávio
Affonso de Almeida, Dra. Fernanda Graziela Côrrea Signoretti, Dra. Janaina
Orlandi Sardi, por contribuirem nas correções da minha dissertação de mestrado.
A todos de que de alguma forma participaram desta minha caminhada, meu muito
obrigada.
Resumo
Os micro-organismos e seus subprodutos são responsáveis pelo desencadeamento das
infecções secundárias e/ou persistentes dos canais radiculares(CR). A diversidade
microbiana destes canais é menor, quando comparada à da infecção primária, com
prevalência da espécie bacteriana Enterococcus faecalis. Objetivos: Avaliar a presença
de micro-organismos e a suscetibilidade antimicrobiana de E. faecalis isolados de
dentes submetidos ao retratamento endodôntico por motivo protético. Foi feito o
monitoramento microbiológico antes e após o preparo químico-mecânico (PQM) e após
o uso de uma medicação intracanal. Metodologia: Vinte dentes indicados para
retratamento endodôntico por motivo protético com ausência de lesão periapical foram
incluídos nesta pesquisa. Amostras microbianas coletadas dos CR foram plaqueadas
em FAA (Fastidious Anaerobe Agar) e em meio seletivo m-Enterococcus. Detecçao de
E. faecalis foi realizada por PCR com primer espécie-específico e sequenciamento
parcial do gene 16S rRNA. As cepas isoladas de E. faecalis, foram testadas quanto sua
suscetibilidade antimicrobiana, através do método de difusão em disco. Resultados:
Micro-organismos foram encontrados em todos os CR, havendo uma redução nos seus
níveis após o PQM e uso da medicacao intracanal. Sete CR apresentaram crescimento
microbiano no meio seletivo. Dos 43 micro-organismos que cresceram no m-
Enterococcus, 41 cepas foram identificadas como E. faecalis por PCR com primer
espécie-específico e sequenciamento. Destes isolados, foi observada suscetibilidade
das cepas à amoxicilina (41/41), amoxicilina com ácido clavulânico (38/41), ampicilina
(38/41), doxiciclina (33/41) fosfomicina (33/41) e tetraciclina (30/41). Entre as cepas,
houve resistência à clindamicina (38/41), gentamicina (35/41), rifampicina (20/41) e
vancomicina (17/41). Conclusão: Micro-organismos foram encontrados nos CR de
dentes indicados ao retratamento por motivo protético e sem lesão periapical. O meio
seletivo m-Enterococcus mostrou alta especificidade com resultados similares ao
método molecular. As cepas isoladas de E. faecalis apresentaram variados graus de
resistência aos agentes antimicrobianos, sendo mais suscetíveis à amoxicilina,
amoxicilina + ácido clavulânico e ampicilina.
Palavras-Chave: Micro-organismo, Endodontia, Enterococcus faecalis.
Abstract
Microorganisms and their by-products are responsible for the triggering of secondary
and / or persistent root canal (RC) infections. The microbial diversity of these root canals
is lower when compared to the primary infection, with a prevalence of the bacterial
species Enterococcus faecalis. Objectives: To evaluate the presence of microorganisms
and antimicrobial susceptibility of E. faecalis isolated from teeth submitted to endodontic
retreatment due to prosthetic reasons. Microbiological monitoring was done before and
after the chemical-mechanical preparation (PQM) and after the use of an intracanal
medication. Methodology: Twenty teeth indicated for endodontic retreatment due to
prosthetic reasons with absence of periapical lesion were included in this study.
Microbial samples collected from RC were plated in FAA (Fastidious Anaerobe Agar)
and in m-Enterococcus selective medium. Detection of E. faecalis was performed by
PCR with primer-specific and partial sequencing of the 16S rRNA gene. The strains
isolated from E. faecalis were tested for their antimicrobial susceptibility by the disc
diffusion method. Results: Microorganisms were found in all RCs, with a reduction in
their levels after PQM and intracanal medication use. Seven RC showed microbial
growth in the selective medium. Out of the 43 microorganisms grown on m-
Enterococcus, 41 strains were identified as E. faecalis by PCR with specific primer and
sequencing. Susceptibility against amoxicillin (41/41), amoxicillin with clavulanic acid
(38/41), ampicillin (38/41), doxycycline (33/41) fosfomycin (33/41) and tetracycline
(30/41) was observed in the tested strains. Among the strains, there was resistance
against clindamycin (38/41), gentamicin (35/41), rifampicin (20/41) and vancomycin
(17/41). Conclusion: Microorganisms were found in all the cases indicated to the
endodontic retreatment due to prosthetic reasons. The selective medium m-
Enterococcus showed high specificity with similar results to the molecular methods. E.
faecalis strains presented varying degrees of resistance to antimicrobial agents, being
more susceptible to amoxicillin, amoxicillin + clavulanic acid and ampicillin.
Keywords: Microorganism, Endodontics, Enterococcus faecalis.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Radiografia periapical do dente 31. 23
Figura 2 – Descontaminação do campo operatório, abertura
coronária e coleta dos canais radiculares. 25
Figura 3 – Sistemas de irrigação e agitação dos irrigantes utilizados. 28
Figura 4 – Câmara de anaerobiose e processamento microbiológico. 31
Figura 5 – Etapas de Identificação fenotípica. 33
Figura 6 – Etapas para a realização do antibiograma com discos de
antibióticos. 39
Figura 7 – Formação dos halos de inibição ao redor do disco
contendo antibióticos selecionados em placas semeadas com E.
faecalis.
40
Figura 8 – Nível de micro-organismos nas diversas fases do
retratamento endodôntico. 46
Figura 9 – Identificação da espécie E. faecalis por cultura, PCR e
sequenciamento. 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Divisão dos grupos de acordo com a substância química
auxiliar e medicação intracanal utilizada. 27
Tabela 2 – Método de coleta e armazenamento das amostras
microbiológicas. 30
Tabela 3 – Concentrações dos antibióticos utilizados. 38
Tabela 4 – Valores interpretativos do tamanho dos halos de inibição
(diâmetro) dos antibióticos nos testes de Enterococcus spp. (CLSI-
2012).
41
Tabela 5 – Caracterização da amostra pelo tempo do tratamento
endodôntico inicial. 43
Tabela 6 – Prevalência dos grupos dentais incluídos na pesquisa. 43
Tabela 7 – Qualidade da obturação e selamento coronário dos
dentes submetidos ao retratamento endodôntico. 44
Tabela 8 – Avaliação da carga bacteriana na guta-percha pelos
terços radiculares. 45
Tabela 9 – Avaliação fases do retratamento endodôntico na redução
dos níveis bacterianos globais e por substâncias químicas auxiliares
(UFC/mL). Média±desvio padrão.
45
Tabela 10 – Frequência de crescimento bacteriano a partir da
cultura, detectadas em meio m-Enterococcus, em diferentes
sítios/etapas de crescimento.
47
Tabela 11 – Número de cepas de Enterococcus faecalis classificadas
de acordo com o halo de inibição, classificado em suscetível,
intermediário e resistente.
49
LISTA DE ABREVIATURAS
CR – Canal(is) radicular(es)
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético
FAA – Fastidious Anaerobe Agar
NaOCl – Hipoclorito de sódio
NMF – Núcleo Metálico fundido
MIC – Medicação intracanal
PQM – Preparo químico-mecânico
SQA – Substância(s) química(s) auxiliar(es)
UFC – Unidade Formadora de Colônia
SUMÁRIO Páginas
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO DA LITERATURA 4
3 PROPOSIÇÃO 17
4 MATERIAL E MÉTODOS 18
5 RESULTADOS 39
6 DISCUSSÃO 46
7 CONCLUSÃO 50
REFERÊNCIAS 51
ANEXOS 73
Anexo 1 – Aspectos clínicos e radiográficos dos dentes submetidos ao retratamento endodôntico por indicação protética
73
Anexo 2 – Contagem das UFC/mL em Meio de cultura FAA 74
Anexo 3 - Presença de Enterococcus através do crescimento em meio M-Enterococcus
75
Anexo 4 - Ficha clínica utilizada na pesquisa 76
Anexo 5 - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa FOP- Unicamp 80
1
1 INTRODUÇÃO
O tratamento endodôntico tem como objetivo a desinfecção do canal radicular
(CR) e o selamento coronário e apical herméticos (Rôças et al, 2016). O principal fator
etiológico das infecções endodônticas está relacionado à presença de micro-
organismos e seus subprodutos (Kakehashi et al, 1965; Gomes et al, 1994, 1996;
Rahimi et al, 2014; Barbosa-Ribeiro et al, 2016a). No entanto, a eliminação total de
micro-organismos é dificultada pela anatomia complexa do sistema de canal radicular e
a sua persistência ou a recontaminação destes canais pode promover o insucesso do
tratamento endodôntico (Gomes et al, 2015). Deste modo, aliado às técnicas de
limpeza, modelagem e obturação, é necessário a reabilitação protética adequada do
elemento dentário, pois a deficiência ou ausência do selamento coronário pode
favorecer à infiltração microbiana (Siqueira et al, 2005a;b; Song et al, 2014; Landys et
al, 2015; Pedro et al, 2016).
A infecção secundária é caracterizada pela reinfecção do canal radicular,
podendo ser resultado de uma infiltração coronária, obturação deficiente, ou cárie
recidivante (Siqueira et al, 2014). No momento que o dente em questão for submetido à
nova reabilitação, está indicado a avaliação de um possível retratamento, mesmo que
não seja evidenciado o insucesso através da lesão periapical (Friedman & Stabholtz,
1986; ESE, 2006; Oliveira et al, 2013; Gomes et al, 2013b).
A microbiota das infecções secundárias e/ou persistentes é diferente da presente
nas infecções primárias. Este fato se deve ao processo de seleção dos micro-
organismos e por eles serem capazes de sobreviver em um meio com restrição
nutricional (Nóbrega et al, 2013; Endo et al, 2013, Tennert et al, 2014, Zhang et al,
2015). Enterococcus faecalis é um micro-organismos frequentemente isolado destes
canais (Endo et al, 2013; Gomes et al, 2013b; Ribeiro, 2015), sendo um coco gram-
positivo; anaeróbio facultativo; com diferentes mecanismos de resistência, resultado de
alterações fisiológicas ou estruturais da célula bacteriana (Forbes et al, 1998; Barbosa-
Ribeiro et al, 2016b). A identificação desta espécie nos canais radiculares varia entre
24% a 97,5%, dependendo do método utilizado, tradicional ou molecular (Murad et al,
2014, Barbosa-Ribeiro et al, 2016a).
2
E. faecalis apresenta genes de virulência que dificultam sua remoção durante o
PQM, favorecem a formação de biofilme, conferem maior resistência antimicrobiana e
facilitam sua penetração nos túbulos dentinários (Pinheiro et al, 2003; Siqueira Jr &
Rôças, 2004; Gomes et al, 2006; Skucaite et al, 2010; Zhu et al, 2010; Endo, 2012;
Marinho et al, 2012; Endo et al, 2013; Gomes et al, 2013b; Dale et al, 2015; Barbosa-
Ribeiro et al, 2016b).
Várias técnicas de instrumentação são utilizadas para a remoção da guta-percha
e limpeza dos canais radiculares de dentes tratados endodonticamente, tais como limas
de aço manual, limas de aço inoxidável manual, brocas de Gates-glidden, e limas
rotatórias de movimento contínuo (Wilcox, 1989; Imura et al, 2000; Bueno et al, 2006;
Inan & Aydin, em 2012). Atualmente, pesquisas vêm comprovando a superioridade das
limas rotatórias de movimento reciprocante quando comparadas às outras técnicas,
principalmente quanto ao tempo de preparo, a remoção de micro-organismos, a menor
extrusão de debris, e a remoção de material obturador (Zuolo et al, 2013; Rios et al,
2014; Silva et al, 2014; Bernardes et al, 2015; Grande et al, 2015; Martinho et al, 2015;
Souza et al, 2015; Crozeta et al, 2016).
Durante o PQM dos canais radiculares são utilizadas substâncias tais como
clorexidina, hipoclorito de sódio, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), entre outras
(Dornelles-Morgental et al, 2011; Gomes et al, 2013a; Shenoi et al, 2016; Gonçalves et
al, 2016; Zandi et al, 2016). A clorexidina é efetiva contra uma gama de micro-
organismos, inclusive E. faecalis, e uma vez associada à instrumentação mostra grande
redução dos seus níveis bacterianos (Gomes et al, 2013a).
Para potencializar a ação das substâncias químicas durante o PQM pode-se
utilizar o ultrassom, passivamente ou ativamente, com pontas adequadas para a
agitação intracanal (Leoni et al, 2016; Rico-Romano et al, 2016; Herrera et al, 2016).
Pesquisas têm revelado alterações na resistência antimicrobiana dos micro-
organismos encontrados nos canais radiculares (Murray, 1990; Morrison et al, 1997;
Shepard & Gilmore, 2002; Pinheiro et al, 2003; Owens, 2008; Hawkey, 2008; Poeschl et
al, 2010; Skucaite et al, 2010; Endo, 2012; Barbosa-Ribeiro et al, 2016b). Nos casos de
retratamento, destaca-se a resistência do gênero Enterococcus, que além da
resistência ao PQM, apresenta também resistência a uma variedade de antibióticos
3
comumente utilizados na terapêutica, por mutação do DNA ou por aquisição de um
novo DNA (Murray, 1990; Morrison et al, 1997). Os antibióticos aos quais os
enterococos apresentam maior resistência incluem eritromicina, tetraciclina,
cloranfenicol e vancomicina (Murray, 1990; Morrison et al, 1997; Mundy et al, 2000;
Shepard & Gilmore, 2002; Owens, 2008; Hawkey, 2008; Skucaite et al, 2010; Barbosa-
Ribeiro et al, 2016b).
A presente pesquisa foi realizada com o objetivo de verificar se dentes
encaminhados para o retratamento endodôntico por motivo protético, e sem lesão
periapical, apresentavam micro-organismos viáveis. Além disso, seria importante
observar se estes micro-organismos pertenciam ao gênero Enterococcus e verificar a
resistência dos mesmos aos antibióticos mais utilizados na clínica odontológica.
4
2 REVISÃO DA LITERATURA
2. 1. Epidemiologia do Retratamento endodôntico
O índice de sucesso do retratamento endodôntico está ligado a uma série de
fatores como a experiência do operador e grau de dificuldade do tratamento, visto que
obturações antigas, presença de retentores intrarradiculares, fratura de instrumentos,
perfurações, desvios e reabsorções dificultam a instrumentação do canal radicular em
toda a sua extensão. Além disto, outros fatores como a presença de lesão periapical e a
realização de uma restauração imediatamente após o tratamento endodôntico
influenciam o índice de sucesso (Torabinejad et al, 2009; Burry et al, 2016).
Os levantamentos dos índices de sucesso do tratamento/retratamento
endodôntico são baseados em avaliações clínico-radiográficas que avaliam a
persistência ou surgimento de lesão periapical, presença de sinais e sintomas clínicos,
presença de restauração coronária. Estas proservações são realizadas no mínimo a
cada ano, e se há duvidas quanto ao sucesso, deve-se proservar anualmente até
completar 4 anos (ESE, 2006).
Sjogren et al, em 1990, realizaram um estudo avaliando o índice de sucesso dos
tratamentos endodônticos, e observaram que nos casos que os dentes não
apresentavam lesão periapical, estes tinham 96% de sucesso, contra 86% nos dentes
associados a lesões periapicais, isto foi concluído após proservações de 8 a 10 anos do
tratamento endodôntico.
Quadros, em 2003, avaliou os procedimentos endodônticos realizados por alunos
do último ano de graduação da FOP-Unicamp e observou que 66,7% dos retratamentos
endodônticos apresentaram sucesso, 14,3% estavam em processo de reparação e 19%
foram considerados como insucesso. Ela observou também que os casos que
possuíam lesão periapical prévia ao tratamento endodôntico inicial apresentaram um
índice de sucesso (55,5%) significantemente menor do que nos casos sem lesão
periapical (89,8%). Concluiu que os índices de sucesso do retratamento são inferiores
ao tratamento endodôntico inicial, os quais apresentaram 78,5% de sucesso, sendo que
a presença de lesão periapical prévia ao tratamento influencia negativamente o índice.
5
Em 2004, Gorni & Gagliani realizaram um levantamento e caracterização dos
fatores que interferem no sucesso do retratamento endodôntico, este realizado por
especialistas, apresentando um índice geral de sucesso de 69%. No entanto foi
observada grande diferença quando o elemento dentário possuía alterações
morfológicas, com 48,7% de sucesso. Além deste fator, foi observado que a presença
de lesão periapical prévia ao tratamento endodôntico influenciava o índice de sucesso,
pois este era de 61,7% contra 89,5% dos dentes sem lesão periapical prévia evidente
radiograficamente.
Imura et al, 2007, único operador, especialista, avaliaram os 2000 casos de
tratamentos endodônticos realizados em sua clínica. O sucesso dos retratamentos
endodônticos convencionais foi de 85,9%. O único fator que afetou negativamente o
índice foi os grupos dentários, visto que molares apresentaram menores valores do que
pré-molares e incisivos.
Torabinejad et al, em 2009, realizaram uma revisão sistemática comparando o
índice de sucesso entre o retratamento endodôntico convencional e a cirurgia
parendodôntica ao longo do tempo. Observou que inicialmente a cirurgia
parendodôntica apresenta maior índice, no entanto quando avaliado de 4-6 anos houve
uma inversão dos índices, sendo que o retratamento convencional mostrou maior
previsibilidade ao longo do tempo.
Ng et al, 2011, investigaram os fatores que influenciam a condição periapical
após o tratamento e retratamento endodôntico. Observaram que as condições que
melhoram a cicatrização periapical foram: presença de lesão periapical de pequeno
tamanho, obtenção da patência foraminal, extensão da limpeza do canal radicular
próximo ao forame, uso de EDTA após o uso de NaOCl, não associação de clorexidina
2% ao NaOCl, ausência de perfuração, ausência de flare-ups, ausência de
sobreobturação, e presença de restauração coronária satisfatória. Neste trabalho
também foi observado o índice de sucesso de 84,6% dos retratamentos realizados,
reduzindo para 66,7% quando ausente o selamento coronário.
Eyuboglu et al, 2016, avaliaram o índice de sucesso de retratamentos realizados
em sessão única e a frequência que ocorreram complicações periapicais, sendo os
tratamentos realizados por um único operador e especialista. As consultas de
6
proservações revelaram 90,9% de sucesso, sendo que todos os retratamentos
endodônticos foram finalizados com a restauração coronária. Os autores concluíram
que os retratamentos endodônticos em única sessão se mostraram favoráveis ao índice
de sucesso, e somente o tamanho da lesão afetou significantemente o índice.
As falhas técnicas têm caracterizado como um dos fatores que induzem a
redução do índice de sucesso, evidenciadas por levantamentos epidemiológicos que
apontaram a relação entre o insucesso e restaurações e obturações inadequadas.
Levantamentos realizados apontam a importância do tratamento restaurador e a grande
redução do índice de sucesso quando o selamento coronário se apresenta deficiente ou
ausente, mesmo relacionado a um tratamento endodôntico bem realizado (Ray & Trope,
1995; Siqueira et al, 2005; Pedro et al, 2016), assim como uma maior incidência de
lesão periapical nestes casos (Kirkevang et al, 2000; Pedro et al, 2016).
Huumonen et al, em 2016, avaliaram a prevalência de lesões periapicais de
dentes tratados endodonticamente, na população da Finlândia. Com este estudo
relacionaram o insucesso do tratamento endodôntico inicial à obturação inadequada.
Esta dobrou o risco das lesões periapicais, mais frequentes em molares do que nos
outros grupos dentais. Já Alfouzan et al, em 2016, avaliando a condição periapical e a
qualidade dos tratamentos realizados na população da Arábia Saudita, observaram que
um tratamento endodôntico inadequado, qualidade da restauração e o tipo de material
utilizado para as restaurações influenciaram na presença de lesões periapicais.
A dificuldade técnica em que se realizar um retratamento endodôntico é maior
quando comparado a um tratamento endodôntico inicial, e a diferença entre a
habilidade de clínico-gerais e especialistas influenciam o índice de sucesso (Alley et al,
em 2004). Estes autores realizaram proservações por 5 anos dos dentes tratados por
clínicos e especialistas. O índice encontrado foi de 89,7% para clínicos e 98,1% para
especialistas. O índice de insucesso teve associação direta com a ausência de
selamento coronário, sendo este responsável por 20,8% dos insucessos ocorridos,
explicitando sua importância na restauração imediatamente após o tratamento
endodôntico.
7
2. 2. Infecções secundárias: dentes submetidos ao retratamento endodôntico
A presença dos micro-organismos e seus subprodutos são fundamentais para o
estabelecimento das doenças pulpares, constituindo uma relação de causa e efeito
estabelecida por Kakehashi et al, 1965. Sendo assim, a remoção dos micro-organismos
e a neutralização de seus subprodutos são essenciais para previsibilidade dos
tratamentos ou retratamentos endodônticos. Para que isso ocorra é necessária a
limpeza, modelagem e selamento hermético do sistema de canais radiculares (Schilder,
1974), além da restauração imediata do elemento dentário (Ray & Trope, 1995; Siqueira
et al, 2005). Falhas técnicas nestas etapas favorecem a persistência/ entrada de micro-
organismos nos canais radiculares, sendo indicado o retratamento endodôntico. (Ford &
Rhodes, 2004)
A resolução dos retratamentos endodônticos inicia-se pelo conhecimento do
material obturador utilizado, sendo estes cones de prata ou de guta-percha e cimentos
endodônticos. A guta-percha foi introduzida por Bowman, em 1867, é o material de
escolha até os dias atuais, com propriedade elástica satisfatória (Maniglia-Ferreira et al,
2005). A obturação é complementada por cimentos endodônticos com variadas
composições, mas com propriedade de selamento do canal radicular (Marroquín et al,
2015; Yildirim et al, 2016).
O diagnóstico e planejamento do retratamento endodôntico são essenciais para
o estabelecimento do tratamento adequado. Endodontistas e pós-graduandos tendem
a indicar mais retratamentos do que clínico-gerais e alunos de graduação (Wenteler et
al, 2015; Çiçek et al, 2016). Com a evolução das técnicas e qualificação profissional,
houve um aumento da previsibilidade dos retratamentos endodônticos convencionais,
assim como das cirurgias parendodônticas. Durante o planejamento deve-se considerar
estas opções, antes da indicação de exodontia e instalação de um implante, já que o
dente em si apresenta melhor função na cavidade oral (Torabinejad & White, 2016).
De acordo com Friedman & Stabholtz em 1986, no planejamento de uma nova
reabilitação protética, diante de casos de sucesso do tratamento endodôntico, com
ausência de imagem radiográfica de lesão periapical, mas com obturação insatisfatória,
deve-se indicar o retratamento endodôntico convencional.
8
Além disso, o tempo da realização do tratamento endodôntico inicial influencia o
selamento do canal radicular, visto que ocorre a degradação do material obturador ao
longo do tempo. Foi reportado que após 15 anos já existe a redução da capacidade de
selamento da guta-percha, comprometendo a longevidade do tratamento (Maniglia-
Ferreira et al, 2007).
A contaminação do canal radicular por micro-organismos pode ocorrer
coronalmente ou apicalmente, no entanto, são as falhas ou ausências dos materiais
restauradores as principais causas de insucesso do tratamento endodôntico (Ray &
Trope, 1995; Siqueira et al, 2005). Nas situações em que o selamento coronário estiver
ausente ou apresentar falhas e expor o material obturador ao meio bucal, a
recontaminação pela saliva ocorre em pouco tempo, podendo variar de 3 dias a 3
meses (Swanson & Madison, 1987; Magura et. al, 1991; Khayat et al, 1993; Siqueira et
al, 2000; Gadê Neto, 2004; Aminsobhani et al, 2010; Oliveira et al, 2013; Markose et al,
2016; Al-Maswary et al, 2016).
A reabilitação protética adequada influencia não somente no selamento,
impedindo infiltração coronária e/ou cárie secundária, como na manutenção do dente
por maior tempo na cavidade bucal, impedindo fraturas. Portanto é necessária a
restauração adequada dos dentes (Alvanforoush et al, 2016). Aquilino & Caplan (2002),
realizaram um estudo avaliando dentes tratados endodonticamente com e sem coroa
protética, observaram que os dentes que não possuíam coroa protética foram perdido 6
vezes mais do que os dentes que haviam coroa protética instaladas após a obturação.
Stavropoulou & Koidis (2007), afirmaram que coroas protéticas unitárias se
mostraram superiores após 10 anos, do que restaurações diretas que duram por
pequenos períodos de tempo. Skupien et al, (2016) mostrou a superioridade das
coroas unitárias quanto a menor necessidade de reintervenções, no entanto concluiu
que ambos apresentam bons resultados com o tempo.
Os casos indicados aos retratamentos são mais complexos, visto que existem os
obstáculos como o próprio material obturador, coroas protéticas, retentores
intrarradiculares. No entanto, também existem as dificuldades não resolvidas no
tratamento endodôntico inicial, como as calcificações, degraus, perfurações, fraturas de
instrumentos (Taylor et al, 2016).
9
A maioria das infecções secundárias ou persistentes resulta-se de uma infecção
intrarradicular, sendo o retratamento endodôntico convencional indicado. Este se
consiste da remoção de materiais obturadores dos canais radiculares e da realização
de uma nova modelagem, limpeza e obturação desses canais (Siqueira et al, 2014).
A abertura coronária adequada inicia-se com a remoção de restaurações ou
coroas anteriores e cáries secundárias, permitindo uma visualização ideal dos canais
radiculares. Após esta etapa, quando há presença de retentores intrarradiculares,
independente do material, a sua remoção é necessária para o estabelecimento de uma
nova limpeza e modelagem do canal. A remoção destes retentores pode ser realizada
de diversas formas, com saca-pinos, desgastes com brocas ou ultrassons, no entanto
visando a manutenção do dente e não a sua fragilização (Stabholtz & Friedman, 1988;
Kim et al, 2016).
Após a abertura coronária e remoção de possíveis retentores intrarradiculares
deve-se remover o material obturador. Isto pode ser feito com limas manuais, limas
rotatórias de rotação contínua, limas rotatórias reciprocantes, solventes ou associação
com ultrassom. Essa etapa é importante, pois além da remoção da guta-percha e
cimento obturador, estão sendo removidos micro-organismos que se mantiveram
viáveis (Del Fabbro et al, 2016)
Estudos comparando os métodos de remoção do material obturador mostram
que as limas rotatórias reciprocantes geram menor tempo de preparo, extrusão apical
de debris dentinários, menor quantidade de material remanescente, maior resistência à
fratura, exige menor habilidade para a execução e mesma capacidade em remover
micro-organismos e endotoxinas, quando comparadas às limas manuais e limas de
rotação contínua (Silva et al, 2014; Grande et al, 2015; Marinho et al, 2015; Uzunoglu &
Turker, 2016; Çanakçi et al, 2016; Kaşıkçi et al, 2016). O uso do ultrassom durante o
PQM auxilia na remoção do material remanescente, assim como de micro-organismos e
endotoxinas presentes (Martinho et al, 2015; Bernardes et al, 2015; Herrera et al, 2016;
Keles et al, 2016).
Para favorecer a remoção da guta-percha durante a instrumentação dos canais
radiculares, foi muito utilizada a químico-plastificação da mesma através do uso de
solventes, com destaque ao clorofórmio. Este apresenta superioridade na remoção da
10
massa obturadora quando comparado à outros solventes, no entanto é tóxico aos
tecidos periapicais, causa transporte do canal radicular e reduz a força de ligação aos
adesivos resinosos (Chutich et al, 1998; Mohammadzadeh Akhlaghi et al, 2013; Karataş
et al, 2016; Demibuga et al, 2016)
Todos os solventes de guta-percha promovem a formação de uma smear layer
química de difícil remoção, deixando maior quantidade de material obturador residual
nas paredes dos canais radiculares. Desta forma são indicados somente em casos de
difícil remoção do material obturador (Wilcox, 1989; Bueno, 1995; Oliveira, 2002;
Takahashi et al, 2009; Horvath et al, 2009; Jain et al, 2015; Souza et al, 2015). A
utilização de clorexidina gel na remoção da guta-percha mostra-se superior aos
solventes na limpeza das paredes do canal radicular (Oliveira, 2002).
Sabendo das contraindicações dos solventes, torna-se essencial a limpeza dos
canais radiculares através de uma instrumentação adequada e do uso substâncias
químicas auxiliares (SQA) de diferentes composições, com destaque ao NaOCl,
clorexidina e EDTA. Estas substâncias têm como objetivo principal dissolver
quimicamente os tecidos necróticos remanescentes, remover debris dentinários e
micro-organismos e seus subprodutos (Endo et al, 2012; Gomes et al, 2013b; van der
Sluis, 2015; Attur et al, 2016; Donyavi et al, 2016; Hertel et al, 2016; Zandi et al, 2016).
Um quesito importante durante o PQM é a ação de fluxo e refluxo gerada pelo
uso de uma solução irrigante. Esta é responsável por uma redução significativa das
endotoxinas (Marinho et al, 2014), podendo ser realizada através de seringas e agulhas
convencionais (manuais) ou sistemas como EndoVac. A irrigação convencional gera
uma pressão positiva e o EndoVac uma pressão negativa. A pressão negativa impede a
extrusão apical dos irrigantes, promove uma melhor limpeza do canal radicular e não
apresenta efeito vapor lock (Pawar et al, 2012; Tuncer & Unal, 2014; Pasricha et al,
2015; Konstantinidi et al, 2016).
A agitação ultrassônica passiva do EDTA faz com que a SQA penetre melhor nos
túbulos dentinários, proporcionando uma maior desinfecção dos canais radiculares e
favorecendo o selamento dos cimentos endodônticos (van der Sluis et al, 2007; Schmidt
et al, 2015; Akcay et al, 2016; Conde et al, 2016; Herrera et al, 2016).
11
2.3 .Infecções secundárias: Microbiota identificada nestes casos
A microbiota de canais radiculares com insucesso do tratamento endodôntico
mostra-se diferente das infecções primárias, visto que estas bactérias são capazes de
resistir aos procedimentos antimicrobianos e medicamentos utilizados na terapia
endodôntica; a um meio escasso de nutrientes, com relações bacterianas mínimas.
Estas condições associadas às alterações de temperatura, pH, tensão de oxigênio e a
capacidade de defesa do hospedeiro determinam a composição microbiológica destas
infecções (Sundqvist, 1992; Gomes et al, 2013b; Nóbrega et al, 2013).
A maioria dos autores concorda que as infecções primárias apresentam maior
diversidade e carga bacteriana do que as secundárias (Rolph et al, 2001; Pinheiro et al
2003; Siqueira & Rôças, 2004; Foschi et al, 2005; Gomes et al, 2005, 2006; 2013b;
2015; Schirrmeister et al , 2007; Blome et al, 2008; Rôças et al, 2008; Endo et al,
2014; Barbosa-Ribeiro et al, 2016a).
Os micro-organismos anaeróbios facultativos Gram-positivos são mais
encontrados nos casos de infecções secundárias do que em infecções primárias, por
serem mais resistentes à terapia endodôntica e por conseguirem permanecer em fase
de latência. Portanto se ocorrer o contato destes micro-organismos residuais com o
meio externo, facilitado pelas infiltrações coronárias, estes poderão ser capazes de se
multiplicar e reinfectar os canais radiculares (Gomes et al, 2013b).
Dentre os micro-organismos anaeróbios facultativos, Gram-positivos, a espécie
mais prevalente nos casos de insucesso endodôntico é o Enterococcus faecalis
(Pinheiro et al, 2003, 2004; Endo et al, 2013; Barbosa-Ribeiro et al, 2016a; Łysakowska
et al, 2016). Além disso, este microrganismo tem a capacidade de formação biofilme,
que o protege contra a ação da maioria das SQA e medicações intracanal utilizadas (Al-
Ahmad et al, 2014; Singh & Kapoor, 2014; Yap et al, 2014; Dale et al, 2015).
As técnicas de cultura relataram a presença de Enterococcus, Propionibacterium,
Actinomyces, Parvimonas, Staphylococcus spp e Candida nos canais de dentes com
insucesso do tratamento endodôntico (Pinheiro et al, 2003, 2004; Endo et al, 2013;
Gomes et al, 2013b; Barbosa-Ribeiro et al, 2016; Łysakowska et al, 2016). Bactérias
como Dialister, Eubacterium, Fusobacterium, Gemella, Mogibacterium,
12
Peptostreptococcus, Prevotella, Propionibacterium, Selenomonas, Synergistes,
Solobacterium e Treponema foram também encontradas nos canais radiculares por
métodos moleculares (Gomes et al, 2013b). A chance de se encontrar E faecalis na
infecção secundária é de 9 vezes maior (Gomes et al, 2013b), visto ao processo de
seleção existente nos canais radiculares.
Murad et al, (2014), através da técnica molecular checkerboard DNA-DNA
hybridization observaram uma diversidade de micro-organismos, sendo que os E.
faecalis estiveram presentes em 28%.
Rodrigues et al, (2015), avaliaram a microbiota de dentes com insucesso
endodôntico através do real-time PCR, e detectaram 81% de estreptococos e 24% de
E. faecalis,
Barbosa-Ribeiro et al(2016a) identificaram por cultura e testes bioquímicos a
espécie E. faecalis em todas as fases do retratamento endodôntico, no entanto nas
amostras iniciais também estiveram presentes Aerococcus spp, e Staphylococcus spp.
Zandi et al, 2016, utilizando o método molecular real-time PCR, observaram
Streptococcus spp em 57% dos canais radiculares e E. faecalis em 6%.
O grande destaque e importância da espécie E. faecalis ocorre pela dificuldade
da sua remoção no canal radicular, causados por seus diversos fatores de virulência
que possibilitam a formação de biofilme, resistência a antibióticos, entre outros (Dale et
al, 2015; Barbosa-Ribeiro et al, 2016b; Khalifa et al, 2016), portanto a persistência deste
micro-organismo pode ocorrer mesmo em casos que foram bem realizados (Molander
et al, 1998).
Fráter et al, 2013, compararam a eficácia de diferentes substâncias químicas
contra biofilme do canal radicular in vitro, e observaram que o NaOCl 5,25% se mostrou
mais eficaz, quando comparado à Solumium Dental, clorexidina 0,2%, Neomagnol,
solução fosfato tamponado (PBS).
Zandi et al, 2016, avaliaram a efetividade de soluções de NaOCl 2,5% e 5,25% e
gel de NaOCl a 2,5% em biofilmes de E. faecalis, sendo observado a superioridade na
redução das unidades formadoras de colônias das soluções sobre o gel.
13
2.4 Antibióticos no uso odontológico
Os antibióticos têm a função de controlar uma infecção, no entanto, quando
prescritos indiscriminadamente, resultam na emergência da resistência bacteriana,
tornando os mesmos menos efetivos ou até mesmo sem efeito (National Action plan for
combating antibiotic-resistant bacteria, 2014).
A microbiota oral sofre alterações quando se ingere um antibiótico, visto que este
medicamento não seleciona especificamente as bactérias a serem mortas. A cavidade
oral é composta por aproximadamente de 50-100 bilhões de bactérias, representadas
por em média 700 espécies bacterianas, dependendo do sítio oral e do indivíduo (Aas
et al, 2005). A maioria das bactérias tem sido associada com saúde, e após o uso de
antibióticos, elas diminuem em número, ocorrendo a proliferação de bactérias
resistentes, alterando assim esta microbiota. (Krishnan et al, 2016; Ferrer et al, 2016).
Além das alterações na microbiota oral, os antibióticos também causam
alterações na microbiota sistêmica. Pesquisas realizadas no Reino Unido e na Suécia
coletaram amostras da saliva e fezes de pacientes que fizeram uso de antibiótico
sistêmico. Foi observado modificações da microbiota nas fezes por maior tempo do que
na saliva. Em ambas as coletas houve seleção dos micro-organismos mais resistentes
após a ingestão dos antibióticos (Zaura et al, 2015).
Para a prevenção da resistência bacteriana aos antibióticos, estes devem ser
utilizados somente quando indicados. Quando o paciente é saudável, a indicação deve
se manter aos casos de envolvimento sistêmico da infecção, com a presença de febre,
mal-estar geral, limitação da abertura bucal, taquicardia, celulite, falta de apetite, ou
linfadenite (AAE, 2008; DHA, 2016). Importante destacar que o antibiótico não substitui
o tratamento endodôntico ou a drenagem de abscesso. A indicação errônea feita por
muitos profissionais não colabora com a efetividade do tratamento endodôntico (AAE,
2006; Lewis, 2008; Federowicz et al, 2013; Andrade, 2014; Hoskin et al, 2016; DHA,
2016).
Os pacientes que devem receber profilaxia antimicrobiana são os que
apresentam cardiopatias específicas, pacientes com substituição articular total ou com
algum grau de imunodepressão. Seu uso previne a endocardite bacteriana durante os
14
procedimentos odontológicos. Estes antibióticos devem ser de menor espectro e por
período curto de uso (Andrade, 2014; Franklin et al, 2016; Holmstrup & Klausen, 2016).
O Reino Unido recomendou através de seu guia, que a profilaxia antibiótica não
deve ser realizada prevenindo a endocardite durante os procedimentos odontológicos,
assim como o enxaguatório bucal de clorexidina não deve ser recomendado nestes
pacientes com finalidade profilática (National Institute for health and care excellence –
NICE, 2008).
As prescrições desnecessárias de antibiótico favorecem o mecanismo de
resistência bacteriana. As bactérias podem alterar o sítio alvo, modificar as enzimas,
podem degradar os antibióticos, alterar a permeabilidade dos antibióticos, gerar afluxo
dos antibióticos às células bacterianas, entre outras (Vranakis et al, 2014).
Na odontologia, diversos países têm realizado levantamentos para mapear o uso
de antibióticos. Na Arábia Saudita, por exemplo, a prescrição desnecessária por
dentistas correspondeu a 27,3% (Iqbal, 2015), no Canadá em 62,2% (Marra et al,
2016). Já na Escócia (Reino Unido), 10% das prescrições foram realizadas sem
indicação clínica (Elouafkaoui et al, 2016).
Cope et al, em 2016, realizaram uma auditoria avaliando o uso de antibióticos no
Pais de Gales, UK. Neste estudo observaram que as prescrições dos antibióticos foram
em sua maioria desnecessárias. Em 268/5.595 casos as prescrições foram para
pacientes com pulpite irreversível, e em 1.654/5.595 casos para abscesso apical agudo
sem envolvimento sistêmico. A maioria não foi associada às intervenções clínicas, ou
seja, o paciente não recebia tratamento e também não retornava para a resolução da
infecção.
Outro dado importante observado em alguns países como, por exemplo, no caso
do Brasil e do Sudão, são as auto prescrições de antibiótico. No Brasil, um
levantamento mostrou que 14,3% dos pacientes que foram atendidos no serviço de
plantão fizeram uso de antibióticos antes da intervenção odontológica e 16,1% após o
tratamento, ambos auto-prescritos (De-Paula et al, 2014). Já no Sudão, os
farmacêuticos dispensam as prescrições por motivo de falta de atendimento médico
suficiente para toda a população. No entanto, estas prescrições são sem
15
acompanhamento e diagnóstico preciso, gerando consequências para o paciente (Salim
& Elgizoli, 2016).
E. faecalis está presente em diversas infecções, como as infecções endodônticas
e as infecções do trato urinário. Seu monitoramento quanto a resistência a antibióticos é
importante, inclusive em âmbito hospitalar, para adoção de medicamentos mais
eficazes (Skucaite et al, 2010; Barbosa-Ribeiro et al, 2016b; Cai et al, 2017). Nos
hospitais, a presença de E. faecalis resistentes à vancomicina é uma preocupação
muito grande, pois a resolução da infecção é dificultada (Isenman & Fisher, 2016;
Jakovac et al, 2016). A resistência antibiótica desta espécie vem aumentando, incluindo
à eritromicina, tetraciclina, cloranfenicol, e, mais recentemente, à vancomicina, devido
às prescrições indevidas (Murray, 1990; Morrison et al, 1997; Mundy et al, 2000;
Poeschl et al, 2010; Skucaite et al, 2010; Endo, 2011, 2014; Ribeiro 2015, Barbosa-
Ribeiro et al, 2016b).
Diversas pesquisas têm sido feitas na área de Endodontia da FOP-UNICAMP
avaliando a suscetibilidade antibiótica do E. faecalis (Pinheiro et al, 2003; Delboni,
2009; Endo et al, 2014; Di Santi et al, 2015, Barbosa-Ribeiro et al, 2016b)
Pinheiro et al (2003), utilizando o E-test, mostraram que as cepas isoladas dos
canais radiculares foram suscetíveis à benzilpenicilina, amoxicilina e amoxicilina com
clavulanato. Já Delboni em 2009, mostrou a suscetibilidade à amoxicilina com ácido
clavulânico, amoxicilina e à moxifloxacina, com resistência de 78,5% das cepas à
rifampicina e 71,4% à azitromicina.
Endo et al, em 2014, utilizando o E-test, mostraram cepas de E. faecalis
suscetíveis à amoxicilina, moxifloxacina, vancomicina, benzilpenicilina e amoxicilina
com ácido clavulânico e resistentes a rifampicina (4/12), tetraciclina (2/12), doxiciclina
(1/12), eritromicina (3/12) e azitromicina (8/12).
Di Santi et al, em 2015, utilizando o E-test, observaram que cepas de E. faecalis
apresentaram suscetibilidade à amoxicilina e à associação de amoxicilina com ácido
clavulânico, sendo que algumas cepas apresentaram resistentes à eritromicina e
azitromicina.
16
Barbosa-Ribeiro et al, em 2016b, utilizando o E-test, encontrou cepas de E.
faecalis 100% suscetíveis à amoxicilina com ácido clavulanato, e resistentes à
clindamicina, cloranfenicol, gentamicina, metronidazol, moxifloxacina e rifampicina.
Já Komiyama et al, em 2016, avaliaram a suscetibilidade antimicrobiana do E.
faecalis isolados de amostras obtidas da cavidade oral através de um bochecho com
PBS, utilizando o método de diluição seriada de acordo com as normas do, CLSI. Os
autores observaram maior suscetibilidade à amoxicilina (87,7%) e ampicilina (84%) e
maior resistência das cepas à tetraciclina (53,8%) e eritromicina (43,4%).
Anderson et al, em 2016, observaram a suscetibilidade de cepas de E. faecalis
isoladas de alimentos, amostras clínicas obtidas de infecções nosocomiais
(hospitalares) e sítios orais (infecções endodônticas, placa dentais e saliva), utilizando o
VITEK AST-P616 card (bioMérieux Deutschland GmbH, Nürtingen, Germany). Todas as
cepas foram resistentes à eritromicina, mas suscetíveis à ampicilina, imipenem,
tigeciclina, nitrofurantoin e vancomicina. Das 28 cepas isoladas endodonticamente, 10
foram resistentes à tetraciclina. Em relação à gentamicina, houve resistência de cepas
isoladas da saliva (19/36), e de isolados clínicos (8/15). No entanto não houve
resistência das cepas isoladas de alimentos e dos canais radiculares.
Desta forma, dúvidas quanto à presença de micro-organismos em dentes
tratados endodonticamente, mas indicados para retratamento endodôntico por motivo
protético, devido a algum grau de inadequação do tratamento anterior ou pelo tempo do
tratamento endodôntico inicial, motivou o desenvolvimento desta pesquisa. Além disso,
a literatura demonstra a permanência de Enterococcus faecalis em dentes com
insucesso do tratamento endodôntico, estando estes desenvolvendo resistência aos
antibióticos prescritos na clínica odontológica.
17
3 Proposição
Objetivo geral
Avaliar a presença de micro-organismos e a suscetibilidade antimicrobiana de
Enterococcus faecalis isolados de canais radiculares de dentes submetidos ao
retratamento endodôntico por indicação protética, assintomáticos.
Objetivos específicos
1 Quantificar a presença de micro-organismos cultiváveis nos terços radiculares,
2 Avaliar o efeito do preparo químico-mecânico utilizando duas substâncias químicas
auxiliares(NaOCl 6% e Clorexidina 2% gel) e medicação intracanal realizados
durante o retratamento endodôntico na redução microbiana,
3 Identificar Enterococcus faecalis através da cultura com meio seletivo, PCR e
sequenciamento,
4 Monitorar o padrão da resistência antimicrobiana das cepas de Enterococcus
faecalis.
18
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Autorização para realização da pesquisa
O presente trabalho foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade
de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP), recebendo a aprovação para o seu
seguimento (protocolo 119/2015). O Certificado consta inserido no ANEXO 5.
Para participação deste estudo, os pacientes assinaram um Termo de
Consentimento livre e esclarecido, conforme as normas vigentes no referido Comitê de
Ética em pesquisa envolvendo seres humanos.
4.2 Seleção dos voluntários da pesquisa
Inicialmente foram analisadas 500 fichas de encaminhamento de pacientes dos
Cursos de Atualização e Especialização em Endodontia da Faculdade de Odontologia
de Piracicaba (FOP/UNICAMP). Foram selecionados apenas os casos encaminhados
para retratamento endodôntico por motivo protético de dentes com ausência de lesão
periapical (Figura 1), com no mínimo dois anos do tratamento endodôntico inicial,
caracterizando o sucesso do tratamento.
Foram excluídos da pesquisa dentes com quaisquer fatores que poderiam
interferir na microbiota do canal radicular como: uso de antifúngicos e antibióticos (< 3
meses); presença de doença periodontal (bolsa > 3mm); dentes com ausência de
selamento coronário; dentes com fratura radicular; dentes com impossibilidade de
isolamento absoluto; presença de sintomatologia; presença de lesão ou espessamento
periapical; presença de edema dos tecidos periapicais; presença de fístulas; e dentes
com mobilidade.
Após avaliação clínica prévia 20 dentes (unirradiculares e multirradiculares),
foram incluídos no presente estudo, nos casos de dentes multirradiculares, foi coletado
o canal mais amplo, sendo o palatino nos superiores e distal nos inferiores.
19
Figura 1. Radiografia periapical do dente 31 evidenciando a presença de tratamento endodôntico a 3 mm do ápice e ausência de lesão periapical.
4.3 Exame clínico (anamnese e exame físico)
Foram realizadas as anamneses, onde foram anotados os dados pessoais de
cada paciente (idade e gênero, história médica), histórico de tratamentos odontológicos
(incluindo o tempo que foi realizado o tratamento endodôntico anterior).
Aspectos clínicos e radiográficos
Durante o exame clínico foram registradas informações sobre o dente a ser
retratado e sua condição atual, segundo Pinheiro et al (2003). Características internas,
como o aspecto físico do canal radicular também foi avaliado. Todos esses dados foram
preenchidos na ficha de cada paciente (Anexo 4).
Radiograficamente foi avaliado se existia presença de cárie e a qualidade da
restauração presente, assim como falhas na margem da restauração, presença ou não de
espaços entre o material restaurador e a parede do canal. Para a análise radiográfica
foram utilizados os parâmetros utilizados por Pinheiro et al, 2003, nos quais a obturação
endodôntica é classificada como boa quando radiograficamente não se observava áreas
radiolúcidas na obturação ou entre o material obturador e a parede do canal, e o material
20
obturador se encontrava a uma distância de até 2 mm do ápice radiográfico. Se um ou
mais desses critérios não fosse atingido, a obturação era considerada ruim.
4.4. Procedimentos clínicos
Parte do método usado neste estudo foi descrito previamente em detalhe por
Gomes et al, 2015. Todos os materiais e instrumentais utilizados na presente pesquisa
foram esterilizados a 250ºC através de calor seco (estufa) por um período de 30
minutos, tornando-os apirogênicos.
Anteriormente ao começo do tratamento foi realizada a descontaminação da face
do paciente com clorexidina 0.2%. Após isso, o dente a ser tratado recebeu um
polimento coronário com auxilio da Escova de Robson e pedra pomes, seguido pela
anestesia local e isolamento absoluto do dente, com arco de Ostby e dique de borracha.
Foi realizado o vedamento interface coroa-lençol com o cianoacrilato (Super Bonder,
Loctite, São Paulo, SP) para que não ocorresse contaminação durante o retratamento.
Todo o conjunto do isolamento absoluto foi vedado com resina fotopolimerizável
(TopDam, FGM, Joinville, SC), para garantir estabilidade do isolamento.
Após a vedação foi realizada a desinfecção do campo operatório, que envolve a
porção coronária exposta, o grampo, o dique de borracha, e o arco de Ostby. A
desinfecção foi feita com swabs estéreis e umidecidos, em água oxigenada 30% (v/v),
NaOCl 2,5% por 30 segundos cada e em seguida, neutralização com solução estéril de
tiosulfato de sódio 5% (Möller, 1966), ilustrado na Figura 2. Foi testada a eficácia da
desinfecção através da coleta de amostra, feita com swab estéril o qual foi plaqueado
em placa de Fastidious Anaerobe Agar (FAA, Lab M, Bury, UK) acrescido de 5%
sangue desfibrinado de carneiro, que foi incubada na câmara de anaerobiose.
21
Figura 2. Descontaminação do campo operatório, abertura coronária e coleta dos canais radiculares. A- Descontaminação da face da paciente com Clorexidina; B- Polimento coronário; C- Anestesia local do dente; D; E- Desinfecção do campo operatório; F- Abertura coronária realizada com broca de alta rotação associada a irrigação com soro fisiológico; G-; H- Desobturação do canal radicular por terços radiculares, com auxílio da Reciproc R25; I- Coleta do canal radicular.
Após a desinfecção do campo operatório foi realizada a abertura coronária, em
alta rotação e irrigação com soro fisiológico estéril, para a redução do aquecimento da
ponta esférica diamantada (#1012 ou #1014). Após a finalização da abertura, com a
forma de contorno e conveniência desejada (#3082), o campo operatório foi novamente
desinfectado e neutralizado, seguindo os mesmos passos anteriores. Quando havia a
presença de núcleos metálicos fundidos, a sua remoção foi realizada através da técnica
SISU, a qual se trata de dois ultrassons simultâneos em posições antagônicas, com
pontas de ultrassom inativas.
22
A desobturação do canal radicular foi feita de forma seriada, de maneira a coletar
individualmente a guta-percha correspondente a cada terço. Para a remoção da guta-
percha de cada terço foi utilizado o sistema Reciproc iniciado pela lima R25 (VDW,
Munique, Alemanha). Foram utilizadas três limas Reciproc R25, sendo estas utilizadas
para desobturação para cada terço radicular, para diminuir o carreamento de debris de
um terço para o outro. Não foi utilizado nenhum solvente ou substância química auxiliar
para a desobturação do canal, somente soro fisiológico estéril para manter o ambiente
propício para as coletas microbianas.
Para a confirmação da patência e obtenção do comprimento de trabalho, que foi
equivalente a posição zero, foi utilizado o localizador apical (Novapex, Forum
Technologies, Rishon le-zion, Israel). A verificação da remoção do material obturador foi
feita com auxílio do microscópio clínico (Opto Eletrônica S.A., São Carlos, SP) e
realização de uma radiografia periapical.
4.5 Coleta microbiológica
As coletas foram realizadas de duas formas distintas, uma com auxílio de limas
endodônticas e outra com cones de papel absorvente, ambos estéreis e apirogênicos.
Durante a desobturação seriada feita com limas individuais R25, conforme se atingia o
comprimento da divisão dos terços radiculares, coronário (GC), médio (GM) e apical
(GAP). Quando havia presença de núcleos metálicos fundidos, este núcleo foi coletado
com cone de papel absorvente esfregando-o sobre sua estrutura. As amostras foram
introduzidas em tubos tipo eppendorfs previamente esterilizados, contendo 1,0 mL do
meio de transporte pré-reduzido VMGA III – Viability Medium Goteberg Agar (Dahlén et
al, 1993) e transportadas em jarros a vácuo para a câmara de anaerobiose (Don
Whitley Scientific, Bradford, UK) do Laboratório de Microbiologia da disciplina de
Endodontia da FOP-UNICAMP para processamento por cultura microbiológica, após o
término do procedimento clínico, não sendo ultrapassado o prazo de 4 horas para seu
processamento.
Após a desobturação, foi realizada a coleta inicial do canal radicular em toda sua
extensão, na posição zero estabelecida pelo localizador apical. O canal foi irrigado com
23
soro fisiológico e 3 cones de papel estéril/apirogênico foram introduzidos, um de cada
vez, em toda a extensão do canal, sendo esta coleta denominada (A1). A seguir os
pacientes foram divididos aletoriamente em dois grupos de acordo com a substância
química auxiliar empregada (Tabela 1). Concomitantemente ao uso da substância, foi
realizado o preparo mecânico com as limas Reciproc. A cada sessão foi realizado um
novo preparo químico-mecânico utilizando o mesmo calibre das limas das sessões
anteriores, para evitar alargamento excessivo dos dentes
Tabela 1. Divisão dos grupos de acordo com a Substância Química auxiliar
(SQA) e medicação intracanal(MIC) utilizadas.
Grupos n SQA MIC
G1 10 CLX 2% gel CLX 2% gel + Ca(OH)2
G2 10 NaOCl 6% CLX 2% gel + Ca(OH)2
Para melhorar a eficiência da irrigação e evitar o extravasamento do NaOCl foi
utilizado o sistema EndoVac (Discus Dental, Culver, CA, USA), sendo que no grupo G1,
a substância irrigadora foi o soro fisiológico, e no grupo G2, foi o NaOCl 6%, no entanto,
entre as trocas de limas o soro fisiológico foi utilizado no G2 para padronização do
tempo de contato das substâncias químicas.
24
Figura 3. Sistemas de irrigação e agitação dos irrigantes utilizados. A- Utilização do sistema EndoVac durante o PQM dos canais radiculares. B- Agitação ultrassônica passiva.
Após a instrumentação de todo o canal, o mesmo foi irrigado com 5mL de soro
fisiológico para remover todas as SQA utilizadas. A seguir procedeu-se a neutralização
da SQA. Para a Clorexidina foi utilizado tween 80 + lecitina de soja e para o NaOCl 6%,
o tiossulfato de sódio 5%. A seguir o canal foi novamente irrigado com 5 mL de soro
fisiológico, aspirado. O canal foi então irrigado com 1 mL de EDTA 17%, o qual foi
agitado ultrassonicamente por 30 s, com auxílio da ponta E1- Irrisonic em potência de 1,
ou seja, 10% (Helse Dental, Santa Rosa de Viterbo, SP, Brasil), ilustrado na Figura 3.
Esta ponta foi mantida 2mm aquém do comprimento real do canal. A irrigação com
EDTA foi feita em 3 tempos de 30 s e a cada irrigação o EDTA foi renovado. Logo a
seguir o canal foi irrigado novamente com soro fisiológico, para então realizar a coleta
após o PQM (D1).
O canal foi preenchido com soro fisiológico, por 7 dias, com selamento coronário
de uma camada de 2mm de coltosol (Vigodent, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e
restauração com resina composta fotopolimerizável Z250 (3M Dental Products, St Paul,
MN, EUA). Passados estes 7 dias, o paciente retornou para a realização das coletas do
canal radicular, antes do PQM (A2), seguindo todos os procedimentos anteriormente
detalhados. Após um novo PQM com EDTA foi feita a coleta D2. A seguir foi colocada a
medicação intracanal a base de hidróxido de cálcio e clorexidina 2% gel, na proporção
1:1, inserida com auxílio de uma Lentulo, por 30 dias. Foi dada especial atenção para o
preenchimento completo do canal com a medicação. Um pellet de algodão foi usado
para condensar a medicação ao nível da entrada do canal e uma radiografia periapical
foi realizada para garantir a qualidade de preenchimento do canal radicular. A seguir o
dente foi restaurado com resina composta fotopolimerizável.
Depois de 30 dias de medicação intracanal, os canais foram assepticamente
acessados, sob isolamento absoluto, de acordo com o protocolo para a desinfecção
como anteriormente descrito. A medicação intracanal foi removida com uma lima K#40
contra as paredes laterais do canal radicular e irrigação abundante com 10 mL de
solução salina. Em seguida, novas coletas foram realizadas (DMIC).
25
Antes de obturação, a instrumentação final do canal radicular foi realizada com a
utilização de três instrumentos manuais maiores do que o diâmetro apical obtido após
PQM. Este procedimento foi associado com o protocolo de irrigação para cada grupo.
Após, todos os canais radiculares foram irrigados com sua respectiva solução
neutralizadora. Os canais foram irrigados com 3 ml de EDTA 17% durante 1 minuto,
seguido por uma lavagem final com 10 mL de solução salina estéril / apirogênica. A
seguir os canais foram novamente coletados (D3).
Em seguida, os dentes foram obturados tridimensionalmente utilizando cones de
guta-percha cortados com uma régua calibradora e lâmina de bisturi, em 2 calibres
além da lima anatômica final, modelados com clorexidina 2% gel e travados no canal
radicular em 2mm aquém do comprimento real do dente. Após este procedimento, o
canal foi seco com auxilio de cones de papel absorvente calibrados no comprimento
real do dente, para então ser realizada a obturação do canal, a qual foi utilizado o a a
cimento endodôntico a base de óxido de zinco e eugenol (Endomethasone N,
Septodont; Saint Maur des Sossés Cedex, França), espatulado até não obter mais
brilho. As cavidades de acesso foram seladas com uma camada de 2mm de coltosol e
resina composta fotopolimerizável.
26
Resumindo, as coletas realizadas foram nomeadas de:
Guta-percha cervical (GC);
Guta-percha média: (GM);
Guta-percha apical: (GAP);
Antes do PQM 1: (A1);
Depois do PQM 1: (D1);
Antes do PQM 2, após 7 dias: (A2);
Depois do PQM 2: (D2);
Depois da medicação intracanal: (DMIC);
Depois do PQM 3: (D3).
Para as coletas das amostras microbiológicas dos canais radiculares
foram utilizados 3 cones de papel absorventes estéreis e apirogênicos, que foram
individualmente introduzidos no comprimento pré-determinado pelo localizador
apical, permanecendo nesta posição por 60 segundos. Em caso de canal seco, este
era umedecido com soro fisiológico estéril e apirogênico, para assegurar uma cultura
viável (Tabela 2). Em todos os casos foram coletadas amostras de um canal
radicular apenas. Em casos de dentes bi ou multirradiculares, as amostras foram
coletadas do canal mais amplo, de maneira a confinar o exame microbiológico em
um único ambiente ecológico.
Tabela 2. Método de coleta e armazenamento das amostras microbiológicas
Amostra Instrumento Qtd Comprimento Meio
1 Microbiológico Limas
endodônticas 01 Terço cervical
Tubo tipo eppendorf com 1,0 mL de VMGA III
2 Microbiológico Limas
endodônticas 01 Terço Médio
Tubo tipo eppendorf com 1,0 mL de VMGA III
3 Microbiológico Limas
endodônticas 01 Terço Apical
Tubo tipo eppendorf com 1,0 mL de VMGA III
4 Microbiológico Ponta papel 03 No ápice Tubo tipo eppendorf com 1,0 mL de VMGA III
27
4.6. Processamento microbiológico das amostras
4.6.1. Cultura microbiológica, Sequenciamento genético
Cultivo, isolamento, incubação e identificação preliminar dos micro-organismos
Figura 4. Câmara de anaerobiose e processamento microbiológico. A- Câmara de anaerobiose utilizada para o plaqueamento e cultivo. B- Plaqueamento do VMGA em placas de FAA, dentro da câmara de anaerobiose.
No interior da cabine de anaerobiose, ilustrados na Figura 4, o tubo de
Eppendorf contendo VMGA III e o material coletado foram agitados por 60 segundos
para facilitar a dispersão dos micro-organismos. Após isso, foram realizadas diluições
seriadas em 1/10, 1/100, e 1/1.000 utilizando Fastidious Anaerobe Broth (Lab M, Bury,
Inglaterra), e cada uma das coletas e diluições foram inoculados 50 μL do VMGA em
placas de Fastidious Anaerobe Ágar (Lab M, Bury, Inglaterra) + 5% de sangue
desfibrinado de carneiro + 1 mg/L de Menadiona (Vitamin K3; 2-Methyl-1,4-
naphthoquinone – SIGMA M5625, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) + 1 mg/L de
Hemina (Hemin Bovine Minimum 80% – SIGMA H5533); e em placas contendo o meio
seletivo m-Enterococcus (Difco BD, Sparks, Maryland, MD, EUA).
As placas de FAA foram incubadas em anaerobiose a 37ºC, numa atmosfera de
10% H2, 10% CO2 e 80% N2 até 14 dias, para permitir a detecção de micro-organismos
anaeróbios estritos de crescimento lento. Para seleção do gênero Enterococcus spp,
as placas com o meio seletivo, foram incubadas em estufa bacteriológica de CO2 a
37°C por 2 dias, para permitir o crescimento de micro-organismos deste gênero (Endo,
2012).
28
Após a incubação, cada placa foi examinada em lupa estereoscópica (Lambda
Let 2, Atto Instruments CO, Hong Kong) em aumento de 3 vezes. As unidades
formadoras de colônias (UFC/mL) foram contadas utilizando as placas de FAA, por
oferecer uma maior diversidade e crescimento de micro-organismos.
O número de UFCs foi determinado a partir da contagem do número de colônias
nas placas contendo o meio de cultura FAA. Para a obtenção do número de UFCs
presentes na amostra por mL (amostra inicial) foi necessário multiplicar por 2.000 ou
200.000 o número de UFCs observadas na contagem das placas, dependendo da
diluição realizada. A escolha da placa para contagem de UFCs estava relacionada à
possibilidade de contar de forma individual o número de UFCs presentes. Quando não
possibilitado a contagem na amostra inicial, foram utilizadas as diluições 10-2 ou 10-3.
Ou seja, quando a diluição 10-2 foi escolhida, o valor correspondente a essa diluição
era 100 vezes menor que o inicial (1 mL). A alíquota plaqueada foi de 50 μL, ou seja,
20 vezes menor que 1,0 mL. Portanto o fator de multiplicação do número de UFCs
obtido seria 2.000. Entretanto, quando a diluição 10-3 foi escolhida, o valor
correspondente a essa diluição era 1.000 vezes menor que o inicial (1 mL). A alíquota
plaqueada foi de 50 μL, ou seja, 20 vezes menor que 1,0 mL. Portanto o fator de
multiplicação do número de UFCs obtido seria 200.000 (Endo, 2012).
A diferenciação das colônias foi realizada de acordo com as suas características
macroscópicas no ágar, o que é facilitado pela adição de sangue, observando-se:
tamanho, cor, forma, textura, elevação, borda, superfície, consistência, opacidade e
hemólise (nenhum, hemólise parcial ou hemólise completa) (Endo, 2012). As diferentes
colônias foram diferenciadas e subcultivadas, com o objetivo de obtenção de culturas
puras (Endo, 2012).
Após a diferenciação, foi realizado o isolamento das colônias em uma placa
contendo BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro e outra em FAA + 5% de
sangue desfibrinado de carneiro + hemina (1 mg/L) + vitamina K (1 mg/L), e testadas
quanto ao seu requerimento gasoso, colocando-se uma placa na estufa bacteriológica
e outra na câmara de anaerobiose, respectivamente; observando em qual condição
gasosa houve crescimento bacteriano. As espécies que cresceram somente em
incubação anaeróbica foram consideradas anaeróbias estritas, após verificar
crescimento negativo em estufa bacteriológica e em cabine de CO2 (Jouan, IG 150,
29
Saint-Herblain, França). As espécies que cresceram nas três condições gasosas foram
caracterizadas anaeróbias facultativas (Endo, 2012).
A morfologia bacteriana foi obtida a partir de colônias puras após cada
incubação, através da coloração de Gram, e testadas quanto à produção de catalase.
No presente estudo, todas as diferentes colônias que cresceram no meio m-
Enterococcus tiveram sua morfologia testada pela coloração de Gram e teste de
produção de catalase, como mostrado em Figura 5.
Todos os tubos tipo Eppendorf contendo as amostras em VMGA III e o material
coletado, imediatamente após a retirada das alíquotas para diluição e para o
plaqueamento nos meios de cultura citados acima, foram estocados em freezer –80°C
para futura análise molecular (Endo, 2012).
Figura 5. Etapas da Identificação fenotípica. A- Plaquemento da amostra em meio de cultura seletivo m-Enterococcus; B- Isolamento das cepas selecionadas; C- Coloração de Gram (cocos Gram-positivos); D- Teste de produção de catalase (negativa).
30
4.5.2. Processamento molecular (PCR)
Extração de DNA bacteriano
As bactérias que foram cultivadas do meio m-Enterococcus e isoladas em
culturas puras em placas de BHI tiveram o DNA extraído através do kit “QIAamp
DNA mini kit” (QIAGEN, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções fornecidas
pelo fabricante. O kit é especifico para essa finalidade e contém uma variedade de
tampões, centrifugações e filtragens para que o material genético seja extraído e
então re-suspendido em uma solução eluente para que possa ser armazenado a
-20ºC. Após a extração, foi quantificada a concentração do DNA em cada amostra
através do espectrofotômetro para ácidos nucléicos NanoDrop 2000 (Thermo
Scientific, Wilmington, DE, EUA).
Amplificação do gene 16S rRNA - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A amplificação do gene 16S rRNA é necessária para identificação genotípica
dos micro-organismos isolados. Foi utilizado a PCR no termociclador GenePro
Thermal Cycler (Bioer Technology, Hangzhou, China) para amplificação da região do
gene 16S rRNA com os primers espécie-específico:
Univ Forward GCAAGGCTTCTTAGAGA
Univ Reverse CATCGTGTAAGCTAACTTC
A reação foi realizada através de um volume total de 50µL, sendo 13µL foram
oriundos de um mix de reagentes. A quantidade de DNA e água MiliQ estéril variou
de acordo com a concentração de DNA extraído de cada amostra, respeitando a
quantidade final, que deverá ser de 37 µL O mix de reagentes foi composto por 5µL
de Buffer 10X PCR; 1,5µL de Cloreto de Magnésio; 4µL de dNTP; 1 µL Primer Univ
F (25 pmol); 1 µL Primer Univ R (25 pMol); 0,5µL de Platinum Taq DNA Polymerase
(Invitrogen®, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).
A concentração de DNA utilizada na reação foi de aproximadamente 100
ng/µL (Siqueira et al, 2001; Viana et al, 2007).
31
Os parâmetros do ciclo para amplificação incluiu uma pré-desnaturação por 4
minutos a 94°C, seguida por 30 ciclos com desnaturação a 94°C por 45 segundos +
anelamento a 60°C por 45 segundos + extensão a 72°C por 1,5 minutos, e
concluindo-se com uma extensão final a 72°C por 15 minutos (Ribeiro et al, 2011).
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese horizontal em gel
de agarose 1%, por aproximadamente 45 minutos a 90V e temperatura ambiente em
tampão TAE 1X (Tris Acetato EDTA). Após a eletroforese, o gel foi corado em
brometo de etídio por 5 minutos, seguido por água destilada, observado sob luz UV
e a imagem era então fotografada e gravada. Reações positivas deveriam ter as
bandas de tamanhos apropriados (1500 pares de base). Um controle positivo de
DNA extraído de uma cepa padrão ATCC de E. faecalis foi usado para comprovação
do sucesso da reação, assim como um controle negativo que estava ausente de
DNA bacteriano, com o objetivo de verificar se houve contaminação nos reagentes
ou na água MiliQ utilizada.
Identificação microbiana através do Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA
O sequenciamento foi iniciado pela extração do DNA das cepas bacterianas
de Enterococcus faecalis que sofreram uma prévia identificação através da cultura
com meio seletivo, coloração de Gram, teste de catalase e PCR com primer espécie-
específico. Esta extração utilizou o kit QIAmp DNA mini kit®, seguindo as instruções
do fabricante, após esta etapa, foi realizada a quantificação do DNA através do
espectrofotômetro NanoDrop 2000.
Após a quantificação do DNA, houve a amplificação do gene rRNA iniciada
por uma reação de PCR universal no termociclador GenePro Thermal Cycler, para
esta amplificação com os primers proposto por Paster et al, 2001:
Univ Forward 5’ GAG AGT TTD ATY MTG GCT CAG 3’
Univ Reverse 5’ GAA GGA GGT GWT CCA RCC GCA 3’
A reação utilizou uma concentração de DNA de 100 ng/µL (Siqueira et al, 2001;
Viana et al, 2007; Ribeiro, 2015). O mix de reagentes foi composto por 5µL de Buffer
10X PCR (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil); 4µL de Cloreto de Magnésio (50 mM)
(Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 2µL de dNTP (40nmol) (Invitrogen São Paulo,
32
SP, Brasil), 1µL Primer Univ F (25 pmol) (Invitrogen São Paulo, SP, Brasil), 1µL
Primer Univ R (25 pMol) (Invitrogen São Paulo, SP, Brasil), 0,2µL de Platinum Taq
DNA Polymerase (Invitrogen São Paulo, SP, Brasil). O volume total foi de 50µL. O
ciclo foi iniciado por uma desnaturação inicial por 4 minutos a 94°C, seguida por 30
ciclos com desnaturação a 94°C por 45 segundos / anelamento a 60°C por 45
segundos / extensão a 72°C por 1 minuto e 30 segundos, concluindo com uma
extensão final a 72°C por 15 minutos (Ribeiro et al, 2011).
Após a reação de amplificação, estes foram analisados por eletroforese
horizontal em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio, por 45 minutos a
90V em tampão TAE 1X (Tris Acetato EDTA), seguido da observação sob luz UV e a
imagem foi fotografada. Os produtos da PCR foram purificados com kit de
purificação “QIAquick® Gel Extraction” (Qiagen, Chatsworth, CA, USA), seguindo as
recomendações do fabricante. Após esta purificação, o DNA foi novamente
quantificado e novamente analisado por eletroforese horizontal em gel de agarose
1%. Para o sequenciamento, as amostras tiveram o DNA padronizado em 20ng/µL,
sendo que quando as concentrações estavam maiores que esta, foi realizada a
eluição com a solução do kit de purificação.
Após esta etapa, foi realizada a reação de sequenciamento através do mix de
reagentes com 3µL do DNA purificado, 2 µL de Sequencing buffer 5X (Applied
Biosystems Carlsbad, CA, EUA), 1µL do BigDye TerminatorCycle Sequencing
(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA), 3µL de água ultrapura (Invitrogen, São
Paulo, SP, Brasil), e 1µL do primer “533R – TKA CCG CGG CTG CTG” (Invitrogen,
São Paulo, SP, Brasil). Os parâmetros do ciclo para amplificação iniciaram por uma
desnaturação inicial por 1 minuto a 96°C, seguida por 40 ciclos com desnaturação a
96°C por 15 segundos / anelamento a 50°C por 15 segundos e extensão a 60°C por
4minuto, e concluindo por uma extensão final a 60°C por 1 minuto.
Posteriormente, as amostras foram submetidas à precipitação, sob
refrigeração com gelo para evitar seu aquecimento e também sem a presença de
luz.
Como continuação a reação de sequenciamento, 1µL de acetato de sódio
(1,0M) + EDTA (2,5mM) foi adicionado a cada amostra, deixando descansar por
1minuto. Após isto, 40µL de etanol 95% foi distribuído em cada tubo, e submetido a
centrifugação a 1.200rpm por 15min a 4°C, e o sobrenadante descartado após esta
33
etapa. Outro ciclo de centrifugação foi realizado, acrescentando 100µL de etanol
70% sob 1.200 rpm por 5min, e descartado o sobrenadante. Os tubos Eppendorf
com as amostras permaneceram semi-abertos por 24h para secagem, protegidos da
luz por papel alumínio.
Após esse período, as amostras foram suspendidas em 10µL de formamida;
vortexadas; em termociclador, as amostras foram submetidas à desnaturação a
95ºC por 5 min, dispostas na placa de 96 poços do aparelho “3500 Genetic Analizer”
(Applied Biosystems/Hitachi). A análise do DNA foi feita utilizando o sistema “ABI
3500 DNA Analyser” (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA), alcançando em
média sequências entre 350 a 700 bases. As corridas foram feitas em capilares de
50 cm utilizando o polímero POP7, e as sequências foram analisadas pelo software
Sequencing Analysis 5.3.1 utilizando o Base Caller KB.
As sequências obtidas foram analisadas quanto à qualidade dos nucleotídeos
e similaridade, utilizando-se o programa CLC Genomics Workbench v6.5 (Qiagen
Company, Silkeborgvej, Dinamarca). Um arquivo no formato “FASTA” foi obtido com
as sequências de boa qualidade, que foram alinhadas pelo software Mega 6
(Molecular Evolutionary Genetics Analysis). As sequências alinhadas foram
comparadas com as sequências depositadas no GenBank (Ribeiro et al, 2011), pelo
programa Basic Local Alignment Tool for Nucleotides (BLASTn). Para um alto nível
de qualidade das sequências, admitiram-se índices de confiança para cada
nucleotídeo acima de 97%.BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied
Biosystems,Carlbad, CA, EUA)
34
Antibiograma
O antibiograma foi realizado com cepas bacterianas identificadas
primeiramente como Enterococcus faecalis através da cultura no meio seletivo m-
Enterococcus, seguido pelo PCR simples, com primer espécie-específico para E.
faecalis, e pelo sequenciamento. As concentrações dos antibióticos utilizados
encontram-se listadas na Tabela 3.
Tabela 3. Concentrações dos antibióticos utilizadas
Antibiótico Concentração
Amoxicilina 25µg
Amoxicilina+Ácido clavulânico 20µg+10µg
Ampicilina 10µg
Azitromicina 15µg
Ciprofloxacina 5µg
Clindamicina 2µg
Cloranfenicol 30µg
Doxiciclina 30µg
Eritromicina 15µg
Fosfomicina 200µg
Gentamicina 10µg
Levofloxacina 5µg
Nitrofurantoin 300µg
Norfloxacina 10µg
Rifampina 5µg
Teicoplanina 30µg
Tetraciclina 30µg
Vancomicina 30µg
As cepas de E faecalis foram subcultivadas em placas de BHI Ágar (BHIA),
sendo depois incubadas por 18-24 h a 37ºC em estufa de 10% CO2 (Jouan, Saint-
Herblain, França). Após crescimento em meio sólido, colônias isoladas foram
suspensas em tubos contendo 5 mL de NaCl a 0,85%. Após agitação mecânica, a
35
suspensão foi ajustada em espectrofotômetro com transmitância de 800 nm, até
atingir a concentração equivalente a 0,5 da escala de Mc Farland (1,5 x 108
bactéria/mL). Tal concentração de inóculo foi utilizada por promover crescimento
semi-confluente dos E. faecalis (Koo et al, 2000).
A seguir, o inóculo bacteriano foi plaqueado, de forma uniforme, diretamente
sobre a superfície de placas contendo Mueller Hinton Agar (Oxoid, Basingstoke,
UK), com o uso de um swab estéril. Todo este procedimento foi realizado em
triplicata. Após o plaqueamento, com auxílio de uma pinça flambada e resfriada, os
discos de antibióticos foram depositados sobre as placas, com uma leve pressão
com a ponta da pinça para adesão, mantendo espaço suficiente para que não
houvesse coincidência dos halos. As placas foram deixadas por 2 horas a
temperatura ambiente para permitir a difusão do antibiótico e a seguir foram
incubadas na cabine de C02 a 37ºC por 18 a 24 horas. A Figura 6 mostra as etapas
para a realização do antibiograma com discos de antibióticos.
Figura 6. Etapas para a realização do antibiograma com discos de antibióticos.
A- Isolamento de uma cepa bacteriana em placa de BHI, mantida em estufa CO2 a
37oC por 18-24h; B- Coleta de uma colônia isolada utilizando uma alça plástica
estéril; C- Transferência da colônia para tubo contendo NaCl; Padronização da
turbidez do inóculo de acordo com a escala 0.5 de McFarland; F- Colocação dos
discos contendo antibiótico nas placas de Mueller Hinton Ágar.
36
Após a incubação a leitura foi realizada pela medida do diâmetro das zonas
de inibição microbiana, com o auxílio de paquímetro digital (Figura 7).
Figura 7. Formação dos halos de inibição ao redor do disco contendo
antibióticos selecionados em placas semeadas com E. faecalis.
Os resultados foram comparados com os padrões de
suscetibilidade/resistência fornecidos pelo CLSI, 2012 (Performance Standards for
Antimicrobial Susceptibility Testing; Clinical and Laboratory. Standards Institute PA
Clinical and Laboratory Standards Institute- CLSI, 2012), como mostrado na Tabela
4.
37
Tabela 4. Valores interpretativos do tamanho dos halos de inibição
(diâmetro) dos antibióticos nos testes de Enterococcus spp. (CLSI-2012).
Zona de inibição(diâmetro)
Agente antibiótico Sensível Intermediário Resistente
Amoxicilina (AMO) ≥17 - ≤16
Amoxicilina+Ácido clavulânico (AMC) ≥18 17-14 ≤13
Ampicilina (AMP) ≥17 - ≤16
Azitromicina (AZI) ≥18 17-14 ≤13
Ciprofloxacina (CIP) ≥21 20-14 ≤15
Clindamicina (CLI) ≥21 20-13 ≤14
Cloranfenicol (CLO) ≥18 17-11 ≤12
Doxiciclina (DOX) ≥16 15-11 ≤12
Eritromicina (ERI) ≥23 22-12 ≤13
Fosfomicina (FOS) ≥16 15-11 ≤12
Gentamicina (GEN) ≥15 14-11 ≤12
Levofloxacina (LVX) ≥17 16-12 ≤13
Nitrofurantoin (NIT) ≥17 16-13 ≤14
Norfloxacina (NOR) ≥17 16-11 ≤12
Rifampicina (RIF) ≥20 19-15 ≤16
Teicoplanina (TEC) ≥14 13-9 ≤10
Tetraciclina (TET) ≥19 18-13 ≤14
Vancomicina (VAN) ≥17 16-13 ≤14
38
Análise Estatística
Foi utilizado ANOVA para medidas repetidas, o qual é um teste paramétrico para
amostras pareadas ou dependentes, e Teste de Friedman, o qual se trata de um
teste não paramétrico para amostras pareadas ou dependentes (p<0,05).
39
5 RESULTADOS
Todos os casos apresentaram-se assintomáticos em todos os momentos do
retratamento endodôntico. Houve maior prevalência de mulheres (n=13). Dentre os
pacientes, nenhum apresentou doença periodontal, mobilidade dental, dor a
palpação, dor a percussão nem dor prévia. O tempo do tratamento endodôntico
inicial foi de 8,58±6,29 anos (Tabela 5). Os dentes que foram incluídos na pesquisa
estão presentes na Tabela 6, constituindo-se de 11 unirradiculares e 9
multirradiculares.
Tabela 5. Caracterização da amostra pelo tempo do tratamento
endodôntico inicial.
Tempo do tratamento endodôntico inicial (anos) n %
2 a 4 anos 6 30%
5 a 10 anos 8 40%
> 10 anos 6 30%
Total 20 100%
Tabela 6. Prevalência dos grupos dentais incluídos na pesquisa.
Grupos dentais n Frequência
Incisivo Central Superior 2 10%
Incisivo Lateral Superior 3 15%
Incisivo Lateral Inferior 1 5%
Canino Superior 1 5%
Pré-molar Superior 3 15%
Pré-molar Inferior 4 20%
Molar Superior 2 10%
Molar Inferior 4 20%
Total 20 100%
40
Em relação a qualidade da obturação observada na radiografia de diagnóstico
e seguindo os critérios previamente estabelecidos, observou-se maior prevalência
de obturação considerada ruim(12/20) em comparação com aquelas consideradas
boas(8/20). Todos os dentes estavam com restaurações definitivas (Tabela 7).
Tabela 7. Qualidade da obturação e selamento coronário dos dentes submetidos ao retratamento endodôntico.
Qualidade da obturação n %
Bom (obturação e limite adequados) 8 40%
Ruim (limite, áreas radiolúcidas ou deficiência no alargamento) 12 60%
Limite apical + Espaços vazios + Deficiência no alargamento 4 20%
Espaços vazios + Deficiência no alargamento 3 15%
Limite apical + Deficiência no alargamento 2 10%
Limite apical + Espaços vazios 2 10%
Deficiência no alargamento 1 5%
Selamento coronário n %
Resina Composta 15 75%
Núcleo Metálico Fundido+Coroa unitária 5 25%
Total 20 100%
Micro-organismos foram encontrados em todos os canais radiculares através
do cultivo no meio FAA. Na tabela 8 foi possível avaliarmos a quantidade de micro-
organismos cultiváveis presentes nos terços radiculares, com maior carga na coleta
do terço coronário, seguida do terço médio e apical, com diferença estatisticamente
significante entre os terços cervical e apical (p≤0,05). Já na Tabela 9, podemos
observar a redução bacteriana nos níveis globais e entre as substâncias utilizadas,
sendo que não foi observada diferença estatisticamente significante entre as
substâncias (p≤0,05).
41
Tabela 8. Avaliação da carga bacteriana na guta-percha pelos terços
radiculares (UFC/mL).
Guta-percha Valores Globais
Cervical 64,8±63,8 A
Média 32,8±29 A,B
Apical 7,6±6,5 B
Teste de Friedman p≤0,05
Tabela 9. Avaliação fases do retratamento endodôntico na redução dos níveis
bacterianos globais e por substâncias químicas auxiliares (UFC/mL). Média±desvio
padrão.
Substância química auxiliar
Fase do tratamento
Valores
Globais CLX 2% gel NaOCl 6%
Inicial 87,25±86,2 A 101,4±98,5 A 73,1±58,99 A
Após 1º.PQM 2,45±2,3 B 0,6±0,4 B 4,3±3,08 B
Antes 2º.PQM (canal vazio-2ª
sessão) 6,7±6,7 B 3,7±3,65 B 9,7±9,5 B
Depois 2º. PQM (2ª sessão) 0,2±0,15 B 0,2±0,17 B 0,2±0,06 B
Depois MIC (30 dias-3ª sessão) 1,1±0,8 B 1,2±1,08 B 1±0,07 B
Depois 3º. PQM (3ª sessão) 0 B 0 B 0 B
ANOVA para medidas repetidas. Letras diferentes indicam diferença estatística
significativa entre si (p<0,05).
A redução da carga bacteriana foi observada em todos os momentos do
retratamento endodôntico, no entanto após o canal ter sido mantido vazio por 7 dias,
houve um aumento quando comparado a coleta depois do PQM 1, sem diferença
estatística. Todas as etapas de preparo atuaram para uma efetiva desinfecção do
canal radicular (Figura 9).
42
Figura 8. Nível de micro-organismos nas diversas fases do retratamento endodôntico.
Identificação da espécie Enterococcus faecalis através da cultura, PCR e
sequenciamento
Através da cultura com meio seletivo M-Enterococcus foi possível observar a
prevalência do gênero Enterococcus, os quais estavam presentes em 60% (12/20)
das amostras do caso clínico estudado, e estiveram ausentes em 40% (8/20) das
amostras coletadas. Para caracterização fenotípica, foram realizadas as analises de
coloração de Gram e reação de catalase. De todos os isolados no meio m-
Enterococcus, dois apresentaram catalase positiva, portanto foram excluídos. Nos
outros a catalase foi negativa, como esperado para bactérias do gênero
Enterococcus. Na tabela 10 estão descritos os sítios/etapa de crescimento
bacteriano detectados através da técnica de cultura(meio m-Enterococcus).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
GutaCervical
GutaMédia
GutaApical
AntesPQM 1
DepoisPQM 1
AntesPQM 2
DepoisPQM 2
DepoisMIC
DepoisPQM 3
43
Tabela 10. Frequência de crescimento bacteriano a partir da cultura,
detectadas em meio m-Enterococcus, em diferentes sítios/ etapas de
crescimento.
Sítio/ Etapa Coletados n
GC 10/20
GM 8/20
GAP 4/20
A1 12/20
D1 1/20
A2 8/20
Guta-percha cervical (GC); Guta-percha média: (GM); Guta-percha apical: (GAP);
Antes do PQM 1: (A1); Depois do PQM 1: (D1); Antes do PQM 2, após 7 dias: (A2).
Na Figura 09 podemos verificar a alta seletividade do meio m-Enterococcus utilizado
na identificação de Enterococcus quando comparado com o PCR com primers
espécie-específico e Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA.
Figura 9. Identificação da espécie E. faecalis por cultura, PCR e sequenciamento.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Cultura PCR Sequenciamento
43 41 41
44
Após o crescimento pela cultura em meio seletivo e identificação por PCR e
sequenciamento, as 41 cepas identificadas como Enterococcus faecalis foram
testadas quanto sua suscetibilidade antibiótica contra os 18 antibióticos. Na Tabela
11 podemos observar os valores obtidos no antibiograma das cepas isoladas
clinicamente.
45
Tabela 11. Número de cepas de Enterococcus faecalis classificadas de
acordo com o halo de inibição, classificado em suscetível, intermediário e
resistente (n=41).
Halo de inibição (diâmetro)
Antibióticos Suscetível Intermediário Resistente
Amoxicilina (AMO) 41 0 0
Amoxicilina+Ácido clavulânico (AMC) 38 2 1
Ampicilina (AMP) 38 0 3
Azitromicina (AZI) 7 12 22
Ciprofloxacina (CIP) 7 16 18
Clindamicina (CLI) 2 1 38
Cloranfenicol (CLO) 34 5 2
Doxiciclina (DOX) 33 5 3
Eritromicina (ERI) 7 28 6
Fosfomicina (FOS) 33 7 1
Gentamicina (GEN) 1 5 35
Levofloxacina (LVX) 15 15 11
Nitrofurantoin (NIT) 1 33 7
Norfloxacina (NOR) 14 26 1
Rifampicina (RIF) 5 16 20
Teicoplanina (TEC) 21 14 6
Tetraciclina (TET) 30 5 6
Vancomicina (VAN) 9 15 17
46
6 DISCUSSÃO
O conhecimento da presença dos micro-organismos, quando caracterizado o
insucesso do tratamento endodôntico com evidência radiográfica de lesão periapical,
é bem estabelecido na literatura. Não obstante, ainda há uma lacuna nos trabalhos
in vivo no que diz respeito à presença de micro-organismos nos casos submetidos
ao retratamento endodôntico por motivos protéticos, sem lesão periapical. No intuito
de assegurar a longevidade de uma nova reabilitação protética, é indicado o
retratamento endodôntico, justificado pela degradação do material obturador ao
longo do tempo. Trabalhos indicam que após 15 anos já existe uma degradação da
guta-percha e redução de sua capacidade de selamento, comprometendo a
longevidade do tratamento (Maniglia-Ferreira et al, 2007).
Nos casos selecionados podemos relacionar a maior prevalência de micro-
organismos no terço coronário, com a possível infiltração pela restauração presente,
mesmo que definitiva, pois onde há perda ou deficiência do selamento coronário,
trabalhos na literatura indicam que o tempo de infiltração ocorre entre 3 dias a 3
meses (Swanson & Madison, 1987; Magura et. al, 1991; Khayat et al, 1993; Siqueira
et. al., 2000; Gadê Neto, 2004; Aminsobhani et al, 2010; Oliveira et al, 2013;
Markose et al, 2016; Al-Maswary et al, 2016). A ausência ou a deficiência do
tratamento restaurador é a principal característica relacionada a falha do tratamento
endodôntico (Ray & Trope, 1995; Kirkevang et al, 2000; Siqueira et al, 2005; Pedro
et al, 2016).
Os resultados desta pesquisa mostram a presença dos micro-organismos nos
casos de dentes submetidos ao retratamento endodôntico por motivo protético, ou
seja, sem imagem radiográfica de lesão periapical, sendo que, todos os casos
incluídos nesta pesquisa possuíam selamento coronário definitivo, com restauração
de resina composta ou núcleo metálico fundido associado à coroa total definitiva,
concordando com Shetty et al., 2015, que avaliando os materiais restauradores,
concluíram existir infiltração coronária em todas os materiais, inclusive resina
composta e amálgama de prata.
Ressalta-se que as coletas de guta-percha do terço coronário apresentam-se
com maior carga bacteriana quando comparado às coletas dos terços médio e
apical, com diferença estatisticamente significante, tendo uma diminuição
47
progressiva da carga bacteriana cervical para apical, justificado pelo tamanho e
número, permeabilidade dos túbulos dentinários (Carrigan et al, 1984; Stauffacher et
al, 2016), e maior proximidade com a cavidade oral, sendo mais suscetível assim, às
infiltrações de micro-organismos pela saliva (Vieira et al, 2012; Muliyar et al, 2014;
Taschieri et al, 2014; Mathur et al, 2015).
Além disso, foi observada uma redução estatisticamente significante da carga
bacteriana após o PQM com e sem a medicação intracanal, sem diferença entre
substância química auxiliar utilizada, clorexidina 2% gel ou NaOCl 6%, portanto
podemos observar que uma sessão única poderia ser instaurada, já que houve
crescimento bacteriano com o canal vazio. A instrumentação foi realizada com o
sistema lima rotatória reciprocante Reciproc, possibilitando um menor tempo de
preparo, efetiva desobturação e preparo do canal radicular. Com a utilização desta
lima rotatória reciprocante Reciproc, podemos observar redução dos micro-
organismos, sem diferença nesta redução, conforme observado em estudos
anteriores (Basmaci et al, 2013; Marinho et al, 2014).
A utilização de aparatos durante o PQM visou a geração de um fluxo
dinâmico, de inserção da substância química e sua aspiração, e agitação da
substância para promover a inserção desta em áreas não atingidas pelo preparo e
maior remoção de debris. Para isso foram utilizados o EndoVac, o qual gera maior
segurança principalmente na utilização de hipoclorito de sódio (Yost et al, 2015) e
irrigação ultrassônica passiva, esta auxilia na remoção da smear layer dos túbulos
dentinários (Prado et al, 2016). Ambos os aparatos foram complementares durante o
PQM com resultados satisfatórios, pois nosso resultado final foi de zero na
contagem de micro-organismos finais.
Na literatura há uma predominância da espécie Enterococcus faecalis nos
casos de insucesso do tratamento endodôntico (Wang et al, 2012; Endo et al, 2012,
2013; Ribeiro, 2015; Barbosa-Ribeiro et al, 2016). Partindo desta premissa
pretendeu-se no presente estudo verificar se nos casos em que não há evidência
radiográfica de lesão periapical, esta espécie também estaria presente.
Foi iniciada a identificação do micro-organismo E. faecalis através do
plaqueamento em meio de cultura seletivo m-Enterococcus, visto que este inibe o
crescimento de bactérias de outros gêneros. Utilizando o método de cultura em meio
específico, observamos a presença de Enterococcus spp em 60% (12/20) das
48
amostras. Trabalhos anteriores de Pinheiro et al 2003, Endo et al, 2013 e Barbosa-
Ribeiro et al, 2016b, mostraram a presença deste gênero em 36,7%, 20% e 100%
das amostras, respectivamente, os quais se tratavam de dentes relacionados ao
insucesso do tratamento endodôntico.
Para a identificação genotípica da espécie de E. faecalis, foram realizados
testes com métodos moleculares, sendo estes, PCR e sequenciamento. Os métodos
moleculares permitem uma maior especificidade e eficiência. No entanto, a
associação entre os métodos de cultura e moleculares é importante para sabermos
os micro-organismos viáveis. Associação de técnicas foram utilizadas por Gomes et
al., 2006; Di Santi et al, 2015; Barbosa-Ribeiro et al 2016b; Cardoso et al, 2016. No
presente estudo houve alta concordância entre as técnicas de identificação, sendo
que entre o PCR e o sequenciamento foram de 100%, e entre a cultura e método
molecular de 95,34%.
O teste de suscetibilidade antibiótica é amplamente utilizado em diversas
áreas da saúde, com a finalidade de saber a resistência e sensibilidade dos
antibióticos às bactérias testadas. Os valores de referência utilizados são descritos
pelo CLSI.
A importância da espécie E. faecalis ultrapassa a área da odontologia, pois
está associada a infecções em outras partes do corpo como é o caso de infecções
urinárias. Além disso, há uma dificuldade de removê-la quando se apresenta
resistente à vancomicina, especialmente em âmbito hospital. No presente estudo os
antibióticos mais efetivos contra E. faecalis foram amoxicilina, amoxicilina + ácido
clavulânico e ampicilina, corroborando com os de Pinheiro et al, em 2003.
A suscetibilidade à amoxicilina associada ao ácido clavulânico e a resistência
à gentamicina e clindamicina foram descritos por Lins et al., 2013; Al-Ahmad et al.,
2013; Barbosa-Ribeiro et. al., em 2016b; suscetibilidade esta também encontrada
em todas as cepas por Delboni em 2009. Um dado adicional é que no presente
estudo as cepas foram suscetíveis à amoxicilina na concentração de (100%) do que
à associação da amoxicilina a com ácido clavulânico (92%), possivelmente resultado
das diferentes concentrações dos antibióticos, sendo que no primeiro, a
concentração utilizada na indústria farmacêutica, é de 25g e quando a amoxicilina
utilizada estava na concentração de 20g.
49
A mudança do perfil de resistência antibiótica tem aumentado pelo uso
exacerbado, principalmente em casos sem indicação precisa ou auto-prescrição. Em
pacientes alérgicos à penicilina, vem sendo utilizada a clindamicina. Entretanto no
presente estudo, assim como no de Barbosa-Ribeiro et. al (2016b), este
medicamento mostrou baixa eficiência contra E. faecalis. Nesses casos, o antibiótico
que se mostrou ser a melhor alternativa de escolha é a doxiciclina e fosfomicina,
demonstrando ser eficiente em cerca de, 80,5% das amostras. Entretanto, apesar
dos resultados obtidos, de acordo com o guia CLSI, os trabalhos in vitro não devem
ser a única fonte de avaliação dos antibióticos.
Outro achado interessante deste estudo foi que 17 cepas apresentaram
resistentes à vancomicina. Essa resistência observada poderia justificar a
permanência destes micro-organismos nos casos de retratamento endodôntico. São
cepas de difícil tratamento, e que geram resistência a maioria das substâncias
químicas e medicações. Estas cepas, quando encontradas em âmbito hospitalar,
geram grande problema pela sua difícil erradicação.
O presente trabalho demonstrou a presença de micro-organismos em dentes
tratados endodonticamente, mas indicados para retratamento endodôntico por
motivo protético, devido a algum grau de inadequação do tratamento anterior ou ao
tempo do tratamento endodôntico inicial. Entretanto, tal presença não significa
insucesso do tratamento, a não ser que exista uma via de comunicação com o meio
externo. A permanência de E. faecalis em dentes tratados endodonticamente e o
desenvolvimento de resistência dos mesmos aos antibióticos prescritos na clínica
odontológica, ou por automedicação, indica a necessidade de um tratamento
endodôntico mais eficaz e do monitoramento periódico da suscetibilidade deste
micro-organismo aos agentes antimicrobianos sistêmicos.
50
7 CONCLUSÃO
Baseado nos resultados obtidos do presente estudo pode-se concluir que:
1 Foram encontrados micro-organismos em todos os canais radiculares, nas
amostras iniciais, indicados para retratamento endodôntico por motivos
protéticos, sem evidencia de lesão periapical.
2 Todas as etapas de instrumentação durante o retratamento endodôntico tiveram
efeito na redução na carga bacteriana.
3 O meio de cultura seletivo m-Enterococcus mostrou boa seletividade para o
gênero Enterococcus, apresentando valores semelhantes ao PCR e ao
sequenciamento parcial do gene 16S rRNA.
4 As cepas identificadas como Enterococcus faecalis apresentaram variados graus
de resistência aos agentes antimicrobianos, sendo mais suscetíveis à
amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulânico e ampicilina.
51
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73
ANEXO 1
Aspectos clínicos e radiográficos dos dentes submetidos ao retratamento endodôntico por motivos protéticos
Caso Dente
Dor Prévia e/ou Atual
Sensibilidade à Palpação
Dor à Percussão
Edema e/ou Fístula
Tempo do tratamento (anos)
Tipo de selamento coronário
Obturação Limite Apical (mm)
Espaços radiolúcidos
Deficiência no alargamento
1 11 - - - - 2 NMF+Coroa Ruim 0 X X
2 24 - - - - 20 RC Boa -1,5
3 45 - - - - 22 RC Boa -1
4 24 - - - - 5 RC Ruim -5
X
5 32 - - - - 6 RC Boa -1
6 16 - - - - 7 RC Ruim -4 X X
7 23 - - - - 5 RC Ruim -3 X X
8 22 - - - - 10 NMF+Coroa Ruim -3
X
9 35 - - - - 3 RC Ruim -3 X
10 46 - - - - 3 RC Ruim -2 X X
11 21 - - - - 10 RC Boa -1
12 12 - - - - 5 NMF+Coroa Ruim -2,5 X X
13 12 - - - - 15 NMF+Coroa Ruim -6 X X
14 27 - - - - 6 RC Boa -2
15 36 - - - - 11 RC Ruim -2 X X
16 47 - - - - 4 RC Boa -2
17 34 - - - - 2,5 NMF+Coroa Boa -1
18 24 - - - - 20 RC Ruim -3 X
19 37 - - - - 12 RC Boa -1
20 45 - - - - 3 RC Ruim 0 X
74
ANEXO 2
Guta-percha cervical (GC); Guta-percha média: (GM); Guta-percha apical: (GAP);
Antes do PQM 1: (A1); Depois do PQM 1: (D1); Antes do PQM 2, após 7 dias: (A2).
Contagem das UFC/mL em Meio de cultura FAA
Caso Dente GC GM GAP A1 D1 A2 D2 DMIC D3
1 11 10 4 1 7 0 5 1 0 0
2 24 104 192 53 356 3 15 0 0 0
3 45 160 49 0 82 0 9 1 0 0
4 24 176 84 0 126 0 1 0 5 0
5 32 5 1 0 14 0 0 0 3 0
6 16 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 23 160 124 11 208 3 5 0 0 0
8 22 84 4 7 158 0 0 0 0 0
9 35 0 0 1 2 0 0 0 4 0
10 46 124 76 39 61 0 2 0 0 0
11 21 134 6 11 87 0 0 0 0 0
12 12 7 1 0 0 13 1 0 0 0
13 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14 27 0 0 3 192 12 16 2 10 0
15 36 35 0 0 98 0 23 0 0 0
16 47 40 14 7 70 0 3 0 0 0
17 34 158 75 14 131 18 31 0 0 0
18 24 0 0 0 70 0 9 0 0 0
19 37 96 21 5 54 0 14 0 0 0
20 45 3 5 0 29 0 0 0 0 0
75
ANEXO 3
Guta-percha cervical (GC); Guta-percha média: (GM); Guta-percha apical: (GAP);
Antes do PQM 1: (A1); Depois do PQM 1: (D1); Antes do PQM 2, após 7 dias: (A2).
Presença de Enterococcus através do crescimento em meio M-Enterococcus
Caso Dente GC GM GAP A1 D1 A2 D2 DMIC D3
1 11 X 0 0 X 0 0 0 0 0
2 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 45 X X 0 0 0 0 0 0 0
4 24 X 0 0 0 0 X 0 0 0
5 32 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 16 X 0 0 0 0 X 0 0 0
7 23 X X 0 X 0 0 0 0 0
8 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0
9 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0
11 21 X X 0 0 0 0 0 0 0
12 12 0 0 X 0 0 0 0 0 0
13 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14 27 X X X X X 0 0 0 0
15 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16 47 X X X X 0 X 0 0 0
17 34 0 0 0 0 0 0 0 0 0
18 24 X X 0 0 0 X 0 0 0
19 37 X X X X 0 0 0 0 0
20 45 0 X 0 0 0 X 0 0 0
76
ANEXO 4 – Ficha clínica utilizada na pesquisa
77
78
79
80
ANEXO 5. Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa FOP-UNICAMP.