336 感染症学雑誌 第60巻 第4号

Avidin-Biotin系 を 用 い たEnzyme-linked immunosorbent

assay (ELISA)法 に よ る血 中 カ ン ジ ダ抗 原 の 検 出法

第1報 基 礎 的 検 討

千葉大学医学部小児科学教室

鈴 木 宏 中村 明

千葉大学生物活性研病原真菌研究部

田 口 英 昭 西村 和 子 宮治 誠

(昭和60年10月14日受付)

(昭和60年12月6日 受理)

Key words: Systemic candidiasis, Enzyme-linked immunosorbent assay with avidin-

biotin system, Heat extraction, Serum Candida antigen

要 旨

近年,増 加傾 向を 示 して い るsystemic candidiasisの 免疫学 的血 中抗 原検 出法 として,従 来 のELISA

法 よ り高感 度 のavidin-biotin系 を用 いたELISA法 を開発 し,マ ウスの感染 実験 を含 め た基礎 的検 討 を

行 な った.

検 出感 度 は,精 製 マ ンナ ン抗原 を正 常人血 清 に加 え て測 定 した場 合,1.2ng/mlで,bufferで は0.25ng/

mlで あった.抗 体 の特 異 性 に 関 して は検 討 した 主要 敗 血 症原 因菌11種 とCryptococcus neoformans,

Aspergillus fumigatusに は交叉 を認 め なか った.し か し,Candida属 中,C.tropicalis, C.guilliermondii,

C.stellatoideaの3種 には強 い交 差抗原 性 を示 した.ま た,ELISA inhibition assayで 精製 マ ンナ ン抗

原 と抗 体 とが特 異的 に反応 す る こ とを確 認 した.

マ ウスの感 染実 験 で は,血 液 培 養 は1例 を除 き陰 性 で あ った が,26例 中14例 で 抗原 が検 出 され た.

Candidaの 静注後 早期 で,主 病 変 が膿 瘍 の マ ウスで は,高 率 に抗原 が検 出 され,膿 瘍 面積 と血 中抗 原濃

度 に は,明 らかな相 関関 係が 認め られ た.一 方,病 巣 が広 範 囲に お よんで も,肉 芽腫 性病 変 を示す マ ウ

スで は,false negativeと な りや す く,臨 床応 用す る場 合,検 体 の採 取時 期 が重要 な ポ イン トにな る と考

え られた.

以 上 よ りavidin-biotin系 を用 いたELISA法 は手 技 も比 較 的 簡 便 で,検 出感 度 も優 れ て お り又,C

albicansに つい で重要 なC.tropicalisと も強 い交差反 応 を示す こ とよ りsystemic candidiasisの 早 期診

断法 として,臨 床応 用可 能 と思 われ る.

1. はじめに

近年,白 血病な どの悪性血液疾患に対する強力

な化学療法の導入や,中 心静脈栄養法を初めとす

る新 しい治療手技の普及に伴い,systemic can-

didiasisは 増加傾向を示 している1)2).しか し,その

診断法に関しては,疾 患に特異的な臨床症状に乏

しい こ と,血 液 培 養 の検 出率 が低 い こ と,さ らに,

Candidaが 常 在 菌 で あ る た め 起 炎 菌 と判 断 し難

い こ とや,基 礎 疾 患 の 性 質 お よび 抗 癌 剤 の 使 用 に

よ り,特 異 抗 体 反 応 に個 体 差 が 大 き い な ど の 困難

を 伴 うこ とが多 い3)4).こ の た め,種 々 の 方 法(Gas-

liquid chromatography以 下GLC法5)～8),

Counterimmunoelectrophoresis以 下CIE法9),

Radio-immunoassay以 下RIA法10),Enzyme-lin-

別刷請求先:(〒280)千 葉県千葉市亥鼻1-8-1

千葉大学小児科 鈴木 宏

昭和61年4月20日 337

ked immunosorbent assay以 下ELISA法11)～

14),Hemagglutination inhibition assay以 下HAI

法)に よ るCandidaの 代 謝 産 物 や 抗 原 の検 出 が 試

み られ て お り,特 異 抗 体 を 中 心 とす る抗 原 測 定 上

の阻 害 因 子 に 対 す る前 処 理 方 法 もい くつ か検 討 さ

れ て い る.

今 回,私 た ち は,血 清 の 前 処 理 法 と し て,Lew

ら14)の方 法 に準 じて加 熱 処 理 を用 い,さ ら に免 疫

反 応 増 幅 因 子 と し てavidin-biotin系 を 用 い た

ELISA法 を 開 発 し,マ ウス の 感 染 実 験 を 含 め た 基

礎 的 検 討 を 加 えた の で報 告 す る.

2. 材 料 と方 法

(1) カ ン ジ ダ マ ン ナ ン抗 原 の作 製

本 法 の検 出 感 度 の測 定 と作 製 した特 異 抗 体 の 性

状 を検 討 す る 目的 で,カ ン ジ ダ マ ンナ ン抗 原 を精

製 した.人 肝 膿 瘍 由 来 のC.albicansN508株(sero-

type A,千 葉 大 活 性 研)をSabouraud dextrose

broth(以 下SDB)に て30℃,48時 間 振 湯 培 養 後 集

菌 し,Fig.1に 示 す 方 法 で精 製 した.

マ ン ナ ン抗 原 の 性 状 につ い て は,Lowry法 に よ

る蛋 白定 量 で蛋 白 成 分 が 含 ま れ て い な い こ とを,

GLC法 に て 既 知 の マ ン ナ ン と 同 じretention

timeの 単 一 のpeakを 示 す こ と,す なわ ち,man-

noseの み よ り成 る こ とを 確 認 した.

(2) 特 異 抗 体 の 作 製

臨 床 検 体 よ り分離 され たC.albicans株 を そ

れ ぞ れ別 々 にSDBに て30℃,48時 間 振 盪 培 養 し,

10%formalinに て 殺 菌 後,phosphate buffer

saline(以 下PBS)に て3回 洗 浄 し,生 食 に て 約

108/mlの 菌 体 浮 遊 液 を作 製 し,5羽 の 雄 のNew-

zeeland white rabbits(体 重 約3kg)に,別 々 に

1回1mlを 週2回,計5週 間 静 注 を1ク ール と し

て2ク ー ル反 復 した.こ の 間,カ ン ジ ダ菌 体 の 直

接 凝集 法 に て 凝 集 価 を測 定 し,最 も抗 体 価 の 高 い

も の を使 用 した.(最 大 凝 集 価1024倍),特 異 抗 体

のIgG分 画 の精 製 は,1/3飽 和 硫 安 塩 析 後,DEAE

cellulose column chromatographyに て 行 な い

PBSに て蛋 白濃 度 を7mg/mlに 調 整 した.

精 製 した 特 異 抗 体 は,免 疫 電 気 泳 動 法 に て正 常

家 兎IgG分 画 と同一 の 沈 降 線 の み を形 成 した.ま

た,免 疫 拡 散 法 で,抗 家 兎IgG抗 体 及 び,抗 家 兎

Fig. 1 Procedure of Candida mannan antigen

preparation.

グ ロ ブ リ ン抗 体 と単 一 の 沈 降 線 を 形 成 す る こ と

と,精 製 カ ン ジ ダ マ ンナ ン抗 原 及 び,Candida培

養 上 清 と単 一 で 同一 の 沈 降 線 を 形 成 す る こ とを確

認 した.

(3) Biotin特 異 抗 体 複 合 体 の 作 製 法18)

特 異IgG抗 体 を0.1MNaHCO3(pH8.2-8.6)

で 透 析 し,0.1M NaHCO3で 蛋 白濃 度 を1.0mg/

mlに 調 整す る.biotin succinate ester (SIGMA

社 製)をdimetyl sulfoxideに 溶 解 し1.0mg/mlに

調 整 蛋 白溶 液1mlに 対 して120μlを 加 え,ゆ っ く

り と覚 拌 し,室 温 で4時 間 静 置 後PBSに て 一 晩

338 感染症学雑誌 第60巻 第4号

透 析 した.

(4) Avidin-Alkalinephosphatase複 合 体 の 作

製 法19)

卵 白 由来 のavidin (Sigma社 製)2mgをPBS1

mlに 溶 解 し,こ れ を 沈 殿 状 のalkalinephospha-

tase type VII (Sigma社 製,以 下ALP)5mgに 加

え,室 温 で 撹 拌 溶 解 後,た だ ち にPBSで4℃ 一 晩

透 析 した.透 析 内 液1mlに 対 し て25%glutalalde-

hydeを8μl加 え 室 温 で2時 間 反 応 さ せ,そ の 後

PBSで4℃ 一晩 透 析 し,さ ら に 透 析 液 を0.05M

Tris buffer (pH7.5)に 変 え,4℃ 一 晩 透 析 した.

最 終 的 に は1%bovin serum albumin(以 下BSA)

加0.05M Tris bufferで 計4mlに 調 整 し,0.02%

NaN3を 加 え遮 光 し4℃ で保 存 した.

5) Biotin特 異 抗 体 複 合 体 とAvidin-ALPの 至

適 希 釈 濃 度 の検 討

Biotin特 異 抗 体 複 合 体 を1%BSA加PBSに

て,200倍,400倍,800倍 に,avindin-ALPをPBS

で,500倍,1,000倍,2,000倍,4,000倍 に希 釈 し,

そ れ ぞ れ の組 み 合 わ せ につ きnegative controlと

positive controlを お き,以 下 に示 すELISA法 で

の比 が 最 も大 き くな る希 釈 濃 度 を 検 討 した.そ の

結 果,biotin特 異 抗 体 復 合 体 を400倍,avidin-ALP

を1,000倍 希 釈 した と き最 も よ い感 度 が 得 られ た.

(b) 被 検 血 清 の前 処 理14)

被 検 血 清 を1:4で0.05%Tween20加PBS(以

下PBS-T)に て希 釈 し,そ の0.1容 量 のNa2EDTA

を 加 え121℃ で5分 間autoclave処 理 し,10,000

rpmで15分 間 遠 沈 し,上 清 を 検 体 と した.

(7) Avidin-Biotin系 を 用 い たELISA法 の 実

際

polystyrene microtiter tray (Nunc社 製)に,

特 異 抗 体(7mg/ml)をsodiumbicar bonate buffer

(pH9.6)で1:500に 希 釈 し,各wellに125μlず

つ 分 注 し,4℃ 一 晩 静 置 した.使 用 前 にPBS2Tに

て5回 洗 浄 した.以 下 同様 に 各 反 応 の後 に 洗 浄 し

た.ま た,以 下 の 各 反 応 時 間 は,後 に示 す 方 法 で

検 討 した 結 果 最 も適 切 で あ る と考 え られ る も の を

用 い た.

第1反 応

加 熱 処 理 した 血 清 をtriplicateで 各wellに100

μlず つ 分 注 し,室 温 で2時 間 静 置 した.

第2反 応

同 様 に 洗 浄 後,biotin特 異 抗 体 複 合 体 を1%

BSA加PBSで1:400に 希 釈 し,各wellに100μl

ず つ 分 注 し,37℃,1時 間 反 応 させ た.

第3反 応

同 様 に 洗 浄 後,avidin-ALPをPBSに て1:

1000に 希 釈 し,各wellに100μlず つ 分 注 し,37℃,

30分 間 反 応 させ た.

第4反 応

同様 に洗 浄 後,基 質(p-nitrophenyl phosphate,

Sigma社 製)をdiethanolamine bufferに1mg/ml

の 濃 度 で 溶 解 した も の を 各wellに100μlず つ 加

え一,室 温,30分 間 反 応,発 色 さ せ,そ の 後,3N

NaOHを50μlず つ 各wellに 加 え反 応 を停 止 させ

た.最 後 にDinatech micro ELISA reader

(Dinatech社 製)で405nmの 波 長 で 吸 光 度 を 測 定

した.検 体 測 定 時 は,毎 回 精 製 マ ン ナ ンを 正 常 人

プ ー ル 血 清 に 加 え て 作 った 標 準 液 を 同 時 に 測 定

し,標 準 曲線 を作 製 した.controlは,five points

で 同時 に 測 定 し,そ のmean+3SD以 上 で しか も

inhibition assayで50%以 上inhibitionさ れ る も

の を陽 性 と した.手 技 の ま とめ をFig.2に 示 す.

(8) ELISA法 の 各 反 応 に お け る至 適 時 間 の 検

討

上 記 に示 したELISA法 の 各 反 応 に お け る至 適

時 間 に つ い て は,第1反 応 を 室 温 で,60分,120分,

180分,第2反 応 を37℃ で,30分,60分,90分,第

3反 応 を37℃ で,15分,30分,60分 に つ き検 討 し

た.そ の 結 果,そ れ ぞ れ,120分,60分,30分 が反

応 の 最 大 を示 し,感 度 も この 組 み 合 わ せ が 最 も優

れ て い た.

(9) マ ウ ス の 感 染 実 験

4週 齢 の マ ウス(体 重 約20g)に,人 肝 膿 瘍 由来

のC.albicans N508株 の5×105個 を 尾 静 脈 よ り

静 注 し,静 注 後,翌 日 よ り連 日7日 間,3匹 か ら

5匹 ず つ 心 腔 穿 刺 に て 採 血 後 屠 殺 し,血 液 培 養,

各 組 織 か ら の逆 培 養,病 理 組 織 とELISA法 に よ

る血 中 カ ン ジ ダ抗 原 濃 度 に つ き検 討 した.血 液 は,

採 血 後 凝 固 させ 遠 沈 分 離 し,測 定 す る ま で の 間

-20℃ に て 凍 結 保 存 し た.血 液 培 養 は,一 部 を

昭和61年4月20日 339

Fig. 2 ELISA for Candida albicans antigen detec-

tion using Avidin-Biotin system

Specific IgG Ab

Candida Ag (Sample)

Biotin- Specific IgG Ab Complex

Avidin-ALP Conjugate

Substrate

Sabouraud dextrose agar (以 下SDA)に 直 接 塗

布 し,一 部 はSDBに て7日 間 増 菌 後SDAに 塗 布

し,そ れ ぞ れ30℃4週 間 観 察 した.組 織 の 逆 培 養

は,各 臓 器 の一 部 をSDAで 同様 に30℃,4週 間 培

養 した.組 織 標 本 は,各 臓 器 に つ きhematoxylin-

eosin(HE染 色)及 びperiodic acid-Schiff reac-

tion (PAS染 色)標 本 を 作 製 し,病 変 面 積 を測 定

し,血 中 カ ン ジ ダ抗 原 濃 度 との相 関 の 有 無 に つ き

検 討 した.

結 果

1) 検 出感 度

Five pointsで 測 定 し たnegative controlの

mean+3SD以 上 で,inhibition assayで50%以 上

inhibitionさ れ る もの を陽 性 と した.Fig.3は,自

家 製 特 異 抗 体 に お け るavidin-biotin系 を 用 い る

方 法 と,従 来 のELINA法 との比 較 を 示 し,Fig.4

は,avidinbiotin系 を 用 い た場 合 の検 体 の 加 熱 処

理 の 有 無 に よ る比 較 で あ る.Avidin-Biotin系 を

Fig. 3 Standard curves and sensitivity for Can-

dida albicans mannan using ELISA

Fig. 4 Standard curves and sensitivity for Can-

dida albicans mannan using ELISA with avidin-

biotin system

用いることと加熱処理を加えることにより,大 幅

に検 出感度が改善 され検 出感度 は1.2ng/mlと

なった.図 には示 さないが,PBSに 精製マンナン

を加えて測定 した場合の検出限界は0.25ng/ml

であ り,血 清をPBS-Tで1:4に 希釈 してある

340 感染症学雑誌 第60巻 第4号

ことを考慮に入れると,加 熱処理を加えることに

よりbuffer内 とほぼ同じ検 出感度が得 られ るこ

とになる.

(2) 特異性の検討

作製した特異抗体の特異性を確認す る目的で,

Candida属6種 (C. tropicalis, C. guilliermondii,

C. stellatoidea, C. krusei, C. parapsilosis, C. psedo-

tropicalis), Aspergillus fumigatus, Cryptococcus

neoformans と細菌11種 (Branhamella catarrhalis,

Enterobacter cloacae, Escherichia coli NIHJ,

Haemophilus influenzae type b, Klebsiella pne-

moniae, Staphylococcus aureus 209P, Streptococ-

cus pneumoniae, Streptococcus agalactiae (GBS),

Streptococcus pyogenes, Streptococcus sanguis,

Pseudomonas aeruginosa) につき,そ の培養上清

及び菌体浮遊液を検体として,ELISA法 にて特異

抗体 との交叉反応の有無につ き検討 した.そ の結

果, C. tropicalis, C. guilliermondii, C.stellatoidea

は,ほ ぼ100%の 交叉を示 したが,そ の他には認め

られなかった.

さらに,一 定濃度(100ng/ml)の マンナン抗原

に段階希釈 した特異抗体を加 え反応 させたものを

検体 とし,同 様のELISA法 で測定 したinhibition

assayで は,抗体の濃度に比例 して%inhibitionが

増加することが認められ,作 製した抗体の特異性

が確認された(Fig.5).

また,false positiveの 有無につ き,主 にてんか

んで外来治療を受けている2歳 から15歳 までの患

児30名 と,臨 床的にsystemic candidiasisを 疑が

わせ る症状のない口腔内カンジダ症及び糞便中よ

りCandidaの 検 出された15名 の入院患児の血清

につ き検討したが,い ずれも検出限界以下であっ

た.

(3) マウスの感染実験結果

Table1に マウス全例の各種培養結果 とELISA

法による血中カンジダ抗原濃度を示す.静 注後 日

数が経過するにつれてCandidaの 検 出部位が減

少している.肝 臓,脾 臓,腎 臓は,ほ とんどのマ

ウスで培養陽性であるが,血 液培養は1例 を除き

陰性であった.

Fig.6は,Candidaで 静注後の各病 日における

Fig. 5 Assay of ELISA-neutralizing activity of

antisera to standard mannan.

Fig. 6 Serum Candida antigen concentration in

mice with experimental systemic cadidiasis

detected by ELISA with avidin-biotin system

それぞれのマウスの血中カンジダ抗原濃度 と,各

病 日における平均値を示す.2日 目をpeakと し

て,血 液培養陰性にもかかわ らず検出されている

例が多いが,病 日が進むにつれて検出感度以下 と

昭和61年4月20日 341

Table 1 Recovery of C. albicans from visceral organs and blood, and serum

antigen concentration detected by ELISA with avidin-biotin system for Candida

antigen in mice with experimental systemic cadidiasis

なるマウスが増加している.

各マウスの病理組織を検討 し,各 組織における

病変の広が りと血中ガンジダ抗原濃度 との関係を

検討した.Fig.7-aは,腎 皮質における膿瘍の面積

と血中カンジダ抗原濃度 との関係を,Fig.7-bは,

全組織における膿瘍面積 と血中カンジダ抗原濃度

との 関 係 を示 す.そ れ ぞ れ相 関 係数0.744,

0.740(p<0.01)で,明 らかな相関が認められた.

ま た,図 に は示 さ な い が,全 組 織 に お け る 肉芽 腫

性 病 変 面 積 を含 め た 病 巣 全 体 の 面 積 と血 中 カ ン ジ

ダ抗 原 濃 度 との 間 に は,相 関 係 数0.227と 相 関 は認

め られ な か った.

考 案

近 年,compromised hostの 増 加 や,治 療 法 の 変

化 に伴 い,systemic candidiasisは 増 加 傾 向 を 示

し て い る.し か し,そ の 診 断 に 関 して は,Candida

342 感染症学雑誌 第60巻 第4号

Fig. 7-a Relationship between antigen concentra-

tion and area of abscess in renal cortex of mouse

Fig. 7-b Relationship between antigen concentra-

tion and area of abscess in total organs of mouse

が常 在 菌 で あ る こ と,血 液 培 養 の 検 出率 が 悪 い こ

と,特 異 抗 体 反 応 に 個 人 差 が あ る こ とな どか ら,

培 養 や 抗 体 測 定 に よ って 早 期 に 診 断 を確 定 す る こ

とは 困 難 で あ る.ま た,現 在,そ の治 療 法 と し て

最 も有 効 で あ るamphotericin Bは,腎 障 害 そ の

他 の 重 篤 な副 作 用 を お こす こ とが 知 られ て お り,

病 気 の 性 質 上,基 礎 疾 患 を有 す る患 者 が ほ と ん ど

で あ る こ とか ら も,そ の投 与 に 際 し て は慎 重 に な

らざ るを え な い の が 現 状 で あ る.以 上 の よ うな こ

とか ら,最 近 で は,systemic candidiasisの 早 期 診

断法 と して,種 々 の方 法 に よ るCandidaの 代 謝 産

物 や 抗 原 の 検 出 が 試 み られ て い る.

1974年,Millerら は,GLC法 を 使 用 し,カ ン ジ

ダ敗 血 症 や 内臓 カ ン ジ ダ症 の 患 者 血 清 中 に マ ン ナ

ン 由 来 の2つ の 異 常peakが あ る こ とを 認 め こ の

方 法 の 有 用 性 を初 め て 示 した.1979年,Kiehnら6)

は,同 様 の方 法 でsystemic candidiasis患 者 の血

清 中 に は,D-arabinitolが1μg/ml以 上 含 ま れ て

い る こ とが多 い と報 告 した.し か し,こ の2つ の

報 告 で は,腎 機 能 と の関 連 に つ い て の 検 討 が不 十

分 で あ った.1982年,Wongら7)8)は,arabinitol/

creatinin比 が,腎 機 能 と は 無 関 係 にsystemic

candidiasisに お い て は高 値 を 示 す と報 告 した.一

方,1984年,de Repentignyら17)は,家 兎 を 用 い た

実 験 よ り,cortisoneを 投 与 した 家 兎 で は,非 特 異

的 にD-arabinitolとmannoseが 高 値 を 示 す と

し,systemic candidiasis患 者 で は,基 礎 疾 患 の 性

格 上 ス テ ロイ ドの 使 用 例 が 多 い こ とか ら,GLC法

に よ るD-arabinitolとmannoseの 測 定 法 の 有 用

性 に 対 して 疑 問 を 投 げ か け て い る.

カ ン ジ ダ抗 原 検 出法 と して は,1976年,Weiner

がHAI法16),1979年,KerkerringがCIE法9),

1979年,WeinerがRIA法10)を 報 告 して い る が,

CIE法 とHAI法 は 感 度 の 点 で,RIA法 は 手 技 の

繁 雑 さ の点 で そ れ ぞ れ 難 点 が あ り,そ の 後 の検 討

は 少 な い.ELISA法 に 関 して は,良 好 な感 度 と簡

便 さの 点 か ら,今 ま で に 最 も多 くの 報 告 が な され

て い る.1977年Warrenら が 初 め て 実 験 的 致 死 的

カ ン ジ ダ 感 染 症 の マ ウ ス と家 兎,及 びsystemic

candidiasis患 者 か ら血 中 カ ン ジ ダ抗 原 の 検 出 に

成 功 した.し か し,検 体 と し て の血 清 に対 す る前

処 理 は な され て お らず,検 出感 度 に つ い て の 記 載

もな い.そ の 後,血 清 中 に 含 ま れ る抗 カ ン ジ ダ抗

体 を 中 心 とす る蛋 白成 分 が,抗 原 検 出 の障 害 因 子

で あ る と考 え られ る よ うに な り,種 々 の血 清 前 処

理 法 が 考 案 され た.1980年,Scheldら13)は 前 処 理

法 と して,56℃,30分 間 の 加 温 に よ り検 出 感 度 が

100ng/mlか ら1mg/mlへ と飛 躍 的 に 改 善 し た と

報 告 した.し か し,今 回,詳 細 に つ い て は 示 さ な

い が,私 た ち の 行 な った 追 試 で は,若 干 の 改 善 は

認 め られ る もの の,Scheldら の報 告 に示 され て い

る よ うな著 明 な改 善 は 認 め られ な か った.1981年,

Reissら は,血 清 にNa2EDTAを 加 え加 熱 す る方

法 と ア ル カ リ処 理 法 に つ き検 討 した 結 果,前 者 で,

検 出 感 度 の 増 強 を認 め る も の の,12.5ng/mlが 限

界 で あ る こ と,ま た,加 熱 す る こ と に よ り血 清 蛋

白が 凝 固 す るた め 上 清 を 取 り出 す の に血 清 必 要 量

が 多 くな る こ とな どを 報 告 した.1982年,Lewら

は,血 清 をPBS-Tで 希 釈 後,Na2EDTAを 加 え,

121℃5分 間 の加 熱 処 理 後,遠 沈 して 蛋 白 成 分 を 除

昭和61年4月20日 343

く こ とに よ り,著 しい 感 度 の増 強 を 認 め,buffer内

の 抗 原 を測 定 す る の と同 程 度 の感 度 が 得 られ る と

報 告 した.

一 方,卵 白中 に 含 まれ るavidinと ビ タ ミ ンH

で あ るbiotinと は 強 い 親 和 性 を 有 す る こ と か ら

免 疫 学 的 手 法 を用 い た 種 々 の検 査 法 に お い て,そ

の検 出感 度 を 高 め るた め に応 用 され て い る.1979

年 に は,Guesdonら20)がELISA法 に お い て の

avidin-biotin系 につ い て の 詳 細 な検 討 を 加 え一,抗

原 抗 体 反 応 自体 に は 直 接 的 に は ほ とん ど影 響 を 与

え る こ と な く検 出 感 度 を高 め る こ とが で き る と報

告 した.当 教 室 の難 波 ら も,avidin-biotin系 を 利

用 したELISA法 に お い て,単 純 ヘ ル ペ ス抗 原 の

検 出 を 試 み 良好 な結 果 を得 て い る21).

今 回,私 た ち は,血 清 の前 処 理 法 と してLewら14)

の 加 熱 処 理 法 を 用 い,さ ら にavidin-biotin系 を利

用 したELISA法 を 開 発 し,1.2ng/mlと 良 好 な検

出 感 度 を得 る こ とが で きた.現 在 ま で に調 べ え た

限 りで は,ELISA法 に よ る カ ン ジ ダ抗 原 検 出法 に

avidin-biotin系 を 用 い た と い う報 告 は 見 当 た ら

ず,私 た ち の 報 告 が 最 初 と思 わ れ る.従 来 報 告 さ

れ て い るsystemic candidiasisに お け る血 中 カ ン

ジ ダ 抗 原 濃 度 は,0.5ng/mlか ら1000ng/ml以 上

とさ れ て お り,標 準 マ ン ナ ン抗 原 の作 製 法 に 若 干

の違 い が あ る こ とを 考 慮 に 入 れ て も,こ の 方 法 は

十 分 臨 床 応 用 可 能 と考 え られ る.し か し,マ ウ ス

の感 染 実 験 に よ る組 織 学 的 検 討 の結 果 か ら,syste-

mic candidiasisが 存 在 し て い て も,そ の 病 巣 が

膿 瘍 か ら肉芽 腫 に置 き換 った 時期 で は,false nega-

tiveと な る可 能 性 が考 え られ る.し た が っ て,本

法 に お け る診 断 率 を 高 め るた め に は,検 体 採 取 の

時 期 が 重 要 で あ り,臨 床 症 状 か らsystemic can-

didiasisが 疑 わ れ た 場 合 に は,早 期 よ り連 続 して

検 索 を 行 うこ とが 重 要 で あ る と思 わ れ る.

現 在,家 兎 を用 い た 感 染 実 験,及 び,臨 床 例 に

つ き検 討 中 で あ り,後 日報 告 す る予 定 で あ る.

本論文 の要 旨は,1984年11月,第33回 日本感染症学会東

日本地方会で報告 した.

終わ りに,御 校閲をいただいた千葉大学医学部小児科中

島博徳教授 に深謝いたします.

また,Candidaな ど臨床分離を分与いただいた当院細菌

検査部に深謝致 します.

文 献

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Detection of Serum Candida Antigen by an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay with Avidin-Biotin System

•\(1) Method and Basic Studies•\

Hiroshi SUZUKI & Akira NAKAMURA Department of Pediatrics, School of Medicine, Chiba University

Hideaki TAGUCHI, Kazuko NISHIMURA & Makoto MIYAJI Department of Pathogenic Fungi, Research Institute for Chemobiodynamics, Chiba University

For the early diagnosis of systemic candidiasis which has been increasing in recent years, we developed an enzyme-linked immunosorbent assay with avidin-biotin system (A-B ELISA) to detect serum Candida antigen. A-B ELISA was evaluated in murine systemic candidiasis.

A-B ELISA detected purified C. albicans mannan with a sensitivity of 1.2 ng/ml inpooled human sera, and 0.25 ng/ml in PBS. Except for C. tropicalis C. guilliermondii and C. stellatoidea, no cross reactivities were seen with a variety of other fungal and bacterial antigen preparations. Anti C. albicans antibody which was used in this method was shown a specific binding to purified Candida mannan by ELISA inhibition technique.

In experimental systemic candidiasis of mice, serum Candida antigen was positive in 14 of 26 mice, but blood culutre was negative except for one. There was a relationship between serum antigen con-centration and an area of abscesses in renal cortex and total organs of infected mouse. On the other hand, even if the foci had developed in large area, Candida antigen was not detected when the lesion had been transformed from abscess to granuloma. Therefore it is important for the diagnosis of systemic can-didasis when the sample should be taken.

These results suggest that A-B ELISA to detect Candida mannan antigen is an useful method for diagnosis of systemic candidiasis because of its simple and timesaving feature and high sensitivity .