アビジン金ナノ粒子を用いた分子間相互作用の赤外分光分析

生命情報工学第2講座

吉田敏研究室 竹森慶之助

緒言 streptavidin結合型金ナノ粒子

（gold-avidin）は、近年バイオテクノロジー分野においてその利用価値に注目を集めている。

gold-avidinの赤外スペクトルは、金ナノ粒子（コロイド；上図）表面の赤外吸収増強効果のために、金との結合部位周辺にあるavidin蛋白分子が非常に高感度に測定することができる 。

表面増強赤外分光（Surface-Enhanced Infrared Absorpotion Spectroscopy; SEIRAS）

•赤外光と金属微粒子および吸着分子の相互作用により、吸着分子の吸収が飛躍的に増大•金属結合部位のみが選択的にスペクトルを測定できる（金属から離れた部位の増強効果は急激に減少するため）

実験の目的

高感度高選択的な赤外分光分析にgold-avidinを利用するための基礎的研究として、10nmサイズのgold-avidinとbiotinの結合した様々な物質（biotin-oligo-dT、-IgM、-protein L）とを反応させ、gold-avidinの赤外吸収にどのような変化が起こるかを調べた。

実験方法及びgold-avidinの赤外吸光スペクトル

gold-avidin（原液18.0

μl/ml）の250倍希釈および、混合する希釈試料を作成

当量ずつ混合してサンプルを作成

1時間反応

サンプル0.3μｌをFTIRに載せ、ドライヤーで乾燥

4cm-1分解能64回積算で、赤外吸光スペクトルを測定

1サンプルあたり2回測定

上記の操作を3回行う再現性の観測

absorbance/wavenumber(cm-1)

gold-avidinと反応させた試料の種類 biotin-oligo-dT

streptavidin１分子あたり4分子のbiotinと結合できる（約1285Da）

-IgM

5個のサブユニットから構成された巨大な免疫グロブリン（約900kDa）

molar ratio=4～6 moles biotin/mol IgM

-protein L

全てのIgクラスでの結合が認められる免疫グロブリン結合型タンパク質（約95kDa）

molar ratio=7moles biotin/mol protein L

結果①gold-avidinと結合させたbiotin-dT量とピーク比との相関関係

gold-avidin１モルあたりbiotin-dTが1～6モル結合するにつれ、ピーク比は上昇あるいは低下を繰り返す

gold-avidin binding biotin-dT

0

1

23

4

5

6

3

3.2

3.4

3.6

3.8

4

4.2

4.4

0 1 2 3 4 5 6 7

biotin-dT/gold-avidin（mol比）

ピー

ク比

（3350cm

-1/2880cm

-1）

◎streptavidin１モルにbiotin1モルが結合すると、biotin結合物質が立体障害となり、他のavidin-biotinの結合を阻害する

結果②gold-avidinと結合させたIgM量とピーク比との相関関係

⇒biotin結合物質の分子量の大きさに由来

biotin-dTとは異なり、最初にピーク比が低下

gold-avidin binding Anti Ms IgM Ig

01 2

46

810

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 2 4 6 8 10

Anti Ms IgM Ig/gold-avidin（mol比）

ピー

ク比

(3350cm

-1/2940cm

-1）

◎biotin結合物質そのものが巨大である場合、最初からavidin-biotin

結合を阻害するようにbiotin結合物質が働く 。

結果③gold-avidinと結合させたprotein L量とピーク比との相関関係

gold-avidin binding protein L(mol比0～1）

0.01 0.0250.05

0.075

0.1

0.25

0.5

0.75

1

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

3.6

0.01 0.1 1

protein L/gold-avidin(mol比)

ピー

ク比

（3350cm

-1/2940cm

-1）

0

ピーク比の変動の

振幅およびバラつき度が大きい

↓

なぜスペクトルが不安定なのか？？

結果③補足実験

反応後、一定時間内におけるピーク比の変化を測定

↓

gold-avidinのピーク比の時間変化

37 20

25

31

37

39

45

49 5457

60

3

7

2632

3539 42 45 48

5256

2810 15

201714

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 10 20 30 40 50 60 70

調製後経過時間(min)

ピー

ク比

(3350cm

-1/2940cm

-1)

prptein L/gold-avidin=0.5（mol比）

prptein L/gold-avidin=0（mol比）

biotinの結合している時の方が、バラつき度が大きい

◎biotinのgold-avidinとの結合により、gold-avidin結合or金コロイドが不安定化し、avidinの赤外スペクトル自体が不安定化

結論 分子量の大きいbiotin結合物質物質がgold-avidin

と結合すると、gold-avidin結合or金コロイド自体を不安定化させている可能性

biotin1分子がstreptavidin１分子に結合した時、結合した分子自体が立体障害となり、他のavidin-biotin結合への阻害剤として働く可能性

biotin結合物質が大きい場合、その大きさ自身が立体障害となってavidin-biotin結合を阻害する可能性