axón de jibia 15 de abril de 2010 cursos_2010 fisiologÍa general
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Axón de jibia
15 de abril de 2010
http://einstein.ciencias.uchile.clCURSOS_2010 FISIOLOGÍA GENERAL
Eliminando la variable espacio
Alambre axial
La placa de tierra asegura que la resistencia del medio externo sea muy chica. Ro = 0
El alambre axial asegura que la resistencia del medio interno sea muy chica. Ri = 0.
oi
m
RRR
2
¿Qué valor toma la constante de espacio?
Vm
Electrodo que mide potencial
Space clamp
Vm
Generador de corriente
El potencial de acción no se propaga. Se llama potencial de acción de membrana.
A todo lo largo del axón pasa exactamente lo mismo, esto simplifica el análisis. Desaparece la variable espacio (Space clamp).
Space clamp
Vm
Generador de corriente
Pero si queremos medir en forma correcta el potencial de membrana tenemos un problema porque mientras esté circulado corriente por el electrodo de tierra no sabemos el potencial eléctrico en la superficie externa de la membrana.
Necesitamos otro electrodo para medir el potencial extracelular.
Potencial de acción de membrana
Potencial de acción de membrana
1Vs2008.0
150 msmV
dtdV
26 Acm 20010200 dtdV
cII KNa
dt
dVCIII m
NaKm dt
dVCII m
NaK 0
Vi, mV
IIones, mAcm-2
t, ms
Intensidad de las corrientes iónicas
dt
dVCII m
NaK
Potencial eléctrico intracelular
IIones, mAcm-2I R
V = 0
V = 0-IR
Electrodo de tierra
Superficie de la membrana
Vi, mV
RoIIones, Vo, mV
t, ms
t, ms
Potencial eléctrico intracelular
Potencial eléctrico extracelular
El potencial de acción aparece en el medio extracelular cono una espiga negativa y de pequeña amplitud. Esta es la base de los registros extracelulares de la actividad neuronal.
Space clamp
Vm
Generador de corriente
Ve
Vi
Ve
Vi, mV
Ve, mV
t, ms
t, ms
Medida de Vm
Medida de Vm
Vi
Ve
R R
0 V
RVi /0 RVo /0
-Vi
Ver en einstein.ciencias.chile.cl Fisiologia General 2008, Lecturas,Circuitos con amplificadores operacionales.
RVe /
Medida de Vm
Vi (t)
Ve (t)
R R
-Vi
R R
0 V
RVi /
Vi -Ve R
Vm
? RVo /0
Current clamp
Vm
Generador de corriente
Con este circuito puedo controlar la corriente y medir el potencial. Current clamp.
Vm
Con este circuito puedo controlar el potencial. ¿Cómo podría medir la corriente?
Vcomando
El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.
Voltage clamp
Vm
Con este circuito puedo controlar el potencial y medir la intensidad de la corriente. Voltage clamp.
VcomandoRf
-IRf
Voltage clamp
El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.
Vm
Con este circuito puedo controlar el potencial y medir la intensidad de la corriente. Voltage clamp.
VcomandoRf
-IRf
Voltage clamp
El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.
Cim III
Extracelular
Intracelular
Vm
Rm
Vr
Cm
Im
Ii IC
dt
dVC
R
VVI m
m
rmm
Vm
Tiempo
Im
Vr
Voltage clamp de un circuito pasivo
Cim III
dt
dVC
R
VVI m
m
rmm
Vm
Tiempo
Im
Vr
Voltage clamp de un circuito pasivo
Extracelular
Intracelular
Rm
Vr
Cm
Im
Ii IC
Cim III
Vm
TiempoIm
Vr
Eliminando la corriente capacitiva
dt
dVC
R
VVI m
m
rmm
XX
Extracelular
Intracelular
Rm
Vr
Cm
Im
Ii IC
Vm
Vcomando
Rf
V0 = -IiRf
Voltage clamp, resta de la corriente capacitiva
R R
-Vcomando
Cm
dtdV
CI mmi
dtdV
C mm
iI0 V
Ajustar hasta que se cancele la corriente capacitiva
iI
I, mA/cm2
t, ms
Voltage clamp de un axón de jibia
NaNaNaKKKm gpNgpNI 5494
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494
-60,8mV0mV
)0()0( NaNaKKm VGVGI
dt
dVCVVGVVGI m
NamNaKmKm )()(
I, mA/cm2
t, ms
-60,8mV0mV
Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494 KtVKKK gpNI ),(94
Control
TTX
I, mA/cm2
t, ms
-60,8mV0mV
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494
La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.
KtVKKK gpNI ),(94NatVNaNaNa gpNI ),(54
Canales de potasio del axón de jibia
Pulso -120 a 100 mV
Vm
El curso temporal del desarrollo de la corriente de potasio no sigue un curso exponencial.
Para estudiar la relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana se mide a diferentes potenciales.
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-150 -100 -50 0 50 100 150
Conductancia GK?
)( KmKK VVGI
Potencial de inversión, VK?
Vm, mV
I K, m
A c
m-2
Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.
y = 0.0434x + 1.6983
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-150 -100 -50 0 50 100 150
Conductancia GK?
)( KmKK VVGI
Potencial de inversión, VK?
?Vm, mV
I K, m
A c
m-2
-39.1 mV
GK = 43.4 mS cm-2
VK = -39.1 mV
Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.
y = 0.0434x + 1.6983
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-150 -100 -50 0 50 100 150
Conductancia GK?
)( KmKK VVGI
Potencial de inversión, VK?
?Vm, mV
I K, m
A c
m-2
-39.1 mV
GK = 43.4 mS cm-2
VK = -39.1 mV
Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-150 -100 -50 0 50 100 150
Conductancia GK?
)( KmKK VVGI
Potencial de inversión, VK?
Vm, mV
I K, m
A c
m-2
Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.
Estrategia para buscar el potencial de inversión VK.
Sospecha: VK = -94 mV
Problema: alrededor de -94 mV no se registra inversión de la corriente. ¿Por qué?Porque los canales están cerrados a -94 mV.
Solución: 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.
Vm, mV
IK,
mA
/cm
2
Prepulso constante
Pulso de prueba variable
Vm
1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.
VK = -73,4 mV
Sorpresa: El valor encontrado, -74 mV es menos negativo que el esperado según Nernst (-94mV).
Una explicación posible: los canales de K no son idealmente selectivos: pasa algo de Na.
Tarea: Calcular GK/GNa para estos canales
VK = -73,4 mV
El potencial de reposo es -60 mV, los potenciales de inversión de las corrientes de potasio y leak son -73 y -50 mV respectivamente. Calcule la razón GK/GLeak para el potencial de reposo.
Vm, mV
IK,
mA
/cm
2
VK=-73.4 mV
)( KmKK VVGI
VK=-73.4 mV
)( KmKK VVGI
Km
KK VV
IG
Vm, mV
IK,
mA
/cm
2
AVISO:SEMINARIOS DE ESTUDIANTES
Forme un grupo de tres estudiantes para la presentación de su seminario.
Cada grupo debe mandar una carta a [email protected] declarando el artículo escogido, los integrantes del grupo, y la dirección electrónica de contacto del grupo.
Antes de elegir el paper, revise en la página del curso ( http://cursos.ciencias.uchile.cl ) el archivo LISTA DE PAPERS PARA SEMINARIOS, en que están indicados los papers ya seleccionados y aquellos aún disponibles.
En la página del curso ( http://cursos.ciencias.uchile.cl ) hay una carpeta que contiene las versiones PDF de todos los papers para seminarios.
Si Ud. encontrara un paper que le interese y que no esté incluido en la lista, puede proponérselo al coordinador del curso y será incorporado si se considera adecuado.
Espere confirmación a vuelta de correo.19 de Abril de 2010
19 de Abril de 2010
Continuación de la clase de canales de potasio del axón de jibia.
Prepulso -100 a 200 mV
Pulse de prueba -100mV
La conductancia se puede medir de la intensidad de la corriente instantánea de la cola, dividida por el potencial del pulso de prueba menos el potencial de inversión de la corriente.
Determinación de la conductancia del potasio a partir de la intensidad instantánea de la corriente de cola.
100
100@,
K
KK V
IG
100mV- a medida mA/cm 939.0 2KmaxI
Scm 0.0353 mV 4.73100
mA/cm 939.0 2-2
KKmax NgG mScm 35.3 -2KmaxG
Intensidad instantánea de la corriente de cola medida a -100 mV después de prepulsos de diferentes voltajes.
)-V(VpgNI KmVKkKK ),( ),(),(
max,
VKKK
VKKK
K
K pgN
pgN
I
I
Kp
NB. Para sacar pK(v,) del análisis de las corrinentes de cola, no hace falta conocer el potencial de inversión de la corriente.
pK(v,) es la probabilidad de encontrar abierto el canal de potasio, al potencial del prepulso, y en estado estacionario.
Los canales de K son tetrámeros.
Cada monómero tiene su propio sensor de potencial: es el segmento S4 que tiene varios residuos de arginina.
Los sensores de potencial tiene dos estados: reposo y activo
Los sensores de potencial operan en forma independiente.
El canal se abre sólo cuando los cuatro sensores de potencial están activos.
Sea n la probabilidad de encontrar un sensor activo
La probabilidad de encontrar un canal abierto es... n4
KmKK -VVnNgI 4
KmKK -VVnNgI 4 4n
I
I
Kmax
K
NB. n es función del voltaje y del tiempo. n sólo es función del voltaje. Es el valor de n en estado estacionario: cuando se aplica un potencial por mucho tiempo.
4n
4
maxII
KmKK -VVnNgI 4 4nII
Kmax
K
n
KmKK -VVnNgI 4 4nII
Kmax
K
RT
VVzF m
e
n0
1
1
V0 = -46 mVz = 1.4
)-V(VnNgI KmKK4 4n
II
Kmax
K
RT
VVzF m
e
n0
1
1
V0 = -47 mVz = 1.8
Errores pesados por 1/n
n
)-V(VnNgI KmKK4 4n
II
Kmax
K
RT
VVzF m
e
n0
1
1
V0 = -48 mVz = 1.2
Errores pesados por n
La curva n vs Vm no se ajusta bien a una función de Boltzmann.
n
Cinética
ntennntn /)()0()()( KmKK -VVnNgI 4
KmKK -VVtnNgtI 4)()(
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
Caso n(0)=0, el curso temporal de la corriente es sigmoideo
Kmt
KK -VVenNgtI n4/4 1)()(
Caso n(∞)=0, el curso temporal de la corriente es exponencial
Kmt
KK -VVenNgtI n/44)0()(
Vm-140mV
0 mV -100mV
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
Determinación de n.
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
Paso desde -140 mV a 0 mV Paso desde 0 mV a -100 mV
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
= 1.8 ms
Paso desde -140 mV a 0 mV Paso desde 0 mV a -100 mV
= 1.8 ms = 4.7 ms
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
Paso desde -140 mV a 0 mV Paso desde 0 mV a -100 mV
La constante de relajación n en función del potencial
RTVVxzF me /)(0
0
RTVmVxzFRTVmVzFx ee /)0(/)0()1(0
1
RTVVzFx me /)(10
0
RTVmVzFRTVmVzF ee 2/)0(2/)0(0
1
0
0
22/)(sech
RTVVzF m
xx eex
2sech
Para el caso x = 0.5
0
0
22/)(sech
RTVVzF m 6)( Vo75Vo083.012/10
2.1z
0
0
22/)(sech
RTVVzF m 6)( Vo75Vo083.012/10
2.1z
0
0
22/)(sech
RTVVzF m 5.78Vo088.00
1.1z
La curva n vs Vm no se ajusta bien a una función secante hiperbólica.
Cálculo de a y b a partir de Po() y t
)(Po
1
)(Po
)(1 Po
1
5001.0
10
50
mVm
n
e
V80
60
125.0mV
n e
ms-1
n n
Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley 1952. Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.
Calcule n para el límite Vm-50 mV
Ngk = 35.3 mS/cm2 VK = -73,4 mV
Descripción completa de los canales de K del axón de jibia
nn
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
1
5001.0
10
50
mVm
n
e
V80
60
125.0mV
n e
nnn
1
nn
nn
Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 5 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.
Calcular la fracción de canales de potasio abiertos si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV.
Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 1 ms de repolarizar desde 0 mV a -60 mV.
Canales de sodio del axón de jibia
I, mA/cm2
t, ms
-60,8mV0mV
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494
La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.
KtVKKK gpNI ),(94NatVNaNaNa gpNI ),(54
-60 mV
0 mVVm
La corriente de Na presenta inactivación
Con el uso de TTX se puede aislar la fracción de la corriente llevada por los canales de sodio.
-60 mV
0 mVVm
La corriente de Na presenta inactivación
30 mV
Procedimiento para demostrar que los canales de sodio cumplen la ley de Ohm y encontrar el potencial de inversión de la corriente
VNa = 41.2 mV
Los canales de sodio cumplen la ley de Ohm
Sorpresa: El valor encontrado, 41 mV es menos positivo que el esperado según Nernst (54 mV).
Una explicación posible: los canales de Na no son idealmente selectivos.Calcule la razón GNa/GK para estos canales
Figure 13.29. Ball-and-Chain Model for Channel Inactivation. The inactivation domain, or "ball" (red), is tethered to the channel by a flexible "chain" (green). In the closed state, the ball is located in the cytosol. Depolarization opens the channel and creates a negatively charged binding site for the positively charged ball near the mouth of the pore. Movement of the ball into this site inactivates the channel by occluding it. [After C. M. Armstrong and F. Bezanilla. J. Gen. Physiol. 70(1977):567.]
El modelo de bola y cadena para la inactivación de los canales de sodio
Topología de un canal de sodio membrana
http://nerve.bsd.uchicago.edu/Na_chan.htm
Inactivation Gate
-60 mV
0 mV
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(
Tratando los axones con pronasa se puede estudiar la activación sin interferencia de la inactivación
-60 mV
0 mV
-40 mV
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(
Procedimiento para determinar la conductacia de los canales.
INa,max = -9.38 mAcm-2 a -40 mV
GNa,max = 116 mS cm-2
VNa = 41.2 mV
40
40max@,,
Na
NaNamaxNa V
INgG
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(
),( VNap
),(),(
VNa
NaNa
VNaNaNa
Na,max
Na pgN
pgN
I
I
La función pNa(V,) no se puede ajustar bien con una función de Boltzmann
-40 mV
0 mVVm
-60 mV
Cinética de la activación
x = 1Suma de cuadrados = 8.0
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x
Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(
La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial
elevada a la cuarta potencia.
x = 2Suma de cuadrados = 0.14
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x
Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(
La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial
elevada a la cuarta potencia.
x = 3Suma de cuadrados = 0.00
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x
Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(
La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. Lo simulamos usando una función exponencial elevada a la tercera potencia.
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa
ntemmmtm /)()0()()(
Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa
ntemmmtm /)()0()()(
Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.
m (0 mV) = 0.27 ms
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa
ntemmmtm /)()0()()(
Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.
m (0 mV) = 0.27 ms m (-40mV) = 0.48 ms
Tau m en función del voltaje
La curva n vs Vm no se ajusta bien a una función secante hiperbólica.
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(
),( VpNa
3)(tmpNa
Como ya sabemos la relación entre pNa y m podemos calcular de m(∞)
m()
3 ),( VpNa
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa
La curva m parece que se ajusta bien a una función de Boltzmann.
Como ya sabemos m y tau podemos calular alfa y beta
mmm
mm
mm
1
)(
m y m a diferentes voltajes
1
351.0
10
35
mV
mm
e
V
18
60
4mV
m e
Calcule m para el límite Vm -35 mV
Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley 1952. Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.
La inactivación.
NamNaNa VVhmNgtI 3)(
La variable h representa probabilidad de que los canales NO estén inactivados.Para h = 1 los canales no están inactivados.Para h = 0 los canales están inactivados
La probabilidad de encontrar un canal conduciendo es m3h
-60 mV0 mV
NamNaNa VVhmNgtI 3)(
Procedimiento para determinar h infinito en función del voltaje-
Potencial de mantención variable
Pulso de prueba fijo en 0 mV
Medir la corriente en el mínimo.
NamNaNa VVhmNgtI 3)(
NamNaNa VVhmNgtI 3)(
h()
hVVmNg
VVhmNg
I
I
NamNa
NamNa
Na,max
Na3
3
La curva h parece que se ajusta bien a una función de Boltzmann.
-100 mV
-60 mV -40 mV-60 mV
Determinación de h mediante ajuste de curvas al curso temporal de la corriente de sodio
NamNaNa VVhmNgtI 3)( ntemmmtm /)()0()()(
htehhhth /)()0()()(
-100 mV
-60 mV -40 mV-60 mV
h = 3.4 ms
NamNaNa VVhmNgtI 3)( ntemmmtm /)()0()()(
htehhhth /)()0()()(
-60 mV -60 mV
0 mV 0 mV
Procedimiento para determinar h midiendo el curso temporal del escape de la inactivación
Procedimiento para determinar h midiendo el curso temporal del escape de la inactivación
h = 8.2 ms
Procedimiento para determinar h midiendo el curso tempooral del escape de la inactivación
Tau h en función del voltaje
La curva h vs Vm no se ajusta bien a una función secante hiperbólica.
Como ya sabemos m y tau en función de Vm, podemos calcular alfa y beta
hhh
hh
hh
1
)(
20
60
07.0mV
h e
1
1
10
30
mVh
e
Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley 1952. Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
-150 -100 -50 0 50 100 150
)(3NamNaNaNa VVhmgNI
NNagNa = 120 mS/cm2
h
m
h, ms
m, ms
VNa = 41,1 mV
Vm, mV Vm, mV
Vm, mVVm, mV
Calcular la fracción de canales de sodio abiertos después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.
Calcular la fracción de canales de sodio inactivados si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 m.
Calcular la fracción de canales de sodio inactivados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.
Calcular la fracción de canales de sodio cerrados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.
Potencial de reposo, segunda visita
Vm
IK
INa
IL
IC
Im
CLNaKm IIIII En el potencial de reposo Im = 0 e IC = 0
LNaK III 0
Vm
IK
INa
IL
IC
Im
LrLNarNaKrK VVGVVhmGVVnG 3max4max0
La tarea ahora es buscar un Vr se satisfaga esta ecuación.
2-max
2-max
-2
mScm 0,3 -50.1mV
mScm 120 mV 41.1
mScm 36 -73.3mV
LL
NaNa
maxKK
GV
G V
GV
LNaK III 0
El problema lo puedo resolver porque conozco n, m y h en función de Vm.
Vm ,(mV)
h
m
n
Celda Objetivo
Celda a ajustar para que la celda objetivo sea cero Solver:
Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero.
Mapshow2010.xls
Solver:
Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero.
Este es el Potencial de Reposo.
El potencial de acción de membrana
Computación de la trayectoria
m
LNaKm
C
III
dt
dV
tdt
dVVtV m
mm )(
Vm, n, m y h son los valores iniciales de la trayectoria. Con estas corrientes se calcula la derivada dVm/dt
Ahora calculo el nuevo Vm
)(4KmKKK VVngNI
)(3NamNaNaNa VVhmgNI
)( LmLL VVGI
Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm a Vm(t) por t unidades de tiempo.
Computación de la trayectoria
m
LNaKm
C
III
dt
dV
tdt
dVVtV m
mm )(
Con estos nuevos valores de Vm, n, m y h y las ecuaciones de las corrientes calculo la derivada dVm/dt
Ahora calculo el nuevo Vm
Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm a Vm(t) por t unidades de tiempo.
Mostar Mapshow
Repito estos pasos para calcular toda la trayectoria de Vm(t)...
19 de Abril de 2010
Fin de la clase de canales de potasio del axón de jibia.