Az egér median raphe régió citoarchitektúrája

Doktori értekezés

Szőnyi András

Semmelweis Egyetem

Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Nyiri Gábor Ph.D., tudományos főmunkatárs

Hivatalos bírálók: Dr. Lőrincz Magor László, Ph.D., tudományos

főmunkatárs

Dr. Kovács Tibor, med. habil., Ph.D., egyetemi docens

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Ádám Veronika, az MTA tagja,

egyetemi tanár

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Rácz Bence, Ph.D., egyetemi docens

Dr. Tamás Gertrúd, Ph.D., egyetemi

adjunktus

Budapest

2018

2

Shiki soku zeku, ku soku zeshiki

________________

Az ürességből lesz a forma,

és a formából lesz az üresség.

3

I. TARTALOMJEGYZÉK

I. TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................... 3

II. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ..................................................................................... 5

III. ELŐSZÓ ..................................................................................................................... 8

IV. BEVEZETÉS ............................................................................................................. 9

IV.1. A median raphe régió funkcionális anatómiája ................................................... 9

IV.1.1. A median raphe anatómiai és szövettani leírása ........................................... 9

IV.1.2. A MRR szerotonerg sejtjeinek eredete és fejlődése – a PET-1 transzkripciós

faktor szerepe .......................................................................................................... 12

IV.1.3. A median raphe régió érett szerotonerg sejtjeinek heterogenitása .............. 15

IV.1.4. A median raphe régió hatása az előagyi hálózati aktivitásra ...................... 17

IV.1.5. A median raphe régió hatása a viselkedésre ............................................... 20

IV.2. Az egér hippokampusz funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása ........ 21

IV.2.1. A hippokampális működés modelljei – szerepe a deklaratív memóriában . 22

IV.2.2. A hippokampális működés modelljei – szerepe a térbeli memória

folyamataiban .......................................................................................................... 23

IV.2.3. A hippokampális formáció anatómiája ....................................................... 24

IV.2.4. A hippokampuszban található interneuronok ............................................. 28

IV.2.5. A hippokampális hálózati aktivitás mintázatok rövid összefoglalása ......... 32

IV.3 A mediális szeptum funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása .............. 33

IV.3.1. A mediális szeptum viselkedésben betöltött szerepe .................................. 33

IV.3.2. A mediális szeptum anatómiai viszonyai és sejtes felépítése ..................... 34

IV.3.3. A mediális szeptum hatása az előagyi aktivitás mintázatokra .................... 36

IV.4. A mediális prefrontális kéreg funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása

.................................................................................................................................... 39

IV.5. A hippokampusz, a mediális szeptum és a mediális prefrontális kéreg

összeköttetései ............................................................................................................ 41

IV.6. A median raphe régió vetítése az előagyi területekre ........................................ 42

IV.7. A szerotonerg és glutamaterg neurotranszmisszió molekuláris elemei ............. 43

IV.7.1. A szerotonerg neurotranszmisszió .............................................................. 43

IV.7.2. A glutamaterg neurotranszmisszió .............................................................. 45

V. CÉLKITŰZÉSEK ...................................................................................................... 49

VI. MÓDSZEREK ......................................................................................................... 51

VI.1. Etikai állásfoglalás ............................................................................................. 51

4

VI.2. Felhasznált kísérleti állatok ............................................................................... 51

VI.3. Sztereotaxiás műtétek, anterográd és retrográd pályajelölés ............................. 52

VI.4. Állatok kezelése, szövetek előkészítése a kísérletekhez.................................... 53

VI.5. Használt antitestek jellemzése ........................................................................... 54

VI.6 Fluoreszcens immunhisztokémia és konfokális lézer-pásztázó mikroszkópia ... 57

VI.7. Sztereológiai mérések ........................................................................................ 61

VI.8. Beágyazás előtti immunhisztokémia ................................................................. 62

VI.9. Elektronmikroszkópos mérések ......................................................................... 63

VII . EREDMÉNYEK .................................................................................................... 65

VII.1. A median raphe régió sejttípusai ...................................................................... 65

VII.2. Az ePet-pozitív sejtek eloszlása a median raphe régióban ............................... 72

VII.3. A median raphe régió sejtjeinek előagyi vetítési mintázata ............................. 73

VII.4. A median raphe régió sejtjei egyszerre több agyterületet is beidegeznek ........ 75

VII.5. A median raphe régió előagyban létrehozott szinapszisai NMDA-receptorokat

tartalmaznak ................................................................................................................ 80

VIII. MEGBESZÉLÉS ................................................................................................... 88

VIII.1. A median raphe régió sejtszintű felépítése ..................................................... 88

VIII.2. Az ePet nem specifikus a median raphe régió szerotonerg sejtjeire ............... 90

VIII.3. A median raphe régió 5HT-és/vagy vGluT3-tartalmú sejtjeinek jellemzése .. 92

VIII.4. A median raphe régióból felszálló pályát döntően glutamaterg rostok alkotják

.................................................................................................................................... 93

VIII.5. A glutamaterg és a szerotonerg neurotranszmisszió kapcsolódási pontjai ..... 94

IX. KÖVETKEZTETÉSEK ........................................................................................... 96

X. ÖSSZEFOGLALÁS .................................................................................................. 98

XI. IRODALOMJEGYZÉK ......................................................................................... 100

XII. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE .............................................................. 121

XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................. 123

5

II. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

10 kDa BDA – 10 kilodalton molekulatömegű biotinilált dextrán-amin

5-HIAA – 5-hidroxi-indolecetsav

5HT – szerotonin

5-HTP – 5-hidroxi-triptofán

ab – anguláris köteg

ACd – anterior cinguláris kéreg, dorzális rész

Acv – anterior cinguláris kéreg, ventrális rész

al – alveus

amg – amygdala

AADC – aromás aminosav dekarboxiláz

AC – adenilát-cikláz

acb – nucleus accumbens

AMPA - α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazol-propánsav

ATP – adenozin-trifoszfát

BSA-c/TBS – TBS-ben oldott Aurion BSA-c oldat

CA1,2,3 – cornu ammonis (ammonszarv) 1,2,3-mas régió

cAMP – ciklikus adenozin-monofoszfát

CB – calbindin

CCK – kolecisztokinin

Cer – kisagy

CTB – kolera-toxin B alegység

cx – agykéreg

DAG – diacil-glicerol

DG – gyrus dentatus

dt – dorzális talamusz

DRR – dorzális raphe régió

EAAT – serkentő aminosav-transzporter

EC – entorhinális kéreg

ePet – enhancer of PET-1

ETS – E26 traszformáció-specifikus domén

fi – fimbria

6

FG – FluoroGold retrográd pályajelölő anyag

FGF8 – fibroblaszt növekedési faktor 8

fr – fasciculus retroflexus

Fr2 – mediális precentrális terület

GABA – gamma-amino-vajsav

GABAA-R – A-típusú GABA receptor

gcl – stratum granulosum

Gln – glutamin

Glu – glutamát

hip – hippokampusz

HIPP – hippokampusz

hf – hippokampális hasadék

hyp – hipotalamusz

IG – induseum griseum

iGluR – ionotróp glutamát receptor

IL – infralimbikus kéreg

IP3 – inozitol-trifoszfát

is – isthmus

KO – génkiütött egértörzs (pl. PET-1 KO)

MAO-A – monoamin-oxidáz A

mGluR – metabotróp glutamát receptor

MS – mediális szeptum

ml – stratum moleculare

mlf – mediális előagyi köteg

mPFC – mediális prefrontális kéreg

MO – mediális orbitális kéreg

MR – median raphe

MRR – median raphe régió

NL2 – neuroligin 2

NMDA – N-metil-D-aszpartát

NMDA-R – NMDA-receptor

nNOS – neuronális nitrogén-monoxid-szintáz

7

ob – szaglógumó

OLM – oriens-lacunosum moleculare sejt

Para – parasubiculum

PB – foszfátpuffer

PC – foszfolipáz C

pcl – stratum pyramidale

PIP2 – foszfatidilinozitol 4,5-bifoszfát

pl – hilus

PL – prelimbikus kéreg

PMR – paramedian raphe

Pre – presubiculum

REM – rapid eye movement (alvási szakasz)

se – szeptum

SERT – szerotonin plazmamembrán transzporter

Shh – sonic hedgehog transzkripciós faktor

SNARE – vezikulaürülésben résztvevő fehérjék

sl – stratum lucidum

sl-m – stratum lacunosum-moleculare

so – stratum oriens

sr – stratum radiatum

Sub – subiculum

st – striatum

TB – tris puffer

TBS – tris pufferelt fiziológiás sóoldat

th – talamusz

TpH – triptofán-hidroxiláz

TRYP – triptofán

TT – taenia tecta

VGLUT – vezikuláris glutamát transzporter

vGluT1,2,3 – 1-es, 2-es, vagy 3-mas típusú vezikuláris glutamát transzporter

VIP – vazoaktív intesztinális polipeptid

VMAT2 – 2-es típusú vezikuláris monoamin transzporter

8

III. ELŐSZÓ

A világon talán semmi nem rendelkezik bonyolultabb felépítéssel az emberi

agynál. Az agyunkban összehuzalozott idegsejtek milliárdjai, melyek sejtenként több ezer

kapcsolatot létesítenek egymással, világegyetemünk egyik legnagyobb csodáját jelentik.

Ezek a kapcsolatok teszik lehetővé a reggeli ébredés első gondolatait, az előző nap

eseményeire való emlékezést, annak a felismerését, hogy azok vagyunk, akik, és nem

azok az emberek, akiket szintén agyműködésünk segítségével ismerünk fel a közös

asztalnál vagy a munkába menet. Ez a kapcsolathalmaz hozza létre a barátaink láttán

bennünk feltörő örömöt, a tavasz első illataira felbuzgó várakozással teli izgalmat, egy

szerettünktől való elköszönéskor a szomorúság érzését, és a gondolatainkba merült séta

közben ránk ugató kutyától való zsigeri ijedtséget, félelmet és a villámgyors védekező

mozdulatokat. Nem kétséges, hogy ezeknek a sokrétű funkcióknak a vizsgálata, jobb

megértése az emberiség legnagyobb és talán legnemesebb kihívásai közé tartozik.

Elménk játékai azonban legalább ugyanilyen gyakran megkeserítik életünket.

Szorongásaink, elnyomott vágyaink, félelmeink és szokásaink mind-mind a sejtek közötti

szinapszisok erdejében bújnak meg, és ha valamelyik alkotóelem működése hibát

szenved, abból különböző, súlyos betegségek alakulhatnak ki, olyanok, mint a

skizofrénia, a depresszió vagy a pánikbetegség. Különösen érvényes ez az agytörzsből

felszálló rendszerekre, melyek agyunk legősibb részei közé tartoznak, és minden agyi

működést befolyásolnak. Disszertációmban ezen rendszerek egyikét, az agytörzsben

elhelyezkedő median raphét veszem górcső alá. A median raphe régióból felszálló pálya

a szerotonerg rendszerek egyike, mely az egyik igen sokrétű hatással bíró ingerületátvivő

anyag az agyban, és szinte minden kognitív funkciónk létrehozásában részt vesz.

Munkám azokra az alapokra is támaszkodik, melyeket az idegtudományi iskola,

melyben volt szerencsém tanulni, már korábban lefektetett. Ezért itt szeretném kiemelni

Szentágothai János és Grastyán Endre munkásságát, akik a XX. század magyar

idegtudományának legfüggetlenebb gondolkodó elméi voltak, és akiknek úttörő

iskolateremtő tevékenysége idegtudósok százainak gondolkodását határozza meg mind a

mai napig. Az általuk, valamint közvetlen és sokadik generációs tanítványaik által

véghezvitt temérdek kísérlet határozta meg ennek a munkának a kereteit is.

9

IV. BEVEZETÉS

IV.1. A median raphe régió funkcionális anatómiája

IV.1.1. A median raphe anatómiai és szövettani leírása

Az agytörzsben több olyan magcsoport is található, amelyek felszálló pályákon

keresztül létesítenek kapcsolatot az előagyi területekkel, és hatékonyan befolyásolják a

magasabb rendű kérgi funkciókat, mint a tanulás és memória, a különböző érzelmekhez

köthető reakciók és az alvás-ébrenlét ciklusok. Ezeknek a pályáknak egy része

monoaminerg ingerületátvitel segítségével – dopamin, noradrenalin vagy szerotonin

(5HT) ürítésével – gyakorol hatást az előagyi területekre. Ez utóbbi felszálló rendszerek

közé tartozik az a pálya is, amely az úgynevezett raphe magokból ered.

A raphe magokat először Dahlström és Fuxe (1964) azonosította a Falck-Hillarp-

féle fluoreszens technika segítségével. A raphe magok közös tulajdonsága, hogy

találhatók bennük olyan sejtek, melyek 5HT-t képesek termelni és azt ingerületátvivő

anyagként használni. Ezek a magok a középagyban és hídban elhelyezkedő, többé-

kevésbé egymástól elkülönült sejtcsoportok; anatómiai helyzetük szerint Dahlström és

Fuxe 9 szerotonerg magot különített el egymástól, melyekről később kiderült, hogy

funkcionálisan két nagyobb rendszerbe tartoznak (1. ábra). A B1-B4 jelölésű magok a

leszálló szerotonerg rendszer részei, melyek a nyúltvelő és a gerincvelő felé küldenek

axonokat, a B5-B9 jelölésű magok alkotják a felszálló szerotonerg rendszert, mely az

előagy felé vetít (Hendricks és mtsai 1999, Hensler 2006). Ez utóbbi magok közül kettőbe

csoportosul a szerotonerg sejtek legnagyobb része: a dorzális raphe régióba (DRR; B6 és

B7 magok) és a median raphe régióba (MRR; B5 és B8 magok).

A MRR a középagy és a híd területén helyezkedik el; rosztrálisan az

interpeduncularis mag és a ventrális tegmentális terület, dorzálisan a felső kisagykarok

kereszteződése és a DRR, ventrálisan a reticulotegmentális mag, kaudálisan a pontin

raphe, laterálisan pedig a nucleus pontis oralis határolja. A MRR-n belül a szerotonerg

sejtek a középvonalban sűrűsödnek össze, ez a terület a median raphe (MR). A MR-t a

jelentős részben GABAerg sejteket tartalmazó paramedian raphe (PMR) veszi körül

10

(Behzadi és mtsai 1990). A MR és PMR közötti átmenet folytonos, az egyes sejtek

dendritjei átlépik ezeket a határokat (Calizo és mtsai 2011; Domonkos és mtsai 2016).

1. ábra: A szerotonerg

rendszer a fejlődő és a

felnőtt egér agyában: a

fejlődő agyról az

embrionális 11-dik

napon (E11) készült

szagittális metszet

rajzán látható, hogy a

szerotonerg sejtek

előalakjai (lila pöttyök)

az agytörzsben, az

isthmustól kaudálisan

helyezkednek el. Az embrionális 14-dik napon a szerotonerg sejtek rosztrális (lila pöttyök,

B6-B9) és kaudális (sárga pöttyök, B1-B3) csoportja is kialakult, melyek a felszálló (lila

nyíl), illetve a leszálló (sárga nyíl) szerotonerg rendszert alkotják. A felszálló pálya

bizonyos pontokon a fejlődő agyba kollaterálisokat ad (lila leágazó nyilak). Rövidítések:

cx: agykéreg, dt: dorzális talamusz, fr: fasciculus retroflexus, hyp: hipotalamusz, mlf:

mediális előagyi köteg, se: szeptum.

A felnőtt agyban kialakultak az egyes szerotonerg magok (B1-B9), és vetítő rostjaik is. A

leágazó lila nyilak a felszálló szerotonerg rendszer által legsűrűbben beidegzett

területeket mutatják. Rövidítések: acb: nucleus accumbens, amg: amygdala, Cer: kisagy,

cx: agykéreg, hip: hippokampusz, hyp: hipotalamusz, ob: szaglógumó, st: striatum, th:

talamusz. A kép forrása: Serotonin homeostasis and serotonin receptors as actors of

cortical construction: special attention to the 5-HT3A and 5-HT6 receptor subtypes,

Vitalis és mtsai 2013. Engedéllyel módosítva és felhasználva.

A MRR sejtjeinek számáról, fenotípusáról eddig nem rendelkeztünk pontos,

adatokkal, bár több vizsgálatot is folytattak az itt található sejtek neurokémiai

jellemzésével kapcsolatban (Araneda és mtsai 1999; Fremeau és mtsai 2004; Fu és mtsai

11

2010; Hioki és mtsai 2004; Hioki és mtsai 2010). Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy

a MRR-ban található szerotonerg sejtek mellett 3-mas típusú vezikuláris glutamát

transzportert (vGluT3) kifejező glutamaterg sejtek is találhatók a MRR-ban. Ezek egy

része átfed a 5HT-pozitív sejtekkel, de vannak olyan sejtek is a MRR-ban, amelyek csak

vGluT3-mat fejeznek ki (Calizo és mtsai 2011; Herzog és mtsai 2004; Jackson és mtsai

2009). Emellett a glutamát-dekarboxilázt kifejező GABAerg, valamint neuronális

nitrogén-monoxid szintázt (nNOS) kifejező nitroxiderg sejtek is találhatók a MRR-ban,

továbbá különböző neuropeptidek (szomatosztatin, galanin, kortikotropin releasing

faktor, neuropeptid Y, kolecisztokinin, tachykinin B, vazoaktív intesztinális peptid)

jelenlétét is leírták ezen a területen. Ezen sejtpopulációk egymással, illetve a

monoaminerg, glutamaterg vagy GABAerg ingerületátvitellel működő populációkkal

való átfedését csak részben vizsgálták (Araneda és mtsai 1999; Calizo és mtsai 2011; Fu

és mtsai 2010). Nem ismertek továbbá kellő pontossággal a MRR-ban található sejtek

egymással létrehozott kapcsolatai sem.

A MRR különböző sejttípusai eltérően vesznek részt az előagyi vetítés

kialakításában. A MRR szerotonerg sejtjei az egész agyba küldenek felszálló rostokat, és

olyan fontos funkciókban vesznek részt, mint a cirkadián ritmus és az alvás-ébrenlét

ciklusok szabályozása (Yamakawa és Antle 2010), különböző tanulási és

memóriafolyamatok (Stäubli és Xu 1995; Wang és mtsai 2015), stressz- és

szorongásszabályozás (Andrade és mtsai 2013; Richardson-Jones és mtsai 2010; Teissier

és mtsai 2015) valamint a félelemmel kapcsolatos reakciók (Avanzi és mtsai 1998; Wang

és mtsai 2015). Azonban úgy tűnik, hogy a MRR egyes nem szerotonerg sejtjei is

rendelkeznek előagyi célpontokkal, és a szerotonerg rendszerrel együttműködve vesznek

részt a fenti funkciók szabályozásában (Aznar és mtsai 2004; Crooks és mtsai 2012). Ezek

a sejtek, legalábbis részben, a vGluT3-pozitív, glutamaterg populációba tartoznak, és igen

hatékonyan képesek befolyásolni az előagyi működést (Amilhon és mtsai 2010; Jackson

és mtsai 2009; Varga és mtsai 2009). A MRR-ban található, nNOS-t, galanint vagy

szomatosztatint kifejező sejtek szintén rendelkeznek előagyi vetítéssel, bár a fenti

peptideket kifejező populációk jelentős átfedést mutattak a szerotonerg sejtekkel

(Araneda és mtsai 1999; Lu és mtsai 2010). A MRR-ban található GABAerg sejtek

előagyi vetítésével kapcsolatban nincsenek információink, a szakirodalom ezeket a

sejteket a MRR vetítő sejtjeit lokálisan gátló populációnak tartja (Wang és mtsai 2015).

12

Bár a 5HT-t kifejező sejtek a MRR-nak csak kisebb hányadát teszik ki, jó

vizsgálhatóságuk miatt ezek működéséről és szerepéről tudunk a legtöbbet. A következő

fejezetekben sorra veszem a szerotonerg sejtek eredetét, fejlődését, és kitérek az utóbbi

időben megfigyelt funkcionális és molekuláris sokféleségükre.

IV.1.2. A MRR szerotonerg sejtjeinek eredete és fejlődése – a PET-1 transzkripciós

faktor szerepe

A majdani szerotonerg idegsejtek progenitor sejtjei a rhombencephalonban

találhatók, a kialakuló negyedik agykamra alatti állományban, a r1-r3, valamint a r5-r7

rhombomérákban (Deneris és Wyler 2012; Hendricks és mtsai 1999; Jensen és mtsai

2008; Lidov és Molliver 1982; Okaty és mtsai 2015). A r1-r3 rhombomérákban található

rosztrális szerotonerg csoportból fejlődnek ki a felszálló, míg a r5-r7 rhombomérákban

található kaudális csoportból a leszálló szerotonerg rendszer sejtjei (Hendricks és mtsai

1999; Okaty és mtsai 2015). A két rendszer fejlődése időben is elkülönül: a rosztrális

csoport fejlődése egérben és patkányban is mintegy egy nappal megelőzi a kaudális

csoport fejlődését (Hendricks és mtsai 1999).

Ezek a progenitor sejtek a fejlődésnek már igen korai szakaszában megjelennek a

fejlődő agyban: egérben az embrionális 9.5 és 12 nap (E9.5-12) között, patkányban E11-

14 között (Hendricks és mtsai 1999; Pfaar és mtsai 2002). A szerotonerg irányba való

elköteleződést egy sor transzkripciós és növekedési faktor összehangolt működése

szabályozza. Ezek között kezdetben fontos szerepet tölt be a sonic hedgehog (Shh) és a

fibroblast növekedési faktor 8 (FGF8), melyek további homeobox gének bekapcsolását

indukálják ezekben a sejtekben (Deneris és Wyler 2012). Ilyenek a Nkx2.2, Foxa2, Gata2

és Gata3 gének, végül a Lmx1b és a PET-1 veszi át a posztmitotikus fejlődésben az

elsődleges szerepet (Deneris és Wyler 2012; Jensen és mtsai 2008).

A PET-1 a fejlődő szerotonerg sejtekre jellemző fehérje, mely az E26

transzformáció-specifikus (ETS) doménnel rendelkező transzkripciós faktorok

családjába tartozik (Fyodorov és mtsai 1998; Hendricks és mtsai 1999; Pfaar és mtsai

2002). A PET-1 az evolúció során megőrződött, homológja az emberben is megtalálható

Fifth Ewing Variant transzkripciós faktor. A PET-1 mRNS-ét rágcsálókban a fejlődés

során kizárólag a raphe magoknak megfelelő régiókban lehet kimutatni in situ

13

hibridizációs technikával; a MRR-n belül a PET-1-et kifejező sejtek főleg a

középvonalban, a szerotonerg sejtek nagy részét is tartalmazó MR-ban tömörülnek (2.

ábra; Hendricks és mtsai 1999; Pfaar és mtsai 2002). A PET-1 kifejeződése megelőzi a

szerotonerg sejtekre jellemző géntermékek kifejeződését mind a rosztrális, mind a

kaudális szerotonerg csoportban. Patkányban az első PET-1-et kifejező sejtek P12.5-nél

jelennek meg a rosztrális csoportban, ezek fél nappal később válnak 5HT-pozitívvá; P14-

re már a kaudális csoport sejtjei is 5HT-pozitivitást mutatnak (Hendricks és mtsai 1999).

2. ábra: Az autoradiográfiával megjelölt PET-1 transzkripciós faktor mRNS-e csak a

raphe magvakban (B1-B9) mutatható ki, mint ahogy az a fenti, agytörzsről készült

koronális metszeteken is látható. A kép forrása: „The ETS domain factor Pet-1 is an early

and precise marker of central serotonin neurons and interacts with a conserved element

in serotonergic genes, Hendricks és mtsai 1999”. Engedéllyel módosítva és felhasználva.

Pár évvel a PET-1 felfedezése után kiderült, hogy ennek a transzkripciós faktornak

a kifejeződését és működését egy enhancer régió is segíti. Ez a 1.8kb hosszúságú régió

közvetlenül a PET-1-et kódoló gén előtt elhelyezkedő ePet, mely folyamatos pozitív

visszacsatolásban áll a PET-1-gyel, a posztmitotikus, már kialakult szerotonerg sejtekben

14

( Liu és mtsai 2010; Scott és mtsai 2005a; Scott és mtsai 2005b). Az ePet/PET-1 rendszer

tehát együttműködve segíti elő a szerotonerg sejtek megfelelő működését.

A PET-1 kifejeződése a szerotonerg sejtek jelentős részében alapvetően fontos a

szerotonerg fenotípus kialakulásához. PET-1 génkiütött (KO) állatban ugyanis mintegy

70%-kal csökken a 5HT-t kifejező sejteknek a száma az egyes raphe magokban, továbbá

a szerotonerg rendszerre jellemző fehérjék, mint a triptofán-hidroxiláz (TpH), szerotonin

transzporter (SERT), 2-es típusú vezikuláris monoamin-transzporter (VMAT2), aromás

aminosav dekarboxiláz (AADC) és a tetrahidrobiopterin-szintézis enzimeinek génjei sem

íródnak át mRNS-é megfelelően (Hendricks és mtsai 2003; Liu és mtsai 2010; Wyler és

mtsai 2015; Wyler és mtsai 2016). Ezekben az állatokban a kérgi szerotonerg rostok

mennyisége, és a belőlük felszabaduló 5HT szintje is jelentősen csökkent, továbbá ennek

megfelelő viselkedésbeli eltéréseket is mutatnak: rosszabbul tűrik a stresszt, fajtársaikkal

szemben aggresszívabbak, és szorongásra hajlamosak (Hendricks és mtsai 2003;

Kiyasova és mtsai 2011; Liu és mtsai 2010).

A PET-1 kifejeződése azonban nem csak a szerotonerg sejtek kifejlődéséhez

szükséges, hanem azok szerotonerg fenotípusának fenntartásához is. ePet-Cre::PET-1loxP/-

állatok létrehozásával a már kialakult, posztmitotikus szerotonerg sejtekből kiütötték a

PET-1-et. Azt találták, hogy bár ezekben az egerekben jelen vannak az érett szerotonerg

sejtek, azokban a TpH, SERT, VMAT2, AADC és az 5HT1A szerotonin-autoreceptor

mRNS-ének szintje jelentősen csökkent. Hasonló eredményeket mutattak ki olyan

egerekben is, melyekben doxycyclin-függő módon időzítetten, fiatal felnőttkorban

csendesítették el a PET-1 kifejeződését; ezek az egerek, hasonlóan a PET-1 KO

egerekhez, szorongásra hajlamosabbak voltak vad típusú társaikhoz képest (Liu és mtsai

2010). Továbbá a PET-1 KO egerek szerotonerg sejtjeire az éretlen, fejlődő szerotonerg

sejtekhez hasonló membrántulajdonságok és szinaptikus kapcsolatrendszer jellemző még

felnőttkorban is (Rood és mtsai 2014; Wyler és mtsai 2016).

A fenti szakirodalmi adatok úgy kezelték az ePet/PET-1 rendszert, mint ami

specifikus a raphe magokban található szerotonerg sejtekre, és azok döntő többségében

kifejeződik. Bár valóban igaz, hogy az ePet/PET-1 rendszer a raphe magok területén kívül

nem aktiválódik, specificitása nem közelíti meg a 100%-ot a szerotonerg sejtekre nézve.

Mind egérben, mind patkányban kimutatták, hogy az ePet/PET-1 rendszer csupán a 5HT-

pozitív sejtek mintegy 70%-ban található meg; azok a szerotonerg sejtek, akik nem fejezik

15

ki a PET-1-et, külön populációt képeznek a raphe magokban, és jellemző agyi vetítési

mintázattal is rendelkeznek, bizonyos agyterületeken funkcionális aszimmetrikus

szinapszisokat létrehozva (Hendricks és mtsai 2003; Kiyasova és mtsai 2011; Pfaar és

mtsai 2002; Wang és mtsai 2015). Továbbá kimutatták, hogy a DRR-ban és a MRR-ban

található vGluT3-pozitív sejtek mintegy 30%-a is kifejezi a PET-1-et (Gaspar és Lillesaar

2012). Az ePet/PET-1 rendszernek a MRR különböző típusú sejtjeiben való kifejeződését

azonban eddig nem vizsgálták, így nem volt világos, hogy – még ha megkötésekkel is, de

- az használható volna-e a szerotonerg rendszer specifikus vizsgálatára.

IV.1.3. A median raphe régió érett szerotonerg sejtjeinek heterogenitása

A felszálló szerotonerg rendszer sejtjei már fentebb bemutatott fejlődésük alapján

sem képeznek egy homogén populációt. A DRR és MRR sejtjei három rhombomérából

(r1-r3) alakulnak ki, és ezeknek a sejteknek az elhelyezkedése, vetítési mintázata és

rostjaik anatómiája is különbségeket mutat. A különböző rhombomérákban mindegyikre

jellemző, különböző transzkripciós faktorok fejeződnek ki; a szerotonerg sejtek nagy

része pedig kifejezi a PET-1-et. A rhomboméra-specifikus transzkripciós faktorokat és a

PET-1-et kifejező sejtpopulációk keresztmetszetébe tartozó sejteket célzott genetikai

módszerekkel megjelölve lehetett leírni. Így megismerhetők a különböző

rhombomérákban található szerotonerg sejtek jellemzői (Bang és mtsai 2012; Jensen és

mtsai 2008; Muzerelle és mtsai 2016).

Az r1 rhombomérából fejlődő szerotonerg sejtek a DRR-ban és kisebb részben a

MRR elülső részében helyezkednek el. Ezek a sejtek az előagyban, a DRR-ra jellemző

vetítési mintázatot mutatják, rostjaik között sok a vékony, kis megvastagodásokat

létrehozó axon. Ezzel szemben a hippokampuszban (HIPP), az r1-ből származó sejtek a

MRR-ra jellemző rétegspecifikus vetítési mintázatot adják a stratum radiatum és

lacunosum-moleculare határán, ahol vastag rostokat és nagy méretű terminálisokat lehet

megfigyelni, ami arra utal, hogy a hippokampuszba a MRR r1 rhombomérából származó

sejtjei is vetítenek.

Az r2 rhombomérából kialakuló sejtek a MRR szerotonerg sejtjeinek nagy

többségét adják, vetítési mintázatuk a MRR-ból anterográd pályajelöléssel leírtnak

16

megfelelő, rostjaik anatómiája, a fent leírt morfológiát mutatja, vastag rostokkal és nagy

méretű terminálisokkal (Vértes és mtsai. 1999).

Az r3 rhombomérából fejlődő sejtek a MRR hátsó részében helyezkednek el,

kevésbé jellemző rájuk a kérgi területekre való vetítés, hangsúlyosabbak a helyi és

agytörzsi magokkal létrehozott kapcsolataik, rostjaik szintén vastagok és egyértelmű

terminálisokat képeznek (Mamounas és mtsai 1991; Vértes és mtsai 1999). A MRR 5HT-

pozitív sejtjeit tehát már eredetük szerint is legalább 3 populáció alkotja.

További heterogenitást okoz a MRR szerotonerg sejtjei között a fent bemutatott

PET-1 pozitivitás. Egyes sejtek a MRR-ban annak ellenére is megtartják szerotonerg

fenotípusukat, hogy a PET-1 génjét kiütötték az állat genomjából, ezek a sejtek pedig

működőképes szinapszisokat hoznak létre több előagyi területen is. A PET-1-negatív

szerotonerg sejtek által egyik legerősebben beidegzett agyterület a bazolaterális amygdala

(Kiyasova és mtsai 2011). Később leírták, hogy a bazolaterális amygdalába vetítő sejtek

elektrofiziológiai tulajdonságai és „genetikai ujjlenyomata” eltérőek a mediális

prefrontális kéregbe (mPFC) vagy a hippokampuszba vetítő sejtekhez képest, ami további

bizonyíték az eltérő szerotonerg alpopulációk létezése mellett (Fernandez és mtsai 2016).

A szerotonerg sejtek heterogenitását elektrofiziológiai és genetikai módszerek

segítségével is vizsgálták. Ezen vizsgálatok szerint a szerotonerg sejtek több populációba

sorolhatóak membrántulajdonságok, tüzelési mintázat és 5HT1A-autoreceptor

aktiválására adott válasz alapján. Ezek a sejtek különböző módon kapcsolódnak az

előagyi hálózati aktivitáshoz is (Beck 2003; Calizo és mtsai 2011; Kiyasova, Bonnavion,

Scotto-lomassese, és mtsai 2013; Kocsis és mtsai 2006; Richardson-Jones és mtsai 2010).

Genetikai vizsgálatok is arra mutattak rá, hogy a szerotonerg sejtek több, különböző

„genetikai ujjlenyomattal” rendelkező csoportba sorolhatóak. Az egyes szerotonerg

alpopulációk mind a raphe magok között, mind az egyes raphe magokon – így a MRR-n

– belül is jelentős eltéréseket mutattak (Fernandez és mtsai 2016; Okaty és mtsai 2015).

A különböző genetikai tulajdonságokkal rendelkező sejtek különböző, a szerotonerg

rendszerhez kapcsolódó funkciókat tölthetnek be, például azon keresztül, hogy különböző

agyterületekre vetítenek (Commons 2016; Fernandez és mtsai 2016).

Talán az egyik legfontosabb tényező a szerotonerg sejtek heterogenitásában azok

vGluT3-pozitivitása, így glutamát felszabadítására való képessége. Mind a DRR-ban,

mind a MRR-ban találhatók olyan sejtek, melyek vGluT3-mat fejeznek ki, és ezek egy

17

része átfed a szerotonerg sejtekkel (Fremeau és mtsai 2004; Herzog és mtsai 2004;

Jackson és mtsai 2009). A vGluT3 génje több, szerotonerg fenotípust meghatározó

génhez hasonlóan felnőtt korban is a PET-1 rendszer szabályozása alatt áll (Liu és mtsai

2010), ami a szerotonerg rendszerrel való szoros együttműködést feltételez. Anterográd

és retrográd pályakövetési vizsgálatokkal patkányban már kimutatták, hogy a MRR nem

szerotonerg vetítéséhez jelentősen hozzájárulnak a vGluT3-pozitív sejtek a

hippokampusz és a mediális szeptum (MS) területén (Aznar és mtsai 2004; Jackson és

mtsai 2009; Shutoh és mtsai 2008; Somogyi és mtsai 2004). A hippokampuszban ennek

a gyors és hatékony glutamaterg vetítésnek igen fontos szerepe van a hálózati aktivitás

szabályozásában, ahogy csoportunk egy korábbi munkája azt kimutatta (Varga és mtsai

2009). Azonban pontos vizsgálatok eddig még nem történtek a MRR 5HT- és vGluT3-

pozitív sejtjeinek számának és egymáshoz viszonyított arányának meghatározására.

IV.1.4. A median raphe régió hatása az előagyi hálózati aktivitásra

Az élőlények a külvilágból érkező ingerekre, illetve a saját belső állapotukból

származó motivációkra különböző viselkedéssel reagálnak, és ezekre a viselkedési

mintákra különböző előagyi aktivitásmintázatok jellemzőek. Ennek a jelenségnek az

egyik legismertebb példája a szeptohippokampális rendszerben figyelhető meg. Több

fajban, a rágcsálóktól az emberig kimutatható, hogy a környezet felmérése, tájékozódás,

aktív figyelem, valamint a paradox, REM-alvás alatt a hippokampuszban 5-12 Hz

frekvenciájú, 1-2mV amplitúdójú szinkron hullámtevékenység, az úgynevezett theta-

oszcilláció jelenik meg, mely a hippokampális piramissejtek szinkron aktivitását tükrözi.

Ezzel szemben nyugalomban, táplálkozás közben vagy mély alvás során a hippokampális

EEG nagy amplitúdójú irreguláris aktivitást mutat, melyet időnként éleshullám-aktivitás

szakít meg (Buzsáki és mtsai 1979; Buzsáki 2002; Stumpf és mtsai 1962; Vértes és Kocsis

1997).

A MRR szerepét a szeptohippokampális oszcillációk szabályozásában már igen

korán kimutatták: a MRR elektromos ingerlése a hippokampális theta-ritmus

deszinkronizációjával járt (Assaf és Miller 1978). Ezeket a megfigyeléseket később

további vizsgálatok is igazolták, mely munkákat kiválóan összefoglalta Vértes és Kocsis

18

(1997). A MRR aktiválása a serkentő szinaptikus transzmisszió kémiai úton történő

fokozásával, vagy a MRR GABAerg gátlásának blokkolásával mind hasonló eredményre

vezettek (Kinney és mtsai 1996; Li és mtsai 2005).

Ezzel szemben a MRR léziója, vagy a MRR-ben található sejtek kémiai úton

történő gátlása prokainnal vagy 5HT1A-receptorokon keresztül, fokozott

szeptohippokampális theta-aktivitáshoz vezetett. Hasonló eredménnyel járt a lokális

serkentő glutamaterg transzmisszió blokkolása vagy a GABAerg gátlás fokozása is

(Crooks és mtsai 2012; Kinney és mtsai 1994; Kinney és mtsai 1995; Kinney és mtsai

1996; Li és mtsai 2005; Maru és mtsai 1979). A MRR mind a mediális szeptumba, mind

a hippokampuszba, nagy mennyiségben küld rostokat, lehetővé téve ezeknek a régióknak

a közvetlen szabályozását (Vértes és mtsai 1999).

Több bizonyíték is arra utal, hogy a MRR theta-deszinkronizáló hatása

szerotonerg neurotranszmisszión keresztül valósul meg. Először is a szerotonerg sejtek

célzott kiirtása 5,7-dihidroxitriptaminnal folyamatos theta-ritmust idézett elő szabadon

mozgó patkányokban (Vanderwolf és mtsai 1989). Ezenfelül a MRR szerotonerg sejtjei

célzottan blokkolhatók 5HT1A-agonistákkal (Beck 2003; Crooks és mtsai 2012), és ennek

a blokkolásnak a hatására szintén theta-ritmust lehet kiváltani a szeptohippokampális

rendszerben (Crooks és mtsai 2012; Kinney és mtsai 1996; Vertes és mtsai 1994). Így pl.

a MRR elektromos stimulálása deszinkronizálta a theta-ritmust, de a szerotonin

szintézisének gátlása, vagy a szerotonerg rostok célzott kiirtása ezt a hatást képes volt

kivédeni (Assaf és Miller 1978; McNaughton és mtsai 1980). Továbbá a szerotonin

prekurzor 5-hidroxitriptofán intraperitoneális injektálásának hatására az állatban hosszú

ideig blokkolódott a theta-ritmus (Yamamoto és mtsai 1979). Úgy tűnik tehát, hogy a

szerotonerg transzmisszió elősegíti a hippokampusz és az élőlény aktív, feltérképező

állapotából a nyugalmi állapotba való átmenetet.

A MRR sejtjeinek theta-oszcillációkra való hatása azonban nem egyforma. A nem

szerotonerg rostok, melyek szintén részt vesznek a felszálló pálya létrehozásában, eltérő

hatásúak lehetnek. Ezeket a rostokat jórészt a MRR vGluT3-pozitív sejtjei alkotják

(Aznar és mtsai 2004; Jackson és mtsai 2009; Varga és mtsai 2009). A MRR theta-ritmusú

tüzeléssel való ingerlésének hatására a hippokampuszban nem deszinkronizáció, hanem

épp ellenkezőleg, theta-ritmusban történő oszcilláció jött létre, az ingerlés fázisához

szorosan fáziskapcsolt módon. Emellett a MRR ingerlésének hatására a hippokampális

19

theta fázisa újraindult (Jackson és mtsai 2008). A MRR rostjai a hippokampuszban

célzottan bizonyos interneuronokkal létesítenek szinapszisokat (Freund és mtsai 1990;

Halasy és mtsai 1992). Kutatócsoportunk korábbi munkája kimutatta, hogy a MRR

rostjainak optogenetikai stimulálása a hippokampuszban nagyon hatékonyan képes

serkenteni ezeket az interneuronokat, mely interneuronok által létrehozott gátlás

hatékonyan áttevődik a hippokampális piramissejtekre. Az interneuronokon létrehozott

posztszinaptikus serkentő áramok amplitúdójának döntő részéért a glutamaterg

neurotranszmisszió volt felelős, mint ahogy azt AMPA- és NMDA-receptor blokkolókkal

kimutattuk (Varga és mtsai 2009).

A MRR-ból felszálló szerotonerg és nem szerotonerg pályák szeptohippokampális

ritmikus aktivitásra való eltérő hatását Crooks és munkatársai (2012) elegáns kísérletei

világították meg a legalaposabban. Az első kísérletek során a MRR minden sejtjét

blokkolták prokain MRR-ba történő lokális injektálásával, ennek hatására a

hippokampuszban erős theta-ritmus jött létre. Ezt a theta-ritmust a MS teljes blokkolását

előidéző intraszeptális prokain-injekció, és a MS-ban található kolinerg sejteket célzottan

blokkoló atropin-injekció is megszüntette. Ha a MRR-ben található szerotonerg sejteket

célzottan blokkolták 5HT1A-autoreceptor agonistával, akkor szintén theta-ritmus volt

megfigyelhető a hippokampuszban. Ezt a theta-ritmust azonban csak a MS általános,

prokainnal történő blokkolása volt képes megszüntetni; amennyiben csak a MS kolinerg

sejtjeit blokkolták atropinnal, a hippokampális theta-ritmus továbbra is megfigyelhető

volt. Ennek az lehet a magyarázata, hogy a MRR-ból felszálló pálya nem szerotonerg

része célzottan serkenti a MS-ban található, parvalbumin-pozitív GABAerg sejteket,

melyek a hippokampális theta-ritmus létrehozásában alapvető szerepet töltenek be

(Borhegyi 2004; Freund és Antal 1988; Hangya és mtsai 2009).

A korábbi szakirodalmi adatok azt mutatják, hogy patkányban a MRR felszálló,

nem szerotonerg rostjai megcélozhatják a MS parvalbumin- vagy calbindin-pozitív

sejtjeit, és ezek a rostok feltehetőleg a MRR vGluT3-pozitív sejtjeitől erednek (Aznar és

mtsai 2004; Jackson és mtsai 2009; Leranth és Vertes 1999). A MRR vGluT3-pozitív

sejtjei tehát valóban alapvető hatással bírhatnak a hippokampális oszcillációk

kialakulására.

Tovább árnyalja a MRR szerepét a hippokampális theta-ritmus szabályozásában

az a jelenség, hogy az epitalamuszban található laterális habenula kiirtásának hatására a

20

hippokampuszban csökken a theta-ritmusban töltött időszakok gyakorisága és hossza. Ezt

a hatást a MRR szerotonerg sejtjeinek célzott kiirtása kivédte, amely azt mutatja, hogy a

laterális habenulának hippokampális theta-ritmust elősegítő hatása a MRR-n keresztül

valósult meg (Aizawa és mtsai 2013).

A MRR nem csak a theta-ritmusra, hanem a hippokampális éleshullám-aktivitásra

is erős hatással bír. A MRR szerotonerg sejtjeinek tüzelése a hippokampális éleshullám-

események előtt közvetlenül lecsökken, míg a MRR GABAerg sejtjeinek aktivitása ezzel

párhuzamosan emelkedik. Ezzel összefüggésben a MRR optogenetikai ingerlése a

hippokampuszban csökkentette, míg optogenetikai gátlása elősegítette az éleshullámok

kialakulását (Wang és mtsai 2015). A hippokampális éleshullám-aktivitás alapvető

fontosságú a memóriafolyamatok helyes működésében, az emlékek megjegyzésében (Wu

és mtsai 2017). Ha a MRR-t ritmusosan aktiválták azokban az időszakokban, mikor az

állat nyugalomban volt, így gátolva az éleshullám-aktivitást, az állat memóriája zavart

szenvedett (Wang és mtsai 2015). A MRR különböző típusú sejtjeinek tehát eltérő, de

alapvető szerepek is juthatnak az előagyi ritmusos aktivitás szabályozásában, melynek az

élőlény viselkedésére is komoly hatása lehet.

IV.1.5. A median raphe régió hatása a viselkedésre

A MRR hatását a viselkedésre a fenti, hálózati működésre gyakorolt befolyása

alapján kezdték el tanulmányozni. A szerotonerg rendszert már korábban kapcsolatba

hozták a szorongás és a félelmi reakciók szabályozásával, illetve a szerotonerg rendszer

hibás működése megfigyelhető olyan betegségekben, mint a depresszió, pánikbetegség,

generalizált szorongás vagy skizofrénia (Andrade és mtsai 2013; Hensler 2006).

A MRR szorongással és félelmi reakciókkal kapcsolatos vizsgálatai abba az

irányba mutatnak, hogy a MRR inaktiválása szorongásoldó, míg a MRR aktiválása

szorongást keltő hatású; ezeket a kísérleteket kiválóan foglalták össze Andrade és

munkaársai (2013). A MRR léziója akár elektromos, akár kémiai úton csökkentette

patkányok szorongását vagy félelmét több különböző viselkedési paradigmában is, mint

az emelt keresztpalló, az erőltetett úszási teszt vagy a kontextuális félelmi teszt (Almada

és mtsai 2009; Almeida és mtsai 2013; Andrade és Graeff 2001; Avanzi és mtsai 1998;

Avanzi és Brandão 2001; Borelli és mtsai 2005; Melik és mtsai 2000). Ez a viselkedés,

21

legalábbis részben, szerotonerg sejteken keresztül valósul meg, ugyanis ha 5HT1A-

autoreceptor agonista MRR-ba való injektálásával gátolták a szerotonerg sejtek

működését, hasonló szorongásoldó hatást tapasztaltak a fenti tesztekben (Andrade és

mtsai 2013; Avanzi és Brandão 2001). A MRR elektromos ingerlése ezzel ellentétben

szorongást váltott ki (Graeff és Silveira Filho 1978), és összhangban a fenti kísérletekkel,

az 5HT1A-autoreceptor antagonista patkány MRR-ba való injektálása is fokozta az állatok

szorongását (Vicente és mtsai 2008).

A fent bemutatott elektrofiziológiai kísérletekkel összhangban, melyek a MRR

szeptohippokampális aktivitásmintázatokra való hatását mutatták be, a MRR viselkedési

hatásai is részben a hippokampuszon keresztül valósulnak meg. 5HT1A-receptor agonista

patkány hippokampuszba való injektálása szintén csökkentette a félelmi reakciókat a

kontextuális félelmi paradigmában (Almada és mtsai 2009). Mivel a 5HT1A-receptorok

preszinaptikusan helyezkednek el a szerotonerg terminálisokon, és azokon gátló hatást

fejtenek ki, csökkentik a hippokampuszban a szerotonin szintjét, ami a fenti kísérletekkel

összhangban szorongásoldó hatású (Fischette és mtsai 1987). Továbbá egerekben a MRR

optogenetikai ingerlése az állat nyugalmi állapotában csökkentette a hippokampális

éleshullám-aktivitást, amely a kontextuális félelmi emléknyomok rögzítésének zavarával

járt (Wang és mtsai 2015).

A MRR viselkedésre gyakorolt hatását tehát vagy a MRR-ban található

sejtpopulációk mindegyikének befolyásolásával, vagy a szerotonerg sejtek működésének

módosításával vizsgálták, mely kísérletek abba az irányba mutatnak, hogy a MRR

működésének a negatív, szorongással összefüggő viselkedési minták szabályozásában,

illetve az azokkal kapcsolatos emléknyomok létrehozásában van szerepe.

IV.2. Az egér hippokampusz funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása

A temporális lebenyben elhelyezkedő hippokampusz az agy első vizsgálatai óta

az idegtudománnyal foglalkozó szakemberek figyelmének központjában van. Ennek

magyarázata jól elkülöníthető anatómiai elhelyezkedése és jól láthatóan strukturált

felépítése, amely nem csupán funkcionális anatómiai, de esztétikai szempontból is

csodálatra méltó. Az utóbbi időben ugrásszerűen fejlődő funkcionális és elektrofiziológiai

vizsgálatoknak köszönhetően a hippokampusz működéséről és kognitív folyamatokban

22

betöltött szerepéről is egyre többet tudunk meg. Annyira központi tárgya volt a XX. és

XXI. század idegtudományának a hippokampusz, hogy 2014-ben az orvosi és

élettudományi Nobel-díjat is ennek az agyterületnek a vizsgálatáért adományozták.

Disszertációm következő fejezeteiben a hippokampusz működésével kapcsolatos

ismereteinket szeretném nagyon röviden összefoglalni, és bemutatni az ezeknek a

funkcióknak a megvalósítását lehetővé tevő anatómiai felépítést.

IV.2.1. A hippokampális működés modelljei – szerepe a deklaratív memóriában

A hippokampuszt és a hozzá tartozó temporális lebenyi struktúrákat már egészen

korán kapcsolatba hozták a tanulás és memória egyes fajtáival. Ehhez az egyik

legnagyobb segítséget egy H.M. nevű beteg egész életen át tartó vizsgálata adta, akinek

súlyos, a korabeli kezelésekre nem reagáló epilepsziás rohamai miatt 27 éves korában

eltávolították mindkét oldali temporális lebenyét. Ennek a műtétnek a hatására H.M. élete

végéig anterográd amnéziában szenvedett, nem volt képes megjegyezni élete egyetlen

olyan eseményét sem, amely a műtét után történt vele, és agya nem tudott új adatokat sem

elraktározni. Ennek ellenére képes volt új mozgásminták elsajátítására, bár soha nem

emlékezett arra, hogy valaha tanulta volna azokat. Ezek a megfigyelések arra utalnak,

hogy a hippokampusz az úgynevezett deklaratív memóriafolyamatokban tölt be alapvető

szerepet.

A deklaratív vagy explicit memória olyan emlékek rögzítését jelenti, melyek

tudatosan, szándékosan előhívhatók. A deklaratív memóriafolyamatoknak két típusát

különböztetjük meg: a szemantikus memóriát, mely egyes adatok, tények megjegyzését

teszi lehetővé (például az ember születési helye, tárgyak nevei, különböző fogalmak,

stb.), valamint az epizodikus memóriát, amely az ember életében történt eseményeket és

a hozzájuk tartozó körülményeket rögzíti (Eichenbaum 2001, Szirmai és mtsai 2011). A

hippokampusz szerepe mind az epizodikus, mind a szemantikus memóriafolyamatokban

elengedhetetlen. Mivel fogalmainkat a velünk történt eseményeken keresztül alkotjuk

meg, nem meglepő, hogy az amnéziában szenvedő embereknél nem csak az új események

megjegyzése, hanem például új szavak jelentésének elmagyarázása is zavart szenved

(Eichenbaum, 2001).

23

A hippokampusz szerepe a deklaratív memóriában Eichenbaum elmélete szerint

három pontban foglalható össze. Először is a hippokampuszban jönnek létre az

epizodikus memóriához tartozó emléknyomok. Másodszor, a hippokampusz megtalálja

az epizodikus emléknyomok közötti közös elemeket. Végül a hippokampuszban jönnek

létre az epizodikus emléknyomok közötti asszociációk, ami egy „emléktér”

kialakulásához vezet. Ez az emléktér adja meg azt a keretet, amelyhez aztán a többi emlék

is kapcsolódik (Eichenbaum, 2001).

A hippokampusz azonban az epizodikus emléknyomok létrejöttének csak egy

szakaszában vesz részt. A munkamemóriában, mely az éppen beérkező információk

átmeneti tárolására szolgál, vagy a hosszútávú memóriába már bekerült régi emlékek

felidézésében a hippokampusznak nincs szerepe: ezek a funkciók az amnéziás betegekben

is megtartottak (Eichenbaum, 2001; Szirmai, 2005). A hippokampusz tehát a beérkező,

egy modalitású szenzoros információkból azok közös elemeit felismerve, közöttük

asszociációkat létrehozva, egy komplex, feldolgozott, a többi emléknyomba beágyazott

kontextust hoz létre (Lovett-Barron és mtsai 2014).

IV.2.2. A hippokampális működés modelljei – szerepe a térbeli memória

folyamataiban

A hippokampális funkciók feltárásának hatalmas lökést adott az úgynevezett

„helysejtek” felfedezése, amelyekkel kapcsolatos vizsgálatokat a 2014-es évben Nobel-

díjjal is honorálták (O’Keefe és Dostrovsky 1971). Ezeknek a sejteknek a jelenlétét több

különböző fajban, így rágcsálókban, denevérekben és főemlősökben is kimutatták

(O’Keefe és Conway 1978; Rubin és mtsai 2014; Wirth és mtsai 2017). A hippokampális

helysejtek a tér bizonyos kitüntetett pontjain megnövelik tüzelésük frekvenciáját, ezzel

kódolva az adott helyre vonatkozó információt. Az egyes hippokampális helysejtek tehát

egy térképet hoznak létre az élőlény környezetéről, amelyben minden pontnak

megfelelően egy helysejt-populáció tüzelése fokozódik (Dragoi és Buzsáki 2006).

A hippokampusz azonban nem önmagában vesz részt a kognitív térkép

létrehozásában. A hippokampusz egyik legfontosabb be- és kimeneti kapcsolódási

pontjában, az entorhinális kéregben, leírtak olyan sejteket, amelyek a helysejtek térbeli

kódolásához szükséges egyfajta skálaként egy hálót hoznak létre. Ebben a hálóban az

24

úgynevezett „hálósejtek” egyenlő oldalú háromszögek csúcsaiban fokozzák tüzelési

frekvenciájukat. Ezeknek a háromszögeknek a mérete és orientációja egyforma, azonban

egymáshoz képest el vannak csúsztatva, így alkalmasak a teljes tér lefedésére,

folytonossági hiány nélkül (Hafting és mtsai 2005). Az entorhinális kéreg hálósejtjeiből

származó információ eléri a hippokampusz helysejtjeit, így segítve a kognitív térkép

létrehozását (de Almeida és mtsai 2012).

Ez a hippokampális térkép, azon túl, hogy lehetővé teszi a térbeli tájékozódást,

megteremti annak a lehetőségét, hogy a beérkező információk a térkép megfelelő

pontjaihoz asszociálódjanak, így térben elhelyezhetőek legyenek. A térbeli

memórianyomok tehát a deklaratív memóriafunkciók részeként beépülnek a

hippokampusz által létrehozott emléktérbe, és ott kapcsolódási pontként szolgálnak a

többi emléknyom számára (Eichenbaum, 1999, 2001).

Éppen ezért a hippokampusznak alapvető szerepe van az olyan viselkedésminták

létrehozásában, mint a kontextuális félelmi reakció, ahol az állatot egy adott környezetben

negatív inger (enyhe elektrosokk) éri. Az ingerrel kapcsolatos térbeli és szenzoros

információkat megjegyezve, ha az állat ugyanabba a környezetbe kerül, jellemző félelmi

viselkedési reakciókat mutat (Fanselow, 2000; LeDoux, 2000). Ez utóbbi félelmi reakció

kialakításában a fent bemutatott módon a MRR-nak is fontos szerep jut.

IV.2.3. A hippokampális formáció anatómiája

A hippokampális formáció az idegtudósok által leginkább tanulmányozott agyi

struktúrák egyike, melynek felépítését már Ramón y Cajal is leírta. Itt csak nagyon

röviden szeretném bemutatni ennek a limbikus rendszeri területnek a felépítését, és

elemeinek egymással való főbb kapcsolatait. A lenti leírás alapját Andersen és

munkatársai 2007-es szakkönyve adja ahol a specifikus hivatkozások megtalálhatóak, így

a hippokampusz felépítésével kapcsolatban további hivatkozásokat nem adok meg.

A hippokampális formáció részeinek a különböző szerzők más-más agyi

struktúrákat tekintenek, azonban abban egyetértenek a leírások, hogy az entorhinális

kéreg, a gyrus dentatus, a hippokampusz ammon-szarvai (CA1-3), és a subiculum

alkotják ennek a temporális kérgi területnek a központi részeit. A gyrus dentatust és az

ammonszarvakat együtt szokták hippokampusznak is nevezni, és disszertációmban én is

25

ezt a nevezéktant követem. Ezeknek a területeknek a glutamaterg sejtjei egymással egy

döntően egyirányú kapcsolatrendszerrel vannak összekötve. Ebben a

kapcsolatrendszerben a kiindulási pont az entorhinális kéreg, mely a többi kérgi

struktúrából származó különböző szenzoros információkat begyűjti. Az entorhinális

kéreg II-III rétegében található piramissejtek axonjaikat két pályán keresztül küldik a

hippokampuszba: a perforáns pályán keresztül megcélozzák a gyrus dentatus

szemcsesejtjeit, míg a temporoammonikus pályán keresztül közvetlenül a CA1-be küldik

rostjaikat. A gyrus dentatus szemcsesejtjei az általuk létrehozott moharostokon keresztül

érik el a CA3 piramissejtjeit. A CA3 piramissejtjei végül a Schaffer-kollaterálisoknak

nevezett axonjaikkal küldenek információt a CA1-es piramissejtek dendritjeire. A CA1

alkotja a hippokampusz fő kimenetét: a CA1-ben található piramissejtek kizárólag a

subiculumba, valamint az entorhinális kéreg V. rétegébe vetítenek. A subiculum sejtjeiből

származó információ szintén eléri az entorhinális kéreg V. rétegének sejtjeit; ezek a sejtek

a többi kérgi struktúra felé közvetítik a hippokampuszban feldolgozott információt. Az

entorhinális kéreg-gyrus dentatus-CA3-CA1 régiók közötti közvetlen kapcsolatok

alkotják az úgynevezett három szinapszisos hurkot, mely a hippokampusz

információfeldolgozásának alapszerkezetét adja (3. ábra).

A hippokampális formáció az agyban ívelten helyezkedik el, melynek egyik

pólusa dorzomediálisan, a szeptális magokhoz közel, másik pólusa pedig

ventrolaterálisan, a temporális kéregben található. A subiculum, és a hozzá tartozó

területek a szeptotemporális tengely egyharmadánál jelennek meg; az entorhinális kéreg

ezekhez a struktúrákhoz képest még kaudálisabban helyezkedik el. A subiculum és az

entorhinális kéreg között helyezkedik el az anguláris köteg, amely az entorhinális kéreg

és a hippokampális formáció többi része közötti információt közvetítő axonokat gyűjti

össze. A szeptális pólus előtt helyezkedik el a hippokampális formációt a többi

agyterülettel összekötő axonköteg, a fimbria, mely anterior irányban a fornixban

folytatódik a corpus callosum alatt, a középvonalban. A kétoldali hippokampuszokat a

kommisszurális rostok kötik össze egymással.

26

3. ábra: A hippokampusz fő serkentő sejttípusai és kapcsolataik: a fenti ábra a

hippokampuszról készített első rajzolt ábrák egyike, Santiago Ramón y Cajal, a neves

spanyol neuroanatómus Golgi-festéssel készült munkája alapján. A Golgi-festéssel

megjelölt sejteket és dendritjeiket feketével ábrázolta, a hippokampális formáció

különböző részeiben (a részleteket lásd a szövegben). A sejtekből eredő axonok által

létrehozott pályák is felismerhetők. Az oldalsó, kis téglalapban a hippokampális

információáramlás stilizált ábrája látható. Rövidítések: CA1: cornu ammonis 1, CA3:

cornu ammonis 3, DG: gyrus dentatus, EC: entorhinális kéreg, Sub: subiculum. A kép

forrása: Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des Vertebretes, Ramón y Cajal

1909. Engedéllyel módosítva és felhasználva.

Az entorhinális kéreg egy neokortikális struktúra, a kéreg általános felépítését

mutatva 6 rétegből épül fel, melyekben különböző sejttípusok találhatóak. A gyrus

dentatus felépítése ezzel szemben jóval egyszerűbb: fő be- és kimeneti szemcsesejtjei egy

sejtrétegbe rendeződnek, a stratum granulosumba, mely V-alakban meghajlított: a V-betű

felső, CA1 és CA3 között elhelyezkedő szára a szuprapiramidális él, a CA3 alatti alsó

szár pedig az infrapiramidális él. Az ammonszarvak piramissejtjei szintén egy rétegben

27

találhatók, a stratum pyramidaléban, mely a CA1-3 régiókon keresztül megtartott. Az

egyes CA-régiók közötti határokat a piramissejtek morfológiai tulajdonságai alapján lehet

meghatározni: A CA3 és CA2-es piramissejtek nagyobbak, mint a CA1 piramissejtjei,

viszont csak a CA3 piramissejtjei kapnak a gyrus dentatus szemcsesejtjeinek

moharostjaitól bemenetet a stratum lucidum rétegében. A gyrus dentatus és az

ammonszarvak között helyezkedik el a hippokampális hasadék, amely egyúttal a

hippokampusz mély és felszíni sejtrétegeinek egymáshoz képesti meghatározásának is

referenciapontja. A hippokampusz ugyanis az egyedfejlődés során megtekeredik, így az

eredetileg a felszínen található hippokampális hasadék a mélybe kerül: így a

hippokampális hasadékhoz közelebbi rétegek jobban a felszínen elhelyezkedőnek

tekintendőek az attól távolabbi, mély rétegekhez képest. Így fordulhat elő, hogy a

hippokampusz legkülső rétegét képző, a piramissejtek és a fimbria ki- és bemenő rostjait

tartalmazó alveus egyúttal a legmélyebb réteg is. Ez alatt helyezkedik el a piramissejtek

bazális dendritjeit tartalmazó stratum oriens. Az ezt követő stratum pyramidale alatt

található a piramissejtek apikális dendritjeit tartalmazó stratum radiatum; a CA3-ban a

piramissejtek dendritjein lévő tüskés kinövések és az azokra a szemcsesejtek

moharostjaitól érkező bemenetek a stratum lucidumban találhatók meg. Végül az apikális

dendritek legvékonyabb ágait tartalmazó stratum lacunosum-moleculare következik,

legközelebb a hippokampális hasadékhoz, leginkább a felszínen. A hippokampális

hasadék alatti gyrus dentatusban szintén a felszínhez közel helyezkednek el a

szemcsesejtek dendritjei, melyek a stratum molecularét alkotják. A stratum granulosumba

rendeződött szemcsesejtek V-alakú élei között helyezkedik el a polimorf réteg, a gyrus

dentatus hilusa, mely interneuronokat, mohasejteket és a szemcsesejtek moharostjait

tartalmazza (4. ábra).

A különböző CA-régiókban található piramissejtek hippokampális formáción

belüli kapcsolatrendszere egymástól jelentősen eltér: A CA3 piramissejtjei bemenetet

kapnak a gyrus dentatus moharostjaitól. Kimeneteik a CA1-be tartó Schaffer

kollaterálisok mellett kommiszurális-asszociációs rostokat is képeznek, melyekkel az

ellenoldali, illetve azonos oldali CA3 piramissejtekkel létesítenek kapcsolatokat. A CA1-

es piramissejtek ezzel szemben a temporo-ammonikus pályán keresztül az entorhinális

kéregből közvetlenül is kapnak bemenetet, de csak kevéssé vannak egymással

összekötve.

28

A hippokampális formáció fő sejtjeinek tüzelését azonban több helyi gátlósejt is

szabályozza; a következő fejezetben ezeknek az interneuronoknak a tulajdonságait

szeretném áttekinteni.

4. ábra: A hippokampuszformáció rétegei: A: Nissl-festéssel készült horizontális metszet

a patkány hippokampuszformációról. B: Az A ábrán bemutatott hippokampusz stilizált

rajza. Rövidítések: ab: anguláris köteg, al: alveus, CA1-3: cornu ammonis 1-3, DG:

gyrus dentatus, EC: entorhinális kéreg, fi: fimbria, gcl: stratum granulosum, hf:

hippokampális hasadék, ml: stratum moleculare, Para: parasubiculum, pcl: stratum

pyramidale, Pre: presubiculum, pl: hilus, sl: stratum lucidum, sl-m: stratum lacunosum-

moleculare, so: stratum oriens, sr: stratum radiatum, Sub: subiculum. A római számok a

EC, Para és Pre területek rétegeit mutatják. Lépték: 500 μm. A kép forrása: The

Hippocampus Book, Andersen 2007. Engedéllyel módosítva és felhasználva.

IV.2.4. A hippokampuszban található interneuronok

Mivel vizsgálataink során a hippokampális formáción belül csak a

hippokampusszal foglalkoztunk, ebben a fejezetben csupán ennek a régiónak az

interneuronjairól szeretnék egy rövid összefoglalót adni.

A hippokampuszban található interneuronok közös tulajdonsága, hogy GABAerg

ingerületátvitel segítségével gátolják a piramissejteket, és szabályozzák azok működését

térben és időben. Jelenleg legalább 21 különböző típusú interneuront tudunk

megkülönböztetni a hippokampuszban (5. ábra); ezekről több kiváló összefoglaló munka

is elérhető (Bezaire és Soltesz 2013; Freund és Buzsáki 1996; Klausberger és Somogyi

29

2008). A következőkben az egyes interneuronoknak a piramissejtek szomatodendritikus

tengelyén létrehozott kapcsolatai alapján sorolom be a sejteket.

a. A piramissejtek szomatodendritikus régióját célzó interneuronok

Két fő típusuk különböztethető meg: a kosársejtek a piramissejtek sejttestjét és

proximális dendritjeit idegzik be, a kandelábersejtek pedig a piramissejtek axondombjára

adnak gátló szinapszisokat.

A kosársejtek sejttestjei többnyire a stratum pyramidaléhoz közel helyezkednek

el; dendritjeik minden rétegben megtalálhatók, axonjaik a stratum pyramidalét célozzák,

ahol a nevüket is adó kosárszerű terminálisokkal veszik körbe a piramissejteket. Egy

kosársejt akár 10 000 kapcsolatot is létrehozhat, egy piramissejten 8-11darabot, így egy

kosársejt akár 1000 piramissejtet is gátolhat egyidejűleg (Bezaire & Soltesz 2013; Miles

és mtsai. 1996). Neurokémiai tulajdonságaik szerint két típusukat különböztetjük meg: a

parvalbumin-pozitív és a kolecisztokinin-pozitív kosársejteket, melyeknek teljesen eltérő

szerepe van a hippokampális aktivitás szabályozásában (Freund 2003; Freund és Katona

2007). Ez utóbbi sejtek legnagyobb része vGluT3-mat is kifejez sejttestjében és

terminálisaiban (Somogyi és mtsai 2004).

A kandeláber- vagy axo-axonikus sejtek sejttestjei, hasonlóan a kosársejtekhez, a

stratum pyramidale közelében találhatók, dendritjeik is minden rétegben megtalálhatók.

Axonjaikkal akár 1200 piramissejtet is beidegezhetnek, átlag 6 szinaptikus kapcsolatot

létrehozva azok axondombján (Bezaire & Soltesz 2013; Li és mtsai. 1992; Somogyi és

mtsai. 1985).

b. A piramissejtek dendritjeit célzó interneuronok

Elsőként tárgyalt típusuk az úgy nevezett oriens-lacunosum moleculare (OLM)

sejt, mely onnan kapta nevét, hogy sejttestje és dendritjei a stratum oriensben találhatóak,

míg axonjaival a piramissejtek legtávolabbi dendritjeit idegzi be a stratum lacunosum-

molecularéban. Fő serkentő bemenetüket a piramissejtek által adott kollaterálisok adják;

rajtuk keresztül a piramissejteken létrejön egy negatív visszacsatoló gátló kör, melynek

fontos szerepe van a hippokampális piramissejtek aktivitásának szabályozásában (Blasco-

Ibáñez és Freund 1995; Klausberger és mtsai 2003).

30

A stratum radiatumban és lacunosum-molecularéban interneuronok több altípusa

is található, melyek sejttestjei ugyan szétszórtan helyezkednek el, de dendritjeik az egyes

rétegekbe lokalizáltak, axonjaikkal pedig a piramissejtek különböző dendritszakaszait

célozzák meg (Lacaille és Schwartzkroin 1988a; Lacaille és Schwartzkroin 1988b; Vida

és mtsai 1998). Ezekben a sejtekben több különböző neurokémiai markert is

azonosítottak, mint a vGluT3, a neuronális nitrogén monoxid szintáz, calbindin,

calretinin, neuropeptid Y, stb. Részletesebb leírásukat több munka is összefoglalja (pl.

Freund és Buzsáki 1996).

c. Interneuron-specifikus interneuronok

Három típusukat különböztetjük meg, melyek sejttestje és dendritjei különböző

rétegekben helyezkednek el, de jellemző közös tulajdonságuk, hogy célzottan bizonyos

interneuronokkal létesítenek szinaptikus kapcsolatokat. Ezek a sejtek jellemzően

calretinint vagy vazoaktív intesztinális peptidet fejeznek ki, bemenetük jelentős része

kéreg alatti magokból ered (Acsády és mtsai 1996; Gulyás és mtsai 1996; Papp és mtsai

1999). Az interneuron-specifikus sejteknek fontos szerepe lehet nagy számú

hippokampális piramissejt egyszerre történő szabályozásában, hasonlóan a neokortexben

nemrégiben leírt működésükhöz (Ayzenshtat és mtsai 2016; Muñoz és mtsai 2017; Pi és

mtsai 2013).

d. Vetítő interneuronok

Ezeknek a sejteknek is több típusát különböztetjük meg, sejttestjeik legnagyobb

része a stratum oriensben található, de más rétegekben is gyakoriak, dendritjeik minden

réteget átérnek (Gulyás és mtsai 2003; Jinno és Kosaka 2002; Jinno és mtsai 2007; Katona

és mtsai 2017; Takács és mtsai 2008). Ezek a sejtek jellemzően szomatosztatint vagy a

muszkarinos acetilkolinreceptor 2-es típusát fejezik ki (Hájos és mtsai 1997; Jinno és

mtsai 2007; Katona és mtsai 2017); axonjaikkal a mediális szeptumba, a szubikulumba

és az entorhinális kéregbe, valamint egyes sejtek esetében – a hippokampuszban történő

fő információáramlással ellentétesen – a gyrus dentatusba vetítenek (Gulyás és mtsai

2003; Jinno és mtsai 2007; Katona és mtsai 2017; Melzer és mtsai 2012; Takács és mtsai

2008). Ezeknek a sejteknek fontos szerepe lehet a mediális szeptumban és a

31

hippokampális formációban az információfeldolgozás és a hálózati aktivitás

szabályozásában (Katona és mtsai. 2017; Manseau és mtsai. 2008; Mattis és mtsai. 2014).

5. ábra: A hippokampusz interneuronjai: a hippokampusz CA1-es régióban található

piramissejtjeit (kék sejtek) legalább 21 különböző típusba sorolható interneuron idegzi

be. A hippokampusz főbb glutamaterg bemenetei bal oldalt vannak jelölve. A

piramissejtek szomatikus régióját beidegző interneuronokat narancssárgával, a

dendritikus gátlósejteket, melyek egy része távoli projekciókat is ad, pirossal, az

interneuronokat beidegző interneuronokat rózsaszínnel jelöltük. A lila nyilak jelzik a

projekciós axonok célpontját. Rövidítések: CB: calbindin, CCK: kolecisztokinin, OLM:

oriens-lacunosum moleculare sejt, vGluT3: 3-mas típusú vezikuláris glutamát

transzporter, VIP: vazoaktív intesztinális polipeptid. A kép forrása: Neuronal Diversity

and Temporal Dynamics: The Unity of Hippocampal Circuit Operations, Klausberger és

Somogyi 2008. Engedéllyel módosítva és felhasználva.

32

IV.2.5. A hippokampális hálózati aktivitás mintázatok rövid összefoglalása

A hippokampusz anatómiai viszonyai és hálózati kapcsoltsága teszi lehetővé

azoknak a hálózati aktivitás mintázatoknak a létrejöttét, melyek hippokampális rendszer

funkcióinak betöltéséhez szükségesek. Ezeket a mintázatokat a kutatók már a legkorábbi

vizsgálatok során is megfigyelték, és azóta rendkívüli tudásanyag gyűlt össze róluk,

melyeket több összefoglaló munka is bemutat (pl. Colgin 2016; Vertes & Kocsis 1997).

Itt csak rendkívül röviden szeretném összefoglalni a hippokampális hálózatban megjelenő

főbb elektromos aktivitási mintázatokat.

A hippokampuszban alapvetően két fő aktivitás mintázat figyelhető meg, melyek

kölcsönösen kizárják egymást, és más viselkedési jelenségek alatt is figyelhetőek meg: a

lassú hullámú, szinkron aktivitás melyet theta-oszcillációnak neveznek, illetve a nagy

irreguláris aktivitás, melyben időnként éleshullám-aktivitás figyelhető meg. Ezeket a

jellemző aktivitásmintázatokat több fajban is leírták a rágcsálóktól a főemlősökön át az

emberig (Bland és Oddie 1998; Colgin 2016).

A theta-ritmus az állat aktív viselkedése során megjelenő, 4-12 Hz frekvenciájú,

1-2 mV amplitúdójú, a hippokampális piramissejtek szinkron működését tükröző hálózati

aktivitás. Akkor figyelhető meg, ha az állat valamilyen szenzoros bemenetet kap, aktívan

felfedezi a környezetét, mozog, vagy REM-fázisú alvásban van (Colgin 2016; Vertes és

Kocsis 1997). A theta-oszcillációk létrehozásában a mediális szeptum, az entorhinális

kéreg és a lokális hippokampális interneuronok alapvető szerepet játszanak. Ezeknek az

elemeknek a pontos szerepét a hippokampuszban jelenleg is sokan vizsgálják, és több

kiváló összefoglaló is elérhető ezekről a kísérletekről (pl. Colgin 2016). A theta-

oszcillációknak alapvető szerepet tulajdonítanak a hippokampusz „online” működésében:

a szenzoros bemenetek feldolgozásában, az ezek közötti asszociációk létrehozásában, új

emléknyomok felvételében.

Ezzel szemben az élőlény nyugalmi állapotában, táplálkozás közben, vagy lassú

hullámú alvásakor a hippokampuszban nagy amplitúdójú, 2-25 Hz frekvenciájú

irreguláris aktivitás figyelhető meg (Bland és Oddie 1998; Dragoi és mtsai 1999).

Ezekben időnként a hippokampális piramissejtek nagy frekvenciájú (>200Hz), de rövid

33

ideig tartó szinkron kisülései, az éles-hullámok is megjelennek. Ez utóbbiak

létrehozásában a hippokampális hálózat belső felépítéséből következő kapcsolatokat

tartják főszereplőnek (Colgin 2016; Schlingloff és mtsai. 2014). A hippokampális éles-

hullámok a már felvett emléknyomok rögzítésében, a már megszerzett emlékek

előhívásában játszhatnak alapvető szerepet.

IV.3 A mediális szeptum funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása

A mediális szeptum a hippokampusszal talán legszorosabban együttműködő

bazális előagyi struktúra. Szerepét a hippokampális hálózati aktivitás szabályozásában és

ezen keresztül a különböző hippokampális funkciókban, memóriafolyamatokban már

régóta vizsgálják, és az idegtudomány utóbbi időben bekövetkezett robbanásszerű

technikai fejlődésének köszönhetően már a mediális szeptum különböző sejtpopulációi is

külön-külön vizsgálhatóvá váltak. A következőkben a mediális szeptális terület

működéséről, viselkedésben betöltött szerepéről és anatómiájáról szerzett

ismeretekeinket szeretném bemutatni.

IV.3.1. A mediális szeptum viselkedésben betöltött szerepe

Már a MS első funkcionális vizsgálatai során is előtérbe került annak

hippokampusszal való szoros kapcsolata (Bird és Aghajanian 1975; Clody és Carlton

1969; Hagan és mtsai 1988). Így nem meglepő, hogy a MS-ot összefüggésbe hozták a

különböző tanulási és memóriafolyamatokkal, beleértve a tájékozódást és térbeli

memóriát (Brioni és mtsai 1990; Elvander-Tottie és mtsai 2009; Hagan és mtsai 1988;

Kelsey és Landry 1988), a térbeli munkamemóriát (Ma és mtsai 2009; Nategh és mtsai

2015) és a tárgyak felismerését (Cai és mtsai 2012; Gangadharan és mtsai 2016). A MS

léziója akár elektromos, akár kémiai úton a fenti memóriafolyamatok hibás működéséhez

vezetett (Hagan és mtsai 1988; Kelsey és Landry 1988; Lehmann és mtsai 2003; Pang és

Nocera 1999). Hasonló hatást váltott ki a lokális GABAerg tónus fokozása GABAA

receptor agonista muszcimol intraszeptális injektálásával is (Brioni és mtsai 1990). A

mediális szeptumban található acetilkolin-tartalmú sejtek pusztulása az Alzheimer-kór

egyik legkorábbi és legjellemzőbb tünete, amely szintén az epizodikus és a térbeli

34

memóriafolyamatok károsodásával jár együtt (Colom 2006; Kesner és mtsai 1989). A MS

és a hippokampusz közötti kapcsolat a fornix-fimbria kötegen keresztül valósul meg;

ennek a struktúrának az átvágása szintén súlyos, memóriafolyamatokat érintő tünetekkel

jár, mely hatásokat rágcsálókban és főemlősökben is megfigyeltek (Gaffan és Gaffan

1991; Mumby 2001; Murray és mtsai 1989; van der Staay és mtsai 1989). Továbbá a MS-

ot összefüggésbe hozták különböző érzelmi reakciókkal is, beleértve a szorongást és a

kontextuális félelmi reakciót, melyek szintén a hippokampusszal közös működésre

utalnak (Degroot és Treit 2003; Knox és Keller 2016; Lovett-Barron és mtsai 2014;

Menard és Treit 1996).

A legfrissebb vizsgálatok a MS-ban újabb sejtcsoportokat tártak fel, illetve a MS

különböző típusú sejtjeinek szelektív megjelölésével, és aktivitásuk módosításával sokkal

célzottabban adtak információt ennek a struktúrának a pontos működéséről. A

következőkben a MS anatómiáját és különböző populációkba tartozó sejtjeinek az előagyi

aktivitás mintázatokra vonatkozó hatását szeretném röviden bemutatni.

IV.3.2. A mediális szeptum anatómiai viszonyai és sejtes felépítése

A MS a szeptális magok közé tartozó bazális előagyi terület, mely magok a

középvonalban, a két oldalkamra mediális falában helyezkednek el. A szeptális magok

közé rágcsálókban 4 nagyobb magcsoport tartozik: a ventrális, a poszterior, a laterális és

a mediális magcsoportok (Paxinos, 2004), mely utóbbi része a mediális szeptum és a

Broca-féle diagonális köteg (6. ábra). Rosztrálian és dorzálisan a corpus callosum,

laterálisan az agykamrák és a nucleus accumbens, kaudálisan a fornix határolja. A MS-

on több fő pályarendszer is áthalad, beleértve a mediális előagyi köteget, a commissura

anteriort és a fornixot, melyeken keresztül az agytörzsi és előagyi struktúrákkal, illetve a

hippokampusszal áll összeköttetésben (Paxinos 2004; Unal és mtsai 2015).

35

6. ábra: A mediális szeptális terület az

előagyban, az oldalkamrák között

helyezkedik el, mint ahogy az a fenti

koronális metszeten is látható. A

szeptum kolinerg sejtjeit fluoreszcens

immun-hisztokémiai eljárás

segítségével jelöltük meg (piros sejtek).

Rövidítések: HDB: Broca-féle

diagonális köteg, horizontális szár,

MS: mediális szeptum, VDB: Broca-

féle diagonális köteg, vertikális szár.

A MS-ban eddig 4 különböző sejtpopulációt írtak le:

- kolinerg sejteket, melyek felismerhetők kolin-acetiltranszferáz-

pozitivitásukról és lassú tüzelésükről (Sotty és mtsai 2003; Vandecasteele és mtsai 2014).

Ezek a sejtek vékony rostokat küldenek a hippokampuszba, melyekkel interneuronokat

és piramissejteket is megcéloznak (Freund és Antal 1988; Kiss és mtsai 1990; Nyakas és

mtsai 1987). Kutatócsoportunk nemrégiben kimutatta, hogy a korábban gondoltakkal

ellentétben ezek a rostok a hippokampuszban – és más agyterületeken is – neuroligin 2

(NL2)-tartalmú szinaptikus kapcsolatokat hoznak létre, melyek a klasszikus besorolás

szerinti aszimmetrikus-szimmetrikus szinapszisok csoportjaiba nem illeszkednek

(Aznavour és mtsai 2005; Takács és mtsai 2013; Umbriaco és mtsai 1995). Bernardo

Sabatini munkacsoportjának legutóbbi vizsgálatai azt feltételezik, hogy egyes bazális

36

előagyi kolinerg sejtek GABA ürítésére is képesek az agykéregben, bár ezeket a

vizsgálatokat a MS és hippokampusz viszonyában még nem végezték el (Granger és mtsai

2016; Saunders és mtsai 2015).

- parvalbumin-pozitív GABAerg sejteket, melyek vagy gyorsan vagy

csomagokban tüzelnek (Manseau és mtsai 2008; Sotty és mtsai 2003). Ezek a sejtek

vastag rostjaikkal és jól elkülönült terminálisaikkal célzottan interneuronokat idegeznek

be a hippokampuszban (Borhegyi 2004; Freund és Antal 1988; Hangya és mtsai 2009).

- a vezikuláris glutamát transzporter 2-es típusát (vGluT2) kifejező

glutamaterg sejteket, melyeket nemrégiben fedeztek fel, és a szeptohippokampális pálya

mintegy negyedét alkotják rostjaikkal (Huh és mtsai 2010; Sotty és mtsai 2003). Ezek a

sejtek kifejezetten a stratum oriens interneuronjait célozzák meg serkentő

szinapszisaikkal, de az entorhinális kéregbe is vetítenek, ahol többnyire piramissejteket

céloznak meg (Fuhrmann és mtsai 2015; Justus és mtsai 2016; Robinson és mtsai 2016).

- calbindin-pozitív GABAerg sejteket, melyek főként lokális

kollaterálisokat adnak, de a legutóbbi tanulmányok szerint az entorhinális kéregbe is

vetítenek (Aznar és mtsai 2004; Fuchs és mtsai 2016; Kiss és mtsai 1997).

A fenti sejttípusok mindegyike alakítja valamilyen módon a szeptohippokampális

hálózati aktivitás különböző formáit: az aktív felfedező viselkedés és REM-alvás közben

megjelenő theta-oszcillációkat vagy a nyugalmi állapotban előforduló éleshullám-

aktivitást. A következőkben a MS ezekre az aktivitás mintázatokra való hatását szeretném

összefoglalni.

IV.3.3. A mediális szeptum hatása az előagyi aktivitás mintázatokra

A MS különböző sejttípusai eltérő módon hatnak az előagyban megjelenő hálózati

oszcillációkra. Az utóbbi években lehetővé vált a MS-ban található sejtcsoportok

szelektív ingerlése vagy gátlása optogenetikai módszerek segítségével, mely

tanulmányoknak köszönhetően sokkal részletgazdagabb képet kaptunk a MS

működéséről.

A MS kolinerg sejtjeinek theta-ritmust elősegítő hatását eleinte a muszkarinos

acetilkolinreceptor-agonista karbakol vagy antagonista atropin hippokampuszba való

injektálásával írták le: karbakol hatására theta-ritmus indukálódott a hippokampuszban,

37

és ezt az atropin képes volt kivédeni (Colom és Bland 1991; Konopacki és mtsai 1987;

Manseau és mtsai 2008). Később a MS kolinerg sejtjeinek szelektív optogenetikai

ingerlése szabadon mozgó patkányokban ezeket a megfigyeléseket tovább erősítette

(Vandecasteele és mtsai 2014). A MS-ban található kolinerg sejtek szelektív léziója 192-

IgG-saporinnal jelentősen csökkentette a hippokampális theta-ritmus erősségét, ezzel

együtt az állatok képességét a tárgyak helyzetének azonosítására (Lee és mtsai 1994; Cai

és mtsai 2012). A kolinerg sejtek szelektív léziója azonban nem volt hatással a theta-

ritmus domináns frekvenciájára (Bassant és mtsai 1995; Lee és mtsai 1994), ami arra utal,

hogy nem a kolinerg sejtek felelősek elsődlegesen a hippokampális theta ritmusának

generálásáért.

A MS kolinerg sejtjeinek a hippokampális éleshullám-aktivitásra még

erőteljesebb hatása van: szabadon mozgó, nyugalmi állapotban lévő patkányban a

kolinerg sejtek ingerlésének hatására az éleshullám-aktivitás szinte teljesen megszűnt

(Vandecasteele és mtsai 2014). Ugyanekkor a theta-aktivitás erőssége jelentősen

fokozódott, ami további bizonyíték a theta és az éleshullám-aktivitás eltérő hálózati

állapotban való megjelenése mellett, és hogy a kolinerg sejtek elősegítik a hálózat theta-

oszcillációba való átsegítését (Kvirkvelia és mtsai 1987).

A MS parvalbumin-pozitív sejtjei a hippokampális theta-oszcillációk más

modalitásait befolyásolják. Ezeknek a sejteknek a szelektív optogenetikai ingerlése

uretánnal altatott egerekben nem segítette elő a theta-ritmusba való átmenetet, de ha az

állat hippokampuszából theta-ritmust lehetett elvezetni, ugyanez az ingerlés fokozta a

theta-ritmus erősségét. A parvalbumin-pozitív sejtek szelektív optogenetikai gátlása

csökkentette a hippokampális theta-ritmus erősségét (Gangadharan és mtsai 2016).

Ezeket a megfigyeléseket további elektrofiziológiai vizsgálatok is megerősítik, melyek

azt mutatják, hogy a MS és a diagonális köteg parvalbumin-pozitív sejtjei azok, amelyek

a theta-ritmus generálásáért felelősek, aktivitásuk megelőzi a hippokampális

interneuronok és piramissejtek aktiválódását, tüzelésük fáziskapcsolt a hippokampális

theta-oszcillációkkal (Borhegyi 2004; Hangya és mtsai 2009; Kaifosh és mtsai 2013).

Ritmusgeneráló szerepüket tovább bizonyítja, hogy működőképes HCN-csatornákat

fejeznek ki (Morris és mtsai 2004; Varga és mtsai 2008). Továbbá a MS vezikuláris

GABA transzportert kifejező sejtjeinek REM-fázisú alvás alatti gátlása jelentősen

csökkentette az erre az alvási fázisra jellemző theta-ritmus erősségét, és az előző napon

38

szerzett emlékek megjegyzését is (Boyce és mtsai 2016). Ez utóbbi felfedezés azonban a

kolinerg sejtekben esetleg jelenlévő GABAerg neurotranszmisszió és a MS-ban található

calbindin-pozitív GABAerg sejtekre való hatás miatt nem tekinthető teljesen szelektívnek

a parvalbumin-pozitív sejtekre.

A MS parvalbumin-pozitív sejtjeinek egy része a hippokampális éleshullám-

aktivitás alatt fokozott tüzelést mutat (Viney és mtsai 2013). Ennek magyarázata az lehet,

hogy a hippokampális éleshullám-események elindításában és fenntartásában nagy

szerepe van a CA3-ban található piramissejtek lokális kollaterálisainak, melyek gyors

glutamaterg serkentéssel segítik fenntartani egymás fokozott aktivitását (Schlingloff és

mtsai 2014). A piramissejtek kimenetét gátló axoaxonikus sejtek megakadályozzák ennek

a serkentő hatásnak a létrejöttét és megfigyelhető hogy az axoaxonikus sejtek az

éleshullám-események alatt nem tüzelnek. Azonosított axoaxonikus sejteken a MS-ban

található parvalbumin-pozitív sejtek szinapszisokat hoznak létre, működésükkel gátolva

azok tüzelését (Viney és mtsai 2013). Azonban nem minden MS-ban található

parvalbumin-pozitív sejt fokozta tüzelését az éleshullámok alatt, és egy korábbi

munkában azt figyelték meg, hogy az éleshullám-aktivitás alatt a MS sejtjei többségének

csökken a tüzelési frekvenciája (Dragoi és mtsai 1999). Ez utóbbi populációba

beletartozhatnak egyes parvalbumin-pozitív sejtek is.

A MS vGluT2-pozitív sejtjeinek szintén alapvető szerepük van a hippokampális

theta-ritmus szabályozásában. Elegáns optogenetikai kísérleteikkel Stefan Remy és

munkacsoportja kimutatta, hogy a MS-ban található glutamaterg sejtek szelektív

aktivitása megelőzi a hippokampális theta-oszcilláció kialakulását. A sejtek tüzelési

frekvenciájának növelésével a hippokampuszban gyorsabban alakult ki a theta-ritmus és

nagyobb volt az oszcilláció frekvenciája is, mellyel párhuzamosan az egerek aktív

mozgásba kezdtek és mozgási sebességük is egyenesen arányos volt a vGluT2-pozitív

sejtek ingerlési frekvenciájával (Fuhrmann és mtsai 2015). Hasonló hatásokat figyeltek

meg az entorhinális kéregben is, ahol a MS vGluT2-pozitív sejtjeiből származó rostok

aktivitása theta- vagy sebesség-modulált változásokat mutatott (Justus és mtsai 2016).

Emellett a vGluT2-es sejtek lokális kollaterálisai is fontos szerepet játszhatnak a

hippokampális theta-ritmus létrehozásában, a többi szeptális sejttípus aktivitásának

fokozásával (Leao és mtsai 2014; Robinson és mtsai 2016). Ez összhangban van azzal,

hogy ha MS parvalbumin-pozitív sejtjeinek ingerelhetősége fokozódik, a

39

hippokampuszban megnő a theta-oszcilláció gyakorisága és erőssége (Gangadharan és

mtsai 2016). A MS vGluT2-pozitív sejtjeinek hatását a hippokampális éleshullám-

aktivitásra eddig még nem vizsgálták.

A MS különböző sejtjei tehát alapvető fontossággal bírnak az előagyi hálózati

aktivitás szabályozására és ezen keresztül az állat kognitív folyamataira és viselkedésére

is. A MS-ra ható, külső magokból (mint például a MRR-ból) származó bemenetek tehát

jelentősen befolyásolhatják a szeptohippokampális rendszer működését.

IV.4. A mediális prefrontális kéreg funkcionális anatómiájának rövid

összefoglalása

Az agykéreg az agy fejlődéstanilag legfiatalabb, legkésőbb kialakult része. A

gerincesek evolúciója során az agy testtömeghez viszonyított mérete jellemzően

növekszik, és ezen a növekedésen belül is az agykéreg növekedése a legszembetűnőbb.

Az egyes agykérgi területek fejlődése között is eltérések mutatkoznak, és a főemlősökben

egyértelműen a homloklebenyben található prefrontális kéreg, illetve annak a középvonal

felé néző, mediális része mutatja a legnagyobb növekedést (Shepherd, 2004).

A mediális prefrontális kéregnek (mPFC) több, a legmagasabbrendű kognitív

tevékenységgel kapcsolatos funkcióját írták le, mint a döntéshozás, motiváció, a figyelem

fenntartása, a viselkedési gátlás és a hibafelismerés (Szirmai, 2005). Több tanulmány

foglalkozott a mPFC munkamemóriában, illetve hosszú távú memóriában betöltött

szerepével is (Euston és mtsai 2012). A mPFC rendkívül gazdag kapcsolatrendszerrel

rendelkezik, információt kap a kívülről érkező szenzoros információkat feldolgozó kérgi

területektől és az érzelmeket és az élőlény belső állapotát felmérő agytörzsi és bazális

előagyi magoktól is (Heidbreder és Groenewegen 2003). A mPFC így a korábbi emlékek

és benyomások alapján, a szenzoros ingereket és a belső állapotot feldolgozva képes

döntést hozni az élőlény reakciójáról, és ezt a döntést szándékká alakítva elindítani a

válaszreakciót (Euston és mtsai 2012). A mPFC működésének bizonyos aspektusai tehát

csak emberben vizsgálhatóak hatékonyan; erre bizonyos emberre specifikus

neuropszichiátriai megbetegedésekben való érintettsége is utal, mint például a skizofrénia

(Szirmai, 2005). Egyes funkciói azonban rágcsálókban is tanulmányozhatóak.

40

7. ábra: A mediális prefrontális kéreg

anatómiája: A-F: a rosztrokaudális

tengelyen egymás után következő, Nissl-

festéssel megjelölt koronális metszeteken

a mPFC alrégiói láthatók. Az A kép a

legrosztrálisabb, az F a legkaudálisabb. A

fehér és fekete nyílhegyek jelölik az

alrégiók határait. Rövidítések: ACd:

anterior cinguláris kéreg, dorzális rész,

Acv: anterior cinguláris kéreg, ventrális

rész, Fr2: mediális precentrális terület,

IL: infralimbikus kéreg, IG: induseum

griseum, MO: mediális orbitális kéreg,

PL: prelimbikus kéreg, TT: taenia tecta. A

kép forrása: The medial prefrontal cortex

in the rat: evidence for a dorso-ventral distinction based upon functional and anatomical

characteristics, Heidbreder és Groenewegen 2003. Engedéllyel módosítva és

felhasználva.

A mPFC legalább 5, a sejtfelépítése alapján különböző területre osztható

rágcsálókban. Ezek a mediális precentrális terület (Fr2), az anterior cinguláris kéreg

(A24), a prelimbikus terület (A32), az infralimbikus terület (A25) és a mediális orbitális

kéreg (7. ábra). Egyes besorolásokban azonban egy dorzoventrális tengely menti

felosztás érvényesül, mely a mPFC dorzális részébe helyezi a Fr2, A24 és a dorzális A32

területet, és a mPFC ventrális részének a ventrális A32 és az A25 területeket tekinti

(Heidbreder és Groenewegen 2003). Ezek a területek az agykéregre jellemző, 6 rétegű

felépítést mutatják, az egyes rétegekben különböző típusú principális sejtek találhatóak.

Ezeknek a sejteknek a működését a kéregben elhelyezkedő GABAerg interneuronok gátló

szinapszisaikkal szabályozzák, melyek sokfélesége a hippokampális interneuronokét is

felülmúlja (Tremblay és mtsai 2016). Ezen interneuronok egy része – egyes

hippokampális interneuronokhoz hasonlóan – kéreg alatti területektől, mint a MRR vagy

a MS is kap bemenetet (Puig és mtsai 2004).

41

IV.5. A hippokampusz, a mediális szeptum és a mediális prefrontális kéreg

összeköttetései

A fent bemutatott agyterületek egymással szoros összeköttetésben vannak, így

képesek összehangoltan hatni az élőlény viselkedésére. A hippokampusz és a MS

egymással több sejttípuson keresztül összeköttetésben áll a fornixban haladó pályákon

keresztül. A MS kolinerg, GABAerg és glutamaterg sejtjeinek a hippokampuszba való

vetítését fentebb részletesen tárgyaltam; azonban a hippokampusz felől a MS-ba is folyik

információáramlás. A hippokampuszban található vetítő GABAerg sejtek (hippokampo-

szeptális, azaz HS sejtek) a MS több sejtpopulációját is beidegzik gátló, GABAerg

szinapszisaikkal, azonban a parvalbumin-pozitív GABAerg sejteket valamivel nagyobb

arányban célozzák meg (Manseau és mtsai 2008; Mattis és mtsai 2014). Azonban in vitro

szepto-hippokampális preparátumban a HS sejtekből származó GABAerg bemenet

elősegítette a parvalbumin-pozitív sejtek ritmikus tüzelését a HCN-csatornákon keresztül

folyó áram aktiválásával (Hangya és mtsai 2009; Manseau és mtsai 2008). A HS sejtek

fő serkentő bemenetüket a hippokampusz lokális piramissejtjeitől kapják, de a MS

GABAerg sejtjeitől is kapnak gátló bemeneteket, tehát ideális helyzetben vannak a

hippokampális hálózati állapot felméréséhez (Takács és mtsai 2008). A HS sejtek

hippokampuszban, MS-ban és a retrohippokampális területeken létrehozott kapcsolataik

segítségével képesek lehetnek ezeknek a területeknek a működését összehangoltan

szabályozni (Gulyás és mtsai 2003; Jinno és mtsai 2007; Katona és mtsai 2017; Takács

és mtsai 2008).

A MS és mPFC között kétirányú összeköttetés figyelhető meg, mely

topografikusan szervezett. A mPFC ventrálisabb részei a szeptális magok mediálisabb

részére, azaz a MS-ba és a ventrális diagonális kötegbe vetítenek, míg a mPFC

dorzálisabb részei inkább laterálisan, a horizontális diagonális kötegbe küldenek rostokat.

Ezek a rostok a MS kolinerg és GABAerg sejtjeit is elérik (Heidbreder és Groenewegen

2003). Ezzel szemben a szeptális magok mediális részéről a mPFC mediális oldalára,

laterális részéről pedig inkább a mPFC laterálisabb területeire halad a vetítés, mely

jellemzően a kolinerg sejtekből származik (Gaykema és mtsai 1990; Paxinos 2004).

A mPFC és a hippokampusz közötti vetítés azonban egyirányú, ugyanis a mPFC

nem vetít közvetlenül a hippokampuszba, bár az abból származó információ az

42

entorhinális kérgen keresztül elérheti a hippokampuszt; ezzel szemben a hippokampusz

ventrális CA1 régiójának piramissejtjei megcélozzák a mPFC ventrálisabban fekvő

területeit (Heidbreder és Groenewegen 2003; Thierry és mtsai 2000). A hippokampusz és

a mPFC képes theta-ritmusban összehangoltan működni, melyre a térbeli munkamemória

helyes működéséhez lehet szükség (O’Neill és mtsai 2013; Numan 2015).

IV.6. A median raphe régió vetítése az előagyi területekre

A MRR hatását a fent tárgyalt előagyi hálózati aktivitásmintázatokra az egyes

agyterületekre való vetítésén keresztül éri el. A MRR-ból származó rostok szinte minden

agyterületet elérnek, ahol nagyon célzottan idegeznek be bizonyos sejteket (Vertes és

mtsai 1999). A következőkben csak a MRR fenti agyterületekkel kapcsolatos vetítési

mintázatát mutatom be.

A MRR a hippokampuszban specifikus vetítési mintázattal rendelkezik: a stratum

oriensbe és a stratum radiatum és lacunosum-moleculare határára adja legtöbb rostját,

melyek átmérője vastag, és azokon nagy méretű, terminálisok találhatóak (Somogyi és

mtsai 2004). A MRR a hippokampuszban célzottan interneuronokat idegez be, azok

sejttestjein akár 40 terminálist is létrehozva (Freund és mtsai 1990; Halasy és mtsai 1992).

Ezek az interneuronok több csoportba tartoznak, leírtak calbindin, kolecisztokinin,

calretinin, neuropeptid Y és szomatosztatin-tartalmú sejteket is a célsejtek között (Freund

és mtsai 1990; Halasy és mtsai 1992; Miettinen és Freund 1992; Varga és mtsai 2009),

azonban a MRR elkerüli a parvalbumin-pozitív sejteket a hippokampuszban (Freund és

mtsai 1990). A MRR hippokampuszba vetítő rostjai 5HT- és/vagy vGluT3-pozitívak, és

igen hatékonyan, ionotrop 5HT3- és AMPA-receptorokon keresztül képesek serkenteni

ezeket az interneuronokat, rajtuk keresztül pedig erős hatást gyakorolnak a hippokampális

hálózati működésre (Chittajallu és mtsai 2013; McMahon és Kauer 1997; Morales és

Bloom 1997; Ropert és Guy 1991; Varga és mtsai 2009).

A MRR a MS-ba nagyon sűrű rosthálózatot küld, ahol ezek a rostok, hasonlóan a

hippokampális vetítéshez, GABAerg sejteket céloznak meg, beleértve a parvalbumin- és

a calbindin-pozitív populációt is (Aznar és mtsai 2004; Leranth és Vertes 1999). A MRR

rostjai ezeken a sejteken gyakran kosárszerű beidegzést hoznak létre, 5-15 terminálissal

körülvéve azokat (Aznar és mtsai 2004). A MS-ban is 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív

43

terminálisok találhatóak, bár úgy tűnik, hogy ezek mellett még legalább egy sejtpopuláció

erőteljesen vetít a MRR-ból a MS-ba (Jackson és mtsai 2009). A MRR szeptális hatásait,

melyet különböző ionotróp és metabotróp szerotonin- és glutamát-receptorokon keresztül

hoz létre, feljebb tárgyaltam.

A mPFC-ben a MRR szintén interneuronokat céloz meg, melyek

tulajdonságaikban nagyon hasonlítanak a MRR hippokampális célsejtjeihez (Puig és

mtsai 2004). Ezek a sejtek általában a kéreg felszíni, I vagy II/III rétegében találhatóak,

kolecisztokinin-pozitívak, és membránjukon kifejeznek 5HT3-receptorokat. Ezeknek a

célsejteknek megfelelő a MRR rostjainak kérgi eloszlása is, mely a legnagyobb sűrűséget

a fenti rétegekben mutatja (Mamounas és mtsai 1991; Vertes és mtsai 1999).

A MRR számos sejtje képes egyszerre több agyterületet is beidegezni

kollaterálisaival, pl. az ellenoldali hippokampuszokat, az azonos oldali hippokampuszt és

entorhinális kérget, vagy a hippokampuszt és MS-ot (Acsády és mtsai 1996; Köhler és

Steinbusch 1982; McKenna és Vertes 2001). Ezeknek a sejteknek egy jelentős része

szerotonerg, de találtak kettősen vetítő nem szerotonin-pozitív sejteket is, melyek

pontosabb neurokémiai tulajdonságait eddig még nem vizsgálták.

IV.7. A szerotonerg és glutamaterg neurotranszmisszió molekuláris elemei

IV.7.1. A szerotonerg neurotranszmisszió

A szerotonin egy aminosavszármazék: triptofánból a triptofán-hidroxiláz (TpH)

nevű enzim 5-hidroxitriptofánt készít (8. ábra, a), amelyet az aromás aminosav-

dekarboxiáz (AADC) tovább alakít 5-hidroxi-triptaminná (8. ábra, b), azaz szerotoninná

(5HT). A központi idegrendszerben a 5HT-t a vezikuláris monoamin-transzporter

(VMAT2) juttatja a szinaptikus vezikulákba (8. ábra, c). A 5HT vezikulákból való

kiürülése után (8. ábra, d) hat a receptorain (8. ábra, e), majd a szinaptikus résből és

környezetéből a szerotonin-transzporter (SERT) segítségével kerül visszavételre a

terminális vagy a sejttest citoplazmájába (8. ábra, f). Innen vagy visszakerül a

vezikulákba (8. ábra, g), vagy a monoamin-oxidáz A enzim (MAO-A) segítségével

lebomlik (8. ábra, h) hidroxi-indolecetsavvá (5-HIAA; Adam és mtsai 2006; Gyires és

mtsai 2011; Wong és mtsai 2005).

44

8. ábra: A szerotonerg neurotranszmisszió: az ábrán egy kékkel jelölt szerotonerg sejt és

egy barna színnel jelölt célsejt ábrázolása látható. A szerotonerg sejtben láthatók a

szerotoninszintészis fő lépései, és a preszinaptikus szerotonin-receptor típusok jellemző

elhelyezkedése, a posztszinaptikus sejtben pedig a posztszinaptikus szerotonin-receptor

típusok, és jelátviteli útvonalaik. Részletek a szövegben. Rövidítések: 5-HIAA: 5-

hidroxiindolecetsav, 5-HT: szerotonin, 5-HTP: 5-hidroxitriptamin, AC: adenilát-cikláz,

AADC: aromás aminosav dekarboxiláz, ATP: adenozin-trifoszfát, cAMP: ciklikus

adenozin-monofoszfát, DAG: diacilglicerol, IP3: inozitol-trifoszfát, MAO: monoamin-

oxidáz, PC: foszfolipáz C, PIP2: foszfatidilinozitol 4,5-bifoszfát, TRYP: triptofán. A kép

forrása: The discovery of fluoxetine hydrochloride (Prozac), Wong és mtsai 2005.

Engedéllyel módosítva és felhasználva.

A 5HT-nak nagyon sok különböző receptora van az agyban: a szerotonin-

receptorok családját a 5HT1-7 nevű receptorok alkotják, melyek különböző sejteken, vagy

a sejtek különböző membránszakaszain helyezkednek el, és a legkülönfélébb hatásokkal

rendelkeznek (Gyires és mtsai 2011). A 5HT egyetlen jelenleg ismert ionotróp receptora

a 5HT3-receptor, a többi receptor mind metabotróp, G-fehérje kapcsolt 7-transzmembrán

fehérje. A 5HT1 és 5HT5 családba tartozó receptorok Gi/o-fehérjékhez kapcsoltan

csökkentik az adenilát cikláz aktivitást; a 5HT2 családba tartozó receptorok Gq/11 kapcsolt

módon az intracellulláris Ca2+-szint emelkedését váltják ki; az 5HT4, 5HT6 és 5HT7

45

családba tartozó receptorok pedig Gs-fehérje kapcsolt módon növelik az adenilát-cikláz

aktivitását. Ezeknek a receptoroknak a működését és elhelyezkedését a központi

idegrendszerben több összefoglaló munka is taglalja (pl. Barnes és Sharp 1999).

A 5HT3-receptorok jelenlétét mind a hippokampuszban, mind a MS-ban, mind a

mPFC-ben kimutatták bizonyos GABAerg sejteken; ezeknek a sejteknek az

elhelyezkedése a MRR-ból érkező beidegzéssel megegyező mintázatot mutat. Továbbá a

fenti agyterületeken a 5HT3-receptorok funkcionálisak, és posztszinaptikus serkentő

potenciálok kialakításában vesznek részt (Chittajallu és mtsai 2013; McMahon és Kauer

1997; Morales és Bloom 1997; Morales és mtsai 1998; Puig és mtsai 2004; Ropert és Guy

1991). Ezen receptorok szerepét a MRR rostjai által a fenti agyterületekre közvetített

információ átvitelében, illetve a glutamaterg neurotranszmisszióval való

együttműködésben még mindig nem pontosan értjük.

IV.7.2. A glutamaterg neurotranszmisszió

A glutamát a központi idegrendszerben előforduló leggyakoribb

neurotranszmitter, serkentő hatását már az 1950-es években leírták. A glutamát egy

aminosav, ingerületátvivő szerepe mellett több metabolikus folyamatban is részt vesz,

ezért a sejtekben bőségesen elérhető. A vér-agy gáton nem képes átmenni, ezért az agyban

szintetizálódik, több lehetséges úton: vagy alfa-ketoglutarátból glutamát-dehidrogenáz

segítségével; vagy transzaminálással; vagy glutaminból glutamináz segítségével. Ez

utóbbi reakcióhoz a gliasejtek közreműködése is szükséges: a gliasejtekben lévő

glutamátból a glutamin-szintáz glutamint készít, amely a neuronokba transzportálódik, és

ott a mitokondriumok belső membránján található glutamináz segítségével alakul vissza

glutamáttá (Adam és mtsai 2006). A glutamátot a vezikuláris glutamát transzporterek 3

típusa (vGluT1-3) juttatja a szinaptikus vezikulákba; ezeknek a transzportereknek az

elhelyezkedése agyterületenként és sejttípusonként különböző. A vGluT1 főleg a kérgi

sejtekben található; a vGluT2-t többnyire a kéreg alatti struktúrák glutamaterg sejtjei

fejezik ki; a vGluT3 pedig olyan sejtekben található, amelyek jellemzően más

neurotranszmittereket is használnak kommunikációjuk során; ezek lehetnek kérgi

GABAerg interneuronok, illetve monoaminerg magokban található sejtek (Fremeau és

46

mtsai 2004; Somogyi és mtsai 2004). A szinaptikus résbe ürített glutamátot a serkentő

aminosav-transzportereknek nevezett fehérjék távolítják el az extracelluláris térből.

A glutamátnak metabotróp (mGluR) és ionotróp (iGluR) receptorai is vannak a

központi idegrendszerben. A nyolc metabotróp glutamát-receptor három csoportba

tartozik, melyek különböző típusú G-fehérjékhez kapcsolódnak. A mGluR I csoportba

tartozó mGluR1 és mGluR5 Gq/11 kapcsolt módon az intracellulláris Ca2+-szint

emelkedését váltják ki, és jellemzően posztszinaptikusan helyezkednek el. A mGluR II

csoportba tartozó mGluR2 és mGluR3 Gi/o-fehérjékhez kapcsoltan csökkentik az adenilát

cikláz aktivitást, és a DCG-IV nevű anyag agonistaként hat rajtuk. A mGluR III csoportba

tartozó mGluR4, mGluR6, mGluR7 és mGluR8 szintén Gi/o-fehérjékhez kapcsolt, és az

L-AP4 nevű anyag hat rajtuk agonistaként. Ez utóbbi két csoportba tartozó receptorok

tagjai jellemzően preszinaptikusan helyezkednek el (Conn és Pin 1997).

Az iGluR-ok három főbb csoportba sorolhatók. Az AMPA-receptoroknak 4

alegységét tartjuk számon (GluA1-4), melyek jellemzően heterotetramerek formájában

állnak össze egy receptorrá. A következő csoport a kainát-receptoroké, melyek a kis-

affinitású GluK1-3 (régen GluR5-7) illetve a nagy-affinitású GluK4-5 (régen KA1-2)

alegységekből épülhetnek fel. Végül az NMDA-receptorok csoportjába tetramer

szerkezetű receptorok tartoznak, melyek alegységei további 3 alcsoportba sorolhatók:

ezek a GluN1, GluN2A-D, illetve a GluN3A-B alegységek (Dingledine és mtsai 1999).

Az NMDA-receptorok heterotetramerek, jellemzően 2 konstitutív GluN1 és 2 GluN2

alegységből épülnek fel. A GluN2 alegységek felelősek a glutamát megkötéséért, a

GluN1 alegységek pedig a NMDA-receptorok membránba való kihelyeződéséért és a ko-

agonista glicin megkötéséért felelősek (Paoletti, 2011). Az NMDA-receptorok ligand- és

feszültségfüggő csatornák, ugyanis nyugalmi állapotban egy Mg2+-ion zárja el a csatorna

nyílását, amely csak egy bizonyos membránpotenciál-érték felett lökődik ki, és enged

szabad utat az ionáramlásnak, amennyiben a glutamát és glicin (vagy D-szerin) is jelen

van (Dingledine és mtsai 1999; Paoletti 2011).

A glutamát szinaptikus résből való kiürülése után a szinaptikus ingerületátvitelt

az AMPA-receptorok indítják el. Az ezeken a receptorokon keresztül a posztszinaptikus

sejtbe áramló Na+-ionok depolarizálják a posztszinaptikus membránt, így elősegítik a

NMDA-receptorok Mg2+-ion általi blokádjának feloldását. Az NMDA-receptorokhoz

kötődő glutamát (illetve a ko-agonista glicin vagy D-szerin) hatására nyit a csatorna, és

47

Ca2+-ionok áramlanak be a sejtbe. Ezek a Ca2+-ionok nem csak erős depolarizációt

váltanak ki, hanem különböző másodlagos hírvivő rendszerek aktiválásán keresztül

hosszabb léptékben érvényesülő változásokat is elindítanak a sejtekben (Paoletti, 2011).

Ilyen például a szinapszis membránjában az AMPA-receptorok mennyiségének

megnövelése, mely a szinapszis megerősödésével jár együtt: ezt a jelenséget nevezzük

hosszútávú potenciációnak, mely a tanulás- és memóriafolyamatok egyik alapját képezi

(Malenka és Bear 2004). A glutamaterg neurotranszmisszió összefoglalása a 9. ábrán

látható.

48

9. ábra: A glutamaterg neurotranszmisszió: a kékkel jelölt glutamaterg sejtben a glutamát

vezikulákba töltődik (a), majd felszabadul a szinaptikus résbe a preszinaptikus aktív

zónában (b) mely folyamat a terminális membránjában elhelyezkedő ioncsatornáktól függ

(c). Glutamát a lilával jelölt gliasejtekből is felszabadulhat (d), miután vagy különböző

receptorokon hat, melyek vagy a szürkével jelölt posztszinaptikus sejt posztszinaptikus

denzitáshoz (f) vannak kihorgonyozva a klasszikus aszimmetrikus szinapszisokban (g,h),

vagy extraszinaptikusan helyezkednek el (e,i), vagy preszinaptikus autoreceptorok (k). A

glutamát receptorain való hatása után a gliasejtekbe kerül visszavételre (j), ahol

metabolikus átalakulás után glutaminná alakul, mely visszakerülhet az idegsejtbe.

További részletek a szövegben. Rövidítések: EAAT: serkentő aminosav-transzporter, Gln:

glutamin, Glu: glutamát, SNARE: vezikulaürülésben részt vevő fehérjék, VGLUT:

vezikuláris glutamát transzporter. A kép forrása: Targeting the glutamatergic system to

develop novel, improved therapeutics for mood disorders, Sanacora és mtsai 2008.

Engedéllyel módosítva és felhasználva.

49

V. CÉLKITŰZÉSEK

1. A median raphe régió (MRR) szerotonerg sejtjeinek kialakulása egy

meghatározott genetikai programhoz kötött, melyben különböző transzkripciós faktorok

játszanak szerepet. Ezek közé a transzkripciós faktorok közé tartozik az ePet/PET-1

rendszer is, mely a szerotonerg fenotípus kialakítása mellett annak fenntartásában is részt

vesz. Az ePet/PET-1 rendszert a szerotonerg sejtekre specifikusnak gondolták. Az utóbbi

időben azonban a szerotonerg sejtektől eltérő, velük részben átfedő, egyéb neurokémiai

tulajdonságokkal rendelkező sejteket is leírtak a MRR-ban, mint a vGluT3-pozitív

glutamaterg sejtek, vagy az ezek mellett elhelyezkedő GABAerg sejtek, melyek

funkcióját még csak most kezdik feltárni. E sejtek pontos számát és egymáshoz

viszonyított arányukat, MRR-ban való pontos eloszlásukat még mindig nem ismerjük.

Első kísérleteinkben tehát a következő kérdésekre kerestük a választ:

Kérdéseink:

1a) Mi a MRR-ban található, különböző fenotípusú idegsejtek pontos száma?

1b) Milyen arányban képviseltetik magukat a különböző sejtpopulációk?

1c) Melyek között van átfedés, és annak mi a pontos mértéke?

1d) Az ePet/PET-1 rendszer valóban specifikus-e a szerotonerg sejtekre?

2. A MRR-ból felszálló pályarendszer az egész agyat elárasztja rostjaival, és erős

hatással bír az előagyi hálózati aktivitás mintázatokra. A MRR szerotonerg és vGluT3

pozitív sejtjei (melyek részben átfednek) mind vetítenek az előagyba. A vGluT3 pozitív,

nem szerotonerg előagyi vetítésnek a mértéke még mindig nem ismert.

Kérdésünk:

2a) Mennyire jellemző a MRR-ra a nem szerotonerg, glutamaterg vetítés?

3. Kutatócsoportunk korábbi munkáiból kiderült, hogy a MRR vGluT3-pozitív

vetítő sejtjei a hippokampuszban gyors és hatékony glutamaterg ingerületátvitelen

keresztül szabályozzák a MRR célsejtjeit. Ennek a glutamaterg ingerületátvitelnek a

50

molekuláris elemei azonban nem mind azonosítottak a MRR előagyi szinapszisaiban. Bár

kutatócsoportunk leírta a MRR szinapszisaiban az AMPA-típusú glutamát-receptorok

jelenlétét, a hosszú távú szinaptikus plaszticitási és tanulási folyamatokban alapvető

fontosságú NMDA-receptorok jelenlétéről nem volt információnk ezekben a

szinapszisokban. Továbbá nem volt ismert, hogy a MRR-ból számazó glutamaterg

transzmisszió a MRR által beidegzett többi agyterületen is megvalósulhat-e.

Kérdésünk:

3a) Megtalálhatók-e az AMPA-típusú glutamát-receptorok mellett az NMDA-

receptorok is a MRR hippokampális szinapszisaiban?

3b) Vajon a MRR mediális szeptumban és mediális prefrontális kéregben létrehozott

szinapszisai is tartalmaznak NMDA-receptorokat, azaz ott is jellemző-e a glutamaterg

jelátvitel?

4. A MRR egyes sejtjei képesek egyszerre több agyterületet beidegezni, azonban

a MRR-ban található nem szerotonerg vGluT3-pozitív sejtek több agyterületre való

vetítési képességét nem vizsgálták. Ha ez megvalósul, akkor az a gyors és hatékony

glutamaterg ingerületátvitel segítségével szinkron szabályozhatná célterületének hálózati

aktivitását.

Kérdésünk:

4a) Képesek lehetnek-e a MRR glutamaterg sejtjei több agyterület összehangolt

beidegzésére? Mi ezeknek a sejteknek a neurokémiai profilja?

51

VI. MÓDSZEREK

VI.1. Etikai állásfoglalás

Minden kísérletet a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi

Kutatóintézet (MTA KOKI) Etikai Kódexe és a kísérleti állatok védelméről szóló

hatályos magyar törvény alapján végeztünk, mely összhangban van az Európai Közösség

által 2010. szeptember 22-én elfogadott irányelvekkel (2010/63/EU). A kísérleteket az

MTA KOKI Állatkísérleti Bizottsága és a Pest Megyei Kormányhivatal a PE/EA/2553-

6/2016 ügyiratszámon engedélyezte.

VI.2. Felhasznált kísérleti állatok

A kísérletek során minden esetben hím egereket használtunk, melyek különböző típusú

törzsekbe tartoztak. Ezen egértörzsek típusát, a kísérletenként felhasznált állatok

darabszámát és az állatok származási helyét az 1. táblázat mutatja. A kísérletekhez

vGAT-IRES-Cre egereket kereszteztünk Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 vagy

Gt(ROSA26)Sor_CAG/tdTomato riporter egerekkel, vagy ePet-IRES-Cre egereket

Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 riporter egerekkel. Az utódokban mindazok a sejtek,

amelyekben a vGAT vagy az ePet promotere aktív volt, zöld vagy piros színű

fluoreszcens fehérje volt detektálható. Az állatok életkora 29-118 nap között mozgott; a

sztereológiai kísérletekhez korban illő, fiatal, ivarérett felnőtt 42-49 napos állatokat

használtunk fel.

52

1. táblázat: A kísérletek során felhasznált állattörzsek típusa és származási helye és a

felhasznált állatok darabszáma.

VI.3. Sztereotaxiás műtétek, anterográd és retrográd pályajelölés

Az egereket a műtét kezdete előtt izoflurán (Forane, Abbvie) gőzével elbódítottuk,

majd intraperitoneális altatókoktél injekciót kaptak (8.3 mg/ml ketamin és 1.7 mg/ml

xylazin-hidroklorid fiziológiás sóoldatban, 10ml/ttkg mennyiségben). A műtéti

anesztézia elérése utén az egereket egy sztereotaxiás készülékbe fogtuk. A műtétekhez

egy Recording Nanoject-R típusú mikroinjektort, és a hozzá tartozó boroszilikát

Egértörzs Kísérlet típusa

Darabszám

(állatok

azonosítója)

Származási

hely

C57Bl/6 vad típus

sztereológia 1 (WT)

MTA KOKI

anterográd pályajelölés 3

retrográd pályajelölés

(mPFC-HIPP)

3 (Egér 1, Egér 2,

Egér 5)

retrográd pályajelölés

(mPFC-MS)

4 (Egér 3, Egér 4,

Egér 6, Egér 7)

immunhisztokémiai

vizsgálatok 5

vGAT-IRES-Cre ::

Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 sztereológia

3 (GM1, GM2,

GM3)

Jackson

Laboratories

vGAT-IRES-Cre ::

Gt(ROSA26)Sor_CAG/tdTomato sztereológia 1 (GM4)

Jackson

Laboratories

ePet-IRES-Cre ::

Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 sztereológia

3 (PM1, PM2,

PM3)

Jackson

Laboratories

vGluT3 KO immunhisztokémiai

vizsgálatok 1

Jackson

Laboratories

53

mikropipettákat használtunk (Drummond, Broomall, PA, USA), melyek hegyét 28-36µm

vastagságúra törtük.

Az anterográd pályajelöléshez 5-9nl 10kDa molekulatömegű biotinilált dextrán

amint (10 kDa BDA; Molecular Probes) injektáltunk az egerek median raphe régiójába

(MRR), Paxinos és Franklin egér sztereotaxiás atlasza (Paxinos és Franklin 2012, 4.

kiadás) alapján meghatározott koordinátákra, mely a bregmától 4.4 mm-re poszterior, a

középvonalban, a bregma és a lambda által meghatározott horizontális síktól (nullszint)

4.5 mm-re ventrálisan helyezkedtek el. Bár a szakirodalom szerint a 10kDa BDA csak

anterográd terjedésre képes (Lanciego és Wouterlood 2011), ellenőriztük más

agyterületeken is az esetleges retrográd pályajelölődést, de csupán pár BDA-val jelölt

sejtet figyeltünk meg a MRR közvetlen közelében; valószínűtlen, hogy ezek a sejtek az

általunk vizsgált előagyi területekre észlelhető mennyiségben küldtek volna rostokat.

A retrográd pályajelöléshez először 14-18 nl 2%-os FluoroGoldot (FG;

Fluorochrome, Denver, CO, USA) injektáltunk a mediális prefrontális kéregbe. Három

egérben csak a bal oldali mPFC-be injektáltunk, a bregmától 1.8 mm-re anterior, a

középvonaltól 0.3 mm-re laterális, és a nullszinttől 2.7 mm-re ventrális pozícióba.

Ezekben az állatokban további 3 darab, egyenként 18-23 nl 0.5%-os koleratoxin-B (CTB;

List Biologicals, Campbell, CA, USA) injekcióval árasztottuk el a bal oldali

hippokampuszt, a bregmától 2.5 mm, 2.8 mm, 3.2 mm-re poszterior, a középvonaltól 1.6

mm, 1.6 mm, 1.7 mm-re laterális, és a nullszinttől 2.1 mm, 2.1 mm és 2.2 mm-re ventrális

koordinátákon. További 4 állatban a fent meghatározott koordinátákon mindkét

agyfélteke mPFC-be injektáltunk FG-ot, és a medialis szeptumba injektáltunk CTB-t, a

bregmától 1.0 mm anterior, középvonali, és a nullszinttől 4.1 mm-re ventrális

koordinátákon.

A műtétek befejezése után az egerek 0.03-0.05 mg/ttkg meloxicam (Metacam,

Boehringer-Ingelheim, Németország) injekciót és 0.5 ml fiziológiás sóoldatot kaptak

intraperitoneálisan, majd 8-14 napig elkülönítve, ketrecekben éltek túl a perfúziókig.

VI.4. Állatok kezelése, szövetek előkészítése a kísérletekhez

Az egereket izoflurán használatával elbódítottuk, majd intraperitoneális

altatókoktél injekció segítségével altattuk el (8.3 mg/ml ketamin, 1.7 mg/ml xylazin-

54

hidroklorid és 0.8 mg/ml promethazinium-klorid fiziológiás sóoldatban). A teljes

anesztézia elérése után az állatokon transzkardiális perfúziót hajtottunk végre: 2 percig

fiziológiás sóoldatot, 40 percig 4%-os frissen beoldott paraformaldehidet, majd 10 percig

7.4-es pH-jú 0.1M-os foszfát puffert (PB) keringettünk át rajtuk. A perfúzió végeztével

az állatok agyát eltávolítottuk a koponyából, majd a vizsgálni kívánt régiókból vibratóm

segítségével (VT1200S, Leica, Németország) metszeteket készítettünk. A metszetek

vastagsága a sztereológiai kísérletek esetében 60 µm volt, ezeket egymást követően, 8

üvegbe metszettük fel, a sztereológiai technikához szükséges szisztematikus

véletlenszerű mintavétel szem előtt tartásával; a többi esetben 50 µm-es volt a

metszetvastagság. A metszeteket a metszés után 0.1M-os PB-ben mostuk, majd 10%-os

és 30%-os szacharóz oldatban tartottuk legalább 2-2 órán keresztül. Az

immunhisztokémiai kísérletek megkezdése előtt a metszeteket 3-5 alkalommal folyékony

nitrogén gőze felett megfagyasztottuk, majd 0.1M-os PB-ben mostuk őket tovább.

Azokon a metszeteken, amelyeken az NMDA-receptorokat jelöltük meg, 1 mg/ml

pepszines előkezelést végeztünk 0.2M-os sósavban, 37⁰C-on, az epitóp feltárása céljából.

VI.5. Használt antitestek jellemzése

A kísérleteinkben használt primer és szekunder antitestek jellemzőit a 2. és 3.

táblázatok tartalmazzák. A vGluT3-, GluN2A-, és NL2-elleni antitestek specificitását

vGluT3 KO (Seal és mtsai 2008; Szabadits és mtsai 2011), GluN2A KO (Watanabe és

mtsai 1998), illetve NL2 KO (Takács és mtsai 2013) génkiütött állatok használatával már

tesztelték. A tengerimalacban termeltetett vGluT3-elleni antitest specificitását mi is

ellenőriztük vGluT3 KO egérben (10. ábra).

A szerotonin (5HT)- és a 5HT-szintézisért felelős triptofán-hidroxiláz (TpH)-

elleni antitestek jól ismertek és karakterizáltak, a megfelelő festési mintázatot mutatták;

a nyúlban illetve a patkányban termeltetett 5HT-elleni antitestek ugyanazt a

sejtpopulációt jelölik (Amilhon és mtsai 2010; Calizo és mtsai 2011; Fox és Deneris

2012). Azokban a kísérletekben, ahol az ePet kifejeződési mintázatát tanulmányoztuk,

különbséget fedeztünk fel az ePet-et és a 5HT-t kifejező sejtpopulációk között. Ezért mi

is ellenőriztük, hogy a nyúlban termeltetett 5HT-elleni és az egérben termeltetett TpH-

elleni antitest azonos festési mintázatot ad-e, mert el akartuk kerülni, hogy a sztereológiai

55

mérések során egyes sejteket tévesen szerotonin-negatívnak számoljunk. A 160

megszámolt 5HT-pozitív sejt mindegyike TpH-pozitív volt és fordítva; ezért az észlelt

különbség nem lehet a használt szerotonin-elleni antitest alacsony szenzitivitásának

következménye, hiszen azon sejtek, amelyek a 5HT szintéziséért felelős enzimet

kifejezték, minden esetben 5HT-pozitívak voltak (11. ábra).

10. ábra: A vGluT3 elleni, tengerimalacban készült antitest tesztelése vGluT3 KO

egérben. A vad típusú egerekben erőteljes, specifikus vGluT3-jelölés látszik, mind a HIPP

str. pyramidale (WT/pyr), mind a str. lacunosum-moleculare (WT/lmr) rétegeiben DAB-

csapadékkal előhívva, fénymikroszkópiával, mind a MRR-ban (WT/MRR) fluoreszcens

mikroszkópiával. Ezzel szemben a vGluT3 KO egértörzsben sem a HIPP-ban (KO/pyr

illetve KO/lmr), sem a MRR-ban (KO/MRR) nem kaptunk jelölést.

A léptékek 30 μm-t jelölnek minden képen. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban

Mayer Márton munkájának eredménye.

11. ábra: A konfokális lézer-pásztázó mikroszkópiával készült képek azt mutatják, hogy

amennyiben egy sejt kifejezi a szerotonin-szintézisben kulcsfontosságú triptofán

hidroxilázt (TpH), az minden esetben 5HT-pozitív is, a kolokalizáció 100%-os.

Lépték: minden képen 50 μm. Az ábra 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin

Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredménye.

56

2. táblázat: A kísérletek során felhasznált primer antitestek jellemzése.

A NeuN, egy neuronokra specifikus DNS-kötő magi fehérje, valamint a FG- és

CTB-elleni antitestek specificitását szintén korábbi szakirodalmi adatok támasztják alá

(Dederen és mtsai 1994; Hamorsky és mtsai 2013; Mullen és mtsai 1992; Varga és mtsai

2002).

A sztereológiai mérések esetében rigorózusan figyeltünk arra, hogy az antitestek

a metszetek belsejébe is penetráljanak, így az immunreakció egyenletes, jó minősége

biztosított legyen. A szekunder antitestek lehetséges keresztreakcióit a többi primer és

szekunder antitesttel teszteltük, de nem láttunk erre utaló jeleket; továbbá a primer

antitestek elhagyásával készült immunreakciókban a szekunder antitestek nem mutattak

jelölést.

Primer antitestek

Antigén Gazdaállat Törzsoldat konc. Hígítás

(fluoreszcens)

Hígítás

(beágyazás

előtt)

Forrás Referencia

FluoroGold nyúl nem ismert 1:10000-

1:30000 - Millipore Varga és mtsai. 2002

Koleratoxin B egér 1 mg/ml 1:500 - Abcam Hamorsky és mtsai 2013

Koleratoxin B kecske nem ismert 1:20000 - List

Biologicals Dederen és mtsai 1994

GluN2A nyúl 542 µg/ml - 1:150-

1:250

M.

Watanabe

ajándéka

Watanabe és mtsai 1998

Neu-N egér 1 mg/ml 1:500 - Chemicon Mullen és mtsai 1992

Neuroligin 2 nyúl 1000 µg/ml - 1:600 Synaptic

Systems Takács és mtsai 2013

Szerotonin nyúl 25 µg/ml 1:10000 - ImmunoStar Fox és Deneris 2012

Szerotonin patkány nem ismert 1:500 - Millipore Amilhon és mtsai 2010

TpH egér nem ismert 1:3000 - Sigma-

Aldrich Calizo és mtsai 2011

vGluT3 nyúl 1 µg/ml 1:500 - Synaptic

Systems Seal és mtsai 2008

vGluT3 tengerimalac nem ismert 1:1000 1:4000 Millipore Szabadits és mtsai 2011 ,

jelen tanulmány

57

3. táblázat: A kísérletek során felhasznált szekunder antitestek és egyéb reagensek

jellemzése.

VI.6 Fluoreszcens immunhisztokémia és konfokális lézer-pásztázó mikroszkópia

A metszetek fent leírt előkészítése után azokat tris-pufferelt fiziológiás sóoldatban

(TBS) alaposan átmostuk, majd egy órán keresztül TBS-ben oldott 1%-os humán szérum

albuminnal (Sigma-Aldrich) blokkoltuk őket, elkerülendő a primer antitestek aspecifikus

kötődését a szövethez. A sztereológiai kísérletekhez használt metszetek esetében ebben a

lépésben 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), illetve 700 µg/ml Digitonin (Sigma-

Aldrich) is került az oldatba, elősegítendő a primer antitestek penetrációját. A blokkolás

után a metszeteket 3 napig a primer antitesteket tartalmazó TBS-alapú oldatban

inkubáltuk. Ezután TBS-sel alaposan átmostuk a metszeteket, majd a szekunder

antitesteket tartalmazó TBS-alapú oldatokban egy éjszakán keresztül inkubáltuk őket.

Azokban a kísérletekben, ahol a retrográd pályajelöléssel megjelölt MRR sejtek

neurokémiai karakterizálását végeztük, ezután további TBS-mosást végeztünk, majd

DyLight 405 konjugált streptavidin oldatában inkubáltuk a metszeteket 5 órán keresztül.

Szekunder antitestek, egyéb reagensek

Konjugálva Gazdaállat Milyen állat ellen? Hígítás Forrás Molekula

1.4 nm nanogold kecske nyúl 1:100-1:300 Nanoprobes Fab-fragment

Biotin kecske tengerimalac 1:200 Vector Laboratories teljes IgG

Alexa 488 szamár egér 1:500 Life Technologies teljes IgG

Alexa 488 szamár nyúl 1:500-1:1000 Life Technologies teljes IgG

Alexa 488 kecske tengerimalac 1:500 Molecular Probes teljes IgG

DyLight 549 szamár egér 1:500 Jackson Immunores. teljes IgG

Alexa 594 szamár egér 1:500 Life Technologies teljes IgG

Alexa 594 szamár kecske 1:500 Life Technologies teljes IgG

Cy3 szamár nyúl 1:500 Jackson Immunores. teljes IgG

Alexa 647 csirke patkány 1:500 Life Technologies teljes IgG

Alexa 647 szamár nyúl 1:500 Jackson Immunores. teljes IgG

- - - 1:10000 Sigma-Aldrich DAPI

DyLight 405 - - 1:500 Jackson Immunores. Streptavidin

58

Végül alaposan kimostuk a metszeteket TBS-ben, majd PB-ben és tárgylemezre

szárítottuk, majd Aquamount (BDH Chemicals LTD.) segítségével lefedtük őket. Az

egyes kísérlettípusok során használt primer és szekunder antitestek kombinációit a 4.

táblázat tartalmazza.

A retrográd pályajelölések esetében minden egyes beadási helyet teljesen

rekonstruáltunk egy Zeiss Axioplan 2 mikroszkóp segítségével, hogy megbecsüljük, hogy

a megcélozni kívánt agyterület mekkora hányadára jutott el a pályajelölő anyag (FG vagy

CTB). Ha a legkisebb mértékben is észleltük egy adott területen a pályajelölő anyagot,

akkor azt a területet a beadási hely részének tekintettük. Minden egyes 50 µm vastag

metszetet illesztettünk az egér sztereotaxiás atlasz (Paxinos és Franklin 2012, 4. kiadás)

vonatkozó képével, és a Fiji/ImageJ szoftver segítségével határoztuk meg az agyterület

és a beadási hely által befogott terület térfogatának arányát. Az agyterületek, melyeket az

atlasz alapján meghatároztunk, a következők voltak: a hippokampusz esetében a CA1-3

régiók és a gyrus dentatus; a medialis szeptális terület esetében a medialis szeptum és a

Broca-féle diagonális köteg; a medialis prefrontális kéreg esetében az A24a-b (anterior

cinguláris kéreg), az A25 (infralimbikus kéreg), az A32 (prelimbikus kéreg) és a medialis

orbitális kéreg.

Minden kísérletben külön értékeltük ki az egér sztereotaxiás atlasz (Paxinos és

Franklin 2012, 4. kiadás) által definiált median raphét (MR) és paramedian raphét (PMR).

A két régiót együttesen median raphe régiónak (MRR) neveztük. A retrográd

pályajelölések esetében az egyes alterületeken vizsgált sejtek mért tulajdonságaiban nem

találtunk eltéréseket, így a vonatkozó adatokat a teljes MRR-ra vonatkozóan adjuk meg.

A sztereológiai mérések esetén az alterületeken talált különbségeket is jeleztük, és az

adatokat a teljes MRR-ra vonatkozóan is megadtuk (12. ábra)

A retrográd pályajelölések kettős jelölései esetében a kiértékelést egy Olympus

Optical FluoView 300-as konfokális lézer-pásztázó mikroszkóppal végeztük, melyben a

két csatornában soronkénti váltással pásztáztuk a MRR-t tartalmazó metszeteket.

59

12. ábra: A fluoreszcens mikroszkópiával készült képeken 5HT-festéssel láthatók a MRR

rosztrokaudális tengelye mentén különböző koronális síkokban elhelyezkedő átmetszeti

képek. A MR és a PMR határait a sztereotaxiás atlasz (Paxinos és Watson, 2012) alapján

határoztuk meg. Lent láthatók a metszetek bregmától számított koordinátái. Lépték: minden

képen 100 μm. Az ábra 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin Eszter, 25%-ban

Mayer Márton munkájának eredménye.

Minden egyes 50 µm-es metszetet rekonstruáltunk, 5 µm-es képsíkok közötti

távolsággal; a sejteket Adobe Photoshop szoftver segítségével számoltuk meg.

A retrográd pályajelölések négyes jelöléseit egy Nikon A1R lézer-pásztázó

konfokális mikroszkóprendszer segítségével értékeltük ki, mely egy Ti-E fordított

elrendezésű mikroszkópra épült, egy 0.45 NA CFI Super Plan Fluor ELWD 20XC Nikon

objektívvel. A mikroszkópot a NIS-Elements AR 4.3 szoftver vezérelte. Zöld argon ion

lézert (457–514 nm, 40 mW), sárga DPSS lézert (561 nm, 20 mW), ibolya dióda lézert

(405 nm) és egy távoli vörös dióda lézert (647 nm, 100 mW) használtunk a fluorofórok

gerjesztésére, a hozzájuk tartozó szűrőkkel. A MRR-t tartalmazó metszeteket 2 µm-es

képsíkok közötti távolsággal teljesen rekonstruáltuk, majd NIS-Elements szoftver

segítségével azonosítottuk a FG- és CTB-tartalmú sejteket, és meghatároztuk vGluT3-

vagy 5HT-tartalmukat. Ezekben a metszetekben a sejtméretből adódó esetleges

sztereológiai torzítást elkerülendő, Abercrombie-korrekcióval határoztuk meg az egyes

populációkba tartozó sejtek relatív, százalékos arányát.

A sztereológiai mérések esetében a képalkotást szintén a fent leírt Nikon A1R lézer-

pásztázó konfokális mikroszkóprendszer segítségével végeztük; a MRR-t tartalmazó

metszeteket 1 µm-es képsíkok közötti távolsággal teljesen rekonstruáltuk, a sejtek

alakjának minél pontosabb meghatározása céljából.

60

4. táblázat: A fluoreszcens immunhisztokémiai kísérletek során használt primer és

szekunder antitestek kombinációi az egyes kísérlettípusokban.

Egértörzs Kísérlet Primerek és reagensek Szekunderek Megjegyzés

C57Bl/6 vad típus

sztereológia, A

típus

5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni

csirke Megkülönböztethető

5HT- és vGluT3-festés,

az eltérő fluoreszcens

csatornák miatt.

vGAT-IRES-Cre ::

Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1

vGluT3 elleni nyúl Cy3 nyúl elleni szamár

ePet-IRES-Cre ::

Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 DAPI -

vGAT-IRES-Cre ::

Gt(ROSA26)Sor_CAG/

tdTomato

sztereológia, A

típus

5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni

csirke

Megkülönböztethető

5HT- és vGluT3-festés,

az eltérő fluoreszcens

csatornák miatt.

vGluT3 elleni nyúl Alexa 488 nyúl elleni szamár

DAPI -

vGAT-IRES-Cre ::

Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1

sztereológia, B

típus

5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni

csirke

Nem

megkülönböztethető

5HT- és vGluT3-festés,

de alkalmas más sejtek

detektálására a külön

csatornában történt Neu-

N festés miatt.

vGluT3 elleni nyúl Alexa 647 nyúl elleni szamár

NeuN elleni egér Alexa 594 egér elleni szamár

DAPI -

vGAT-IRES-Cre ::

Gt(ROSA26)Sor_CAG/tdTomato

sztereológia, B

típus

5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni

csirke

Nem

megkülönböztethető

5HT- és vGluT3-festés,

de alkalmas más sejtek

detektálására a külön

csatornában történt Neu-

N festés miatt.

vGluT3 elleni nyúl Alexa 647 nyúl elleni szamár

NeuN elleni egér Alexa 488 egér elleni szamár

DAPI -

C57Bl/6 vad típus

retrográd

pályajelölés

(kettős)

FG elleni nyúl Alexa 488 nyúl elleni szamár A sejtek neurokémiai

karakterizálása nélkül. CTB elleni kecske Alexa 594 kecske elleni

szamár

C57Bl/6 vad típus

retrográd

pályajelölés

(négyes)

FG elleni nyúl Alexa 488 nyúl elleni szamár

A sejtek neurokémiai

karakterizálására is

alkalmas.

CTB elleni egér DyLight 549 egér elleni

szamár

5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni

csirke

vGluT3 elleni

tengerimalac

biotinilált tengerimalac elleni

kecske, majd DyLight 405

konjugált streptavidin

C57Bl/6 vad típus antitest tesztelése

vGluT3 elleni

tengerimalac

Alexa 488 tengerimalac

elleni kecske -

vGluT3 KO

61

VI.7. Sztereológiai mérések

A torzításmentes, tervezésen alapuló sztereológiai mérést az optikai hányadolásos

módszerrel végeztük (Gundersen 1986; Schmitz és Hof 2005; Sterio 1984; West és mtsai

1991), melynek alapja, hogy egy vizsgálni kívánt térfogatban található objektumok száma

meghatározható egy, az adott térfogatból kivett, előre meghatározott térfogatmintában

jelenlévő objektumok megszámolásával (Dorph-Petersen és mtsai 2001). A teljes

sejtszám meghatározásához a megszámolt sejtek számát három tört reciprokával kell

megszorozni: ezek a törtek a metszet-mintavételezési, a terület-mintavételezési és a

vastagság-mintavételezési hányadosok (West és mtsai 1991). Minden kísérletben

szisztematikus véletlenszerű mintavételezést alkalmaztunk: a 8 üvegbe szisztematikusan,

egymást követően felvett metszetsorozatok páratlan számú üvegein a vGluT3- és 5HT-

pozitív sejtek megkülönböztetésére alkalmas immunreakciókat (sztereológia A típusú

kísérlet), a páros számú üvegeken a MRR-ban található egyéb neuronok azonosítására

alkalmas immunreakciót (sztereológia B típusú kísérlet) végeztünk (4. táblázat). Ebből

következően a metszet-mintavételezési hányados 1/2-nek adódott. A beágyazott

metszeteken csupán egy előre meghatározott négyzetháló négyzeteinek egy részén

végeztük a mérést. Az erre vonatkozó terület-mintavételezési hányados az A-típusú

kísérletben, a MR-ra vonatkozóan 152/402-nek, a B-típusú kísérletben a MR-ra

vonatkozóan 152/802-nek, illetve mindkét kísérlettípusban a PMR-re vonatkozóan

102/802-nek adódott. Végül, a vastagság-mintavételezési hányados a 60 µm-es metszetek

átlagosan 28 µm-re való zsugorodásának köszönhetően 15/28-nak adódott, mert csupán

a metszet belsejében, egy 15 µm vastag térrészben végeztük a számolást, melyet a metszet

felszínétől egy legalább 5 µm-es biztonsági zóna ráhagyásával helyeztünk el. A nagyobb

pontosság érdekében minden egyes mérési ponton meghatároztuk a beágyazott metszet

vastagságát. A mérési térfogatokban minden egyes sejtet megszámoltunk, melyek a

befoglaló síkokhoz értek, de mindet kizártuk, amelyek megérintették a kizáró síkokat.

Mindent összevetve, a MRR teljes sejtpopulációjának (mintegy 126 500 db) kb. 10%-át

számoltuk meg, összesen kb. 12 300 db sejt azonosításával, 8 egérben. A méréseket a

StereoInvestigator program segítségével végeztük (MicroBrightField Bioscience); a

sejtek neurokémiai tulajdonságait párhuzamosan a NIS-Elements Documentation

szoftverrel végeztük.

62

VI.8. Beágyazás előtti immunhisztokémia

A metszetek fent leírt előkészítése után azokat tris-pufferelt fiziológiás sóoldatban

(TBS) alaposan átmostuk. A tengerimalacban termeltetett vGluT3-ellenes antitest

tesztelésére és a neuroligin-2 (NL2) detektálására használt metszeteket egy órán keresztül

TBS-ben oldott 1%-os humán szérum albuminnal (HSA; Sigma-Aldrich) blokkoltuk. Az

NMDA-receptorok detektálására használt metszetek blokkolásához először fél órán

keresztül 50mM-os glicint, majd egy órán keresztül 1%-os HSA-t, végül 10 percen át

TBS-ben oldott BSA-c oldatot (BSA-c/TBS; Aurion) használtunk. A blokkolás után a

metszeteket 3 napig a primer antitesteket tartalmazó TBS vagy BSA-c/TBS-alapú

oldatban inkubáltuk. Ezután a metszeteket alaposan átmostuk TBS-sel vagy BSA-c/TBS-

sel. A neuroligin-2 (NL2) detektálására használt metszeteket egy órán keresztül blokkoló

oldattal (Gel-BS) kezeltük, mely 0.5% hidegvízi hal bőréből kivont zselatint (GE

Healthcare, Little Chalfont, UK) és 0.5% HSA-t tartalmazott TBS-ben oldva. A blokkolás

után a metszeteket 1 napig a szekunder antitesteket tartalmazó TBS vagy BSA-c/TBS-

alapú oldatban inkubáltuk. Az egyes kísérletekben használt antitestek kombinációit az 5.

táblázat tartalmazza.

5. táblázat: a beágyazás előtti immunhisztokémiai kísérletek során használt primer és

szekunder antitestek kombinációi az egyes kísérlettípusokban.

Egértörzs Kísérlet Primerek Szekunderek Megjegyzés

C57Bl/6 vad típus antitest tesztelése

vGluT3 elleni

tengerimalac

biotinilált tengerimalac

elleni kecske

TBS-ben oldott

reagensek vGluT3 KO

C57Bl/6 vad típus anterográd pályajelölés GluN2A elleni

nyúl

1.4nm arany konjugált

nyúl elleni kecske

BSA-c/TBS-ben

oldott reagensek

C57Bl/6 vad típus

NMDA-receptor

kimutatása vGluT3-pozitív

terminálisokban

vGluT3 elleni

tengerimalac

biotinilált tengerimalac

elleni kecske BSA-c/TBS-ben

oldott reagensek GluN2A elleni

nyúl

1.4nm arany konjugált

nyúl elleni kecske

C57Bl/6 vad típus NL2 kimutatása vGluT3-

pozitív terminálisokban

vGluT3 elleni

tengerimalac

biotinilált tengerimalac

elleni kecske TBS-ben oldott

reagensek NL2 elleni nyúl

1.4nm arany konjugált

nyúl elleni kecske

63

A metszetek alapos TBS-sel vagy BSA-c/TBS-sel történő átmosása után a NL2 és

az NMDA-receptorok detektálására használt metszeteken 15 percig 2%-os

glutáraldehides fixálást alkalmaztunk, hogy az aranyszemcséket a szövethez rögzítsük.

Ezután a vGluT3- vagy a BDA-jelölés előhívásához a metszeteket 3 órán keresztül

avidin-biotinilált tormaperoxidáz komplex oldatban inkubáltuk (ABC Elite, 1:1:300,

Vector Laboratories), melyet TBS-ben, majd 7.6-os pH-jú tris pufferben (TB) történő

mosás és 3,3’diaminobenzidinben (DAB; Sigma-Aldrich) való inkubáció követett. A

DAB-ot 1 ml-enként 2 µl 0.5%-os hidrogén-peroxid hozzáadásával hívtuk elő. Az

immunperoxidáz reakciót alapos, 0.1M-os PB-ben történő mosás követte, majd a NL2 és

az NMDA-receptorok kimutatására használt metszeteket intenzifikálás előkészítő

oldatban (ECS; Aurion) inkubáltuk. Az immunarany jelölést ezüst-intenzifikálással tettük

erősebbé (SE-EM kit; Aurion). A metszeteket végül 0.5%-os ozmium-tetroxid oldattal

kezeltük és felszálló alkoholsorral és acetonitrillel víztelenítettük. A víztelenítés során a

metszeteket 1%-os uranilacetáttal kontrasztoztuk. A metszeteket végül epoxigyantába

(Durcupan, ACM, Fluka, Buchs, Svájc) ágyaztuk. A beágyazás után a metszetekből a

vizsgálni kívánt területeket kivágtuk, azokat epoxigyanta blokkokra ragasztottuk, és

ultramikrotóm (Leica EM UC6, Nussloch, Németország) segítségével 70-100 nm-es

ultravékony metszeteket készítettünk belőlük. A mintákat Hitachi H-7100-as

elektronmikroszkóp (Tokió, Japán) segítségével vizsgáltuk, a felvételek készítéséhez egy

Veleta CCD-kamerát (Olympus Soft Imaging Solutions) használtunk.

VI.9. Elektronmikroszkópos mérések

Teljesen rekonstruáltunk véletlenszerűen kiválasztott, vGluT3-pozitív

terminálisokat a hippokampuszban, melyek a stratum radiatum és lacunosum-moleculare

határán található interneuronok sejttestjére vagy proximális dendritjeire adtak

szinapszisokat; ezen terminálisok legnagyobb része a MRR-ban található sejtektől ered

(Somogyi és mtsai 2004). Az anterográd pályajelölést tartalmazó kísérletekben a

hippokampusz, a medialis szeptum és a medialis prefrontális kéreg területén található

BDA-pozitív terminálisokat rekonstruáltunk. Ezeknek a szinapszisoknak a

posztszinaptikus membránjához asszociált (attól 40 nm-nél nem távolabb található)

immunarany jelölés alapján határoztuk meg a szinapszisok NL2- és NMDA-receptor

64

tartalmát. A 40nm-es távolságot a következők alapján határoztuk meg: a NL2 és a

NMDA-receptorok GluN2A alegységének C-terminális vége pár nm-re belóg a membrán

intracelluláris oldalán. Ehhez egy primer IgG antitest és egy szekunder Fab’-töredék

antitest kötődik. Atomerő-mikroszkópos, és egy-részecske elektrontomográfiai adatok

alapján (San Paulo és García 2000; Zhang és Ren 2012) egy IgG molekulát 15-18nm, egy

Fab’-töredéket pedig 6-7 nm hosszúságúnak számolva, hozzászámolva az

ezüstintenzifikált aranyszemcse 10-15 nm-es átmérőjét, adódik a 40 nm-es sáv, amiben a

mérést végeztük, ezzel biztosítva, hogy ne zárjunk ki valós jelölést.

A posztszinaptikus membránhoz asszociált jelölés mellett megszámoltuk a

GluN2A-immunarany-jelölés sűrűségét jelöletlen aszimmetrikus szinapszisok

posztszinaptikus membránján, az ugyanezen szinapszisok szélétől 200-200 nm-re

kétoldalt található extraszinaptikus membránszakaszokon, valamint a háttérjelölés

erősségének meghatározása érdekében ugyanezen szinapszisok preszinaptikus

terminálisainak membránján. A NL2-immunarany-jelölés jel-zaj arányát már korábban,

hasonló mérések segítségével megállapítottuk (Takács és mtsai 2013). Méréseink során

az immunarany-jelölés sűrűsége a posztszinaptikus membránokhoz asszociáltan a

GluN2A-jelölés esetében 30-120-szor nagyobbnak, a NL2-jelölés esetében 240-szer

nagyobbnak adódott a háttérhez képest, mely tovább bizonyítja az immunreakciók jó

minőségét és az antitestek specificitását.

A vizsgált szinapszisok területét minden esetben sorozatmetszeteken teljesen

rekonstruáltuk. Mivel a nagyobb szinapszisok felülreprezentáltak lehetnek, ha nem

alkalmazunk sztereológiai szabályokat, így egy adott, véletlenszerűen kiválasztott,

elegendő hosszúságú metszetsorozaton minden szinapszis területét megmértük, amely

egy adott metszeten kezdődött, de az eggyel felette lévő biztonsági metszeten nem volt

megtalálható. Így a szinapszisok méretére való tekintet nélkül tudtuk megmérni azok

területét. Mivel a legnagyobb jelöletlen aszimmetrikus szinapszisok is legfeljebb 6 db 100

nm vastag metszetből rekonstruálhatók voltak, csak olyan metszetsorozatokat

használtunk, melyek legalább 6 metszetet tartalmaztak a tesztelt térfogat alatt.

65

VII . EREDMÉNYEK

VII.1. A median raphe régió sejttípusai

A célkitűzéseink 1a-1d pontjainak vizsgálata céljából immunhisztokémiai

festéseket végeztünk, és sztereológiai módszereket alkalmaztunk. Ezek segítségével 10

különböző fenotípusú sejtet tudtunk elkülöníteni a MRR-ban. Három különböző,

genetikailag módosított egértörzsekből származó egereket, és egy darab vad típusú egeret

használtunk fel ezekhez a vizsgálatokhoz. Az egerek egymáshoz korban illő, fiatal,

ivarérett hímek voltak; a vizsgálatok során azt tapasztaltuk, hogy a becsült sejtszámokat

nem befolyásolja az, hogy az egerek milyen genetikai háttérrel rendelkeztek.

Két kísérlettípust (A-típusú és B-típusú kísérlet) hajtottunk végre annak

érdekében, hogy a MRR sejtjeinek fenotípusát feltérképezzük. Az A-típusú kísérletben

az volt a cél, hogy meghatározzuk a MRR-ban található „csak 5HT-pozitív” (SO), „csak

vGluT3-pozitív” (GO), „5HT és vGluT3-pozitív” (SG), vGAT-pozitív és ePet-pozitív

idegejtek számát és egymáshoz viszonyított arányát. Ezért ebben a kísérletben külön

festettük meg a 5HT-t és a vGluT3-mat. A B-típusú kísérletben az elsődleges cél az összes

MRR-ban található neuron számának és a többi sejttípushoz képesti arányának

meghatározása volt; ebben a festésben a Neu-N jelölésnek köszönhetően azokat a sejteket

is azonosítani tudtuk, amelyek a fenti markerekre immunonegatívak voltak, viszont mivel

csak négy fluoreszcens csatornát tudtunk elkülöníteni, itt a 5HT-t és vGluT3-mat

ugyanabban a fluoreszcens csatornában hívtuk elő (4. táblázat).

A sejtmagokat DAPI-val jelöltük meg; a vGAT illetve ePet-pozitív sejteket

genetikailag kódolt fluoreszcens fehérjék segítségével azonosítottuk; a Neu-N, a 5HT, és

a vGluT3 megjelöléséhez immunhisztokémiai reakciókat használtunk (13. és 14. ábra).

Az egyes markerek általános jelölési mintázata megfelelt annak, amelyet előzetesen

vártunk; továbbá minden egyes jelölésünk egyértelműen meghatározható festést adott,

mely a háttértől jól elkülönült. A torzításmentes sztereológiai módszereknek

köszönhetően meg tudtuk határozni a MRR különböző fenotípusú

66

13. ábra: A MRR különböző sejttípusainak sztereológiai méréseihez használt képek,

melyek vGAT-IRES-Cre-zsGreen (A és B sorozat) és vGAT-IRES-Cre-tdTomato (C és D

sorozat) transzgenikus egerek agyából, konfokális lézer-pásztázó mikroszkópiával

készültek. A vGAT-pozitív sejtek megjelöléséhez használt genetikai markert mindkét

egértörzsben zöldre színeztük (A3-D3). A sejtmagokat minden esetben DAPI-val jelöltük

meg (A4-D4). A „B-típusú” kísérletekben (A1-A4, C1-C4) az idegsejteket Neu-N festéssel

azonosítottuk (piros), a 5HT és/vagy vGluT3-pozitív sejteket pedig ugyanabban a

fluoreszcens csatornában hívtuk elő (fehér). Egyes sejtek csak Neu-N-pozitívak („hármas

negatív”) voltak (teli kör), mások 5HT és/vagy vGluT3-pozitivitást is mutattak (teli

négyzet), megint mások csak vGAT-pozitívak voltak (csillag). Az „A-típusú” kísérletekben

(B1-B4, D1-D4) a 5HT-pozitív (fehér) és a vGluT3-pozitív (piros) sejteket külön

fluoreszcens csatornákban jelenítettük meg. SO (teli kör), GO (teli négyzet), SG (üres

kör), „vGluT3- és vGAT”-pozitív (üres négyzet), valamint „csak vGAT-pozitív” (csillag)

sejteket tudtunk megkülönböztetni. Lépték: minden képre 50 μm. Az ábra 13%-ban Szőnyi

András, 62%-ban Sós Katalin Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredménye.

67

sejtjeinek abszolút számát, ebből pedig ki tudtuk számolni azok egymáshoz viszonyított

arányát.

Minden kísérletben használtunk DAPI-festést, mely a sejtmagokat erősen

megjelölte; ez a jelölés szolgált a sejtek azonosítására (15. ábra, A). Az egyes

állattörzsekben használt genetikailag kódolt fluoreszcens jelölőanyagok egyenletesen

erős szomatikus jelet adtak a vGAT- illetve ePet-pozitív sejtek citoplazmájában. Minden

kísérletben találtunk olyan sejteket, amelyek csak ezt a genetikailag kódolt jelölőanyagot

tartalmazták, ezek voltak a „csak vGAT-pozitív” illetve „csak ePet-pozitív” sejtek.

14. ábra: A MRR különböző sejttípusainak sztereológiai méréseihez használt képek,

melyek ePet-IRES-Cre-zsGreen transzgenikus egerek agyából, konfokális lézer-pásztázó

mikroszkópiával készültek, az „A-típusú” kísérletben. Az ePet genetikai jelölését zölddel,

a DAPI-t kékkel, a 5HT-t fehérrel, a vGluT3-mat pirossal jelöltük, külön fluoreszcens

csatornákban. Egyes SO sejtek ePet-pozitívak voltak (teli kör), mások ePet-negatívak

(üres kör); találtunk ePet-pozitív GO sejteket (tele négyzet) és ePet-negatív GO sejteket

(üres négyzet); és voltak ePet-pozitív SG (tele rombusz) és ePet-negatív SG (üres

rombusz) sejtek is. Végül egyes sejtek csak ePet-pozitívak (csillag) voltak.

Lépték: minden képre 50 μm. Az ábra 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin

Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredménye.

68

A B-típusú kísérletben használt Neu-N jelölés szintén egyértelműen erős jelet

adott a neuronok sejtmagjában, illetve valamivel halványabbat azok citoplazmájában.

Ezekben a kísérletekben is találtunk olyan sejteket, amelyek csak a Neu-N-t fejezték ki,

ezeket „hármas negatív” (a három neurotranszmitter-rendszer jelöléseire negatív, azaz

5HT-, vGluT3- és vGAT-negatív) sejteknek neveztük. A B-típusú kísérletekben találtunk

továbbá olyan sejteket is, amelyek 5HT-t és/vagy vGluT3-mat tartalmaztak (13. ábra,

A1-A4, C1-C4).

Az A-típusú kísérletekben mind a 5HT-, mind a vGluT3-jelölés megfestette a

sejtek szómájának és proximális dendritjeinek citoplazmáját, valamint azok lokális

terminálisfelhőjét is. Azon A-típusú kísérletekben, ahol a vGAT-pozitív sejtek

tartalmaztak fluoreszcens jelölőanyagot, meg tudtunk különböztetni „csak 5HT-pozitív”

(SO), „csak vGluT3-pozitív” (GO), „5HT és vGluT3-pozitív” (SG), „vGluT3- és vGAT-

pozitív”, valamint „csak vGAT-pozitív” sejteket is (13. ábra, B1-B4, D1-D4). Azokban

az A-típusú kísérletekben, ahol az ePet-pozitív sejtek tartalmaztak fluoreszcens

jelölőanyagot, meg tudtunk figyelni ePet-pozitív, illetve ePet-negatív SO, GO és SG

típusú sejteket is (14. ábra). A fentiek alapján megszámolt különböző típusú sejtek

darabszámát az egyes állatokban és agyterületekben a 6. és 7. táblázat mutatja be

(célkitűzéseink 1a pontjának megfelelően).

Célkitűzéseink 1b-1c pontjainak megfelelően a fenti számok alapján meg tudtuk

határozni az egyes sejtek százalékos arányát a MRR-ban, és annak alrégióiban, a MR-ban

és a PMR-ban is (15. ábra). Röviden összefoglalva azt találtuk, hogy a MR-ban a

neuronoknak mintegy 8.5%-a SO sejt, mintegy 26%-uk GO sejt, és 12.8%-uk SG sejt. Az

idegsejtek 37.2%-a „csak vGAT-pozitív” volt, és mintegy 14.4%-uk tartozott a „hármas

negatív” populációba (15. ábra, B). A PMR-ban az idegsejteknek összesen csupán

mintegy 6.4%-a tartalmazott 5HT-t és/vagy vGluT3-mat, de ezek a sejtek többnyire a

PMR MR-hoz közeli határán helyezkedtek el, melyet az egér sztereotaxiás atlasz (Paxinos

és Franklin, 2012) alapján határoztunk meg. Az összes PMR-ben található neuron

mintegy 66.8%-a volt „csak vGAT-pozitív”, és mintegy 27.7%-uk tartozott a „hármas

negatív” csoportba. Soha nem figyeltünk meg kolokalizációt az 5HT és a vGAT esetében,

és a „vGluT3- és vGAT-pozitív” sejtek száma is nagyon alacsony volt (15. ábra, C).

69

6. táblázat: A median raphéban található különböző sejttípusok darabszámának

sztereológiai becslése. A táblázat adatai 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin

Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredményei.

A median rapheban mért sejtszámok 8 egérben

Jelölt sejttípusok GM1 GM2 GM3 GM4 WT PM1 PM2 PM3 Átlag

Nem neuronális sejtek,

csak DAPI-pozitív 11269 10449 10672 11928 - - - - 11079

Minden idegsejt (az összes egérből gyűjtött adatok alapján kiszámolva, minden jelölt sejttípus átlagos

számát felhasználva) 8160

Minden 5HT-pozitív sejt,

vGluT3 jelölés nélkül -

“SO”-ként rövidítve

1310 515 573 662 640 807 351 697 695

⇾ ezekből az ePET-pozitív

sejtek: - - - - - 380 240 378 333

Minden vGluT3-pozitív

sejt , 5HT jelölés nélkül -

“GO”-ként rövidítve

1840 2078 2209 2055 2041 2209 2591 1957 2123

⇾ ezekből az ePET-pozitív

sejtek: - - - - - 906 886 959 917

Minden 5-HT és vGluT3

kettős pozitív sejt -

“SG”-ként rövidítve

627 890 904 940 1408 1427 1014 1126 1042

⇾ ezekből az ePET-pozitív

sejtek: - - - - - 1002 705 891 866

Minden 5-HT és/vagy

vGluT3-pozitív sejt 3655 3450 3426 3620 4089 4862 3957 3780 3855

Minden vGAT-pozitív sejt,

5-HT és vGluT3 jelölés

nélkül

3105 3190 2619 3222 - - - - 3034

Minden vGAT és vGluT3

kettős pozitív sejt,

5-HT jelölés nélkül

35 149 93 65 - - - - 86

Minden Neu-pozitív sejt

(hármas negatív),

5HT, vGluT3 és VGAT

jelölés nélkül

597 712 1632 1782 - - - - 910

Minden ePET-pozitív sejt,

5-HT és/vagy vGluT3 jelölés

nélkül

- - - - - 68 451 296 271

70

7. táblázat: A paramedian raphéban és a median raphe régióban található különböző

sejttípusok darabszámának sztereológiai becslése. A táblázat adatai 13%-ban Szőnyi

András, 62%-ban Sós Katalin Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredményei.

A paramedian rapheban mért sejtek száma

A MRR-ban

mért sejtek

száma

(A MR-ban és

PMR-ban

mért

sejtszámok

összege)

Jelölt sejttípusok GM1 GM2 GM3 GM4 Mean

Nem neuronális sejtek, csak DAPI-

pozitív 69924 59634 71573 71472 68151 79230

Minden idegsejt (az összes egérből gyűjtött adatok alapján kiszámolva, minden jelölt

sejttípus átlagos számát felhasználva) 39298 47458

Minden 5HT-pozitív sejt, vGluT3 jelölés

nélkül –

“SO”-ként rövidítve

264 0 795 221 320 1015

⇾ ezekből az ePET-pozitív sejtek: (a 15. ábrán lévő arányok alapján számolva): 153 533

Minden vGluT3-pozitív sejt , 5HT

jelölés nélkül -

“GO”-ként rövidítve

751 1143 2094 899 1222 3344

⇾ ezekből az ePET-pozitív sejtek: ( a 15. ábrán lévő arányok alapján számolva): 528 1445

Minden 5-HT és vGluT3 kettős pozitív

sejt -

“SG”-ként rövidítve

1438 217 555 460 668 1710

⇾ ezekből az ePET-pozitív sejtek: a 15. ábrán lévő arányok alapján számolva): 555 1421

Minden 5-HT és/vagy vGluT3-pozitív

sejt 2514 1535 3013 1785 2212 6067

Minden vGAT-pozitív sejt, 5-HT és

vGluT3 jelölés nélkül 33486 25728 25035 19445 25924 28958

Minden vGAT és vGluT3 kettős pozitív

sejt, 5-HT jelölés nélkül 244 578 234 130 297 383

Minden Neu-pozitív sejt (hármas

negatív), 5HT, vGluT3 és VGAT jelölés

nélkül

9017 8646 11991 13820 10710 12049

Minden ePET-pozitív sejt, 5-HT és/vagy vGluT3 jelölés nélkül ( a 15. ábrán lévő

arányok alapján számolva) 159 430

71

15. ábra: A sztereológiai mérések alapján meghatározott különböző sejttípusok száma és

aránya a MRR-ban, 8 egérben végzett mérések alapján meghatározva. A: a MRR-ban és

annak részterületein található idegsejtek és egyéb sejtek száma. B, C: A MR-ban és a

PMR-ban található különböző sejttípusok, és azok ePet-pozitvitása. D: A vGluT3- és

5HT-pozitivitás eloszlása az ePet-pozitív sejtekben a MR-ban és a PMR-ban. Mivel a

PMR-ben csak szemikvantitatív módszerrel határoztuk meg az ePet-pozitív sejtek számát,

pontos értéket nem közlünk, de az érték a többi kördiagramból kiszámolható (1395 db).

E: A MRR-ban található különböző sejttípusok, és azok ePet-pozitvitása, összesítve. Az

ábra 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin Eszter, 25%-ban Mayer Márton

munkájának eredménye.

72

Mivel az egér MR igen kicsi terület, és az egyes, MR-ban található idegsejtek

dendritjei átnyúlnak a PMR-ba, valamint a PMR-ben található idegsejtek dendritjei is

beleérnek a MR területébe, célszerűnek tartottuk a fenti adatokat a teljes MRR területére

is megadni. Funkcionális szempontból is helytállónak tűnik ez a megközelítés, hiszen

gyakorlatilag lehetetlen, a MR-ban vagy a PMR-ban található idegsejtpopulációk külön

történő vizsgálata akár elektromos stimulációt, akár farmakológiai, akár a legmodernebb

optogenetikai módszereket vesszük számításba. Bár az egyes idegsejtpopulációk

genetikai megjelölése a MRR-ban található neuronok alpopulációit külön-külön

vizsgálhatóvá teszi, a MR-ban és a PMR-ban található, azonos alpopulációba tartozó

idegsejtekre is hatnának ezek a vizsgálatok.

Ez alapján azt találtuk, hogy a MRR-ban található összes idegsejt mintegy csupán

2.1%-a SO sejt, 7.0%-a GO sejt és 3.6%-a SG sejt; a „csak vGAT-pozitív” sejtek aránya

mintegy 61.0%, a „hármas negatív”, még nem azonosított populációba tartozó sejtek

pedig mintegy 25.4%-ot tesznek ki (15. ábra, E).

VII.2. Az ePet-pozitív sejtek eloszlása a median raphe régióban

A korábbi szakirodalmi adatok alapján úgy gondolták, hogy a PET1 trankripsziós

faktor enhancer régiójának, az ePet-nek a kifejeződése specifikus a szerotonerg sejtekre;

ennek a kérdésnek a pontosabb vizsgálatát célozta célkitűzéseink 1d pontja. Saját

kísérleteink során azonban azt tapasztaltuk, hogy részben eltérő festési mintázatot ad az

ePet és a 5HT megjelölése. Még olyan neuronokat is találtunk, amelyek a „hármas

negatív” populációba tartoztak, és kifejezték az ePet-et („csak ePet-pozitív sejtek”).

Habár ebben a kísérleti felállásban nem tudtuk direkt módon bizonyítani, hogy az ePet-

és a vGAT-pozitív idegsejtek között nincs átfedés, mégis ezt tartjuk a legvalószínűbbnek.

Ennek egyfelől az az oka, hogy a két sejtpopuláció eloszlása nagyon eltérő, az ePet-

pozitív sejtek legnagyobb része a MR-ban, míg a vGAT-pozitív sejtek legnagyobb része

a PMR-ban helyezkedik el. Emellett az SO és SG sejtek, melyek részben ePet-pozitívak,

soha nem mutattak vGAT-pozitivitást. Továbbá általában véve a serkentő és a gátló

neurotranszmittereket kifejező sejtek eltérő sejtvonalból erednek, így valószínűtlennek

tűnik hogy a „csak vGAT-pozitív” sejtek ePet-et is kifejeznének. Így minden ePet-pozitív

idegsejtet, mely nem mutatott 5HT és/vagy vGluT3-pozitivitást, a „hármas negatív”

73

populációba soroltunk. Összesen 4 különböző sejtpopulációban is találtunk ePet-pozitív

sejteket (14. ábra).

Mivel a MR és PMR közötti határvonal mesterséges, minden okunk megvan azt

feltételezni, hogy az egyes idegsejtpopulációk a MRR-ban ugyanazokba a

populációtípusokba tartoznak, függetlenül attól, hogy a MR-ban vagy a PMR-ban

helyezkednek-e el. Mivel ez vonatkozik az ePet-pozitív sejtekre is, a PMR-ban található

ePet-pozitív sejtek arányát a MR-ban számolt arányokból következtettük vissza.

Azonban, hogy tovább erősítsük a PMR-ben található ePet-pozitív sejtekre vonatkozó

adatainkat, egy egér PMR-ban egy szemikvantitatív módszerrel megszámoltuk az ott

található ePet-pozitív sejteket. Ehhez egy reprezentatív mintát vettünk a PMR-ban

található ePet-pozitív sejtekből (összesen 425 db-ot számoltunk meg), egy A-típusú

kísérletből. Itt ez a módszer bizonyult hatékonyabbnak, ugyanis a teljesen kvantitatív,

torzításmentes sztereológiai méréssel a PMR-ben elfogadhatatlanul kicsi ePet-pozitív

sejtmintához jutottunk volna. Ebben a mérésben az arányok hasonlóak voltak a MR-ban

talált arányokhoz, mely tovább bizonyítja, hogy a MR-ban és a PMR-ban található sejtek

ugyanabba a populációba tartoznak (15. ábra, D)

VII.3. A median raphe régió sejtjeinek előagyi vetítési mintázata

A MRR-ból az előagyba való vetítést klasszikusan egy szerotonerg pályának

tartjuk (Hensler és mtsai 2006). Kvantitatív, torzításmentes sztereológiai méréseink azt

mutatják, hogy a MRR sejtjeinek legnagyobb része nem 5HT-tartalmú, továbbá a 5HT-

tartalmú sejtek jelentős része vGluT3-mat is tartalmaz, így glutamaterg transzmisszióra

is képes (15. ábra). Ezen adatok tükrében, a célkitűzéseink 2a pontjának megfelelően,

meg akartuk vizsgálni, hogy mennyire jellemző a különböző típusú sejtek vetítése az

előagy területére. Három agyterületet választottunk ki erre a célra: a hippokampuszt

(HIPP), a mediális szeptumot (MS) és a medialis prefrontális kérget (mPFC), melyek

mind erős beidegzést kapnak a MRR-ból. Ezekre az agyterületekre különböző retrográd

pályajelölő anyagokat juttatunk: 3 egérben a mPFC területére FG-ot, 2 egérben a MS

területére CTB-t valamint 1 egérben a HIPP területére CTB-t injektáltunk. Mivel

patkányban a MRR-ból a HIPP-ba és a MS-ba vetítő rostok neurokémiai tulajdonságait

már leírták (Jackson és mtsai 2009), mi egérben csupán megerősítő vizsgálatokat

74

végeztünk. 8-14 nappal a retrogád pályajelölő anyagok injektálása után fluoreszcensen

megjelöltük a MRR-ban a 5HT- és vGluT3-tartalmú sejteket. Minden fluoreszcens

csatornában egyértelmű jelölést kaptunk; a 5HT és vGluT3 a már fent leírt festési

mintázatot mutatta; a FG és a CTB a retrográd megjelölt idegsejtek szómájában és

legproximálisabb dendritjeiben adott erős citoplazmatikus jelölést.

8. táblázat: A retrográd pályajelöléssel megjelölt sejtek neurokémiai tulajdonságai. A

táblázat adatai 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban Mayer Márton munkájának

eredményei.

Retrográd pályajelölő

anyaggal

jelölt célterület

A MRR-ban

retrográd

visszajelölt

sejtek száma

A MRR-ben retrográd visszajelölt sejtek

neurokémiai tulajdonságai

SG

sejtek

GO

sejtek

SO

sejtek

jelöletlen

sejtek

Hippokampusz (egér 5) 391 49% 31% 8% 12%

Mediális szeptum (egér 6) 850 19% 34% 13% 34%

Mediális szeptum (egér 7) 710 21% 47% 10% 21%

Mediális PFC (egér 5) 506 32% 38% 21% 9%

Mediális PFC (egér 6) 555 24% 45% 16% 15%

Mediális PFC (egér 7) 334 29% 46% 10% 15%

A méréseink során kapott értékeket a 8. táblázat mutatja. Röviden összefoglalva

azt tapasztaltuk, hogy a mPFC-be vetítő sejtek átlagosan mintegy 45%-a csak vGluT3-

mat tartalmazott, átlagosan mintegy 30%-uk 5HT- és vGluT3-pozitív volt, és csupán

átlagosan mintegy 15%-uk tartalmazott csak 5HT-t. A HIPP és MS esetében a patkányban

már leírt számadatokhoz hasonló eredményeket kaptunk: a HIPP-ba vetítő sejtek mintegy

31%-a csak vGluT3-pozitív, mintegy 49%-a 5HT- és vGluT3-pozitív, és mintegy 8%-a

csak 5HT-pozitív volt; a MS-ba vetítő sejtek átlagosan mintegy 40%-a volt csak vGluT3-

pozitív, átlagosan mintegy 20%-a 5HT- és vGluT3-pozitív, és átlagosan mintegy 10%-a

csak 5HT-pozitív.

Minden pályajelölés során megfigyeltünk olyan sejteket is, amelyek sem 5HT-t,

sem vGluT3-mat nem tartalmaztak. A HIPP és a mPFC esetében ez a visszajelölt sejtek

legfeljebb 15%-át érintette, a MS-ba történt beadások esetén azonban akár a visszajelölt

sejtek 34%-át. Mivel a kísérletekben használt antitestek szenzitivitását alaposan teszteltük

75

(lásd VIII.1. fejezet), ezek a sejtek valóban negatívnak tekinthetőek. Valószínűnek

tartjuk, hogy ezek a sejtek a fent leírt GABAerg és/vagy „hármas negatív” populációkba

tartoznak, de mivel csak négy fluoreszcens csatornát tudtunk megjeleníteni, vGAT-

riporter egerekbe nem adtunk retrográd pályajelölő anyagot, ezért ezen sejteket

neurokémiailag nem azonosítottuk.

Összességében véve azt figyeltük meg, hogy a korábbi elgondolással szemben a

MRR-ból az előagyba vetítő sejtek legnagyobb része glutamaterg, vGluT3-pozitív, tehát

képes egy igen hatékony és gyors serkentő hatást közvetíteni a beidegzett agyterületeken.

VII.4. A median raphe régió sejtjei egyszerre több agyterületet is beidegeznek

Mivel azt tapasztaltuk, hogy a MRR-ból az előagyba vetítő sejtek legnagyobb része képes

a glutamaterg transzmisszióra, így egy hatékony és gyors serkentő hatást közvetíthet a

célterületein, célkitűzéseink 4a pontjának megfelelően meg akartuk vizsgálni, hogy egyes

MRR sejtek több agyterületet is beidegeznek-e egyszerre. Ebben az esetben ugyanis ezek

a sejtek képesek lehetnének a különböző agyterületeken gyors és hatékony, szinkron

hatást létrehozni. Hogy ezt megvizsgáljuk, kettős retrográd pályajelölést végeztünk;

ennek során 7 egér mediális prefrontális kérgébe FG-ot injektáltunk, melyből 4 egér

medális szeptumába, valamint 3 egér hippokampuszába párhuzamosan CTB-t adtunk.

Megfelelő túlélési idő után megvizsgáltuk, hogy a MRR-ban vannak-e olyan sejtek,

melyek mindkét retrográd pályajelölő anyagot tartalmazzák (9. és 10. táblázat).

Mivel már ismert volt, hogy vannak a MRR-ban a HIPP és MS területére

egyszerre vetítő sejtek, és ezek neurokémiai jellemzőit is részben leírták (Acsády és mtsai

1996; McKenna és Vertes 2001), HIPP-MS kettős retrográd pályajelölést nem végeztünk.

Azonban az eddig még nem vizsgált mPFC-HIPP és mPFC-MS kettős pályajelölés

esetében is azt tapasztaltuk, hogy a MRR sejtjeinek jelentős része beidegzi mindkét

elárasztott agyterületet. A mPFC-HIPP kettős pályajelölés esetében, abban az egérben,

amelyben a legnagyobb mértékben sikerült elárasztani a célzott előagyi területeket, a

MRR sejtjeinek átlagosan mintegy 9-12%-a mindkét agyterületet beidegezte. A mPFC-

MS kettős pályajelölés esetében ez átlagosan mintegy 11-16%-nak adódott (9. és 10.

táblázat).

76

9. táblázat: Hippokampusz-mPFC kettős retrográd pályajelölési kísérletek és a két

agyterületre vetítő sejtek neurokémiai tulajdonságai. A táblázat adatai 80%-ban Szőnyi

András, 20%-ban Mayer Márton munkájának eredményei.

Állat azonosítója: Egér 1 Egér 2 Egér 5

Az egyik oldali hippokampusz pályajelölő anyaggal megjelölt

térfogata (százalék) 11% 12% 13%

Az egyik oldali mPFC pályajelölő anyaggal megjelölt

térfogata (százalék) 8% 9% 13%

A hippokampuszba vetítő sejtek azon része, amelyek a mPFC

pályajelölő anyaggal jelölt részére vetítenek

9/166

(5.4%)

11/96

(11.5%)

46/391

(11.9%)

A mPFC-be vetítő sejtek azon része. amelyek a hippokampusz

pályajelölő anyaggal jelölt részére vetítenek

9/156

(5.8%)

11/304

(3.6%)

46/506

(8.7%)

A két agyterület pályajelölő anyaggal jelölt

területére vetítő sejtek neurokémiai

jellemzése

SG sejtek - - 71%

GO sejtek - - 20%

SO sejtek - - 9%

jelöletlen sejtek - - 0%

10. táblázat: MS-mPFC kettős retrográd pályajelölési kísérletek. és a két agyterületre

vetítő sejtek neurokémiai tulajdonságai. A táblázat adatai 80%-ban Szőnyi András, 20%-

ban Mayer Márton munkájának eredményei.

Állat azonosítója: Egér 3 Egér 4 Egér 6 Egér 7

A MS pályajelölő anyaggal megjelölt térfogata

(százalék) 16% 11% 23% 9%

A kétoldali mPFC pályajelölő anyaggal megjelölt

térfogata (százalék) 21% 24% 17% 21%

A MS-ba vetítő sejtek azon része. amelyek a mPFC

pályajelölő anyaggal jelölt részére vetítenek

23/395

(5.8%)

30/319

(9.4%)

91/850

(10.9%)

64/710

(9.2%)

A mPFC-be vetítő sejtek azon része. amelyek a MS

pályajelölő anyaggal jelölt részére vetítenek

23/686

(3.4%)

30/1050

(2.9%)

91/555

(16.0%)

64/334

(18.6%)

A két agyterület pályajelölő

anyaggal jelölt területére vetítő

sejtek neurokémiai jellemzése

SG sejtek - - 32% 37%

GO sejtek - - 35% 56%

SO sejtek - - 15% 5%

jelöletlen sejtek - - 18% 3%

77

Fontos megjegyezni, hogy ezek az eredmények mindenképpen alulbecslik a

mindkét agyterületet egyszerre beidegezni képes idegsejtek arányát. Ennek az okai, hogy

nem lehet úgy elárasztani egy agyterületet pályajelölő anyaggal, hogy annak teljes

területét elérjük, viszont más területre ne kerüljön pályajelölő anyag, így a célzott

agyterületnek mindig csupán egy részéről jelölünk vissza sejteket. Az agyterületen belül

is változhat a beadóanyag koncentrációja, továbbá az egyes agyterületekre érkező rostok

sűrűsége az agyterületen belül is változhat, így az egyes beadások hatékonysága nagyon

változó lehet. Végül a különböző típusú sejtek más-más hatékonysággal szállíthatják a

különböző beadóanyagokat.

A fenti vizsgálatok mellett a mPFC-HIPP retrográd pályajelölések esetében 1

egérben (16. ábra), a mPFC-MS pályajelölések esetében 2 egérben (17. ábra)

megvizsgáltuk a két helyre vetítő sejtek neurokémiai tulajdonságait is. Az tapasztaltuk,

hogy a mPFC-be és MS-ba vetítő sejtek átlagosan mintegy 45%-a csak vGluT3-pozitív,

átlagosan mintegy 35%-a vGluT3 és 5HT-pozitív, valamint átlagosan mintegy 10%-a

csak 5HT-pozitív volt. A mPFC-be és HIPP-ba vetítő sejtek mintegy 20%-a csak vGluT3-

pozitív, mintegy 71%-a vGluT3 és 5HT-pozitív, és mintegy 9%-a csak 5HT-pozitív volt.

Az egyszerre két agyterületre vetítő sejtek döntő többsége tehát képes a glutamaterg

transzmisszióra, így a beidegzett célsejtek aktivitásának egyszerre, szinkron történő

befolyásolására. A retrográd pályajelöléses kísérletekből nyert adatok összefoglalása a

18. ábrán látható.

78

16. ábra: A MRR

sejtjei egyszerre

vetítenek a mPFC-be

és a HIPP-ba. A1-

A2: A fluo-reszcens

mikro-szkópiával

készült képek az

ugyanazon

agyfélteke mPFC-be

injektált FG (A1) és

HIPP-ba adott CTB

(A2) beadási helyét

mutatják. A met-

szeteken jelöltük a

mPFC és a HIPP

alrégióit.

Lépték: 200 μm mindkét képen. B1-B4: A MRR-ban retrográd pályajelöléssel megjelölt

mPFC-be vetítő FG-pozitív (zöld), HIPP-ba vetítő CTB-pozitív (piros), vGluT3-pozitív

(kék) és 5HT-pozitív (magenta) sejtek. A MR és a PMR határait a sztereotaxiás atlasz

(Paxinos és Franklin 2012) alapján határoztuk meg. A C-vel jelölt téglalap a C1-C4

képeken felnagyított sejtek helyzetét jelzi. Lépték: 100 μm minden képen. C1-C4: A MRR-

ban található, különböző területekre vetítő, eltérő neurokémiai tulajdonságú sejtek. Az

üres nyíl egy csak a mPFC-be vetítő, vGluT3- és 5HT-pozitív sejtet, a teli nyílhegy egy, a

MS-ba vetítő 5HT-pozitív sejtet jelöl. A teli nyilak mindkét agyterületre vetítő sejteket

jelölnek, melyek közül a felső vGluT3- és 5HT-pozitív, míg az alsó csak vGluT3-pozitív.

Lépték: 30 μm minden képen. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban Mayer Márton

munkájának eredménye.

79

17. ábra: A MRR

sejtjei egyszerre

vetítenek a mPFC-

be és a MS-ba. A1-

A2: A fluoreszcens

mikroszkópiával ké-

szült képek mindkét

agyfélteke mPFC-be

injektált FG (A1) és

a MS-ba adott CTB

(A2) beadási helyét

mutatják. A met-

szeteken jelöltük a

mPFC és a MS

alrégióit. Lépték:

200 μm mindkét

képen. B1-B4: A MRR-ban retrográd pályajelöléssel megjelölt mPFC-be vetítő FG-

pozitív (zöld), MS-ba vetítő CTB-pozitív (piros), vGluT3-pozitív (kék) és 5HT-pozitív

(magenta) sejtek. A MR és a PMR határait a sztereotaxiás atlasz (Paxinos és Franklin

2012) alapján határoztuk meg. A C-vel jelölt téglalap a C1-C4 képeken felnagyított sejtek

helyzetét jelzi. Lépték: 100 μm minden képen. C1-C4: A MRR-ban található, különböző

területekre vetítő, eltérő neurokémiai tulajdonságú sejtek. Az üres nyilak csak a mPFC-

be vetítő, vGluT3+ sejteket jelölnek, a teli nyílhegyek a MS-ba vetítő sejteket jelölnek,

melyek közül a felső vGluT3-pozitav, az alsó 5HT-pozitív. A teli nyilak mindkét

agyterületre vetítő sejteket jelölnek, melyek közül a felső vGluT3- és 5HT-pozitív, míg az

alsó csak vGluT3-pozitív. Lépték: 30 μm minden képen. Az ábra 80%-ban Szőnyi András,

20%-ban Mayer Márton munkájának eredménye.

80

18. ábra: A MRR-ból felszálló pályarendszerben résztvevő 5HT és/vagy vGluT3-pozitív

sejtek megoszlásának aránya. A kék nyilak az egyes területekre vetítő pályákat mutatják,

a téglalapokban az egyes területekre, vagy mindkét területre egyszerre vetítő sejtek

neurokémiai eloszlása látható, az azonosított sejttípusok százalékában.

VII.5. A median raphe régió előagyban létrehozott szinapszisai NMDA-

receptorokat tartalmaznak

Fenti vizsgálataink azt mutatják, hogy a MRR legnagyobb részben glutamaterg

sejtekkel célozza meg a mPFC-t, a MS-t és a HIPP-t. Célkitűzéseink 3a-3b pontjainak

megfelelően meg akartuk vizsgálni, hogy a MRR által létrehozott előagyi

szinapszisokban megvan-e a glutamaterg transzmisszióhoz szükséges molekuláris

felépítés. Mivel a klasszikus serkentő szinapszisok jelentős része posztszinaptikusan

NMDA-receptorokat fejez ki, megvizsgáltuk, hogy a MRR által létrehozott előagyi

szinapszisokban is megtalálható-e az NMDA-receptorok GluN2A alegysége. Ezekhez a

vizsgálatokhoz az anterográd pályajelölő anyag 10kDA BDA-t adtunk be vad típusú

egerek MRR-ba; csak olyan egereket használtunk, melyben a BDA a MRR-n kívüli

81

19. ábra: Az NMDA-receptorok GluN2A-alegysége megtalálható a MRR HIPP-ban

létrehozott szinapszisaiban. A: a fénymikroszkópiával készült felvétel a MRR-ba injektált

10 kDA BDA beadási helyét mutatja. A MR és PMR határait a sztereotaxiás atlasz

(Paxinos és Franklin 2012) alapján határoztuk meg. Lépték: 200 μm. B1-B3: A BDA-val

jelölt, DAB-csapadékot tartalmazó, MRR-ból származó terminális által létrehozott

szinapszis posztszinaptikus aktív zónájában ezüst-intenzifikált immunarany szemcsék

jelölik a GluN2A-alegység jelenlétét (nyílhegyek). A képsorozat a sorozatmetszeteken

teljesen rekonstruált ugyanazon szinapszis egyes ultravékony metszeteiről készült képeket

tartalmazza. C1-C3, D, E1-E2: A HIPP CA1 régiójának str. radiatum és str. lacunosum

moleculare határán elhelyezkedő interneuronok szómájára és proximális dendritjeire

érkező vGluT3-pozitív, DAB-csapadékkal jelölt terminálisok szinapszisainak

posztszinaptikus aktív zónájában ezüst-intenzifikált immunarany szemcsék jelölik a

GluN2A-alegység jelenlétét (nyílhegyek). A C1-C3 és E1-E2 képek ugyanazoknak a

szinapszisoknak a különböző ultravékony metszeteiről készültek. F: Az ugyanezen

interneuronok szómájára érkező vGluT3-pozitív terminálisok jelentős része nem

tartalmaz NL2-jelölést (görbe nyíl), míg a közvetlenül mellettük elhelyezkedő, DAB-

negatív GABAerg szimmetrikus szinapszisok NL2-pozitívak (nyílhegyek). Lépték: 300 nm

a B-F képeken. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban Mayer Márton munkájának

eredménye.

82

területeket nem festette meg (19. ábra, A). 7-10 nap túlélési idő után kettős immunarany-

immunperoxidáz jelölést végeztünk a GluN2A alegység és a BDA ellen. A BDA jelölés

a MRR előagyi rostjainak mintázatával egyezett az összes vizsgált agyterületen (Freund

és mtsai 1990; Vertes és mtsai 1999). A HIPP-ban a MRR rostjai legnagyobb sűrűségben

a str. radiatum és a str. lacunosum-moleculare határán helyezkedtek el, ahol lokális

interneuronok sejttestjeit és proximális dendritjeit idegezték be kosárszerűen

elhelyezkedő szinapszisokkal. Korrelált fény-és elektronmikroszkópia segítségével

teljesen rekonstruáltunk összesen 42 darab szinapszist (n=15, 12, 15; 3 egér), melyet

véletlenszerűen kiválasztott BDA-pozitív terminálisok hoztak létre a HIPP disztális

dendritikus régióiban. Méréseink szerint ezeknek a szinapszisoknak legalább egyharmada

tartalmazta az NMDA-receptorok GluN2A alegységét posztszinaptikusan (19. ábra B1-

B3, 20. ábra, C).

Bár a beágyazás előtti immunarany jelölés szemikvantitatív módszer, és az epitóp

abszolút mennyiségének meghatározására nem alkalmas, segítségével jól meg lehet

becsülni egyes membránszakaszok egymáshoz képesti epitópsűrűségét. Ezért a fenti

reakciókban teljesen rekonstruáltunk BDA-pozitív, MRR-ból származó szinapszisokat,

illetve lokális, DAB-csapadékot nem tartalmazó, aszimmetrikus (feltehetően

glutamaterg) szinapszisokat, ugyanis ez utóbbiakban is megtalálható volt az NMDA-

receptorok GluN2A alegysége. Ezután összehasonlítottuk az ezen szinapszisok

posztszinaptikus aktív zónájában található GluN2A immunarany-jelölés sűrűségét. A

teljes rekonstrukció során azt találtuk, hogy a MRR-ból érkező szinapszisok területe

átlagosan mintegy kétszer nagyobb, mint a lokális aszimmetrikus szinapszisoké (20.

ábra, E), viszont a GluN2A immunarany jelölés sűrűsége a két populációban nem tért el

egymástól (MRR: 0.41 ± 0.24 aranyrészecske/szinapszis, DAB-negatív aszimmetrikus:

0.38 ± 0.20 aranyrészecske/szinapszis), vagyis a MRR-ból érkező terminálisok által

létrehozott szinapszisok hasonló mennyiségű NMDA-receptort tartalmaznak, mint a

klasszikus serkentő szinapszisok. Emellett a korábban publikált adatokkal összhangban

(Szabadits és mtsai 2011) ritkán megfigyeltünk immunarany-jelölést extraszinaptikus

membránszakaszokon is. A DAB-negatív aszimmetrikus szinapszisok preszinaptikus

terminálisainak membránján mért háttérjelölés mértéke elhanyagolható volt (VI/9 fejezet,

20. ábra, D).

83

Az NMDA-receptorok megjelöléséhez pepszines emésztést kellett végrehajtani a

szöveten, hogy feltárjuk az antitest epitópját (Watanabe és mtsai 1998; Szabadits és mtsai

2011). Mivel a pepszinnel történő emésztés hatékonysága a szövet mélyebb rétegei felé

haladva csökken, eddigi eredményeinket megerősítendő a HIPP-ban kettős GluN2A-

vGluT3 immunarany-immunperoxidáz jelölést is végeztünk, hogy nagyobb mintát

tudjunk venni a szövet felszínéről, ahol a legjobb volt a GluN2A-jelölés jel-zaj aránya. A

vGluT3-jelölés a szakirodalomból ismert mintázatot adta a HIPP-ban (Somogyi és mtsai

2004). Mivel a HIPP-ban lokális vGluT3-pozitív interneuronok is találhatóak, melyek a

piramissejtek szómáját és proximális dendritjeit idegzik be (és amely jelölési mintázatot

a mi festésünk is mutatta), korrelált fény- és elektronmikroszkópia segítségével olyan

vGluT3-pozitív terminálisokból vettünk mintát, melyek a str. radiatum és str. lacunosum-

moleculare határán találhatóak, legnagyobb részben a MRR-ból erednek, és igazoltan az

ott található interneuronok szómájára vagy proximális dendritjeire adtak szinapszisokat.

2 egérben végzett méréseink szerint (n=20 szinapszis/egér) ezen szinapszisok majdnem

mindegyike tartalmazta a GluN2A alegységet a posztszinaptikus oldalon (19. ábra C-E,

20. ábra, A). Ebből a mintából is rekonstruáltunk lokális, aszimmetrikus DAB-negatív

szinapszisokat, és azt találtuk, hogy az egyes membránszakaszokon mért immunarany-

jelölés sűrűségének egymáshoz viszonyított aránya hasonló volt az anterográd-

pályajelölés során mért adatokhoz (20. ábra, B).

Bár a HIPP-ban található vGluT3-pozitív interneuronok terminálisainak

legnagyobb része a periszomatikus régióban található, előfordulhat, hogy néhány

terminálisuk a disztális dendritikus régiókban létesít szinapszist. Mivel a lokális vGluT3-

pozitív interneuronok GABAergek, az általuk létrehozott szinapszisok posztszinaptikus

oldalán megtalálható egy transzmembrán fehérje, a neuroligin-2 (NL2), mely csak a

GABAerg és kolinerg szinapszisokban található meg (Takács és mtsai 2013; Varoqueaux

és mtsai 2004). Ezért vGluT3-NL2 kettős immunarany-immunperoxidáz jelölést

végeztünk a disztális dendritikus régiókban található, lokális vGluT3-pozitív

interneuronoktól származó szinapszisok arányának meghatározására. A NL2 jelölés a

korábbi szakirodalmi adatoknak megfelelően posztszinaptikus membránokhoz

kapcsolódott (Takács és mtsai 2013). 2 egérben végzett méréseink

84

85

20. ábra: Az elektronmikroszkópos mérések során gyűjtött adatok összegzése. A: Az

oszlopok a str. radiatum és str. lacunosum-moleculare határán elhelyezkedő

interneuronok sejttestjeire vagy proximális dendritjeire érkező vGluT3-pozitív

terminálisok posztszinaptikus NL2 vagy GluN2A-alegység pozitivitását mutatják, 2-2

egérben. B: Az oszlopok 2 egér HIPP-ban, különböző membránszakaszokon mért GluN2A

immunarany-jelölés átlagos sűrűségét mutatják. Az első oszlop a vGluT3-pozitív

terminálisok posztszinaptikus aktív zónájában (vGluT3 term), a második oszlop a

közvetlenül ezen terminálisok mellett elhelyezkedő jelöletlen, aszimmetrikus szinapszisok

posztszinaptikus aktív zónájában (serk. term), a harmadik oszlop ezen aszimmetrikus

szinapszisok posztszinaptikus aktív zónájának szélétől 200-200nm-re található

membránszakaszon (extra), a negyedik oszlop ezen aszimmetrikus szinapszisok

preszinaptikus terminálisainak membránján (háttér) mért immunarany-sűrűséget

mutatja. A teljes lemért membránfelületet μm2-ben határoztuk meg. C: A GluN2A-

alegységet kifejező BDA-pozitív terminálisok százalékos aránya a HIPP-ban, MS-ban és

mPFC-ben, 3 egérben. D, F, H: Az oszlopok 3 egér HIPP-ban (D), MS-ban (F), illetve

mPFC-ben (H), különböző membránszakaszokon mért GluN2A immunarany-jelölés

átlagos sűrűségét mutatják. Az első oszlop a BDA-pozitív terminálisok posztszinaptikus

aktív zónájában (MRR term), a második oszlop a közvetlenül ezen terminálisok mellett

elhelyezkedő jelöletlen, aszimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus aktív zónájában

(serk. term), a harmadik oszlop ezen aszimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus aktív

zónájának szélétől 200-200nm-re található membránszakaszon (extra), a negyedik oszlop

ezen aszimmetrikus szinapszisok preszinaptikus terminálisainak membránján (háttér)

mért immunarany-sűrűséget mutatja. A teljes lemért membránfelületet μm2-ben

határoztuk meg. E,G,I: Az oszlopok a fenti egerek HIPP-ban (E), MS-ban (G), illetve

mPFC-ben (I) mért BDA-pozitív (MRR term) és jelöletlen, aszimmetrikus szinapszisok

(serk. term) posztszinaptikus aktív zónájának területét mutatják, μm2-ben. A függőleges

vonalak a standard deviációt jelölik. A mintaként szolgáló teljesen rekonstruált

szinapszisok számát az oszlopokban jelöltük. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban

Mayer Márton munkájának eredménye.

86

szerint (n=49 és 39 teljesen rekonstruált szinapszis) a vizsgált vGluT3-pozitív

terminálisok által létrehozott szinapszisok átlagosan csupán mintegy 10%-a tartalmazott

NL2-jelölést (20. ábra, A). Ezzel szemben a közvetlenül ezen szinapszisok mellett

elhelyezkedő, az interneuronok szómájára érkező szimmetrikus, GABAerg szinapszisok

mindegyike NL2-pozitív volt (19. ábra, F). Mivel ezek alapján azt mondhatjuk, hogy az

ebben a rétegben található vGluT3-pozitív terminálisok által létrehozott szinapszisok

90%-a a MRR-ból származik, összességében a MRR-ból származó szinapszisok legalább

88%-a tartalmaz NMDA-receptorokat. Ezek az arányok azért magasabbak az anterográd

pályajelölés során mért adatokhoz képest, mert lehetőségünk volt a metszetek felszínéről

mintát venni, ahol a legjobb volt az immunreakció minősége.

Az anterográd pályajelöléses vizsgálatok segítségével a MS-ban és a mPFC-ben

is megvizsgáltuk a MRR-ból származó szinapszisok NMDA-receptor tartalmát (21.

ábra). A MS-ban a BDA-pozitív rostok eloszlása a szakirodalomból ismert eloszlást

mutatta: a medialis szeptális területen és a Broca-féle diagonális köteg területén is sűrű

rosthálózatot láttunk, melyek egyes sejtek körül kosárszerű terminálishálót hoztak létre

(Aznar és mtsai 2004; Leranth és Vertes 1999). A mPFC területén a rostozat ritkább volt,

viszont minden esetben kosárszerű termináliseloszlást láttunk, főleg a kéreg felszíni

rétegeiben, mely 10-15 terminálist is tartalmazott egy csoportban. 3 egérben végzett

méréseink alapján (MS: n= 15, 15, 15, összesen 45 darab; mPFC: n= 15, 14, 15, összesen

44 darab teljesen rekonstruált szinapszis) azt tapasztaltuk, hogy a MRR MS-ban

létrehozott szinapszisainak átlagosan legalább 40%-a (20. ábra, C, 21. ábra, A-C), míg

az mPFC-ben létrehozott szinapszisok átlagosan legalább a fele tartalmazta a GluN2A

alegységet posztszinaptikusan (20. ábra, C, 21. ábra, D-F). Hasonlóan a HIPP-ban

megfigyeltekhez, a MRR-ból származó szinapszisok mérete átlagosan mintegy kétszerese

volt a lokális aszimmetrikus szinpaszisokénak (20. ábra, G, I). Az egyes

membránszakaszokon mért aranyszemcse-sűrűség értékek hasonlóak voltak a HIPP-ban

mért adatokhoz, és itt is azt tapasztaltuk, hogy az NMDA-receptorok sűrűsége a MRR

által létrehozott szinapszisokban összemérhető a lokális aszimmetrikus szinapszisok

NMDA-receptor tartalmával, mind a MS-ban (MRR: 0.89 ± 0.48 aranyszemcse/

szinapszis, DAB-negatív aszimmetrikus: 0.65 ± 0.40 aranyszemcse/ szinapszis, 20. ábra,

F), mind a mPFC-ben ( MRR: 0.92 ± 0.42 aranyszemcse/ szinapszis, DAB-negatív

aszimmetrikus: 0.52 ± 0.24 aranyszemcse/ szinapszis, 20. ábra, H).

87

21. ábra: Az NMDA-receptorok GluN2A-alegysége megtalálható a MRR előagyi

szinapszisaiban. A BDA-val jelölt, DAB-csapadékot tartalmazó, MRR-ból származó

terminálisok által a MS-ban (A1-A4, B, C), illetve a mPFC-ben (D1-D2, E1-E3, F)

létrehozott szinapszisok posztszinaptikus aktív zónájában ezüst-intenzifikált immunarany

szemcsék jelölik a GluN2A-alegység jelenlétét (nyílhegyek). Az A1-A4, D1-D2 és E1-E3

képek ugyanazoknak a szinapszisoknak a különböző ultravékony metszeteiről készültek.

Lépték: 500 nm minden képen. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban Mayer Márton

munkájának eredménye.

88

VIII. MEGBESZÉLÉS

VIII.1. A median raphe régió sejtszintű felépítése

Méréseink az egér MRR-ban található különböző típusú idegsejtek számának

eddigi legpontosabb, torzításmentes, statisztikai szempontok által megalapozott

meghatározását adják. Ezen mérések során külön elemeztük a MR-ra és a PMR-ra

vonatkozó adatokat. Azonban a MR és a PMR között húzott határvonalat mesterségesen,

a patkányban készült korai vizsgálatok alapján határozták meg (Paxinos és Franklin

2012). Mivel méréseink során a MR-ban és a PMR-ban vizsgált sejtpopulációk

semmilyen tekintetben nem különböztek egymástól, valamint az egyes sejtek dendritjei

minden irányból áthaladnak ezeken a határokon (Calizo és mtsai 2011), minden okunk

megvan azt feltételezni, hogy a MR-ban és a PMR-ban található sejtek ugyanabba a

populációba tartoznak. Az egér MRR szélessége nem haladja meg az 1mm-t (Paxinos és

Franklin 2012), amely még a legmodernebb optogenetikai vizsgálatok esetében is azt

jelenti, hogy a megvilágításhoz használt fény a MR és PMR területét is képes hatékonyan

elárasztani (Yizhar és mtsai 2011). Úgy gondoljuk tehát, hogy az egérben történő

vizsgálatok esetében a MR és PMR elkülönítése funkcionális szempontból nem célszerű,

és helyesebb a MRR-t egységes agyterületként kezelni.

Az eddigi munkák sejtszámokra vonatkozó adatai főleg patkányban végzett

mérésekből származnak. Ezek az adatok vagy csak a MRR-ban található 5HT-pozitív

sejtekre vonatkoznak, melyek altípusai között további különbségeket nem tettek, vagy

csupán becsléseit adták a MRR-ban található sejteknek, közelítő méréseket alkalmazva

(Aldahmash 2015; Ishimura és mtsai 1988; Ito és mtsai 2014; Jackson és mtsai 2009). A

patkány MRR-ban található szerotonerg sejtek számát eddig mintegy 1100-2100 darabra

becsülték; a mi méréseink alapján az egér MRR-ban található szerotonerg sejtek száma

mintegy 2700 darab, melyek nagyobb része – mintegy 1700 darab – vGluT3-mat is

kifejez fiatal felnőttkorban.

A MRR-ban jelenlévő vGluT3-pozitív sejteket már régóta ismerjük (Fremeau és

mtsai 2004; Gras és mtsai 2005; Herzog és mtsai 2004), és ismert volt, hogy ezek,

legalábbis részben, a 5HT-pozitív sejtek csoportjával is átfednek (Hioki és mtsai 2010;

89

Jackson és mtsai 2009), azonban pontos számuk meghatározása eddig nem történt meg.

Méréseink szerint a 5HT- és vGluT3-pozitív sejteken felül további, mintegy 3300 darab

csak vGlut3-pozitív sejt található a MRR-ban. A 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtek

legnagyobb többsége a MR-ban helyezkedett el. A PMR-ban található, ilyen típusú sejtek

a MR-hoz közelebbi határokon helyezkedtek el, a PMR szélei felé egyre kevésbé voltak

megfigyelhetőek.

A MRR-ban található további sejttípusok számára és működésére vonatkozóan

még kevesebb adattal rendelkezünk. Bár a MRR területén található GABAerg sejtek

jelenléte már régóta ismert volt (Stamp 1995; Calizo és mtsai 2011), jellemzőiket és

működésüket csak az utóbbi időben kezdték feltárni (Wang és mtsai 2015; Domonkos és

mtsai 2016). Anatómiai módszerekkel azonban sem számukat, sem a többi sejthez

viszonyított arányukat nem vizsgálták meg alaposabban. A MRR GABAerg sejtjeinek

döntő többsége a PMR-ban helyezkedik el, méréseink szerint számuk mintegy 29000

darab, mely a teljes MRR-ban található sejtpopuláció mintegy kétharmada. Kísérleteink

alapján ezek a sejtek a 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtektől eltérő populációba

tartoznak: mint ahogy azt korábbi vizsgálatok is mutatták, sosem tartalmaztak 5HT-t

(Stamp, 1995), és vGluT3-mat is csupán elenyésző töredékük (mintegy 400 darab)

tartalmazott. Ez utóbbi, vGAT- és vGluT3-pozitív sejtek olyan fenotípusúak, melyhez

hasonló az agykérgi területek egyes interneuronjaiban is megfigyelhető (Somogyi és

mtsai 2004), azonban ezen sejtek szerepe a MRR működésében teljesen ismeretlen.

Az utolsó, „hármas negatív” populáció tagjai sem 5HT-t, sem vGluT3-mat, sem

pedig vGAT-ot nem fejeztek ki; ezen sejtek száma a MRR-ban mintegy 12000 darab volt,

ezzel a MRR sejtjeinek mintegy 25%-át tették ki. Előfordulhatna, hogy ezek olyan sejtek

voltak, melyekben a megjelölni kívánt molekulák mennyisége nem érte el az általunk

használt antitestek érzékelési küszöbét, de ezt több okból is valószínűtlennek tartjuk.

Egyrészt ezeknek a sejteknek a mennyisége a metszetek felszínén, ahol nincsenek

penetrációs problémák, is ugyanannyi volt, mint a metszetek belsejében. Olyan

területeken is láttunk „hármas negatív” sejteket, ahol az antitestekkel megjelölt többi

sejtpopuláció tagjai erős, határozott jelölést adtak, így az adott helyen nem volt gyengébb

az immunreakció minősége. A „hármas negatív” sejtek a szövetben egyenletesen

oszlottak el, továbbá nagy részük a PMR területén helyezkedett el, ahol a 5HT- és/vagy

vGluT3-pozitív sejtek egyébként is ritkábban voltak megtalálhatók, ezért valószínűtlen,

90

hogy ezek álnegatív sejtek lettek volna. Továbbá igazoltuk, hogy a 5HT-festésünk

minden szerotonerg sejtet megjelöl, ugyanis minden olyan sejt, amely a 5HT szintézisért

felelős TpH enzimet tartalmazta, 5HT-pozitív volt. A vGAT genetikai jelölés erős,

egyértelmű és egyenletes volt, mintázata nem tért el attól, amire számítottunk, és egyezett

a korábbi leírásokkal (Vong és mtsai 2011).

Mi lehet a „hármas negatív” sejtek neurokémiai profilja? Az agy glutamaterg

sejtjeinek jelentős része nem vGluT3 segítségével tölti fel a szinaptikus vezikulákat

glutamáttal, hanem vGluT1-et vagy vGluT2-t fejez ki (Fremeau és mtsai 2004). Ezeknek

a vezikuláris transzportereknek a jelenlétét in situ hibridizációs módszerek segítségével

vizsgálták a MRR területén, de a vGluT1 génjének transzkriptumát egyáltalán nem

sikerült kimutatni, és a vGluT2 transzkriptumának jele is gyenge és ritkán észlelhető volt

(Hioki és mtsai 2010). A raphe magok területén dopaminerg sejtek is találhatók, melyek

tirozin-hidroxiláz festéssel mutathatók ki, de a MRR régió területén ezen sejtek

mennyisége elenyésző (Jahanshahi és mtsai 2013), ezért valószínűtlen, hogy a „hármas

negatív” populációba tartozó sejtek mind dopaminergek lennének. Leírtak továbbá

nitrogén-monoxid szintázt, galanint vagy szomatosztatin kifejező sejteket is a MRR

területén, de ezek jelentős része TpH-pozitív, szerotonerg sejt volt (Araneda és mtsai

1999; Fernandez és mtsai 2016; Lu és mtsai 2010). Tudomásunk szerint további

vizsgálatok nem történtek a MRR-ben található egyéb sejtpopulációk vizsgálatára.

VIII.2. Az ePet nem specifikus a median raphe régió szerotonerg sejtjeire

A ETS-doménnal rendelkező transzkripciós faktorok családjába tartozó PET-1-et

már régóta ismerjük, mint a szerotonerg rendszer fejlődéséhez, differenciálódásához, és

felnőttkori működéséhez szükséges fehérjét (Hendricks és mtsai 1999; Liu és mtsai 2010;

Wyler és mtsai 2015; Wyler és mtsai 2016). A PET-1-et és a hozzá tartozó 1.8 kb

hosszúságú enhancer régiót, az ePet-et nagyon sokáig a szerotonerg sejtekre specifikus

elemnek gondolták (Depuy és mtsai 2011; Hendricks és mtsai 1999; Hendricks és mtsai

2003; Kiyasova, és mtsai 2013; Scott 2005a; Scott és mtsai 2005b; Wylie és mtsai 2010).

Ezen vizsgálatok során már megfigyelték, hogy a PET-1 és az ePet csak a szerotonerg

sejtek 70-80%-ában fejeződik ki (Hendricks és mtsai 2003; Kiyasova és mtsai 2011; Pfaar

és mtsai 2002). Később azonban a PET-1 kifejeződését megfigyelték a MRR nem

91

szerotonerg sejtjeiben is, melyek a teljes PET-1-pozitív sejtpopuláció mintegy 20%-át

adták (Pelosi és mtsai 2014). Emellett azt is megfigyelték, hogy PET-1 KO egerekben a

MRR vGluT3-mat kifejező sejtjeinek jelentős része továbbra is jelen van (Gaspar és

Lillesaar 2012).

Kvantitatív sztereológiai méréseink igazolták a fenti adatokat. Az összes MRR-

ban található 5HT-pozitív sejtnek mintegy 70%-át (mintegy 1900-at a 2700-ból) ePet-

pozitívnak találtuk. Azonban azt is megfigyeltük, hogy a „csak vGluT3-pozitív”

sejtpopuláció jelentős része, mintegy 40%-a is ePet-pozitív, továbbá vannak olyan

„hármas negatív” sejtek is (ugyan jelentősen kisebb számban), melyek szintén kifejezik

az ePet-et. Összességében véve a MRR ePet-pozitív sejtjeinek mintegy fele nem fejezett

ki 5HT-t. Mivel az ePet genetikai jelölésünk a szakirodalomban jól karakterizált, erős és

egyértelmű jelölést adta (Depuy és mtsai 2011; Scott 2005a; Scott és mtsai 2005b; Wylie

és mtsai 2010), azt gondoljuk, hogy az ePet-pozitivitás nem specifikus a szerotonerg

sejtekre, és az eddigi és jövőbeni szakirodalmi adatokat ennek tükrében kell értelmezni.

Méréseink azonban azt is mutatják, hogy az ePet-pozitív sejteknek csupán

mintegy 10%-a tartozik olyan populációba, amely nem fejez ki 5HT-t és/vagy vGluT3-

mat, és ezek a „csak ePet-pozitív” sejtek a teljes MRR-ban található sejtpopulációnak

csupán mintegy 1%-át alkotják. Az ePet és a PET-1 olyan gének felnőttkori működését

segítik, melyek a MRR szerotonerg és/vagy glutamaterg sejtjeire jellemző fenotípust

határozzák meg: PET-1 KO egerekben jelentősen csökken többek között a TpH, a

szerotonin-transzporter, az 5HT1A és 5HT1B autoreceptorok, valamint a vGluT3 mRNS-

ének átíródása, és ezáltal a kódolt fehérjék mennyisége is (Hendricks és mtsai 2003; Liu

és mtsai 2010; Wyler és mtsai 2015; Wyler és mtsai 2016). Méréseink szerint a vGAT-

pozitív sejtek nem fejeznek ki 5HT-t, és vGluT3-mat is csak elenyésző menyiségben; ez

azt sugallja, hogy az ePet-pozitív és a vGAT-pozitív sejtek eltérő populációba tartoznak.

Ezért a „csak ePet-pozitív” sejteket neurotranszmitter-tartalmuk szerint a „hármas

negatív” csoportba soroltuk.

92

VIII.3. A median raphe régió 5HT-és/vagy vGluT3-tartalmú sejtjeinek jellemzése

A MRR 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtjeinek száma állatonként nagy

variabilitást mutatott: például a GM1 egérben a SO sejtek száma nagyobb volt a többi

állatban mérthez képest, de kevesebb SG és GO sejtet tartalmazott, mint például a GM2

egér; valamint az egyes kategóriákon belül az ePet-negatív és -pozitív sejtek aránya is

változó volt. Azonban az összes 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejt száma meglehetősen

állandó volt a MRR területén. Ezek a sejtek közösen alkotják a MRR-ból felszálló

pályarendszert (Aznar és mtsai 2004; Shutoh és mtsai 2008; Somogyi és mtsai 2004), az

általuk megcélzott agyterületek hasonlóak, és ott elsődlegesen helyi GABAerg sejteket

céloznak meg (Aznar és mtsai 2004; Freund és mtsai 1990; Varga és mtsai 2009).

Eredményeink azt sugallják, hogy a MRR-ból származó információ jelentős részét ezek

a sejtek közösen továbbítják az előagyi területek felé, a szerotonerg és glutamaterg

rendszer szoros együttműködésével.

A 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtek ePet-pozitivitásával kapcsolatos adataink

azonban azt sugallják, hogy különbségek is vannak ezen sejtpopulációkon belül.

Méréseink során a 5HT-pozitív sejteknek csak mintegy 70%-át találtuk ePet-pozitívnak.

Korábbi munkák szerint a 5HT-pozitív sejteknek hasonló aránya mutat PET-1 pozitivitást

(Hendricks és mtsai 2003; Pfaar és mtsai 2002). A PET-1-et nem kifejező szerotonerg

sejtek egy külön populációt alkotnak, jellemzően a bazolaterális amygdalába és egyes

thalamikus magokba vetítenek, ahol funkcionális szinaptikus kapcsolatokkal

rendelkeznek (Kiyasova és mtsai 2011). A bazolaterális amygdalába, mPFC-be vagy

HIPP-ba vetítő sejtek elektrofiziológiai és neurokémiai tulajdonságai további eltéréseket

mutatnak (Fernandez és mtsai 2016). Továbbá genetikai nyomonkövetési módszerek

segítségével leírták, hogy a MRR-ban található 5HT- (és részben vGluT3-) pozitív sejtek

több rhombomérából fejlődtek ki (Bang és mtsai 2012; Jensen és mtsai 2008),

egymáshoz, és más raphe magokban található szerotonerg sejtekhez képest eltérő előagyi

vetítési mintázatuk van, és rostjaik morfológiája is különböző (Bang és mtsai 2012;

Deneris és Wyler 2012; Jensen és mtsai 2008; Muzerelle és mtsai 2016). A vGluT3-

pozitív sejtek hasonlóan heterogén csoportot képeznek ePet-pozotivitás szempontjából

(Gaspar és Lillesaar 2012), és ezt a mi méréseink is alátámasztották. Újabb mérések

szerint a MRR-ban található 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtek alapvető

93

elektrofiziológiai tulajdonságokban térnek el egymástól (Calizo és mtsai 2011;

Domonkos és mtsai 2016).

Összefoglalva tehát úgy tűnik, hogy a MRR-ban található 5HT- és/vagy vGluT3-

pozitív sejtek alapvetően hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek, és feladatuk a MRR-

ból származó információ közvetítése az előagy felé; a sejtpopuláción belüli különbségek

azonban lehetővé tehetik, hogy a különböző sejtek a szerotonerg rendszer sokrétű

funkcióinak különböző céljait valósítsák meg.

VIII.4. A median raphe régióból felszálló pályát döntően glutamaterg rostok

alkotják

A MRR-ból felszálló pályát klasszikusan szerotonergnek tartják, bár már egyes

korai szakirodalmi adatok is leírtak nem szerotonerg, előagyba vetítő sejteket (Acsády,

Arabadzisz, és mtsai 1996; Dahlström és Fuxe 1964; Hensler 2006; Köhler és mtsai 1982;

Köhler és Steinbusch 1982). Később patkányban mind retrográd, mind anterográd

pályajelöléssel kimutatták, hogy a MRR-ban található nem szerotonerg sejtek részt

vesznek a MRR-ból felszálló pálya létrehozásában (Aznar és mtsai 2004; Jackson és

mtsai 2009; Somogyi és mtsai 2004), majd egérben végzett vizsgálatok is megerősítették

ezeket az adatokat (Amilhon és mtsai 2010; Kiyasova és mtsai 2011; Varga és mtsai

2009). Ezekben a munkákban a szerotonerg sejtekre jellemző jelölés mellett a vGluT3

jelenlétét figyelték meg ezekben a sejtekben és axonjaikban. Csoportunk korábbi

munkájából kiderült, hogy a vGluT3 működőképes ezekben a rostokban, ugyanis az egér

HIPP-ban egyes interneuronokon serkentő posztszinaptikus potenciálokat tudtunk

kiváltani a MRR-ból felszálló rostok optogenetikai ingerlésével, melyek glutamaterg

blokkolószerek jelenlétében szinte teljesen eltűntek (Varga és mtsai 2009).

Fenti méréseink szerint a MRR-ból felszálló pálya gerincét a vGluT3-pozitív GO

és SG sejtek adják. Az egér HIPP-ból, MS-ból és mPFC-ből végzett retrográd

pályajelölésünk szerint az ezen agyterületekre vetítő sejtek mintegy 60-80%-a kifejezi a

vGluT3-mat; ezen adatok hasonlóak a korábban patkányban mért értékekhez (Jackson és

mtsai 2009). Azonban meglepő módon, főleg a MS-ot célzó rostok esetében, azt találtuk,

hogy a retrográd pályajelöléssel azonosított sejtek mintegy 25%-a nem tartalmazott sem

5HT-t, sem vGluT3-mat, ami szintén összhangban van a korábbi szakirodalmi adatokkal

94

(Jackson és mtsai 2009). Mivel a használt antitestek szenzitivitását a sztereológiai

mérések esetében igazoltuk, azt gondoljuk, hogy ezek a rostok vagy a MRR GABAerg,

vagy az eddig még neurokémiailag nem azonosított sejtjeitől erednek. A mPFC és a HIPP

területére az ilyen típusú rostokból jóval kevesebb érkezett, ami azt sejteti, hogy ezek a

sejtek a MRR fő pályáját képviselő vGluT3- és/vagy 5HT-pozitív rostoktól eltérő

célterület-, és feltehetőleg célsejt-szelektivitással rendelkeznek.

A MRR sejtjeinek több agyterületre való vetítését eddig viszonylag kevés

tanulmányban vizsgálták, és ezekben is döntően a HIPP és MS viszonyában (Acsády és

mtsai 1996; Köhler és mtsai 1982; Köhler és Steinbusch 1982; McKenna és Vertes 2001).

Fenti méréseink szerint a MRR sejtjeire jellemző, hogy több agyterületet egyszerre

idegezzenek be; a retrográd pályajelölő anyagokkal megjelölt sejtek átlagosan mintegy

10%-a két pályajelölő anyagot is tartalmazott. Továbbá kimutattuk, hogy ezen sejtek

jelentős része, mintegy 70-90%-uk kifejezi a vGluT3-mat.

A MRR rostjai jellemzően lokális GABAerg interneuronokat céloznak meg a

beidegzett kortikális területeken és a mediális szeptumban; illetve a MS-ban a HIPP

interneuronjait célzó PV-pozitív, GABAerg sejtek is erős beidegzést kapnak (Aznar és

mtsai 2004; Freund és mtsai 1990; Leranth és Vertes 1999). Ezeken a sejteken egy rost

akár 40 terminálist is létesíthet, többnyire azok periszomatikus régiójában (Freund és

mtsai 1990; Leranth és Vertes 1999). Méréseink szerint ezekben a szinapszisokban

NMDA-receptorok is találhatók, melyek sűrűsége hasonló a klasszikus serkentő

szinapszisokban mérhetőhöz. A MRR tehát nagyon hatékonyan aktiválhatja ezeket a

sejteket glutamaterg serkentésen keresztül, így befolyásolva a helyi hálózati működést.

Mivel a MRR sejtjei több agyterületet is képesek egyszerre beidegezni, a hatékony

glutamaterg transzmisszió segítségével ezeken az agyterületeken szinkron hatásokat is

kiválthatnak, így összehangolva azok aktivitását.

VIII.5. A glutamaterg és a szerotonerg neurotranszmisszió kapcsolódási pontjai

A glutamaterg és szerotonerg rendszerek több molekuláris eleme is

összekapcsolódik; ezeket a kapcsolatokat – melyekben az NMDA-receptorok is részt

vesznek – több agyterületen is kimutatták. A MRR által célzott interneuronok

működőképes ionotróp 5HT3-receptorokat fejeznek ki a HIPP, MS és mPFC területén is

95

(McMahon és Kauer 1997; Morales és Bloom 1997; Puig és mtsai 2004; Ropert és Guy

1991). Bár közvetlen anatómiai módszerekkel nem bizonyítottuk az 5HT3-receptorok

szinaptikus jelenlétét, és NMDA-receptorokhoz képesti helyzetüket, hatásukat a HIPP-

ban korábbi munkánk során mi is kimutattuk (Varga és mtsai 2009). Az 5HT3-receptorok

áram-feszültség görbéjének lefutása függ az extracelluláris Ca2+-szinttől (McMahon és

Kauer 1997). Így az 5HT3-receptorok közvetlenebb kapcsolatban is állhatnak a

glutamaterg ingerületátvitellel ezekben a szinapszisokban, ugyanis az NMDA-receptorok

képesek lehetnek az extracelluláris Ca2+-ot átmenetileg eltüntetni a szinaptikus térből

(Arens és mtsai 1992; Vassilev és mtsai 1997). Továbbá az 5HT3-receptorok által okozott

posztszinaptikus depolarizáció segíthet az NMDA-receptorok Mg2+-blokkját

megszüntetni, így azokat aktiválni.

A vGluT3 a hippokampuszban és az agykéregben segíti a 5HT vezikulákba

történő felvételét, és ezáltal hatékonyabbá teszi ezeken a területeken a szerotonerg

ingerületátvitelt (Amilhon és mtsai 2010). A 5HT képes lehet az NMDA-receptorokat

közvetlenül blokkolni, ahogy azt patkány ventrális gerincvelő kultúrában kimutatták

(Chesnoy-Marchais és Barthe 1996). Elképzelhető, hogy a MRR erős aktiválása során

felszabaduló 5HT a szinaptikus NMDA-receptorok közvetlen blokkolásával

megakadályozza a posztszinaptikus sejtbe történő fokozott Ca2+-beáramlást, így megvédi

azt az excitotoxicitástól. Bár közvetlen vizsgálatok ezen kölcsönhatások felmérésére

eddig még nem történtek, az NMDA-receptorok jelenléte ezekben a szinapszisokban új

megvilágításba helyezi a két rendszer közötti együttműködési lehetőségeket.

96

IX. KÖVETKEZTETÉSEK

A MRR alapvetően fontos szerepet tölt be több kognitív funkció szabályozásában,

és ennek a régiónak a hibás működését több neuropszichiátriai betegségben is leírták.

Vizsgálataink során kvantitatív, torzításmentes sztereológiai módszerek segítségével

meghatároztuk a MRR-ban található különböző sejttípusok számát és egymáshoz

viszonyított arányát. Méréseink szerint a MRR sejtjeinek mintegy 60%-a GABAerg és

csupán mintegy 15%-uk tartalmaz 5HT-t és/vagy vGluT3-mat. Továbbá a MRR

sejtjeinek mintegy 25%-a az eddig ismert kategóriákba nem besorolható neurokémiai

fenotípusba tartozik. Ugyanezen módszerek segítségével azt figyeltük meg, hogy az eddig

a kifejezetten szerotonerg sejtekre specifikusnak gondolt ePet csupán a 5HT-pozitív

sejtek mintegy felében expresszálódik felnőttkorban, és a 5HT-negatív sejtek egy jelentős

része is kifejezi az ePet-et. Így az ePet nem alkalmas a 5HT-pozitív sejtek célzott

azonosítására a MRR-ban, és az eddigi ePet/PET-1 rendszerrel kapcsolatos adatokat is

ennek tükrében kell újraértelmeznünk. Ez a munka nem csupán az egér MRR sejtszintű

felépítésének első statisztikailag pontos leírása, de ráirányítja a figyelmet, hogy eddig a

MRR-ban található sejteknek csupán töredékét vizsgáltuk behatóan. A MRR-ban

található sejtek funkcióinak, viselkedésben betöltött szerepének megértéséhez további,

specifikus vizsgálatok szükségesek.

A MRR-ből felszálló pálya az előagy több területét is beidegzi, ahol erős hatással

bír a helyi hálózati aktivitásra. Retrográd pályajelölés és fluoreszcens immunhisztokémiai

módszerek segítségével kimutattuk, hogy a MRR-ból a HIPP-ba, MS-ba és mPFC-be

vetítő rostok legnagyobb része a vGluT3-pozitív sejtektől ered. Így a MRR képes lehet

gyors és hatékony serkentő hatást kifejteni az ezeken a területeken található célsejtjein.

Emellett kettős retrográd pályajelölés segítségével kimutattuk, hogy a MRR egyes sejtjei

képesek több agyterület szimultán beidegzésére, valamint a két agyterületet egyszerre

beidegző sejtek legnagyobb része tartalmaz vGluT3-mat. A MRR tehát képes lehet több

agyterületen gyors, szinkron hatást kiváltani, rendkívül hatékonyan befolyásolva az

előagyi aktivitást.

Anterográd pályajelölés, valamint korrelált fény-és elektronmikroszkópos

módszerek segítségével kimutattuk, hogy a MRR előagyban létrehozott szinapszisai

97

valóban rendelkeznek a gyors glutamaterg ingerületátvitelhez szükséges molekuláris

felépítéssel, ugyanis ezeknek a szinapszisokban megtaláltuk az NMDA-receptorok

GluN2A alegységét. Az immunarany-jelölés sűrűségének elemzése azt mutatta, hogy a

MRR szinapszisaiban található NMDA-receptorok sűrűsége hasonló a klasszikus

serkentő szinapszisokban találhatóhoz, ami tovább erősíti a MRR hatékonyságát az

előagyi hálózatok befolyásolásában.

Összességében tehát úgy tűnik, hogy a MRR előagyra gyakorolt elsődleges hatása

a területeken található célsejtek, vagyis egyes helyi interneuronok hatékony glutamaterg

serkentése, melyhez az ezzel párhuzamos szerotonerg vetítés egy fontos modulációs

mechanizmussal járul hozzá.

98

X. ÖSSZEFOGLALÁS

A median raphe régió (MRR) alapvetően fontos szerepet tölt be egyes kognitív

funkciók szabályozásában. A MRR-ból eredő pálya a felszálló szerotonerg rendszerhez

tartozik, melynek fontos szerepe van az előagyi hálózati aktivitás szabályozásában. A

szerotonerg sejtek fenotípusának fenntartásában az ePet/PET-1 transzkripciós faktor-

rendszer alapvető szerepet tölt be, mely rendszert sokáig a szerotonerg sejtekre

specifikusnak gondolták.

A MRR-ban azonban a szerotonerg sejtek mellett a vezikuláris glutamát

transzporter 3 típusát (vGluT3) kifejező glutamaterg, és GABAerg sejtek is vannak. A

MRR-ban található különböző sejttípusok számának pontos leírása, és ezen sejttípusok

ePet-pozitivitásának aránya azonban eddig nem volt ismert.

Kutatócsoportunk korábbi munkáiból kiderült, hogy a MRR-ból hatékony

glutamaterg serkentés érkezik a hippokampusz egyes interneuronjaira. Azonban eddig

nem vizsgálták, hogy a glutamaterg beidegzés mennyire jellemző más előagyi

területeken, illetve hogy a MRR sejtjei képesek-e egyes agyterületeket egyszerre

beidegezni, így azokat gyorsan és hatékonyan szinkron módon szabályozni.

Vizsgálataink során kvantitatív, torzításmentes sztereológiai módszerekkel

kimutattuk, hogy az egér MRR sejtjeinek csupán mintegy 15%-a szerotonerg vagy

vGluT3-pozitív, mintegy 60%-uk GABAerg, és mintegy 25%-uk a fenti jelölésekkel nem

azonosítható fenotípusú. Az ePet csupán a szerotonerg sejtek mintegy 70%-ában

fejeződött ki, és a glutamaterg sejtek mintegy 70%-a is ePet-pozitív volt. Az ePet tehát

nem alkalmas a szerotonerg fenotípusú sejtek specifikus azonosítására.

Retrográd pályajelölés és konfokális lézer-pásztázó mikroszkópia segítségével

kimutattuk, hogy a MRR hippokampuszba, mediális szeptumba és mediális prefrontális

kéregbe küldött vetítésének döntő része a glutamaterg sejtektől származik, és a MRR

sejtjei képesek egyszerre beidegezni ezeket az agyterületeket. Anterográd pályajelölés és

elektronmikroszkópos vizsgálatok segítségével kimutattuk, hogy a MRR fenti területeken

létrehozott szinapszisai a klasszikus serkentő szinapszisokhoz hasonló sűrűségben

tartalmaznak NMDA-receptorokat. A MRR tehát igen hatékonyan és gyorsan képes

szinkron módon szabályozni egyes előagyi területek aktivitását, melyhez a szerotonerg

transzmisszió egy jelentős modulációs mechanizmussal járulhat hozzá.

99

SUMMARY

The median raphe region (MRR) plays an important role in the regulation of

several cognitive functions. The pathway arising from the MRR belongs to the ascending

serotonergic system that was shown to have a powerful effect on the network activity of

several forebrain areas. The ePet/PET-1 transcription factor system has an essential role

in the maintenance of the serotonergic phenotype of these cells. The expression of ePet is

thought to be specific to the serotonergic cells located to the brainstem.

Besides serotonergic cells, vesicular glutamate transporter type 3 (vGluT3)-

positive glutamatergic and GABAergic cells were also described in the MRR. However,

the exact numbers and ratios of the different cell types of the MRR was never examined.

The ePet-positivity of these populations is also unknown.

The vGluT3-positive cells of the MRR also project to the forebrain, and our

workgroup has shown before that these fibers can exert a powerful glutamatergic

excitation on certain hippocampal interneurons. However the presence of this

glutamatergic effect was not examined in other brain areas. It is also unknown whether

these cells can project to different forebrain areas simultaneously, modulating the network

activity in these areas in a synchronous manner.

Using unbiased, quantitative stereological methods, we have shown that about

60% of the cells in the MRR are GABAergic, and only about 15% of them contains

serotonin or vGluT3, furthermore, about 25% of them belongs to an unidentified

population. Only about 70% of the serotonergic cells expressed ePet, and about 70% of

vGluT3-positive cells were also ePet-positive. Therefore ePet can not be used as a specific

marker for serotonergic cells.

Using retrograde tracing and confocal laser-scanning microscopy we have shown that the

majority of the MRR cells projecting to the hippocampus, medial septum or medial

prefrontal cortex express vGluT3, and these cells can innervate these areas

simultaneously. Furthermore, anterograde tracing and electron microscopy showed that

the synapses established by MRR in these areas express postsynaptic NMDA-receptors.

Therefore, MRR is in an ideal position to exert a fast, synchronous effect through

glutamatergic transmission in these areas that is supported by serotonergic modulation.

100

XI. IRODALOMJEGYZÉK

Acsády L, Arabadzisz D, Freund TF (1996a) Correlated morphological and

neurochemical features identify different subsets of vasoactive intestinal

polypeptide-immunoreactive interneurons in rat hippocampus. Neuroscience

73:299–315.

Acsády L, Görcs TJ, Freund TF (1996b) Different populations of vasoactive intestinal

polypeptide-immunoreactive interneurons are specialized to control pyramidal

cells or interneurons in the hippocampus. Neuroscience 73:317–334.

Adam V. Orvosi biokemia. Medicina Könyvkiadó Zrt. Budapest; 2006:545-546.

Aizawa H, Yanagihara S, Kobayashi M, Niisato K, Takekawa T, Harukuni R, Mchugh

TJ, Fukai T, Isomura Y, Okamoto H, Takakawa T, Harukuni R, Mchugh TJ, Fukai

T, Isomura Y, Okamoto H (2013) The Synchronous Activity of Lateral Habenular

Neurons Is Essential for Regulating Hippocampal Theta Oscillation. J Neurosci

33:8909–8921.

Aldahmash A (2015) Cell numbers in the dorsal and median raphe nuclei of AS and AS

/ AGU rats. Biomed Res 21:15–22.

Almada RC, Borelli KG, Albrechet-Souza L, Brandão ML (2009) Serotonergic

mechanisms of the median raphe nucleus-dorsal hippocampus in conditioned fear:

Output circuit involves the prefrontal cortex and amygdala. Behav Brain Res

203:279–287.

Almeida P, Trovo M, Tokumoto A, Pereira A, Padovan C (2013) Role of serotonin 1A

receptors in the median raphe nucleus on the behavioral consequences of forced

swim stress. J Psychopharmacol 27:1134–1140.

Amilhon B, Lepicard E, Renoir T, Mongeau R, Popa D, Poirel O, Miot S, Gras C,

Gardier AM, Gallego J, Hamon M, Lanfumey L, Gasnier B, Giros B, El

Mestikawy S (2010) VGLUT3 (vesicular glutamate transporter type 3)

contribution to the regulation of serotonergic transmission and anxiety. J Neurosci

30:2198–2210.

Andersen P. (2007) The Hippocampus book. Oxford University Press.

Andrade TG, Zangrossi H, Graeff FG (2013) The median raphe nucleus in anxiety

revisited. J Psychopharmacol 27:1107–1115.

101

Andrade TGC., Graeff F. (2001) Effect of electrolytic and neurotoxic lesions of the

median raphe nucleus on anxiety and stress. Pharmacol Biochem Behav 70:1–14.

Araneda S, Gysling K, Calas A (1999) Raphe serotonergic neurons projecting to the

olfactory bulb contain galanin or somatostatin but not neurotensin. Brain Res Bull

49:209–214.

Arens J, Stabel J, Heinemann U (1992) Pharmacological properties of excitatory amino

acid induced changes in extracellular calcium concentration in rat hippocampal

slices. Can J Physiol Pharmacol 70 Suppl:S194-205.

Assaf SY, Miller JJ (1978) The role of a raphe serotonin system in the control of septal

unit activity and hippocampal desynchronization. Neuroscience 3:539–550.

Avanzi V, Brandão M. (2001) Activation of somatodendritic 5-HT1A autoreceptors in

the median raphe nucleus disrupts the contextual conditioning in rats. Behav Brain

Res 126:175–184.

Avanzi V, Castilho VM, De Andrade TGCS, Brandão ML (1998) Regulation of

contextual conditioning by the median raphe nucleus. Brain Res 790:178–184.

Ayzenshtat I, Karnani MM, Jackson J, Yuste R (2016) Cortical Control of Spatial

Resolution by VIP + Interneurons. J Neurosci 36:11498–11509.

Aznar S, Qian ZX, Knudsen GM (2004) Non-serotonergic dorsal and median raphe

projection onto parvalbumin- and calbindin-containing neurons in hippocampus

and septum. Neuroscience 124:573–581.

Aznavour N, Watkins KC, Descarries L (2005) Postnatal development of the

cholinergic innervation in the dorsal hippocampus of rat: Quantitative light and

electron microscopic immunocytochemical study. J Comp Neurol 486:61–75.

Bang SJ, Jensen P, Dymecki SM, Commons KG (2012) Projections and

interconnections of genetically defined serotonin neurons in mice. Eur J Neurosci

35:85–96.

Barnes NM, Sharp T (1999) A review of central 5-HT receptors and their function.

Neuropharmacology 38:1083–1152.

Bassant MH, Apartis E, Jazat-Poindessous FR, Wiley RG, Lamour Y a (1995) Selective

immunolesion of the basal forebrain cholinergic neurons: effects on hippocampal

activity during sleep and wakefulness in the rat. Neurodegeneration 4:61–70.

Beck SG (2003) Median and Dorsal Raphe Neurons Are Not Electrophysiologically

102

Identical. J Neurophysiol 91:994–1005.

Behzadi G, Kalén P, Parvopassu F, Wiklund L (1990) Afferents to the median raphe

nucleus of the rat: Retrograde cholera toxin and wheat germ conjugated

horseradish peroxidase tracing, and selective d-[3H]aspartate labelling of possible

excitatory amino acid inputs. Neuroscience 37:77–100.

Bezaire MJ, Soltesz I (2013) Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge

base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus 23:751–785.

Bird SJ, Aghajanian GK (1975) Denervation supersensitivity in the cholinergic septo-

hippocampal pathway: A microiontophoretic study. Brain Res 100:355–370.

Bland BH, Oddie SD (1998) Anatomical, electrophysiological and pharmacological

studies of ascending brainstem hippocampal synchronizing pathways. Neurosci

Biobehav Rev 22:259–273.

Blasco-Ibáñez JM, Freund TF (1995) Synaptic Input of Horizontal Interneurons in

Stratum Oriens of the Hippocampal CA1 Subfield: Structural Basis of Feed-back

Activation. Eur J Neurosci 7:2170–2180.

Borelli KG, Gárgaro AC, Dos Santos JM, Brandão ML (2005) Effects of inactivation of

serotonergic neurons of the median raphe nucleus on learning and performance of

contextual fear conditioning. Neurosci Lett 387:105–110.

Borhegyi Z (2004) Phase Segregation of Medial Septal GABAergic Neurons during

Hippocampal Theta Activity. J Neurosci 24:8470–8479.

Boyce R, Glasgow SD, Williams S, Adamantidis A (2016) Causal evidence for the role

of REM sleep theta rhythm in contextual memory consolidation. Science (80- )

352:812.

Brioni JD, Decker MW, Gamboa LP, Izquierdo I, McGaugh JL (1990) Muscimol

injections in the medial septum impair spatial learning. Brain Res 522:227–234.

Buzsáki G (2002) Theta oscillations in the hippocampus. Neuron 33:325–340.

Buzsáki G, Grastyán E, Tveritskaya IN, Czopf J (1979) Hippocampal evoked potentials

and EEG changes during classical conditioning in the rat. Electroencephalogr Clin

Neurophysiol 47:64–74.

Cai L, Gibbs RB, Johnson DA (2012) Recognition of novel objects and their location in

rats with selective cholinergic lesion of the medial septum. Neurosci Lett 506:261–

265.

103

Calizo LH, Akanwa A, Ma X, Pan YZ, Lemos JC, Craige C, Heemstra LA, Beck SG

(2011) Raphe serotonin neurons are not homogenous: Electrophysiological,

morphological and neurochemical evidence. Neuropharmacology 61:524–543.

Chesnoy-Marchais D, Barthe JY (1996) Voltage-dependent block of NMDA responses

by 5-HT agonists in ventral spinal cord neurones. Br J Pharmacol 117:133–141.

Chittajallu R, Craig MT, McFarland A, Yuan X, Gerfen S, Tricoire L, Erkkila B, Barron

SC, Lopez CM, Liang BJ, Jeffries BW, Pelkey K a, McBain CJ (2013) Dual

origins of functionally distinct O-LM interneurons revealed by differential 5-

HT(3A)R expression. Nat Neurosci 16:1598–1607.

Clody DE, Carlton PL (1969) Behavioral effects of lesions of the medial septum of rats.

J Comp Physiol Psychol 67:344–351.

Colgin LL (2016a) Rhythms of the hippocampal network. Nat Rev Neurosci 17:239–

249.

Colgin LL (2016b) Rhythms of the hippocampal network. Nat Rev Neurosci 17:239–

249.

Colom L V. (2006) Septal networks: Relevance to theta rhythm, epilepsy and

Alzheimer’s disease. J Neurochem 96:609–623.

Colom L V., Bland BH (1991) Medial septal cell interactions in relation to hippocampal

field activity and the effects of atropine. Hippocampus 1:15–30.

Commons KG (2016) Ascending serotonin neuron diversity under two umbrellas. Brain

Struct Funct 221:3347–3360.

Conn PJ, Pin J-P (1997) PHARMACOLOGY AND FUNCTIONS OF

METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTORS. Annu Rev Pharmacol Toxicol

37:205–237.

Crooks R, Jackson J, Bland BH (2012) Dissociable pathways facilitate theta and non-

theta states in the median raphe-Septohippocampal circuit. Hippocampus 22:1567–

1576.

Dahlström A, Fuxe K (1964) Localization of monoamines in the lower brain stem.

Experientia 20:398–399.

de Almeida L, Idiart M, Lisman JE (2012) The single place fields of CA3 cells: a two-

stage transformation from grid cells. Hippocampus 22:200–208.

Dederen PJWC, Gribnau AAM, Curfs MHJM (1994) Retrograde neuronal tracing with

104

cholera toxin B subunit: Comparison of three different visualization methods.

Histochem J 26:856–862.

Degroot A, Treit D (2003) Septal gabaergic and hippocampal cholinergic systems

interact in the modulation of anxiety. Neuroscience 117:493–501.

Deneris ES, Wyler SC (2012) Serotonergic transcriptional networks and potential

importance to mental health. Nat Neurosci 15:519–527.

Depuy SD, Kanbar R, Coates MB, Stornetta RL, Guyenet PG (2011) Control of

breathing by raphe obscurus serotonergic neurons in mice. J Neurosci 31:1981–

1990.

Dingledine R, Borges K, Bowie D, Traynelis SF (1999) The glutamate receptor ion

channels. Pharmacol Rev 51:7–61.

Domonkos A, Nikitidou Ledri L, Laszlovszky T, Cserép C, Borhegyi Z, Papp E, Nyiri

G, Freund TF, Varga V (2016) Divergent in vivo activity of non-serotonergic and

serotonergic VGluT3-neurones in the median raphe region. J Physiol 594:3775–

3790.

Dorph-Petersen KA, Nyengaard JR, Gundersen HJG (2001) Tissue shrinkage and

unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc 204:232–

246.

Dragoi G, Buzsáki G (2006) Temporal Encoding of Place Sequences by Hippocampal

Cell Assemblies. Neuron 50:145–157.

Dragoi G, Carpi D, Recce M, Csicsvari J, Buzsáki G (1999) Interactions between

hippocampus and medial septum during sharp waves and theta oscillation in the

behaving rat. J Neurosci 19:6191–6199.

Eichenbaum H (1999) The hippocampus and mechanisms of declarative memory.

Behav Brain Res 103:123–133.

Eichenbaum H (2001) The hippocampus and declarative memory: cognitive

mechanisms and neural codes. Behav Brain Res 127:199–207.

Elvander-Tottie E, Eriksson TM, Sandin J, Ögren SO (2009) 5-HT1A and NMDA

receptors interact in the rat medial septum and modulate hippocampal-dependent

spatial learning. Hippocampus 19:1187–1198.

Euston DR, Gruber AJ, McNaughton BL (2012) The Role of Medial Prefrontal Cortex

in Memory and Decision Making. Neuron 76:1057–1070.

105

Fanselow MS (2000) Contextual fear, gestalt memories, and the hippocampus. Behav

Brain Res 110:73–81.

Fernandez SP, Cauli B, Cabezas C, Muzerelle A, Poncer JC, Gaspar P (2016)

Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons

projecting to the forebrain. Brain Struct Funct 221:4007–4025.

Fischette CT, Nock B, Renner K (1987) Effects of 5, 7-dihydroxytryptamine on

serotonin1 and serotonin2 receptors throughout the rat central nervous system

using quantitative autoradiography. Brain Res 421:263–279.

Fox SR, Deneris ES (2012) Engrailed is required in maturing serotonin neurons to

regulate the cytoarchitecture and survival of the dorsal raphe nucleus. J Neurosci

32:7832–7842.

Fremeau RT, Voglmaier S, Seal RP, Edwards RH (2004) VGLUTs define subsets of

excitatory neurons and suggest novel roles for glutamate. Trends Neurosci 27:98–

103.

Freund TF (2003) Interneuron Diversity series: Rhythm and mood in perisomatic

inhibition. Trends Neurosci 26:489–495.

Freund TF, Antal M (1988) GABA-containing neurons in the septum control inhibitory

interneurons in the hippocampus. Nature 336:170–173.

Freund TF, Buzsáki G (1996) Interneurons of the hippocampus. Hippocampus 6:347–

470.

Freund TF, Gulyás AI, Acsády L, Görcs T, Tóth K (1990) Serotonergic control of the

hippocampus via local inhibitory interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A 87:8501–

8505.

Freund TF, Katona I (2007) Perisomatic Inhibition. Neuron 56:33–42.

Fu W, Le Maître E, Fabre V, Bernard JF, Xu ZQD, Hökfelt T (2010) Chemical

neuroanatomy of the dorsal raphe nucleus and adjacent structures of the mouse

brain. J Comp Neurol 518:3464–3494.

Fuchs EC, Neitz A, Pinna R, Melzer S, Caputi A, Monyer H (2016) Local and Distant

Input Controlling Excitation in Layer II of the Medial Entorhinal Cortex. Neuron

89:194–208.

Fuhrmann F, Justus D, Sosulina L, Kaneko H, Beutel T, Friedrichs D, Schoch S,

Schwarz M, Fuhrmann M, Remy S (2015) Locomotion, Theta Oscillations, and the

106

Speed-Correlated Firing of Hippocampal Neurons Are Controlled by a Medial

Septal Glutamatergic Circuit. Neuron 86:1253–1264.

Fyodorov D, Nelson T, Deneris E (1998) Pet-1, a novel ETS domain factor that can

activate neuronal nAchR gene transcription. J Neurobiol 34:151–163.

Gaffan D, Gaffan EA (1991) Amnesia in man following transection of the fornix: A

review. Brain 114:2611–2618.

Gangadharan G, Shin J, Kim S-W, Kim A, Paydar A, Kim D-S, Miyazaki T, Watanabe

M, Yanagawa Y, Kim J, Kim Y-S, Kim D, Shin H-S (2016) Medial septal

GABAergic projection neurons promote object exploration behavior and type 2

theta rhythm. Proc Natl Acad Sci U S A 113:6550–6555.

Gaspar P, Lillesaar C (2012) Probing the diversity of serotonin neurons. Philos Trans R

Soc B Biol Sci 367:2382–2394.

Gaykema RPA, Lutten PGM, Twakas C, Traber J (1990) Cortical Projection Patterns of

the Medial Septum-Diagonal Band Complex. J Comp Neurol 124:293103–293124.

George Paxinos KF (2012) Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic

Coordinates. São Paulo, Acad Press:360 p.

Graeff FG, Silveira Filho NG (1978) Behavioral inhibition induced by electrical

stimulation of the median raphe nucleus of the rat. Physiol Behav 21:477–484.

Granger AJ, Mulder N, Saunders A, Sabatini BL (2016) Cotransmission of

acetylcholine and GABA. Neuropharmacology 100:40–46.

Gras C, Vinatier J, Amilhon B, Guerci A, Christov C, Ravassard P, Giros B, El

Mestikawy S (2005) Developmentally regulated expression of VGLUT3 during

early post-natal life. Neuropharmacology 49:901–911.

Gulyás AI, Hájos N, Freund TF (1996) Interneurons containing calretinin are

specialized to control other interneurons in the rat hippocampus. J Neurosci

16:3397–3411.

Gulyás AI, Hájos N, Katona I, Freund TF (2003) Interneurons are the local targets of

hippocampal inhibitory cells which project to the medial septum. Eur J Neurosci

17:1861–1872.

Gundersen HJ (1986) Stereology of arbitrary particles. A review of unbiased number

and size estimators and the presentation of some new ones, in memory of William

R. Thompson. J Microsc 143:3–45.

107

Gyires K., Furst Zs., Bartho L. (2011) A farmakologia alapjai. Medicina Könyvkiadó

Zrt. Budapest, 2011.

Hafting T, Fyhn M, Molden S, Moser M-B, Moser EI (2005) Microstructure of a spatial

map in the entorhinal cortex. Nature 436:801–806.

Hagan JJ, Salamone JD, Simpson J, Iversen SD, Morris RGM (1988) Place navigation

in rats is impaired by lesions of medial septum and diagonal band but not nucleus

basalis magnocellularis. Behav Brain Res 27:9–20.

Hájos N, Papp EC, Acsády L, Levey AI, Freund TF (1997) Distinct interneuron types

express m2 muscarinic receptor immunoreactivity on their dendrites or axon

terminals in the hippocampus. Neuroscience 82:355–376.

Halasy K, Miettinen R, Szabat E, Freund TF (1992) GABAergic Interneurons are the

Major Postsynaptic Targets of Median Raphe Afferents in the Rat Dentate Gyrus.

Eur J Neurosci 4:144–153.

Hamorsky KT, Kouokam JC, Bennett LJ, Baldauf KJ, Kajiura H, Fujiyama K, Matoba

N (2013) Rapid and Scalable Plant-based Production of a Cholera Toxin B Subunit

Variant to Aid in Mass Vaccination against Cholera Outbreaks. PLoS Negl Trop

Dis 7.

Hangya B, Borhegyi Z, Szilágyi N, Freund TF, Varga V (2009) GABAergic neurons of

the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci

29:8094–8102.

Heidbreder CA, Groenewegen HJ (2003) The medial prefrontal cortex in the rat:

evidence for a dorso-ventral distinction based upon functional and anatomical

characteristics. Neurosci Biobehav Rev 27:555–579.

Hendricks T, Francis N, Fyodorov D, Deneris ES (1999) The ETS domain factor Pet-1

is an early and precise marker of central serotonin neurons and interacts with a

conserved element in serotonergic genes. J Neurosci 19:10348–10356.

Hendricks TJ, Fyodorov D V., Wegman LJ, Lelutiu NB, Pehek EA, Yamamoto B,

Silver J, Weeber EJ, Sweatt JD, Deneris ES (2003) Pet-1 ETS gene plays a critical

role in 5-HT neuron development and is required for normal anxiety-like and

aggressive behavior. Neuron 37:233–247.

Hensler JG (2006) Serotonergic modulation of the limbic system. Neurosci Biobehav

Rev 30:203–214.

108

Herzog E, Gilchrist J, Gras C, Muzerelle A, Ravassard P, Giros B, Gaspar P, El

Mestikawy S (2004) Localization of VGLUT3, the vesicular glutamate transporter

type 3, in the rat brain. Neuroscience 123:983–1002.

Hioki H, Fujiyama F, Nakamura K, Wu SX, Matsuda W, Kaneko T (2004) Chemically

specific circuit composed of vesicular glutamate transporter 3- and

preprotachykinin B-producing interneurons in the rat neocortex. Cereb Cortex

14:1266–1275.

Hioki H, Nakamura H, Ma YF, Konno M, Hayakawa T, Nakamura KC, Fujiyama F,

Kaneko T (2010) Vesicular glutamate transporter 3-expressing nonserotonergic

projection neurons constitute a subregion in the rat midbrain raphe nuclei. J Comp

Neurol 518:668–686.

Huh CYL, Goutagny R, Williams S (2010) Glutamatergic neurons of the mouse medial

septum and diagonal band of Broca synaptically drive hippocampal pyramidal

cells: relevance for hippocampal theta rhythm. J Neurosci 30:15951–15961.

Ishimura K, Takeuchi Y, Fujiwara K, Tominaga M, Yoshioka H, Sawada T (1988)

Quantitative analysis of the distribution of serotonin- immunoreactive cell bodies

in the mouse brain. Neurosci Lett 91:265–270.

Ito H, Moriizumi T, Shimogawa Y, Yamanouchi K (2014) Postnatal changes in the

number of serotonin-immunoreactive cells in midbrain raphe nuclei of male rats.

Anat Sci Int 89:199–206.

Jackson J, Bland BH, Antle MC (2009) Nonserotonergic projection neurons in the

midbrain raphe nuclei contain the vesicular glutamate transporter VGLUT3.

Synapse 63:31–41.

Jackson J, Dickson CT, Bland BH (2008) Median raphe stimulation disrupts

hippocampal theta via rapid inhibition and state-dependent phase reset of theta-

related neural circuitry. J Neurophysiol 99:3009–3026.

Jahanshahi A, Steinbusch HWM, Temel Y (2013) Distribution of dopaminergic cell

bodies in the median raphe nucleus of the rat brain. J Chem Neuroanat 53:60–63.

Jensen P, Farago AF, Awatramani RB, Scott MM, Deneris ES, Dymecki SM (2008)

Redefining the serotonergic system by genetic lineage. Nat Neurosci 11:417–419.

Jinno S, Klausberger T, Marton LF, Dalezios Y, Roberts JDB, Fuentealba P, Bushong

EA, Henze D, Buzsáki G, Somogyi P (2007) Neuronal diversity in GABAergic

109

long-range projections from the hippocampus. J Neurosci 27:8790–8804.

Jinno S, Kosaka T (2002) Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal

projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: A retrograde

labeling study. Brain Res 945:219–231.

Justus D, Dalügge D, Bothe S, Fuhrmann F, Hannes C, Kaneko H, Friedrichs D,

Sosulina L, Schwarz I, Anthony Elliott D, Schoch S, Bradke F, Karl Schwarz M,

Remy S (2016) Glutamatergic synaptic integration of locomotion speed via

septoentorhinal projections. Nat Publ Gr.

Kaifosh P, Lovett-Barron M, Turi GF, Reardon TR, Losonczy A (2013) Septo-

hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nat

Neurosci 16:1182–1184.

Katona L, Micklem B, Borhegyi Z, Swiejkowski DA, Valenti O, Viney TJ,

Kotzadimitriou D, Klausberger T, Somogyi P (2017) Behavior-dependent activity

patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.

Hippocampus 27:359–377.

Kelsey JE, Landry BA (1988) Medial septal lesions disrupt spatial mapping ability in

rats. Behav Neurosci 102:289–293.

Kesner RP, Adelstein TB, Crutcher KA (1989) Equivalent spatial location memory

deficits in rats with medial septum or hippocampal formation lesions and patients

with dementia of the Alzheimer’s type. Brain Cogn 9:289–300.

Kinney GG, Kocsis B, Vertes RP (1994) Injections of excitatory amino acid antagonists

into the median raphe nucleus produce hippocampal theta rhythm in the urethane-

anesthetized rat. Brain Res 654:96–104.

Kinney GG, Kocsis B, Vertes RP (1995) Injections of muscimol into the median raphe

nucleus produce hippocampal theta rhythm in the urethane anesthetized rat.

Psychopharmacology (Berl) 120:244–248.

Kinney GG, Kocsis B, Vertes RP (1996) Medial septal unit firing characteristics

following\ninjections of 8-OH-DPAT into the median raphe\nnucleus. Brain Res

708:116–122.

Kiss J, Maglóczky Z, Somogyi J, Freund TF (1997) Distribution of calretinin-

containing neurons relative to other neurochemically identified cell types in the

medial septum of the rat. Neuroscience 78:399–410.

110

Kiss J, Patel AJ, Baimbridge KG, Freund TF (1990) Topographical localization of

neurons containing parvalbumin and choline acetyltransferase in the medial

septum-diagonal band region of the rat. Neuroscience 36:61–72.

Kiyasova V, Bonnavion P, Scotto-Lomassese S, Fabre V, Sahly I, Tronche F, Deneris

E, Gaspar P, Fernandez SP (2013a) A subpopulation of serotonergic neurons that

do not express the 5-HT1A Autoreceptor. ACS Chem Neurosci 4:89–95.

Kiyasova V, Bonnavion P, Scotto-lomassese S, Sahly I, Deneris E, Gaspar P, Fernandez

SP (2013b) A Subpopulation of Serotonergic Neurons That Do Not Express the 5 ‑

HT1A Autoreceptor.

Kiyasova V, Fernandez SP, Laine J, Stankovski L, Muzerelle A, Doly S, Gaspar P

(2011) A genetically defined morphologically and functionally unique subset of 5-

HT neurons in the mouse raphe nuclei. J Neurosci 31:2756–2768.

Klausberger T, Magill PJ, Márton LF, Roberts JDB, Cobden PM, Buzsáki G, Somogyi

P (2003) Brain-state- and cell-type-specific firing of hippocampal interneurons in

vivo. Nature 421:844–848.

Klausberger T, Somogyi P (2008) Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity

of hippocampal circuit operations. Science 321:53–57.

Knox D, Keller SM (2016) Cholinergic neuronal lesions in the medial septum and

vertical limb of the diagonal bands of Broca induce contextual fear memory

generalization and impair acquisition of fear extinction. Hippocampus 26:718–726.

Kocsis B, Varga V, Dahan L, Sik A (2006) Serotonergic neuron diversity: identification

of raphe neurons with discharges time-locked to the hippocampal theta rhythm.

Proc Natl Acad Sci U S A 103:1059–1064.

Köhler C, Chan-Palay V, Steinbusch H (1982) The distribution and origin of serotonin-

containing fibers in the septal area: a combined immunohistochemical and

fluorescent retrograde tracing study in the rat. J Comp Neurol 209:91–111.

Köhler C, Steinbusch H (1982) Identification of serotonin and non-serotonin-containing

neurons of the mid-brain raphe projecting to the entorhinal area and the

hippocampal formation. A combined immunohistochemical and fluorescent

retrograde tracing study in the rat brain. Neuroscience 7:951–975.

Konopacki J, Bruce MacIver M, Bland BH, Roth SH (1987) Carbachol-induced EEG

“theta” activity in hippocampal brain slices. Brain Res 405:196–198.

111

Kvirkvelia L, Buzsaki G, Grastyan E (1987) Septal deafferentation produces continuous

rhythmic slow activity (theta) in the rat hippocampus. Acta Physiol Hung 70:127–

131.

Lacaille JC, Schwartzkroin P a (1988a) Stratum lacunosum-moleculare interneurons of

hippocampal CA1 region. I. Intracellular response characteristics, synaptic

responses, and morphology. J Neurosci 8:1400–1410.

Lacaille JC, Schwartzkroin P a (1988b) Stratum lacunosum-moleculare interneurons of

hippocampal CA1 region. II. Intrasomatic and intradendritic recordings of local

circuit synaptic interactions. J Neurosci 8:1411–1424.

Lanciego JL, Wouterlood FG (2011) A half century of experimental neuroanatomical

tracing. J Chem Neuroanat 42:157–183.

Leao RN, Targino ZH, Colom L V, Fisahn A (2014) Interconnection and

Synchronization of Neuronal Populations in the Mouse Medial Septum/Diagonal

Band of Brocca. J Neurophysiol 1986:jn.00367.2014.

LeDoux JE (2000) Emotion Circuits in the Brain. Annu Rev Neurosci 23:155–184.

Lee MG, Chrobak JJ, Sik A, Wiley RG, Buzs??ki G (1994) Hippocampal theta activity

following selective lesion of the septal cholinergic systeM. Neuroscience 62:1033–

1047.

Lehmann O, Grottick AJ, Cassel JC, Higgins GA (2003) A double dissociation between

serial reaction time and radial maze performance in rats subjected to 192 IgG-

saporin lesions of the nucleus basalis and/or the septal region. Eur J Neurosci

18:651–666.

Leranth C, Vertes RP (1999) Median raphe serotonergic innervation of medial

septum/diagonal band of Broca (MSDB) parvalbumin-containing neurons: Possible

involvement of the MSDB in the desynchronization of the hippocampal EEG.

598:586–598.

Li S, Varga V, Sik A, Kocsis B (2005) GABAergic control of the ascending input from

the median raphe nucleus to the limbic system. J Neurophysiol 94:2561–2574.

Li XG, Somogyi P, Tepper JM, Buzsáki G (1992) Axonal and dendritic arborization of

an intracellularly labeled chandelier cell in the CA1 region of rat hippocampus.

Exp brain Res 90:519–525.

Lidov HGW, Molliver ME (1982) An immunohistochemical study of serotonin neuron

112

development in the rat: Ascending pathways and terminal fields. Brain Res Bull

8:389–430.

Liu C, Maejima T, Wyler SC, Casadesus G, Herlitze S, Deneris ES (2010) Pet-1 is

required across different stages of life to regulate serotonergic function. Nat

Neurosci 13:1190–1198.

Lovett-Barron M, Kaifosh P, Kheirbek M, Danielson N, Zaremba J, Reardon T, Turi G,

Hen R, Zemelman B, Losonczy A (2014) Dendritic inhibition in the hippocampus

supports fear learning. Science (80- ) 343:857–863.

Lu Y, Simpson KL, Weaver KJ, Lin RCS (2010) Coexpression of Serotonin and Nitric

Oxide in the Raphe Complex: Cortical Versus Subcortical Circuit. Anat Rec

293:1954–1965.

Ma S, Olucha-Bordonau FE, Hossain MA, Lin F, Kuei C, Liu C, Wade JD, Sutton SW,

Nuñez A, Gundlach AL (2009) Modulation of hippocampal theta oscillations and

spatial memory by relaxin-3 neurons of the nucleus incertus. Learn Mem 16:730–

742.

Malenka RC, Bear MF (2004) LTP and LTD: An embarrassment of riches. Neuron

44:5–21.

Mamounas LA, Mullen CA, O’hearn E, Molliver ME (1991) Dual serotoninergic

projections to forebrain in the rat: Morphologically distinct 5-HT axon terminals

exhibit differential vulnerability to neurotoxic amphetamine derivatives. J Comp

Neurol 314:558–586.

Manseau F, Goutagny R, Danik M, Williams S (2008) The hippocamposeptal pathway

generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and

diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in

vitro. J Neurosci 28:4096–4107.

Maru E, Takahashi LK, Iwahara S (1979) Effects of median raphe nucleus lesions on

hippocampal EEG in the freely moving rat. Brain Res 163:223–234.

Mattis J, Brill J, Evans S, Lerner TN, Davidson TJ, Hyun M, Ramakrishnan C,

Deisseroth K, Huguenard JR (2014) Frequency-Dependent, Cell Type-Divergent

Signaling in the Hippocamposeptal Projection. J Neurosci 34:11769–11780.

McKenna JT, Vertes RP (2001) Collateral projections from the median raphe nucleus to

the medial septum and hippocampus. Brain Res Bull 54:619–630.

113

McMahon LL, Kauer J a (1997) Hippocampal interneurons are excited via serotonin-

gated ion channels. J Neurophysiol 78:2493–2502.

McNaughton N, Azmitia EC, Williams JH, Buchan A, Gray JA (1980) Septal elicitation

of hippocampal theta rhythm after localized de-afferentation of serotoninergic

fibers. Brain Res 200:259–269.

Melik E, Babar-Melik E, Ozgünen T, Binokay S (2000) Median raphe nucleus mediates

forming long-term but not short-term contextual fear conditioning in rats. Behav

Brain Res 112:145–150.

Melzer S, Michael M, Caputi A, Eliava M, Fuchs EC, Whittington M a., Monyer H

(2012) Long-Range – Projecting GABAergic. Science (80- ) 335:1506–1510.

Menard J, Treit D (1996) Lateral and medial septal lesions reduce anxiety in the plus-

maze and probe-burying tests. Physiol Behav 60:845–853.

Miettinen R, Freund TF (1992) Neuropeptide Y-containing interneurons in the

hippocampus receive synaptic input from median raphe and Gabaergic septal

afferents. Neuropeptides 22:185–193.

Miles R, Tóth K, Gulyás AI, Hájos N, Freund TF (1996) Differences between somatic

and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron 16:815–823.

Morales M, Battenberg E, Bloom FE (1998) Distribution of neurons expressing

immunoreactivity for the 5HT3 receptor subtype in the rat brain and spinal cord. J

Comp Neurol 402:385–401.

Morales M, Bloom FE (1997) The 5-HT3 receptor is present in different subpopulations

of GABAergic neurons in the rat telencephalon. J Neurosci 17:3157–3167.

Morris NP, Fyffe REW, Robertson B (2004) Characterisation of hyperpolarization-

activated currents (Ih) in the medial septum/diagonal band complex in the mouse.

Brain Res 1006:74–86.

Mullen RJ, Buck CR, Smith AM (1992) NeuN, a neuronal specific nuclear protein in

vertebrates. Development 116:201–211.

Mumby DG (2001) Perspectives on object-recognition memory following hippocampal

damage: lessons from studies in rats. In: Behavioural Brain Research, pp 159–181.

Muñoz W, Tremblay R, Levenstein D, Rudy B (2017) Layer-specific modulation of

neocortical dendritic inhibition during active wakefulness. Science (80- ) 355:954–

959.

114

Murray EA, Davidson M, Gaffan D, Olton DS, Suomi S (1989) Effects of fornix

transection and cingulate cortical ablation on spatial memory in rhesus monkeys.

Exp Brain Res 74:173–186.

Muzerelle A, Scotto-Lomassese S, Bernard JF, Soiza-Reilly M, Gaspar P (2016)

Conditional anterograde tracing reveals distinct targeting of individual serotonin

cell groups (B5-B9) to the forebrain and brainstem. Brain Struct Funct 221:535–

561.

Nategh M, Nikseresht S, Khodagholi F, Motamedi F (2015) Nucleus incertus

inactivation impairs spatial learning and memory in rats. Physiol Behav 139:112–

120.

Numan R (2015) A Prefrontal-Hippocampal Comparator for Goal-Directed Behavior:

The Intentional Self and Episodic Memory. Front Behav Neurosci 9:323.

Nyakas C, Luiten PGM, Spencer DG, Traber J (1987) Detailed projection patterns of

septal and diagonal band efferents to the hippocampus in the rat with emphasis on

innervation of CA1 and dentate gyrus. Brain Res Bull 18:533–545.

O’Keefe J, Conway DH (1978) Hippocampal place units in the freely moving rat: why

they fire where they fire. Exp brain Res 31:573–590.

O’Keefe J, Dostrovsky J (1971) The hippocampus as a spatial map. Preliminary

evidence from unit activity in the freely-moving rat.

O’Neill P-K, Gordon JA, Sigurdsson T (2013) Theta oscillations in the medial

prefrontal cortex are modulated by spatial working memory and synchronize with

the hippocampus through its ventral subregion. J Neurosci 33:14211–14224.

Okaty BW, Freret ME, Rood BD, Brust RD, Hennessy ML, deBairos D, Kim JC, Cook

MN, Dymecki SM (2015) Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin

Neuron System. Neuron 88:774–791.

Pang KC, Nocera R (1999) Interactions between 192-IgG saporin and intraseptal

cholinergic and GABAergic drugs: role of cholinergic medial septal neurons in

spatial working memory. Behav Neurosci 113:265–275.

Paoletti P (2011) Molecular basis of NMDA receptor functional diversity. Eur J

Neurosci 33:1351–1365.

Papp EC, Hájos N, Acsády L, Freund TF (1999) Medial septal and median raphe

innervation of vasoactive intestinal polypeptide-containing interneurons in the

115

hippocampus. Neuroscience 90:369–382.

Paxinos G (2004) The Rat Nervous System.

Pelosi B, Migliarini S, Pacini G, Pratelli M, Pasqualetti M (2014) Generation of

Pet1210-Cre transgenic mouse line reveals non-serotonergic expression domains of

Pet1 both in CNS and periphery. PLoS One 9:24–29.

Pfaar H, von Holst A, Vogt Weisenhorn DM, Brodski C, Guimera J, Wurst W (2002)

MPet-1, a mouse ETS-domain transcription factor, is expressed in central

serotonergic neurons. Dev Genes Evol 212:43–46.

Pi H-J, Hangya B, Kvitsiani D, Sanders JI, Huang ZJ, Kepecs A (2013) Cortical

interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature 503:521–524.

Puig MV, Santana N, Celada P, Mengod G, Artigas F (2004) In vivo excitation of

GABA interneurons in the medial prefrontal cortex through 5-HT3 receptors.

Cereb Cortex 14:1365–1375.

Ramón y Cajal S (1909) Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des Vertebres.

Maloine, Paris: 1911. chap. II.

Richardson-Jones JW, Craige CP, Guiard BP, Stephen A, Metzger KL, Kung HF,

Gardier AM, Dranovsky A, David DJ, Beck SG, Hen R, Leonardo ED (2010) 5-

HT1A Autoreceptor Levels Determine Vulnerability to Stress and Response to

Antidepressants. Neuron 65:40–52.

Robinson J, Manseau F, Ducharme G, Amilhon B, Vigneault E, El Mestikawy S,

Williams S (2016) Optogenetic Activation of Septal Glutamatergic Neurons Drive

Hippocampal Theta Rhythms. J Neurosci 36:3016–3023.

Rood BD, Calizo LH, Piel D, Spangler ZP, Campbell K, Beck SG (2014) Dorsal raphe

serotonin neurons in mice: immature hyperexcitability transitions to adult state

during first three postnatal weeks suggesting sensitive period for environmental

perturbation. J Neurosci 34:4809–4821.

Ropert N, Guy N (1991) Serotonin facilitates GABAergic transmission in the CA1

region of rat hippocampus in vitro. J Physiol 441:121–136.

Rubin A, Yartsev MM, Ulanovsky N (2014) Encoding of Head Direction by

Hippocampal Place Cells in Bats. J Neurosci 34:1067–1080.

Sanacora G, Zarate CA, Krystal JH, Manji HK (2008) Targeting the glutamatergic

system to develop novel, improved therapeutics for mood disorders. Nat Rev Drug

116

Discov 7:426–437.

San Paulo A, García R (2000) High-resolution imaging of antibodies by tapping-mode

atomic force microscopy: attractive and repulsive tip-sample interaction regimes.

Biophys J 78:1599–1605.

Saunders A, Granger AJ, Sabatini BL (2015) Corelease of acetylcholine and GABA

from cholinergic forebrain neurons. Elife 2015.

Schlingloff D, Kali S, Freund TF, Hajos N, Gulyas AI, Káli S, Freund TF, Hájos N,

Gulyás AI (2014) Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. J

Neurosci 34:11385–11398.

Schmitz C, Hof PR (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience

130:813–831.

Scott MM (2005) A Differentially Autoregulated Pet-1 Enhancer Region Is a Critical

Target of the Transcriptional Cascade That Governs Serotonin Neuron

Development. J Neurosci 25:2628–2636.

Scott MM, Wylie CJ, Lerch JK, Murphy R, Lobur K, Herlitze S, Jiang W, Conlon RA,

Strowbridge BW, Deneris ES (2005) A genetic approach to access serotonin

neurons for in vivo and in vitro studies. ProcNatlAcadSciUSA 102:16472–16477.

Seal RP, Akil O, Yi E, Weber CM, Grant L, Yoo J, Clause A, Kandler K, Noebels JL,

Glowatzki E, Lustig LR, Edwards RH (2008) Sensorineural Deafness and Seizures

in Mice Lacking Vesicular Glutamate Transporter 3. Neuron 57:263–275.

Shepherd GM (2004) The Synaptic Organization of the Brain.

Shutoh F, Ina A, Yoshida S, Konno J, Hisano S (2008) Two distinct subtypes of

serotonergic fibers classified by co-expression with vesicular glutamate transporter

3 in rat forebrain. Neurosci Lett 432:132–136.

Somogyi J, Baude A, Omori Y, Shimizu H, El Mestikawy S, Fukaya M, Shigemoto R,

Watanabe M, Somogyi P (2004) GABAergic basket cells expressing

cholecystokinin contain vesicular glutamate transporter type 3 (VGLUT3) in their

synaptic terminals in hippocampus and isocortex of the rat. Eur J Neurosci 19:552–

569.

Somogyi P, Freund TF, Hodgson AJ, Somogyi J, Beroukas D, Chubb IW (1985)

Identified axo-axonic cells are immunoreactive for GABA in the hippocampus

visual cortex of the cat.

117

Sotty F, Danik M, Manseau F, Laplante F, Quirion R, Williams S (2003) Distinct

electrophysiological properties of glutamatergic, cholinergic and GABAergic rat

septohippocampal neurons: novel implications for hippocampal rhythmicity. J

Physiol 551:927–943.

Stamp JA (1995) Extent of colocalization of serotonin and G A B A in the neurons of

the rat raphe nuclei. Surgery 677:39–49.

Stäubli U, Xu FB (1995) Effects of 5-HT3 receptor antagonism on hippocampal theta

rhythm, memory, and LTP induction in the freely moving rat. J Neurosci 15:2445–

2452.

Sterio DC (1984) The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles

using the disector. J Microsc 134:127–136.

STUMPF C, PETSCHE H, GOGOLAK G (1962) The significance of the rabbit’s

septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The

differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the

hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 14:212–219.

Szabadits E, Cserep C, Szonyi A, Fukazawa Y, Shigemoto R, Watanabe M, Itohara S,

Freund TF, Nyiri G (2011a) NMDA receptors in hippocampal GABAergic

synapses and their role in nitric oxide signaling. J Neurosci 31:5893–5904.

Szabadits E, Cserép C, Szonyi A, Fukazawa Y, Shigemoto R, Watanabe M, Itohara S,

Freund TF, Nyiri G (2011b) NMDA receptors in hippocampal GABAergic

synapses and their role in nitric oxide signaling. J Neurosci 31:5893–5904.

Szirmai I (2005) Neurológia. Medicina Könyvkiadó Zrt. Budapest.

Takács VT, Freund TF, Gulyás AI (2008) Types and synaptic connections of

hippocampal inhibitory neurons reciprocally connected with the medial septum.

Eur J Neurosci 28:148–164.

Takács VT, Freund TF, Nyiri G (2013) Neuroligin 2 Is Expressed in Synapses

Established by Cholinergic Cells in the Mouse Brain. PLoS One 8.

Teissier A, Chemiakine A, Inbar B, Bagchi S, Ray RS, Palmiter RD, Dymecki SM,

Moore H, Ansorge MS (2015) Activity of Raph?? Serotonergic Neurons Controls

Emotional Behaviors. Cell Rep 13:1965–1976.

Thierry AM, Gioanni Y, Dégénétais E, Glowinski J (2000) Hippocampo-prefrontal

cortex pathway: Anatomical and electrophysiological characteristics. Hippocampus

118

10:411–419.

Tremblay R, Lee S, Rudy B (2016) GABAergic Interneurons in the Neocortex: From

Cellular Properties to Circuits. Neuron 91:260–292.

Umbriaco D, Garcia S, Beaulieu C, Descarries L (1995) Relational features of

acetylcholine, noradrenaline, serotonin and GABA axon terminals in the stratum

radiatum of adult rat hippocampus (CA1). Hippocampus 5:605–620.

Unal G, Joshi A, Viney TJ, Kis V, Somogyi P (2015) Synaptic Targets of Medial Septal

Projections in the Hippocampus and Extrahippocampal Cortices of the Mouse. J

Neurosci 35:15812–15826.

van der Staay FJ, Raaijmakers WGM, Lammers AJJC, Tonnaer JADM (1989) Selective

fimbria lesions impair acquisition of working and reference memory of rats in a

complex spatial discrimination task. Behav Brain Res 32:151–161.

Vandecasteele M, Varga V, Berényi A, Papp E, Barthó P, Venance L, Freund TF,

Buzsáki G (2014) Optogenetic activation of septal cholinergic neurons suppresses

sharp wave ripples and enhances theta oscillations in the hippocampus. Proc Natl

Acad Sci 111:13535–13540.

Vanderwolf CH, Leung LW, Baker GB, Stewart DJ (1989) The role of serotonin in the

control of cerebral activity: studies with intracerebral 5,7-dihydroxytryptamine.

Brain Res 504:181–191.

Varga C, Sík A, Lavallée P, Deschênes M (2002) Dendroarchitecture of relay cells in

thalamic barreloids: a substrate for cross-whisker modulation. J Neurosci 22:6186–

6194.

Varga V, Hangya B, Kránitz K, Ludányi A, Zemankovics R, Katona I, Shigemoto R,

Freund TF, Borhegyi Z (2008) The presence of pacemaker HCN channels

identifies theta rhythmic GABAergic neurons in the medial septum. J Physiol

586:3893–3915.

Varga V, Losonczy A, Zemelman B V., Borhegyi Z, Nyiri G, Domonkos A, Hangya B,

Holderith N, Magee JC, Freund TF (2009) Fast Synaptic Subcortical Control of

Hippocampal Circuits. Science (80- ) 326:449–453.

Varoqueaux F, Jamain S, Brose N (2004) Neuroligin 2 is exclusively localized to

inhibitory synapses. Eur J Cell Biol 83:449–456.

Vassilev PM, Mitchel J, Vassilev M, Kanazirska M, Brown EM (1997) Assessment of

119

frequency-dependent alterations in the level of extracellular Ca2+ in the synaptic

cleft. Biophys J 72:2103–2116.

Vertes RP, Fortin WJ, Crane AM (1999) Projections of the median raphe nucleus in the

rat. J Comp Neurol 407:555–582.

Vertes RP, Kinney GG, Kocsis B, Fortin WJ (1994) Pharmacological suppression of the

median raphe nucleus with serotonin1A agonists, 8-OH-DPAT and buspirone,

produces hippocampal theta rhythm in the rat. Neuroscience 60:441–451.

Vertes RP, Kocsis B (1997) Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems

controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience 81:893–926.

Vicente MA, Zangrossi H, dos Santos L, de Macedo CE, Andrade TGCS (2008)

Involvement of median raphe nucleus 5-HT1A receptors in the regulation of

generalized anxiety-related defensive behaviours in rats.

Vida I, Halasy K, Szinyei C, Somogyi P, Buhl EH (1998) Unitary IPSPs evoked by

interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the

CA1 area of the rat hippocampus in vitro. J Physiol 506:755–773.

Viney TJ, Lasztoczi B, Katona L, Crump MG, Tukker JJ, Klausberger T, Somogyi P

(2013) Network state-dependent inhibition of identified hippocampal CA3 axo-

axonic cells in vivo. Nat Neurosci 16:1802–1811.

Vitalis T, Ansorge MS, Dayer AG (2013) Serotonin homeostasis and serotonin

receptors as actors of cortical construction: special attention to the 5-HT3A and 5-

HT6 receptor subtypes. Front Cell Neurosci 7:93.

Vong L, Ye C, Yang Z, Choi B, Chua S, Lowell BB (2011) Leptin Action on

GABAergic Neurons Prevents Obesity and Reduces Inhibitory Tone to POMC

Neurons. Neuron 71:142–154.

Wang D V, Yau H-J, Broker CJ, Tsou J-H, Bonci A, Ikemoto S (2015) Mesopontine

median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation.

Nat Neurosci 18:728–735.

Watanabe M, Fukaya M, Sakimura K, Manabe T, Mishina M, Inoue Y (1998) Selective

scarcity of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum (mossy fibre-

recipient layer) of the mouse hippocampal CA3 subfield. Eur J Neurosci 10:478–

487.

West MJ, Slomianka L, Gundersen HJ (1991) Unbiased stereological estimation of the

120

total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical

fractionator. Anat Rec 231:482–497.

Wirth S, Baraduc P, Planté A, Pinède S, Duhamel J-R (2017) Gaze-informed, task-

situated representation of space in primate hippocampus during virtual navigation.

PLoS Biol 15:e2001045.

Wong DT, Perry KW, Bymaster FP (2005) Case history: The discovery of fluoxetine

hydrochloride (Prozac). Nat Rev Drug Discov 4:764–774.

Wu C-T, Haggerty D, Kemere C, Ji D (2017) Hippocampal awake replay in fear

memory retrieval. Nat Neurosci 20:571–580.

Wyler SC, Donovan LJ, Yeager M, Deneris E (2015) Pet-1 Controls

Tetrahydrobiopterin Pathway and Slc22a3 Transporter Genes in Serotonin

Neurons. ACS Chem Neurosci 6:1198–1205.

Wyler SC, Spencer WC, Green NH, Rood BD, Crawford L, Craige C, Gresch P,

McMahon DG, Beck SG, Deneris E (2016) Pet-1 Switches Transcriptional Targets

Postnatally to Regulate Maturation of Serotonin Neuron Excitability. J Neurosci

36:1758–1774.

Wylie CJ, Hendricks TJ, Zhang B, Wang L, Lu P, Leahy P, Fox S, Maeno H, Deneris

ES (2010) Distinct Transcriptomes Define Rostral and Caudal Serotonin Neurons.

J Neurosci 30:670–684.

Yamakawa GR, Antle MC (2010) Phenotype and function of raphe projections to the

suprachiasmatic nucleus. Eur J Neurosci 31:1974–1983.

Yamamoto T, Watanabe S, Oishi R, Ueki S (1979) Effects of midbrain raphe

stimulation and lesion on EEG activity in rats. Brain Res Bull 4:491–495.

Yizhar O, Fenno LE, Davidson TJ, Mogri M, Deisseroth K (2011) Optogenetics in

Neural Systems. Neuron 71:9–34.

Zhang L, Ren G (2012) IPET and FETR: Experimental approach for studying molecular

structure dynamics by cryo-electron tomography of a single-molecule structure.

PLoS One 7.

121

XII. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

I. Az értekezés témájában megjelent eredeti közlemények:

Sos KE, Mayer MI, Cserep C, Takacs FS, Szonyi A, Freund TF, Nyiri G

Cellular architecture and transmitter phenotypes of neurons of the mouse median raphe region

BRAIN STRUCTURE & FUNCTION 222: (1) pp. 287-299. (2017)

IF: 4,698*

Szonyi A, Mayer MI, Cserep C, Takacs VT, Watanabe M, Freund TF, Nyiri G

The ascending median raphe projections are mainly glutamatergic in the mouse forebrain

BRAIN STRUCTURE & FUNCTION 221: (2) pp. 735-751. (2016)

IF: 4,698

II. Egyéb — nem az értekezés témájában megjelent — eredeti közlemények:

Takacs VT, Szonyi A, Freund TF, Nyiri G, Gulyas AI

Quantitative ultrastructural analysis of basket and axo-axonic cell terminals in the mouse

hippocampus

BRAIN STRUCTURE & FUNCTION 220: (2) pp. 919-940, (2015)

IF: 5,811

Cserep C, Szabadits E, Szonyi A, Watanabe M, Freund TF, Nyiri G NMDA Receptors in

GABAergic Synapses during Postnatal Development PLOS ONE 7: (5) e37753. 13 p. (2012)

IF: 3,730

Cserep C, Szonyi A, Veres JM, Nemeth B, Szabadits E, de Vente J, Hajos N, Freund TF,

Nyiri G

Nitric Oxide Signaling Modulates Synaptic Transmission during Early Postnatal Development

CEREBRAL CORTEX 21: (9) pp. 2065-2074. (2011)

IF: 6,544

122

Szabadits E, Cserep C, Szőnyi A, Fukazawa Y, Shigemoto R, Watanabe M, Itohara S, Freund

TF, Nyiri G

NMDA Receptors in Hippocampal GABAergic Synapses and Their Role in Nitric Oxide

Signaling

JOURNAL OF NEUROSCIENCE 31: (16) pp. 5893-5904. (2011)

IF: 7,115

Zádori D, Nyiri G, Szőnyi A, Szatmári I, Fülöp F, Toldi J, Freund TF, Vécsei I.,

Klivényi P

Neuroprotective effects of a novel kynurenic acid analogue in a transgenic mouse model of

Huntington's disease

JOURNAL OF NEURAL TRANSMISSION 118: (6) pp. 865-875. (2011)

IF: 2,730

A PhD-fokozat megszerzése előtt álló szerzőtársak munkájának aránya a disszertáció

témájában megjelent első szerzős publikációban, beleértve minden adatot, táblázatot és

ábrát:

Szőnyi András: 80%

Mayer Márton: 20%

A PhD-fokozat megszerzése előtt álló szerzőtársak munkájának aránya a disszertáció

témájában megjelent nem első szerzős publikációban, beleértve minden adatot, táblázatot

és ábrát:

Szőnyi András: 13%

Sós Katalin Eszter: 62%

Mayer Márton: 25%

123

XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Szeretném megköszönni szüleimnek, Szőnyiné Simon Beatricének és Szőnyi Lászlónak,

hogy az elmúlt évek alatt végig hittek abban, amit csinálok, és mindvégig támogattak az

orvosi egyetem és a doktori iskola elvégzésében. Az ő áldozataik és biztatásuk nélkül ez

a munka nem készülhetett volna el. Köszönöm testvérem, Szőnyi Péter szerető

támogatását is. Itt mondok köszönetet családom minden tagjának, akik mindannyian

végig érdeklődéssel és biztatással fordultak felém.

Külön köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, Dr. Nyiri Gábornak, és

csoportvezetőnknek, Dr. Freund Tamásnak, akik megmutatták nekem az idegtudomány

szépségét és a helyes tudományos gondolkodást. Az ő példamutatásuk a jövőben is végig

el fog kísérni és útmutatásul fog szolgálni.

Közvetlen munkatársaim közül szeretném kiemelni Sós Katalin Eszter és Mayer Márton

támogatását, emberi és szakmai alázatát és példamutatását, akik az elmúlt évek közös

munkájában a legtöbb segítséget nyújtották nekem, amely jóval túlmutatott és túlmutat a

közös publikációk társszerzőségén.

Végül, de nem utolsósorban szeretném megköszönni az Agykéreg Kutatócsoport, a

Thalamusz Kutatócsoport, a Celluláris Idegélettan Kutatócsoport és a Hálózat-Idegélettan

Kutatócsoport tagjainak, és a MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet

munkatársainak azt, hogy az általuk megteremtett, páratlanul inspiráló és baráti légkörben

dolgozhatok már középiskolás korom óta.

A kutatás a TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság

Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer

kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretében zajlott. A

projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával

valósul meg.