Budapest, 2018.11.10

Vellai Tibor

Eötvös Loránd Tudományegyetem

Genetikai Tanszék

Az öregedési folyamat

szabályozása és

mechanizmusa

Öregedés: az egyed fitneszében és általános fiziológiájában

bekövetkező folyamatos hanyatlás az élettartam során,

amelyet molekuláris károsodások okoznak.

Abbott (Nature

428:116, 2004):

Across the developed

world, birth rates are

falling and people are

living longer. This

requires a new focus

on research to

promote healthy

ageing, rather than

simply treating the

diseases of old age.

A fejlett országokban a várható élettartam meghaladja a 80 évet

(Monaco: 95 év!).

Az öregedési folyamat társadalmi, gazdasági

jelentősége

Orvosbiológiai jelentőség: öregkori degeneratív

patológiák sikertelen kezelése

„aging is a collection of mostly independent degenerative processes

leading to disease and, ultimately, death.”

(Hekimi and Guarente, Science 299: 1351, 2003).

• rák

• neurodegeneratív betegségek

• cukorbetegség

• szöveti atrófia (pl. szarkopénia)

• fibrózis

• Immun-deficienciák

• ...

Molekuláris károsodás

Genetika: hosszú élettartamú mutáns törzsek

izolálása

Cynthia Kenyon

Az elmúlt 3 évtized: kb. 500 „aging” gén feltárása. Jelátviteli rendszerek,

szabályozó fehérjék, respiráció, transzláció, ...

Nature, 366:461-4, 1993.

Életkor (napok)

Élő

álla

tok

(%) vad típus

daf-2(-)

„Some aspects of ageing remain particularly enigmatic.

One of these is the all-important question of what

actually causes ageing.”

Miért?

Az öregedési folyamat mechanizmusa feltáratlan

maradt

• ROS

• telomér rövidülés

• mutációk

• ...

Élő

álla

tok

(%)

Életkor (napok)

vad típusdaf-2(-); daf-2-RNSi, gonád(-)

6x

Eredmények

I.

Piwi fehérjék

Rákos sejtek CsalánozókCsíravonal

Piwi fehérjék (Piwi-piRNS útvonal)

Nem öregedő sejtek (replikatív immortalitás)

összehasonlító elemzése

zigóta

szomatikus sejtek

csíravonal sejtek

Sturm Á. és mtsi., CMLS, 2015Sturm Á. és mtsi., Aging Cell, 2017

ugráló gén gén

enzim

inszerciós mutáns gén

(elrontott gén)

Piwi-piRNS útvonal: transzpozábilis elemek (TE)

blokkolása

Az eukarióta genomok jelentős részét TE-eredetű

szekvenciák alkotják

ENCODE (2012)

„Miért?”

TE-k: nagy kópiaszám (több ezer/millió)

nem lehet genetikailag inaktiválni

TE-k:

• A kópiaszám exponenciális növekedése a szomatikus genomban

• DNS hibajavító rendszer nem ismeri fel

Caenorhabditis elegans genom: kevés TE (12%),

csak néhány család aktív

31/haploid genom

29/haploid genom

Egy új, hatékonyabb RNSi rendszer kifejlesztése.Sturm Á. és mtsi., Nucleic Acids Res 46:e105, 2018.

TE családok csendesítése megnöveli az élettartamot

C. elegans-ban

Tc1Tc3Tc14...

Élő

álla

tok

(%)

Életkor (napok)

Kontroll RNSi

Tc1-RNSi

0

5

10

15

20

25

Mea

n li

fesp

an (

day

s)

control RNAi

Tc1(RNAi)

***Kontroll

Tc1-RNSi

Átl

ago

s é

lett

arta

m

Piwi/PRG-1 szomatikus (ektopikus) expressziója

jelentősen megnöveli az élettartamot

Élő

álla

tok

(%)

Életkor (napok)

Vektorhs::prg-1Vad típus

Az adenin metiláció szintje progresszíven nő TE

szekvenciák mentén

DNS

2 DAMT-1(C18A3.1)

NMAD-1(F09F7.7)

DNS

CH3

Cele141 napos felnőttek 11 napos felnőttek

PvuII M DpnI PvuII M DpnI

30 34 38 30 34 38 30 34 38 30 34 38

(kontroll) (6mA) (kontroll) (6mA)

0100200300400500600700

Day 1 Day 11R

elat

ive

6mA

leve

lsat

Cel

e14

stre

ches

Adult age

DpnI

1 nap 11 nap(életkor)

Re

latí

v 6

mA

szi

nt

a C

ele1

4TE

sz

ekv

enci

ák m

en

tén

0

100

200300

400

500

600700

Day 1 Day 11

Rel

ativ

e6m

A le

vels

atTc

1 st

rech

es

Adult age

DpnI

***

0100200300400500600700

Day 1 Day 11

Rel

ativ

e6m

A le

vels

atTc

3 st

rech

es

Adult age

DpnI

***

Re

latí

v 6

mA

szi

nte

k a

Tc1

sze

kven

ciák

me

nté

n

Re

latí

v 6

mA

szi

nte

k a

Tc3

sze

kven

ciák

me

nté

n

1 nap 11 nap(életkor)

1 nap 11 nap(életkor)

Tc3

100 bpTc3

cdc-42

Tc1

Tc1

cdc-42

800 bp

Az adenin metiláció befolyásolja a TE transzkripciót

Az öregedés sztochasztikus/mutációs aspektusa

(mechanizmus)

Genom instabilitás

TE transzkriptum

kromoszóma

6mA

Fiatal felnőtt Idős felnőttkor

Genomi integritás

ÖregedőNem öregedő

TE TE

TE transzkriptum

kromoszóma

Nincs/minimális transzpozíció Transzpozíció

Eredmények

II.

MTMR14/EDTP fehérjék

Az öregedést sejtes károsodások felhalmozódása

okozza.

A sejtes károsodások eltávolításának legfontosabb

mechanizmusa: AUTOFÁGIA.

Atg génekben TE inszerciók egyedi sejtekben.

AUTOFÁGIA

Sejt anyagainak megújítása

Atg8/LC3B-II

Atg12-Atg5-Atg16

SQSTM1/p62

fagofór autofagoszómalizoszóma

autolizoszóma

PI3K Savas hidrolázokMTMR14

MTMR14

PI3K

Az autofág kapacitás hanyatlása idegsejtekben a felnőtt élettartam során

1 nap 10 nap 30 nap 50 nap 70 nap

Atg5

Hoechst

FYVE-GFP

Hoechst

Ref(2)P/p62

Hoechst

50 µm

0

2

4

6

8

10

1

cove

rag

eo

f A

tg5

par

ticl

es

1

10

30

50

70

Atg5

0

5

10

15

1

1

10

30

50

70

PI3K (FYVE)

cove

rag

eo

f

FY

VE

-GF

P p

arti

cles

napok

Atg

5 s

tru

ktú

rák

me

nn

yisé

ge

FYV

E st

rukt

úrá

km

en

nyi

sége

napok

0

4

8

12

Oregon

1

10

30

50

70

cove

rag

eo

f

Ref

(2)P

par

ticl

es

Ref(2)P/p62

napokRef

(2)P

/p6

2 s

tru

ktú

rák

me

nn

yisé

ge

Fluoreszcens mikroszkópia

α-Tub84B

p62/Ref(2)P

Atg8a-I

Atg8a-II

100 kDa

49.9 kDa

15 kDa

12 kDa

nap 1 10 20 30 40 50 60

Ref(2)P/p62

0

2

4

6

1

1

10

20

30

40

60

50

Rel

ativ

eam

ou

nts

of

Ref

(2)P

Ref(2)P/p62

Ref

(2)P

/p6

2 s

zin

tek

Western blot

napok

year 42

year 71

p62

DAPI

p62

DAPI

p62

0

10

20

30

40

1

abu

nd

ant

of

p62

p

osi

tive

stru

ctu

res

42

71

p6

2 s

zin

tek

Fluoreszcens mikroszkópia

MTMR14/EDTP gátolja az autofágiát

MTMRs

PI3K/Vps34

PI

PI5P

PI3P

MTMRsPI3,5-P2

P1

23

4

5 6P

P

1

23

4

5 6

P

P1

23

4

5 6P

P1

23

4

5 6

P

5’ phosphatasesPIPK

AUTOFÁGIA

MTMR14/EDTP folyamatosan akkumulálódik neuronokban a felnőtt élettartam során

EDTPHoecsht

0

25

50

75

100

1

10

20

30

40

60

50

ED

TP

exp

ress

zió

s

szin

tje

EDTP

napok

Fluoreszcens mikroszkópia

0

3

6

1

1

10

20

30

40

60

50

ED

TP

szi

nte

k

EDTP

Western blot

napok

EDTP

αTub84B

Day: 1 10 20 30 40 50 60M

49.9 kDa

EDTP

α-Tub84b

83.1 kDa

control EDTPminos

MTMR14 akkumulálódik neuronokban a felnőtt élettartam során

27 éves 73 éves

Az öregedés szabályozása – MTMR14/EDTP lipid

foszfatázok, mint endogén pro-aging faktorok

Életkor

Re

latí

v ak

tivi

tás

MTMR14/EDTP

Autofág kapacitás

Öregedési modellünk

Szabályozó faktorok

(pl. MTMR14)

Sztochasztikus faktorok

(random mutációk,

elsősorbanTE-k)

Fenntartó rendszerek

• Autofágia

• Ubikvitin-proteoszóma rendszer

• Chaperone-ok

• DNS hibajavító útvonalak

Sejtes károsodások

Öregedés

• Öregkori betegségek kezelése

• Egészséges élettartam növelése