Az RNS interferencia szerepe a génregulációban

1. Az RNS interferencia felfedezése: az RNS interferencia jelensége, felfedezése

2. miRNS: a miRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában

3. miRNS célpontok keresése állatokban

1. Az RNS interferencia felfedezése- 2006: orvosi Nobel-díj

Craig C. Mello,Andrew Fire

- Kísérletek: C. elegans-on (fonálféreg) 1. az elcsendesíteni kívánt gén mRNS-ével egyszer azonos, másszor ellentétes szekvenciájú RNS bejuttatása → génelcsendesítés mindegyik esetbenha egyszerre juttatták be → erősebb génelcsendesítés

2. az állatokat genetikailag módosított baktériumokkal etették (az állat egyik génjének mRNS-ével azonos felépítésű duplaszálú mRNS-eket termelt) → úgy viselkedtek, mint akiknek nincs adott működőképes génjük

(Nature: 1998-ban publikálták)

2. A mikroRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában

Transzkripciós faktorok, miRNS-ek és azok születése

sokfajta génszabályozás-transzkripciós faktorok: • fehérjék, gátolják vagy aktiválják a transzkripciót

• kis cisz-regulációs elemekhez kötődnek

-mikroRNS: érett mikroRNS: • rövid, nemkódoló ssRNS-ek (egyszálú RNS), amelyek gátolják a mRNS-ek transzlációját • kötődik a mRNS vele komplementer szakaszához (miRNS kötőhely)

≈70 nukleotidból álló hajtű struktúrából vágódik ki (pre-miRNS)a Dicer enzim vágja ki

pre-miRNS: a pri-miRNS-ből (primery miRNS) vágja ki a Drosha enzim

pri-miRNS: a DNS-ből az RNS-polimeráz II. által átírt elsődleges miRNS átirattöbb száz nukleotid hosszúságú is lehet, több pre-miRNS-t tartalmazhatnéha a fehérjekódoló gének intronjaiban vannak (a splicinggal vágódnak ki)

Növényeknél a miRNS érés a sejtmagban történik.

Humán genom: 328 miRNS-t azonosítottak eddig nagyobb, mint 1%-a a géneknek miRNS-t kódola fehérjekódoló gének több, mint 30%-áról hiszik azt, hogy miRNS-ek regulálják

Arabidopsis: 199 miRNS

A miRNS-ek felfedezése• ~22 nukleotid hosszú RNS-ek• A mRNS-hez kötődnek, génelcsendesítés:

→ hasítás→ transzlációs represszió

1993: Victor Ambros, Rosalind Lee, Rhonda Feinbaum

• Felfedezik, hogy a lin-4 C. elegans-ban található gén, ami a lárvafejlődés időzítéséért felelős nem fehérjét, hanem egy pár rövid RNS-t kódol

• Az egyik RNS ~22 nukleotid hosszú, a másik ~61 nukleotid hosszú• A lin-4 RNS-eknek „antisense” (a mRNS átirat szálával komplementer)

komplementaritásuk van több helyhez a lin-14-es gén 3’ UTR szakaszában→ csökken a LIN-14 fehérje mennyisége anélkül, hogy a lin-14 mRNS mennyisége csökkenne

modell: a lin-4 RNS a lin-14 3’ UTR-jének egy szakaszával párt alkot,transzlációs repressziót végez (egy regulációs útvonal része, ami az első lárva állapotból a

második lárva állapotba való átmenetet indítja el)

- 2001: a rövidebbik lin-4 RNS a kicsi reguláló RNS-ek csoportjába tartozó RNS: miRNS

- 2003: miRNS funkciók eddig:• sejtosztódás • sejthalál • zsír metabolizmus a legyekben • neurális mintázatok kialakulása a nematodákban

• levél- és virágfejlődés a növényeknél

A., C.Elegans stem loop-ok a lin-4, let-7 esetében

B., Példák állatokban található stem loop-okra (a mir-1, mir-34, mir-124 esetén)

C., Három Arabidopsis stem loop (MIR165a, MIR172a2, JAW)

piros: értett miRNS-ek

kék: kísérleti úton megtalált szekvenciák

Növényi, állati miRNS- A növényekben a stem loop-okban lévő visszahajlások méret szempontjából sokkal

változatosabbak, mint az állatokban- Növényekben nagyobb a komplementaritás a miRNS és a stem loop másik karja

között, mint az állatokban - Növényekben keskenyebb méreteloszlás van a miRNS 21 nukleotidja körül, mint az

állatoknál, itt 22-23 nukleotid körül van az eloszlás

Reguláció RNS interferenciávalRISC komplex

- Miután létrejönnek a miRNS-ek (növényekben, állatokban, gombákban), siRNS-ek (állatokban), csak az egyik szál kerül bele egy ribonukleoprotein komplexbe ( RNA including scilencing complex): RISC• Az elcsendesítendő mRNS-t olyan üzenetek alapján ismeri fel, ami a tökéletes, vagy majdnem tökéletes bázispárosodáson alapul

- A RISC-en található endonukleáz hasítja a mRNS-t közel a komplementer szakasz közepéhez

A RISC-et légy és emberi sejtekből izolálták

- A miRNS-eket először a miRNP komplexben találták meg (miRNA ribonukleoprotein komplex)• ugyanazokkal a speciális tulajdonságokkal rendelkezik, mint a RISC, lehet, hogy a RISC egy altípusa

- Amikor a miRNS:miRNS* duplexből a miRNS bekerül a RISC komplexbe, akkor a miRNS* degradálódik• A duplexnek az a szála kerül be a komplexbe, amelyiknek az 5’ végénél lazább a bázispárosodás

mRNS hasítás, transzláció represszióHasítás

- Ha a mRNS és a miRNS komplementaritása megfelelő, akkor hasítás

Transzlációs represszió

- Ha nincs megfelelő komplementaritás ahhoz, hogy hasítson → elnyomja a transzlációt

Jelenség:A lin-4 RNS-ek expressziójával korreláltan csökken a LIN-14 fehérje mennyisége, eközben a mRNS-ek száma nem változik

A lin-14 mRNS poliszóma profilja az első lárvaállapotban megkülönböztethetetlen a későbbi lárvaállapotokétól, amelyekben már a LIN-14 fehérje mennyisége csökkent

Két lehetséges magyarázat:

1. lin-4 RNS a transzlációs iniciáció után elnyomja a transzlációt úgy, hogy nem változtatja meg a riboszómák sűrűségét az üzeneten

(pl. riboszómák lassítása vagy megállítása)

2 A transzláció ugyanúgy folytatódik tovább, de az új szintetizálódó polipeptid specifikusan degradálódik

Néhány megjegyzés:

- Jelentős komplementaritás kell a hasításhoz- Az állatoknál kisebb mértékű a komplementaritás, mint a növények esetében → az

állatoknál jelentősebb a transzlációs represszió, mint a növényeknél- Több RISC komplex hatására történik hatásos transzláció inhibíció, ezért is jó, ha

több miRNS komplementer hely van a mRNS-en (állatoknál)- Néhány miRNS a DNS transzkripciós csendesítését is végezheti

A., mRNS hasításB., transzlációs represszióC., transzkripciós génelcsendesítés

3. miRNS célpontok keresése állatokban

Korai szakasz:- (2003) egy légy miRNS (bantam) negatívan regulálja a pro-apoptotikus hid gént

hid gén → híd fehérje: elősegíti az apoptózist (gátolja az apoptózist gátló faktort (IAP), így teszi lehetővé, hogy

bekövetkezzen az apoptózis)- a Drosophila, gerincesek esetében sok más miRNS célpont-jóslás a következők alapján:

1. kevés kísérletileg azonosított valószínűsíthető célponthoz való kapcsolódási hely

(20 kapcsolódási hely 2 miRNS-re Drosophilában)2. Megfigyelés: az ismert poszttranszkripciós regulációs motívumok a 3’

UTR- ben teljes mértékben komplementerei néhány légy miRNS 5’ végének3. in vitro kísérletek eredménye: több kapcsolódási hely a 3’ UTR-ben exponenciálisan megnöveli a mRNS elcsendesítésének mértékét

Ezek az eljárások nem csak a komplementaritás alapján értékelték a miRNS-mRNS párokat, hanem a kapcsolódáskor érvényes szabadenergiára is. (scoring)

- kiderült: 6-8 bp hosszú szakaszok, amelyeknél tökéletes Watson-Crick bázispárok alakulnak ki a miRNS-mRNS között → ezek segítettek a legtöbbet a szabályozott mRNS-ek megtalálásában

• általában a miRNS 5’ végén helyezkednek el (seed site)

A 6-8 bp hosszú tökéletes W-C bázispárokból álló szakaszokat nukleusznak szokták nevezni

- A létrejött nukleusz, (legyőzve a hőmozgást) a két szál gyors összecipzározódását segíti előmajd a mRNS-miRNS duplexben bázispárok kialakulásával termodinamikailag stabilizálódik a rendszer

- Az algoritmusok kapcsán felmerülő szempontok, nehézségek

• Állati miRNS-ek esetén a kapcsolódási hely kicsi, ezért korlátozott a komplementaritása → ha kis eltérés van az algoritmusban, nagy eltérés lehet a célpontmeghatározásban • általában az algoritmusok az evolúciós szempontból konzervált kapcsolódási helyeket tekintik biológiailag fontosnak célpont-meghatározás szempontjából

• különböznek az eljárások a következőkben:

a kapcsolódási helyek konzerváltságának mértékét máshogy határozzák meg

(scoring szabályai)az ortológ 3’ UTR szekvenciát hogyan definiálják, hogyan vizsgálják

• probléma: hogyan vegyék figyelembe a 3’ UTR szekvencia hosszát → rövidebb 3’

UTR- ben lévő kapcsolódási hely hatékonyabban vagy kevésbé hatékonyan csndesíti a mRNS-t

(hogyan számítsuk bele a score-ba)

Célpont-meghatározás ma:

- Kapcsolódási hely mutációs kísérleteken és az azt követő bioinformatikai analízisen alapul (gyakran felhasználják a fajok összehasonlításából kapott eredményeket)a mutációs kísérletek megmutták: kétfajta célpont létezik

1. Tökéletes W-C bázispárok kialakulása a miRNS 5’ végének ‘seed’ szakaszához

2. Nem tökéletes illeszkedés az 5’ végen lévő szakaszhoz, további bázispárok alakulnak ki a miRNS 3’ végénél

- Az első csoportba tartozó kapcsolódási helyek száma egy nagyságrenddel nagyobb, mint a második csoportba tartozók száma

a., Az első csoporthoz tartozó

és a b., a második csoporthoz tartozó miRNS-ek kapcsolódása a mRNS-hez

Az algoritmusok összehasonlítása:

- ~ 130 kísérletileg meghatározott mRNS-miRNS (Drosophila) alapján értékelték az algoritmusokat

(Cohen Laboratory, EMBL)- A legjobban szereplő két algoritmus:

PicTar, EMBL: 90%-os pontosság (annak a valószínűsége, hogy az algoritmus konzisztens a kísérlettel)

70-80% érzékenység(mennyire képes az algoritmus tényleges mRNS-miRNS párokat

találni)

A többi algoritmus nem ért el ilyen érzékenységet és pontosságot, de sok más célpontot is megtalált

FNTNFPTPTNTP

FNTPTP

mRNS-miRNS párok: (példák)

miRandamiRBase

PicTarTargetScan, TargetScanS

RNA hybrid

mRNS-miRNS párokat kereső eszközök:

RNAhybridDIANA-MicroT

RNA22

mRNS-miRNS párok kísérletileg alátámasztott adatbázisa:

TarbaseArgonaute

miRNAMAP

##txt Format ##source-version miRanda 3.0 ##created on:2007-10-31 ##GROUP SEQ METHOD FEATURE CHR START END STRAND PHASE SCORE PVALUE_OG TRANSCRIPT_ID EXTERNAL_NAME

Similarity cel-miR-785 miRanda miRNA_target III 1772526 1772547 - . 18.9884 2.999100e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-796 miRanda miRNA_target III 1772391 1772413 - . 18.2142 3.818450e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-236 miRanda miRNA_target III 1772565 1772588 - . 17.4222 2.849710e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-236 miRanda miRNA_target III 1772565 1772588 - . 17.4222 2.849710e-02 Y39A3CL.4a Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-260 miRanda miRNA_target III 1765303 1765322 - . 17.2423 2.781390e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-262 miRanda miRNA_target III 1765264 1765283 - . 17.932 4.266260e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-36 miRanda miRNA_target III 1765281 1765302 - . 16.3733 2.782390e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-37 miRanda miRNA_target III 1765281 1765302 - . 15.691 4.356940e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-787 miRanda miRNA_target III 1759917 1759941 + . 17.0828 3.145560e-02 Y46E12A.2 Y46E12A.2 Similarity cel-miR-72 miRanda miRNA_target III 1751881 1751903 - . 17.9879 2.637880e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-60 miRanda miRNA_target III 1751955 1751977 - . 17.6485 2.983430e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-73 miRanda miRNA_target III 1751881 1751903 - . 19.2323 9.934760e-03 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-74 miRanda miRNA_target III 1751881 1751902 - . 17.2829 4.588090e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-266 miRanda miRNA_target III 1751881 1751900 - . 17.1274 4.344880e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-51 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 15.8384 3.247690e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-52 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.008910e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-53 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.294690e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-54 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.321450e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-271 miRanda miRNA_target III 1723215 1723235 - . 16.3227 2.590130e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-55 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 16.4041 2.930900e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-56 miRanda miRNA_target III 1723248 1723268 - . 16.1459 3.430470e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-273 miRanda miRNA_target III 1723248 1723266 - . 16.2078 2.475660e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-38 miRanda miRNA_target III 1723215 1723239 - . 16.1459 4.123270e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-51 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 15.8384 3.247690e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-52 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.008910e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-53 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.294690e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-54 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.321450e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-271 miRanda miRNA_target III 1723215 1723235 - . 16.3227 2.590130e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-55 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 16.4041 2.930900e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-56 miRanda miRNA_target III 1723248 1723268 - . 16.1459 3.430470e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-273 miRanda miRNA_target III 1723248 1723266 - . 16.2078 2.475660e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-38 miRanda miRNA_target III 1723215 1723239 - . 16.1459 4.123270e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-239b miRanda miRNA_target III 1716235 1716258 - . 16.6007 4.554820e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 Similarity cel-miR-269 miRanda miRNA_target III 1716473 1716492 - . 16.3227 4.615520e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 Similarity cel-miR-73 miRanda miRNA_target III 1716472 1716494 - . 17.9879 2.771030e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 Similarity cel-miR-74 miRanda miRNA_target III 1716472 1716494 - . 17.5103 3.831370e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12

C. elegans miRNA-ek és célpontok

Irodalom:

CellDavid P. Bartel: MicroRNAs: Genomics, Biogenesis,

Mechanism, and Function

Nature GeneticsNikolaus Rajewsky: microRNA target predictions in animals