bỘ giÁo dỤc vÀ ĐÀo tẠo viỆn hÀn lÂm khoa hỌc vÀ...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

PHÙNG KHẮC HUY CHÚ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT

TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ CHỨA DIOXIN

CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE

Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường

Mã số: 9.52.03.20

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Hà Nội, 2018

Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công

nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà

Người hướng dẫn khoa học 2:

Phản biện 1:………………………..

Phản biện 2:………………………..

Phản biện 3:…………………………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án Tiến sĩ

cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi….

giờ……ngày……..tháng………năm …….

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ;

- Thư viện Quốc gia Việt Nam.

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết

Trong những năm gần đây, ô nhiễm bởi các loại hóa chất

trong đó có các chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) do con người

tạo nên ngày càng tăng, gây nên rất nhiều hệ lụy cho sức khỏe

con người và môi trường. Ở các nước đang phát triển như Việt

Nam, việc sử dụng và xả thải hóa chất trong nông nghiệp, công

nghiệp, y dược và các ngành sản xuất khác không có khả năng

kiểm soát đã gây nên những hậu quả nghiêm trọng với môi

trường và con người. Ngoài ra chất diệt cỏ chứa dioxin tồn lưu

từ chiến tranh sau hơn 40 năm và các chất dioxin hình thành

trong quá trình phát triển công nghiệp hiện vẫn đang tiếp tục

gây nhiều hậu quả nghiêm trọng cho môi trường sinh thái và

con người ở Việt Nam.

Việt Nam là một nước nhiệt đới có đa dạng sinh học nằm

trong top 10 của thế giới, đặc biệt là đa dạng vi sinh vật. Có

nhiều loài vi sinh vật sinh tổng hợp các loại enzyme khác nhau.

Hai họ oxidoreductive và peroxidase bao gồm các loại enzyme

có nhiều ứng dụng mang hiệu quả cao trong các lĩnh vực kinh tế

và bảo vệ sức khỏe con người. Trong đó laccase không chỉ có

hoạt tính cao mà còn có khả năng hoạt động mạnh chỉ cần oxy

tự do với sự hỗ trợ của chất gắn kết hay hệ chất gắn kết

(mediator) cho nên laccase được quan tâm nhiều hơn cả.

Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu của nghiên cứu sinh với tên

là “Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và

phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme

laccase” đã được tiến hành.

2

2. Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh laccase, laccase-

like từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì, trong đất ô nhiễm chất

diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa; Đánh giá khả năng phân

hủy các chất diệt cỏ chứa dioxin và loại màu thuốc nhuộm hoạt

tính bởi laccase, laccase-like và chủng VSV được lựa chọn

nhằm định hướng áp dụng trong hoạt động quốc phòng.

3. Nội dung thực hiện

Phân lập, phân loại nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh laccase

và laccase-like có tiềm năng cao từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì

và đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa tỉnh

Đồng Nai; Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm, xạ khuẩn

có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like cao; Tách chiết và

tinh sạch laccase, laccase-like từ đại diện nấm, xạ khuẩn có hoạt

tính cao đã được phân lập; Nghiên cứu các đặc tính hóa-lý, hóa -

sinh cơ bản của laccase, laccase-like đã được tinh sạch; Đánh giá

hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp, thuốc nhuộm hoạt tính

bởi laccase, laccase-like và bản thân chủng VSV sinh tổng hợp

laccase, laccase-like; Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-

D, 2,4,5-T tinh khiết và có trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa

bởi laccase, đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp

laccase; Đánh giá hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD

bằng đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase;

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase,

laccase-like

1.1.1. Giới thiệu chung về laccase

3

Laccase đã được quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm với các

nội dung: nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, cấu tạo phân tử

và cơ chế hoạt động xúc tác, nghiên cứu về gene, protein và đặc

điểm hóa - lý của laccase. Qua đó cho thấy laccase là đối tượng

đã được nghiên cứu khá chi tiết.

Đến thời điểm hiện nay, có ít công trình sử dụng tổ hợp của

nhiều chủng vi sinh tổng hợp laccase trong xử lý ô nhiễm môi

trường nói chung và thuốc nhuộm, các chất ô nhiễm hữu cơ khó

phân hủy nói riêng, vì việc lựa chọn được tổ hợp của nhiều vi sinh

vật sinh tổng hợp laccase có khả năng cao không đơn giản và

nghiên cứu đòi hỏi nhiều công sức. Đây là cơ hội cho các nghiên

cứu nhằm tìm kiếm con đường để tạo nên công nghệ xử lý ô nhiễm

môi trường nói chung và công nghệ xử lý nước thải dệt nhuộm và

môi trường ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin nói riêng.

Kết quả các nghiên cứu về khả năng của laccase cần tiếp tục

thực hiện để bổ sung cơ sở khoa học, cơ sở dữ liệu về mức độ đa

dạng của chủng vi sinh vật sinh tổng hợp laccase nói chung và

trên phương diện địa lý, hệ sinh thái khác nhau nói riêng.

1.1.2. Giới thiệu về laccase-like

Trong quá trình sinh trưởng của mình, các chủng nấm ngoài

khả năng sinh tổng hợp các enzyme có bản chất protein thì chúng

còn có khả năng khác nữa là sinh tổng hợp một số tác nhân sinh

học có khối lượng phân tử thấp, tên gọi các chất này phụ thuộc

vào nguồn gốc nó được sinh ra. Các tác nhân này có khả năng

oxy hóa giống laccase nhưng đặc điểm hóa-lý thì rất khác. Các

hợp chất này không có cấu tạo protein mà chỉ là các đoạn

peptides có hoạt tính oxy hóa cao.

4

Một số nghiên cứu ở Việt Nam đã phát hiện ra chất có hoạt

tính sinh học như trên được sinh tổng hợp từ các chủng xạ khuẩn

được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên

Hòa, tuy nhiên nghiên cứu chi tiết để tìm hiểu đặc tính hóa-lý cũng

như khả năng ứng dụng của chúng trong loại màu thuốc nhuộm,

phân hủy các hợp chất hữu cơ mạch vòng hầu như là rất ít công bố.

Vì vậy, để phân biệt với những tên gọi và thuật ngữ của các nghiên

cứu trước đây và thuận tiện trong việc gọi tên trong nghiên cứu của

Luận án, hoạt chất này sẽ được gọi là laccase-like.

1.2. Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và các công

nghệ xử lý

Phần này nêu đặc điểm của nước thải dệt nhuộm, các công

nghệ hiện nay đang được sử dụng để xử lý nước thải dệt

nhuộm. Trong đó tập trung tổng quan các nghiên cứu về ứng

dụng của laccase, vi sinh vật sinh tổng hợp laccase trong xử lý

loại màu các loại thuốc nhuộm.

1.3. Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam và

các công nghệ xử lý

Phần này nêu hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin

tại các "điểm nóng" tại Việt Nam, nhấn mạnh hiện trạng ô

nhiễm tại sân bay Biên Hòa. Tổng hợp các công nghệ đã được

thống kê trên thế giới và Việt Nam trong xử lý môi trường ô

nhiễm dioxin. Tập trung tổng hợp các nghiên cứu sử dụng

enzyme ngoại bào nói chung và laccase nói riêng trong xử lý

các hợp chất hữu cơ và các hợp chất hữu cơ khó phân hủy.

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Chủng vi sinh vật

5

Các chủng nấm đảm được thu thập và phân lập ở độ cao

trên 600m từ rừng Quốc gia Ba Vì và tại khu vực Ba Trại xung

quanh khu vực chân núi Ba Vì thành phố Hà Nội; Các chủng xạ

khuẩn được thu thập từ lô xử lý sinh học đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin tại khu vực XĐ-1 sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng Nai;

Các chủng xạ khuẩn được thu thập từ đất ô nhiễm khu vực ô

nhiễm mới Tây - Nam (Pacer Ivy) sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng

Nai; Chủng nấm đảm FBD154 được phân lập từ khu vực rừng

Quốc gia Bidoup-Núi Bà, Lâm Đồng và nấm sợi FNBLa1 được

phân lập từ rơm mục ở Ninh Bình trong bộ sưu tập giống của

nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học.

2.1.2. Đối tượng thử nghiệm

Các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T tinh khiết tiêu chuẩn phân tích

(PA) của Sigma và đồng loại độc 2,3,7,8-TCDD; Đất ô nhiễm

chất diệt cỏ/dioxin được thu thập từ 2 khu vực của sân bay Biên

Hoà, có độ độc trung bình khoảng 20.000 ngTEQ/kg; Một số

thuốc nhuộm tổng hợp thuộc 2 nhóm azo và anthraquinone; Các

loại thuốc nhuộm hoạt tính thương mại được thu thập từ Nhà

máy X20/Tổng Cục Hậu cần.

2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường Gause M; Dịch chiết khoai tây (DCKT); Môi

trường PDA/B; Môi trường Czapeck; Môi trường PDB-DT;

Môi trường MEG; Môi trường Vis; Môi trường TSH1;

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Do thực hiện nhiều thực nghiệm để xác định đặc tính, khả

năng của laccase, laccae-like và bản thân chủng vi sinh vật sinh

tổng hợp laccase, laccae-like trong loại màu thuốc nhuộm và phân

6

hủy chất diệt cỏ/dioxin nên sơ đồ thực nghiệm được mô tả bằng sơ

đồ ở Hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu

2.2.1. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật

2.2.2. Phân loại vi sinh vật

2.2.3. Phương pháp hóa – sinh

2.2.4. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm

2.2.5. Xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin

2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu phân tích được xử lý bằng phần mềm Microsolf

excel/Microsoft office 10

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng nấm và xạ

khuẩn có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like

3.1.1. Phân lập và lựa chọn để phân loại nấm đảm có hoạt

tính laccase cao

Đã thu thập được 45 mẫu nấm đảm có trong tự nhiên và

trong đất có gỗ mục tại khu vực lấy mẫu. Sau 4 ngày nuôi cấy,

22 chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng trên bề mặt môi

trường, hệ sợi nấm bông xốp có màu trắng, mịn và tạo vòng nâu

7

đỏ trên môi trường có chứa chất chỉ thị guaiacol. Hoạt tính

laccase in situ được xác định ngay sau khi mẫu nấm được đưa

về phòng thí nghiệm đã được tiến hành. Kết quả thu được

chứng tỏ các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các enzyme

ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (MnP, LiP) hoặc

oxidoreductase (laccase). Kết quả cho thấy có khoảng 16 mẫu

nấm thu thập được ở rừng Quốc gia Ba Vì sinh tổng hợp

laccase. Dựa vào kết quả đo hoạt tính laccase in situ và khả

năng sinh trưởng. Dựa vào kết quả đo hoạt tính laccase in situ

và khả năng sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, chủng FBV40 đã

được lựa chọn để nghiên cứu phân loại, đặc tính enzyme, khả

năng loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin.

Như vậy xét trên đặc điểm mẫu, hình thái khuẩn lạc, bào tử và

trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng nấm FBV40 (đã được đăng

ký trình tự trên GenBank với mã số MG243365) được xét vào

chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus sp. FBV40.

Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loài chủng nấm FBV40

8 3.1.2. Phân lập và phân loại xạ khuẩn có khả năng sinh

trưởng trên môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin và sinh tổng

hợp laccase-like

Từ nguồn đất ô nhiễm, 8 chủng xạ khuẩn đã được phân lập

trong đó có 2 chủng là (XKBHN1, XKBHN2) từ đất khu vực Tây

- Nam và 6 chủng là XKBiR1, XKBiR2, XKBiR3, XKBiR4,

XKBiR929 và XKBiR930 từ đất nguyên thủy (trước khi xử lý khu

vực Z1) ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Biên Hòa.

Dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh

trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA, chủng XKBHN1,

XKBiR929 được xếp vào chi Streptomyces và được đặt tên

Streptomyces sp. XKBHN1 và Streptomyces sp. XKBiR929.

Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loài 2 chủng XKBHN1 và

XKBiR929

3.1.3.2. Sinh trưởng của XKBHN1 và XKBiR929 trong môi

trường chứa chất hữu cơ có clo và các hydrocacbon có vòng

thơm (PAHs)

Sau 7 ngày nuôi cấy ở điều kiện 30ºC, lắc ở 120 vòng/phút,

hai chủng XKBHN1 và XKBiR929 đều có khả năng sinh trưởng

9

mạnh trên môi trường có chứa các chất ô nhiễm DCĐ; 2,4,5-T;

2,4-D; DBF và PAHs. Chủng XKBiR929 sinh tổng hợp laccase-

like với hoạt tính cao nhất là 867 U/l trong môi trường Gauss M

chứa 200 ppm PAHs sau 15 ngày nuôi.

Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu đề cập đến khả

năng sinh tổng hợp laccase-like, cũng như khả năng phân hủy

chuyển hóa của laccase-like từ các đại diện thuộc chi

Streptomyces trên môi trường chứa các chất ô nhiễm như đã

được sử dụng trong nghiên cứu này.

3.2. Tinh sạch và các đặc điểm hóa-lý của laccase, laccase-

like tinh sạch

3.2.1. Tinh sạch laccase của nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40

Điện di đồ cho ta thấy enzyme được tinh sạch có chất

lượng tốt, hình thành các băng đơn đồng nhất, kết quả chỉ ra

rằng có hai băng protein thu được ở kích thước 55 kDa và 60

kDa và gọi là Lac1 và Lac2. Khối lượng của hai isozyme

laccase của chủng nấm thu được là phù hợp với khoảng khối

lượng đã được công bố về laccase và kết quả nghiên cứu của

luận án cũng đã bổ sung thêm thông tin vào bộ sưu tập isozyme

laccase của chủng nấm thuộc chi Rigidoporus.

3.2.2. Tinh sạch laccase-like từ xạ khuẩn Streptomycese sp.

XKBiR929

Khi xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel

polyacrylamide 15-20% (SDS-PAGE) để kiểm tra độ tinh sạch

của enzyme. Điện di đồ không thấy xuất hiện “protein” được

tinh sạch. Có thể nhận định trọng lượng phân tử của laccase-like

này nhỏ hơn 10kDa. Cũng như đã đề cập ở trên, laccase-like là

sản phẩm được tạo ra bởi các chủng xạ khuẩn không phải là

protein Vì, sau khi đun sôi dịch nuôi cấy vài giờ vẫn quan sát

10

thấy khả năng oxy hóa ABTS sang màu xanh. Đây có thể là

chất trao đổi có khả năng tham gia phản ứng oxy hóa các hợp

chất hữu cơ vòng thơm, để khẳng định điều này sẽ cần rất nhiều

nghiên cứu chi tiết tiếp theo để tìm hiểu rõ hơn về bản chất hóa

học và hoạt động xúc tác của chất được sinh tổng hợp bởi chủng

xạ khuẩn XKBiR929.

3.2.3. Đặc tính hóa-lý của laccase và laccase-like tinh sạch

3.2.3.1. Đặc tính hóa-lý của laccase tinh sạch

a) Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ bền của laccase

Kết quả thu được cho thấy, ở pH 3 thì cả Lac1 và Lac2 đều

đạt hoạt tính cao nhất. Lac1 mất hoàn toàn mất hoạt tính ở giá

trị pH bằng 1, 7, 8, và 9, trong khi đó đối với Lac2 là ở pH 1 và

8. Về độ bền hoạt tính của laccase tinh sạch, đối với Lac1 ở pH

5 hoạt tính còn lại trên 50% và ở giá trị pH 3, 4 hoạt tính còn

lại tương ứng lần lượt là 21 và 29% sau 5 h. Trong khi đó, đối

với Lac2 ở pH 6 hoạt tính còn lại trên 92% và ở pH 3, 4, 9 hoạt

tính còn lại tương ứng lần lượt là 54, 55 và 78% sau 3 h.

Như vậy, đã thấy có sự khác nhau của pH môi trường lên

hoạt tính laccase của 2 isozyme từ chủng FBV40, đặc biệt là

ảnh hưởng tới độ bền.

b) Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền nhiệt

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền nhiệt của

Lac 1, Lac 2 từ chủng FBV40 đã được thực hiện trong khoảng

từ 35 đến 70oC thời gian khảo sát đến 140 phút đối với Lac 1.

Nhiệt độ từ 30 đến 90oC và độ bền nhiệt đã được khảo sát từ 35

đến 70oC với thời gian kéo dài đến 180 phút đối với Lac 2. Kết

quả thu được, cả Lac1 và Lac2 đạt hoạt tính cao nhất ở 60°C.

11

Trong khoảng nhiệt độ từ 65 đến 70°C Lac1 giảm hoạt tính

tương ứng lần lượt từ 15 đến 23%. Lac2 giảm hoạt tính từ 20,

32 và 75% khi nhiệt độ tương ứng là 70, 80 và 90°C. Hoạt tính

Lac1 bền nhất ở 35oC khi vẫn còn 18% so với hoạt tính ban đầu

sau 140 phút, trong khi đó hoạt tính Lac2 đạt 92% và 90% ở ở

30oC và 40oC sau 180 phút.

c) Cơ chất đặc hiệu

Lac1, Lac2 đều có thể oxy hóa các cơ chất đặc hiệu của

laccase như ABTS, syringaldazine (Syrin), 2, 6-DMP và

guaiacol (Gua). Hoạt tính Lac1 với các cơ chất 2,6-DMP,

guaiancol và syringaldazine so với ABTS lần lượt là 76,5%,

0,54% và 0,13%, tương ứng với Lac 2 là 74%, 0,3% và 0,2%.

d) Ảnh hưởng của các chất ức chế và ion kim loại

Ảnh hưởng của một số chất ức chế protein điển lên hoạt

tính của Lac1, Lac 2 đã được nghiên cứu. Kết quả được tổng

hợp như sau:

Chất ức

chế

Nhận xét mức độ bị ức chế

Lac 1 Lac 2

SDS Bị ức chế hoàn toàn ở bất

kỳ nồng độ nào

Bị ức chế hoàn toàn ở

bất kỳ nồng độ nào

EDTA

10 mM bị ức chế hoàn

toàn; 5 mM hoạt tính bị

ức chế 65,5% và 2 mM

hoạt tính bị ức chế

28,5%

10 mM hoạt tính bị ức

chế 92%, 5 mM hoạt

tính bị ức chế 58,4%

và 2 mM hoạt tính bị

ức chế 31,6%

Cl-

10 mM bị ức chế hoàn

toàn; 5 mM hoạt tính bị

ức chế 72%; 2 mM hoạt

tính bị ức chế 9,4%

-

L-cystein 5 mM và 10 mM hoạt tính

bị ức chế hoàn toàn; 2 -

12

mM hoạt tính bị ức chế

54,5%

Arginin -

10 mM hoạt tính bị ức

chế 48%; 5 mM hoạt

tính bị ức chế 36,5; 2

mM hoạt tính bị ức

chế 28,5%.

Chú thích: "-" không thử nghiệm

Ảnh hưởng của các ion kim loại như sau:

ion Nhận xét mức độ ảnh hưởng

Lac 1 Lac 2

Cu2+

Làm tăng 109% hoạt tính ở

nồng độ 2 mM

Làm tăng 112% đến

184,6% hoạt tính ở

nồng độ tương ứng từ

1,0 đến 5 mM

Mg2+

Ức chế hoạt tính ở tất cả các

nồng độ và dao động trong

khoảng 21,5 đến 78,95%

tương ứng từ 0,5 mM đến

5,0 mM

Ức chế hoạt tính ở tất

cả các nồng độ và dao

động trong khoảng

11,6% đến 27% tương

ứng với từ 0,5 mM

đến 5,0 mM

Ni2+

Ở 1,0 mM làm tăng 100,6%

hoạt tính, ở các nồng độ còn

lại đều ức chế và dao động

từ 5,3% đến 44,4% tương

ứng 0,5 mM đến 5 mM


cả các nồng độ và

dao động từ 12,8%

đến 30% với nồng độ

từ 0,5 mM đến 5 mM

Mn2+


nồng độ và dao động từ

21,1% đến 35% với nồng độ

từ 0,5 đến 5,0 mM



động từ 11,6% đến

18,9% với nồng độ từ

0,5 đến 5,0 mM

Co2+



15,5% đến 35,2% với nồng

độ từ 0,5 đến 5,0 mM

Gây ức chế hoạt tính ở

tất cả các nồng độ và

dao động từ 14,5% đến


0,5 mM đến 5 mM

13

Fe2+



71,6% đến 93,3% với nồng

độ từ 0,5 mM đến 5 mM




100% với nồng độ

tương ứng từ 0,5 mM

đến 5 mM

Ca2+

Làm tăng 107% và 128%

hoạt tính ở nồng độ 0,5 và 2

mM





0,5 mM đến 5 mM

Kết quả thu được từ nghiên cứu này cho thấy, ảnh hưởng của

các ion kim loại lên hoạt tính laccase sinh tổng hợp bởi chủng

FBV40 là tương đồng với các nghiên cứu đã được công bố quốc

tế, tuy nhiên có sự khác biệt về mức độ ức chế giữa Lac1 và Lac2.

3.2.3.2. Đặc điểm động học của laccase tinh sạch

Km và Vmax của Lac1 là 0,3 µM và 200.000 µM/phút. Trong

khi đó với Lac2 là 0,4 µM và Vmax là 10.000 µM/phút.

3.2.3.2. Đặc tính hóa-lý của laccase thô

Nghiên cứu ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường lên hoạt

tính laccase thô đã được thực hiện.

Bảng 3.10. Tổng hợp các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính laccase

thô/FBV40

Các yếu tố ảnh

hưởng Sự thay đổi hoạt tính laccase

Ảnh hưởng của pH

pH 3 Hoạt tính cao nhất

pH 2 Mất hoạt tính

pH 4 Hoạt tính còn lại trên 65% sau 120 phút

Ảnh hưởng của nhiệt độ

30 đến 40oC Hoạt tính cao nhất

50oC, 60 đến 70oC

Bị ức chế lần lượt là 15% sau 160 phút ở

50oC và 79% sau 40 phút ở 60oC và đến

98% sau 20 phút ở 70oC

14



30oC và 40oC Sau 160 phút hoạt tính gần như không bị

ức chế

Động học xúc tác

Km 0,5 µM

Vmax 25.000 µM/phút

Ảnh hưởng của chất ức chế

SDS Với 5 mM bị ức chế hoàn toàn và 2 mM

bị ức chế 79%

L-lysis Với 5 mM bị ức chế hoàn toàn và 2 mM

ức chế 86%

EDTA Với 5 mM bị ức chế là 92% và 2 mM bị

ức chế 10%

Ảnh hưởng của các ion kim loại

Co2+

Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và

dao động từ 44,7% đến 79,5% với nồng

độ từ 2 đến 10 mM

Mn2+



độ từ 2 đến 10 mM

K+



độ từ 2 đến 10 mM.

Na+


dao động từ 75,5% đến 94% với nồng độ

từ 2 đến 10 mM.

Mg2+




Ca2+




Fe2+


dao động từ 97% đến 97,9% với nồng độ


Ni2+ Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và

15



dao động từ 2,7% đến 88,3% với nồng độ


Cu2+




Kết quả thu được cho thấy, có sự tương đồng về khả năng

nhưng có sự khác biệt lớn ở mức độ ảnh hưởng của cùng một yếu

tố lên hoạt tính laccase thô và laccase tinh sạch của chủng FBV40.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, để ứng dụng laccase tinh sạch hay

laccase thô trong xử lý ô nhiễm môi trường cần phải nghiên cứu

tổng thể và chi tiết để xác định các yếu tố và mức độ ảnh hưởng để

qua đó nâng cao hiệu quả ứng dụng của chúng.

3.2.3.3. Đặc tính hóa-lý của laccase-like tinh sạch

Laccase-like tinh sạch có hoạt tính cao nhất ở pH 1, giảm

nhanh hoạt tính và gần như không xác định được ở pH 3. Hoạt

tính của laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929 hầu như

không giảm khi được đun sôi trong thời gian tới 3 giờ. Thậm chí,

khi chưng cất trên thiết bị cất quay ở nhiệt độ 800C và áp suất 0,8

atm, hoạt tính laccase-like của chủng này vẫn không thay đổi.

Như vậy, laccase-like tạo ra từ chủng XKBiR929 rất bền nhiệt.

Dựa trên kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất lên khả năng

oxy hóa của laccase-like, tính toán được giá trị động học của nó

với giá trị Vmax là 142.857 µM/phút và Km là 0,43 µM. Khi so

sánh với giá trị động học của laccase chủng nấm FBV40 thì thấy

vận tốc phản ứng của laccase-like chỉ thấp hơn Lac1 (200.000

µM/phút) và cao hơn gấp khoảng 14 lần Lac2 (10.000 µM/phút)

và hơn 5 lấn laccase thô (25.000 µM/phút). Với giá trị Vmax và Km

16

như vây cho thấy khả năng oxy rất cao của laccase-like đặc biệt

là ở giá trị pH rất thấp. Đây là một đặc tính rất đáng lưu ý của

hoạt chất này mà luận án này đã tìm thấy ở xạ khuẩn. Chất ức chế

hoạt tính laccase-like mạnh nhất là L-lys, ở nồng độ 10 mM hoạt

tính laccase-like còn lại 14%, tiếp đến là EDTA hoạt tính còn lại

66,7% và SDS có ảnh hưởng ít nhất với hoạt tính laccase-like còn

lại là 83,6%. Trong số các cation kim loại thử nghiệm với hoạt

tính laccase-like, cation Fe2+ gây ra sự ức chế hoạt tính mạnh ở

tất cả các nồng độ khảo sát. So với ảnh hưởng của các ion kim

loại đối với laccase của chủng FBV40 cho thấy đây là một đặc

tính hết sức đặc biệt của laccase-like từ chủng XKBiR929. Kết

quả thu được của luận án liên quan đến đặc tính của laccasee-like

được xạ khuẩn tạo ra, đây là những kết quả đầu tiên thu được khi

khảo sát đặc tính cơ bản của protein và cho thấy những đặc điểm

nổi bật của laccase-like.

3.3. Loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin

3.3.1. Loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like

3.3.1.1. Loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thô

Laccase chủng FBV40 có khả năng rất cao trong loại các

màu gốc azo là NY1 và NY7 cũng như màu có gốc anthraquinon

như NY5 ngay cả khi có mặt và không có mặt chất gắn kết. Kết

quả này là những kết quả đầu tiên về khả năng loại màu NY1,

NY5 và NY7 của nấm thuộc chi Rigidoporus được phân lập từ

rừng tự nhiên ở Việt Nam.

3.3.1.2. Loại màu hoạt tính sử dụng trong quân đội bởi laccase thô

a) Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính

Laccase thô chủng FBV40 cho thấy khả năng loại được các

màu hoạt tính thương mại được sử dụng để nhuộm vài may quân

17

trang cho quân đội. Khả năng loại màu tốt nhất đối với thuốc

nhuộm MN.FBN là 92,17% với thuốc nhuộm NN.SG là 91,84%

sau 3,5 h .

b) Lựa chọn thuốc nhuộm hoạt tính bị loại màu cao nhất

So sánh khả năng loại màu của laccase thô chủng FBV40

với thuốc nhuộm MN.FBN cao nhất đạt 92,67%, với thuốc

nhuộm NN.SG là 91,84%. Tốc độ loại màu MN.FBN đạt trên

85% trong khi với thuốc nhuộm NN.SG chỉ đạt hiệu suất trên

17% sau 0,25 h. Đặc biệt khi không có CGK thì laccase giảm

hoạt tính 62,9% khi loại màu thuốc nhuộm MN.FBN và 91,4%

đối với NN.SG sau 3,3 và 4h. Chính vì vậy thuốc nhuộm

MN.FBN được lựa chọn để nghiên cứu tiếp theo.

c) Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN. FBN bằng laccase thô với

sự có mặt của D-glucose

Sau 138 h, với nồng độ 50 mg/L thuốc nhuộm MN.FBN,

laccase thô chủng FBV40 đã loại màu được 99% và 97,6% với sự

có mặt của 0,1g và 0,05g D-glucose.

3.3.1.3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi Lac1

Sau 24h, khi có mặt ViO 500 µM, Lac 1 của chủng FBV40

đã loại được 91% màu thuốc nhuộm MN.FBN với nồng độ ban

đầu là 50 mg/L. Kết quả rõ ràng cho thấy vai trò và khả năng

rất cụ thể của laccase chủng FBV40 trong loại màu thuốc

nhuộm nói chung và các màu hoạt tính thương mại của Nhà

máy X20/Tổng cục Hậu cần nói riêng.

3.3.1.4. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi laccase-

like tinh sạch

Ở pH 1, laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929 khi có

mặt chất gắn kết ViO đã loại được 76,3% màu MN.FBN sau

18

23h, nhưng chỉ sau 5 h laccase-like đã loại được 75,8% với

nồng độ thuốc nhuộm ban đầu là 100 mg/L. Khi sử dụng CGK

khác là HBT, khả năng loại màu sau 23h đạt 54,7% và sau 5h

đạt 54,0%. Vai trò của CGK ViO đối với laccase-like chủng

XKBiR929 trong loại màu thuốc nhuộm là không lớn (chỉ tăng

hiệu suất thêm được 22%), với CGK HBT chỉ làm tăng hiệu

suất loại màu không đáng kể. Kết quả nghiên cứu đã mở ra

hướng nghiên cứu ứng dụng laccase-like trong xử lý loại các hợp

chất hữu cơ khác trong điều kiện pH thấp.

3.3.2. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi chủng FBV40

3.3.2.1. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử

dụng để nhuộm vải may quân trang

Chủng FBV40 có hiệu suất loại màu đối với thuốc nhuộm

MN.FBN cao nhất trên 99% sau 7 ngày nuôi cấy. Đối với màu

thuốc nhuộm MY.EG và MY.BES hiệu suất loại màu thuốc

nhuộm đạt thấp chỉ xác định được từ 6 đến 8%. Quan sát quả thể

nấm sinh trưởng trong dung dịch màu thuốc nhuộm MY.EG và

MY.BES thấy có sự hấp phụ màu lên quả thể nấm, ngược lại đối

với màu thuốc nhuộm MN.FBN không thấy sự hấp phụ trên. Từ

hiện tượng trên có thể nhận định chủng FBV40 loại màu thuốc

nhuộm MN.FBN bằng cơ chế phân hủy, chuyển hóa.

3.3.2.2. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN ở các nồng độ khác nhau

Sau 1 đến 3 ngày nuôi cấy chủng FBV40 loại màu thuốc

nhuộm MN.FBN có nồng độ 100 mg/L đạt từ 52,7 % đến 97,3

%, trong khi ở nồng độ thuốc nhuộm 50 và 200 mg/L thì hiệu

suất loại màu đạt tương ứng từ 49,8 % đến 94,3% và 35,2 % đến

97,1 %. Như vậy, chủng nấm FBV40 có khả năng loại màu cao

nhất trong môi trường có nồng độ thuốc nhuộm 100 mg/l.

19

3.3.2.3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt D-glucose

Sau 1 ngày, hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bởi

FBV40 đã đạt rất cao từ 31 đến 97%, còn môi trường không có

D-glucose thì hiệu suất chỉ đạt 8%. Kết quả thu được của luận án

cùng với những nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, D-glucose

có thể là nguồn carbon hoặc là chất cảm ứng hoặc là CGK thích

hợp để quá trình loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bởi chủng nấm

FBV40 đạt hiệu quả cao.

3.3.2.4. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các loại

đường khác nhau

Sử dụng các loại đường làm nguồn carbon thì D-glucose

đạt hiệu suất loại màu cao nhất là 96%, Lactose đạt 90%,

Sacharose đạt 87%, Mannose là 74%, trong khi mẫu không bổ

sung các loại đường thì chỉ đạt 28% sau 9 ngày. Kết quả nghiên

cứu đã trình bày trên một lần nữa khẳng định và chứng minh rõ

ràng về vai trò của nguồn carbon phù hợp nói chung cũng như

chứng minh vai trò của D-glucose trong loại màu thuốc nhuộm

hoạt tính MN.FBN của chủng FBV40.

3.3.2.5. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các nguồn

nitơ khác nhau

(NH4)2SO4 trong môi trường nuôi cấy chủng FBV40 cho hiệu

suất loại màu thuốc nhuộm đạt 67%, KNO3 là 57% và NH4NO3 là

54% sau 9 ngày nuôi cấy so với mẫu đối chứng chỉ là 29%. Kết

quả thu được của luận án cho thấy, nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng

lớn tới khả năng loại màu và chúng đóng vai trò rất quan trọng

trong quá trình sinh tổng hợp laccase của các chủng nấm.

3.3.3. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase và nấm sinh

tổng hợp laccase

3.3.3.1. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase thô

20

a) Phân hủy dịch chiết đất

Sau 13 ngày thí nghiệm khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T

tương ứng đạt 65,46% và 85,71% ở công thức thí nghiệm với sự

có mặt của đệm acetate và CGK ViO.

b) Phân huỷ 2,4,5-T tinh khiết

Sau 20 ngày, laccase thô chủng FBV40 đều cho khả năng

phân hủy đối với 2,4,5-T ở mức độ khác nhau trong khoảng từ

40,55 đến 98,45% tương ứng với hàm lượng 2,4,5-T còn lại trong

mẫu sau thí nghiệm là 1,401 mg đến 0,037 mg.

c) Phân huỷ 2,4-D và 2,4,5-T có trong đất ô nhiễm

Sau 27 ngày, 2,4-D có trong đất ô nhiễm đã bị phân hủy

49,5% và 2,4,5-T bị phân hủy 37,71% với nồng độ ban đầu trong

đất ô nhiễm rất cao tương ứng là 556,92 và 981,88 ppm.

3.3.3.2. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi nấm sinh tổng hợp laccase

a) Phân huỷ 2,4,5-T có trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa

Hàm lượng 2,4,5-T có trong đất rất cao đạt 473,5 mg/kg, sau 8

ngày nuôi cấy chủng FBV40 có thể phân hủy được hơn 7% tương

ứng với 36 mg/kg, nếu tính hiệu suất xử lý/ngày đối với khối

lượng thí nghiệm thì FBV40 đã xử lý được 0,045mg 2,4,5-T/ngày.

b) Phân huỷ 2,4-D và 2,4,5-T trong đất ô nhiễm tại sân bay

Biên Hòa bằng đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm

Hiệu suất phân hủy của đơn chủng FBV40 đối với 2,4-D,

2,4,5-T trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa lần lượt là 11,44 và

12,13% sau 10 ngày xử lý với hàm lượng ban đầu lần lượt là 62,95

mg/kg và 63,5 mg/kg. Còn khi sử dụng hỗn hợp chủng FBV40,

FBD154 và FNBLa1 với tỷ lệ 1:1:1 theo thể tích thì hiệu suất phân

hủy 2,4-D, 2,4,5-T tăng lên đáng kể lần lượt đạt 56,08 và 36,06%.

21 c) Phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bằng đơn và hỗn hợp

chủng nấm sinh tổng hợp laccase

Sau 10 ngày, đơn chủng và hỗn hợp chủng đều có khả năng

phân hủy 2,3,7,8-TCDD với hiệu suất 44.68% khi độ độc ban đầu

là 2.000 ng-TEQ/L và hỗn hợp chủng có tiềm năng cao hơn với

hiệu suất 92,89% sau 10 ngày nuôi cấy.

KẾT LUẬN

1. Đã lựa chọn chủng FBV40 từ 22 chủng phân lập được từ

khu vực rừng Quốc gia Ba Vì, Hà Nội với hoạt tính laccase thô cao

nhất là 107.708U/l trên môi trường TSH1 sau 8 ngày nuôi cấy.

Chủng FBV40 được phân loại thuộc chi Rigidoporus và tên là

Rigidoporus sp. FBV40. Đã phân lập, và phân loại được hai chủng

xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces với tên là Streptomyces sp.

XKBHN1 và Streptomyces sp. XKBiR929 sinh tổng hợp laccase-

like trong môi trường chứa PAHs, 2,4-D, 2,4,5-T và DCĐ.

2. Đã tinh sạch và xác định đặc tính laccase của chủng

FBV40 gồm 2 isozyme Lac1 và Lac2 có khối lượng phân tử lần

lượt là 55 kDa và 60 kDa, chúng có các đặc tính riêng khác

nhau. Sau 24h phản ứng, Lac1 đã loại được 91% màu thuốc

nhuộm thương mại MN.FBN ở nồng độ 50 mg/L. Laccase-like

tinh sạch từ Streptomyces sp. XKBiR929 rất bền nhiệt ngay cả

ở 1000C, trong vòng 3 h hoạt tính không thay đổi; bị ảnh hưởng

bởi chất ức chế protein như L-lys, EDTA, SDS rất khác so với

laccase thật; loại được 76% màu thuốc nhuộm MN.FBN ở nồng

độ ban đầu 50 mg/L trong môi trường pH 1 khi có mặt của chất

gắn kết ViO sau 5 h.

3. Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thô

của FBV40 ở nồng độ 100 mg/L là 82% sau 2,5h, 85% sau 4h

22

đối với thuốc nhuộm tổng hợp azo NY1, NY7 và 70% sau 48h

đối với thuốc nhuộm anthraquinone NY5. Có mối quan hệ tỷ

nghịch lệ giữa mức độ giảm hoạt tính laccase với nồng độ chất

gắn kết trong quá trình loại màu thuốc nhuộm tổng hợp.

4. Sau 138 h với sự có mặt 0,1g D-glucose, laccase thô từ

Rigidoporus sp. FBV40 đã loại được 99% màu thuốc nhuộm

MN.FBN và khi không có mặt D-glucose thì chỉ loại 44%. Sau 1

ngày nuối cấy Rigidoporus sp. FBV40 ở môi trường chứa 100 mg/L

thuốc nhuộm MN.FBN và 0,5g D-glucose 97,2% màu đã bị loại.

5. Laccase thô của FBV40 phân hủy 40,55 đến 98,45%

2,4,5-T tinh khiết ở các công thức thí nghiệm với hàm lượng 2,5

mg. Khi hàm lượng 2,4-D, 2,4,5-T lên tới 556,92 mg/kg và

981,89 mg/kg, sau 27 ngày, laccase thô đã phân hủy 49,5 và

37,7%. Sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy chủng Rigidoporus sp.

FBV40 phân hủy 11,44% (7,2 mg/kg) chất diệt cỏ 2,4-D với

hàm lượng ban đầu 62,95 mg/kg và 12,13% (7,7 mg/kg) 2,4,5-T

với hàm lượng ban đầu là 63,5 mg/kg. Hỗn hợp nấm đảm và

nấm sợi FBV40, FBD154 và FNBLa1 phân hủy 56,07% (35,29

mg/kg) 2,4-D và 36,06% (22,89 mg/kg) 2,4,5-T.

6. Sau 8 ngày nuôi cấy chủng FBV40 phân hủy 44,7%

đồng loại 2,3,7,8-TCDD với độ độc ban đầu 2000 ng-TEQ/L,

trong khi hỗn hợp các chủng nấm đảm là FBV40, FBD154 và

nấm sợi FNBLa1 phân hủy 92,9%.

Kiến nghị:

Tiếp tục nghiên cứu phát triển khả năng của laccase, laccase-

like và bản thân chủng vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-

like để từng bước sáng tạo hoàn thiện công nghệ trong xử lý các

23

chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy nói chung và chất diệt cỏ chứa

dioxin nói riêng góp phần vào hoàn thành chương trình Khắc phục

hậu quả chất độc hóa học tồn lưu sau chiến tranh ở Việt Nam và

xử lý ô nhiễm bảo vệ mội trường.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Công trình đầu tiên nghiên cứu về đặc tính laccase-like được

sinh tổng hợp bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBiR929 và

khả năng của laccase-like trong loại màu thuốc nhuộm hoạt tính

thương mại MN.FBN;

2. Chứng minh được nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 có

hoạt tính laccase thô lên tới 107.708 U/L và tiềm năng cao trong

loại màu thuốc nhuộm gốc azo, anthraquinone được sử dụng

trong quân đội;

3. Khẳng định nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 đồng thời

có khả năng phân hủy được các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T và

đồng loại độc nhất của dioxin là 2,3,7,8-TCDD. Bên cạnh đó,

đã làm sáng tỏ và khẳng định hỗn hợp các loài nấm khác nhau

(nấm đảm và nấm sợi) có khả năng sinh tổng hợp laccase phân lập

từ thiên nhiên Việt Nam không chỉ phân hủy được 2,4-D, 2,4,5-T

mà còn phân hủy được cả đồng loại 2,3,7,8-TCDD đạt hiệu suất

cao hơn khi chỉ sử dụng đơn chủng.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1. Phùng Khắc Huy Chú, Đào Thị Ngọc Ánh, Đinh Thị Thu

Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà, Phân lập, phân loại và khảo sát khả

năng sinh tổng hợp laccase-like của một số chủng xạ khuẩn từ

đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng

Nai.Tạp chí Khoa học đại học Huế, (2015),110(11):29-41;

24

2. Phung Khac Huy Chu, Nguyen Hai Van, Dang Thi Cam

Ha, Purification and characterization of laccase involved in

the decolourization of synthetic dyes and 2,3,7,8-TCDD

congener degradation by the white rot fungus isolated from

bavi forest of Vietnam, Vietnam Journal of Science and

Technology, (2017), 55 (4C), 180-185;

3. Phùng Khắc Huy Chú, Đào Thị Ngọc Ánh, Đặng Thị

Cẩm Hà, Nấm đảm sinh tổng hợp laccase có khả năng loại

màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng để nhuộm vải may

quân trang, Tạp chí Khoa học và Công nghệ quân sự, (2017),

52:169-179.

bỘ giÁo dỤc vÀ ĐÀo tẠo viỆn hÀn lÂm khoa hỌc vÀ...

Documents