PRATIKUM PAKET 4

PENANAMAN DAN PERHITUNGAN MIKROBA

TUJUAN PRATIKUM

Pratikum ini bertujuan agar mahasiswa dapat melakukan penanaman dan memahami cara perhitungan jumlah mikroba

DASAR TEORI

A. Penanaman Mikroorganisme (Bakteri)

Populasi mikroba di alam sangat besar dan kompleks. Alam sekitar baik udara, tanah, air juga dihuni oleh mikroba. Penelitian mikroba dalam berbagai habitat memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran atau biakan campuran yang rumit ini menjadi spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk. Bahan yang dinokulasikan pada medium disebut inokolum. Dengan menginokuasikan medium dengan teknik goresan yaitu menggoreskan inokulum di atas media menggunakan ose, sel-sel itu akan terpisah-pisah sendiri. Setelah inkubasi sel-sel mikroba memperbanyak diri dalam waktu 18-24 jam terbentuk massa sel yang disebut koloni. Piaraan murni yang disimpan lama mudah sekali mengalami mutasi. Jika terjadi demikian maka piaraan murni tersebut bukan lagi piaraan murni semula. Ini berarti tipe asli telah hilang. Untuk menghindarkan atau paling sedikit mengurangi terjadinya mutasi dalam piaraan simpanan maka :1. Secara periodik piaraan harus dipindahkan ke medium baru. Pemindahan ini sebaiknya dilakukan pada koloni mencapai fase log.2. Piaraan harus disimpan pada suhu rendah dan terhindar dari radiasi.

3. Mikroba diliofilisasikan yaitu dimasukkan dalam ampul berisi susu kering bercampur CO2 kemudian disimpan pada tempat bersuhu rendah.

Sesungguhnya kebanyakan laboratorium mikrobiologi menyimpan dan memelihara koleksi biakan tersebut. The American Type Culture Collection (ATTC) yang ada di Washington memelihara ribuan spesies mikroba termasuk virus.

Dalam mengembangbiakan mikroorganisme, khususnya bakteri, alat-alat yang digunakan harus steril. Sterilisasi dilakukan dengan memanaskan seluruh alat, seperti cawan petri, ose, tabung reaksi, dll di dalam autoclave. Membiakkan bakteri dapat dilakukan dengan berbagai cara, salah satunya pengembangbiakan dalam media cawan petri. Pengembangbiakan dalam cawan ini ada beberapa metode, yaitu :

1. Metode cawan gores (steak plate)

Metode cawan gores cukup sulit bagi pemula. Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Prinsip metode ini, yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dlakukan 3-4 kali membentuk garis horizontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi. Teknik penanaman dengan goresan (streak) bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. a. Goresan sinambungSentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar, lalu putar cawan 180C lanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umunya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

INCLUDEPICTURE "http://lh6.ggpht.com/_kFz4vOoppxQ/SSKo1tkRXVI/AAAAAAAAAdI/2hZIROeOBAM/clip_image0363.jpg" \* MERGEFORMATINET b. Goresan T

Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker, inokulai daerah dengan streak zig-zag. Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin kemudian lanjutkan streak zig-zag. Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna.

INCLUDEPICTURE "http://lh3.ggpht.com/_kFz4vOoppxQ/SSKo8Jq4hOI/AAAAAAAAAdY/Budr_VyEaiM/clip_image0403.jpg" \* MERGEFORMATINET

INCLUDEPICTURE "http://lh4.ggpht.com/_kFz4vOoppxQ/SSKo_k5Xp8I/AAAAAAAAAdg/T5bEJqMcLtY/clip_image0423.jpg" \* MERGEFORMATINET c. Goresan kuadran (streakquadrant)

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisme. Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horizontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptik agar tidak terkontaminasi.

INCLUDEPICTURE "http://lh5.ggpht.com/_kFz4vOoppxQ/SSKpG8yjhMI/AAAAAAAAAdw/IaueTghDrHY/clip_image0463.jpg" \* MERGEFORMATINET

INCLUDEPICTURE "http://lh5.ggpht.com/_kFz4vOoppxQ/SSKpKD-y3TI/AAAAAAAAAd4/iW-CEuUaDz8/clip_image0483.jpg" \* MERGEFORMATINET

INCLUDEPICTURE "http://lh3.ggpht.com/_kFz4vOoppxQ/SSKpNJR0Z3I/AAAAAAAAAeA/ZtJPr7hpjuc/clip_image0503.jpg" \* MERGEFORMATINET 2. Metode cawan tuang (pour plate)

Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan ketrampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam 9 ml garam fisiologis (NaCL 0.85%) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagai penyangga pH agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapat tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (nutrien agar) steril hangat (40-50C) kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator (37C) selama 1-2 hari. Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjadi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan (di laboraturium, kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan (media panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. Pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudia diletakkan dalam inkubator.

INCLUDEPICTURE "http://lh3.ggpht.com/_kFz4vOoppxQ/SSKokiAWJcI/AAAAAAAAAcg/XzzbDEXZWnQ/clip_image0263.jpg" \* MERGEFORMATINET

INCLUDEPICTURE "http://lh3.ggpht.com/_kFz4vOoppxQ/SSKopm1mSlI/AAAAAAAAAco/RMjdVE-f3oo/clip_image0283.jpg" \* MERGEFORMATINET 3. Metode cawan sebar (spread plate)

Pada metode cawan sebar, 0,1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan disebar pada media penyubur steril yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan batang drygalski agar koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian diletakkan dalam inkubator (37C) selama 1-2 hari. Metode ini cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan batang drygalski. Alih-alih koloni tumbuh merata, biakan justru terkontaminasi. Oleh karena itu, batang drygalski harus benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol kemudian dipanaskan dengan api bunsen. Perlu diingat, batang drygalski, yang masih panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar, sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar api bunsen (15 cm). Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni, dan permukaan koloni.B. Penghitungan jumlah bakteri

Penghitungan jumlah bakteri dengan berdasarkan jumlah koloni termasuk metode pengukuran secara tidak langsung. Untuk melakukan perhitungan jumlah bakteri berdasarkan jumlah koloni (plate count) harus memperhatikan syarat-syarat sebagai berikut:

1. Jumlah koloni tiap cawan petri antara 30-30.000 koloni, jika memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300.

2. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas cawan petri, dikenal sebagai spreader.

3. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang berturut-turut antara pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2 hasilnya dirata-rata, tetapi jika lebih besar dari 2 yang dipakai jumlah mikroba dari hasil pengenceran sebelumnya.

Beberapa langah dalam melakukan pengenceran untuk menghitung jumlah koloni, dapat terlihat beberapa perbedaan hasil baik dari penampakan warna saat pengenceran sampai jumlah koloni mikroba yang didapatkan. Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran bergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1:10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.

Pada saat melakukan pengenceran maupun pemindahan ke petridish harus dilakukan secara aseptis suapaya saat melakukan pemindahan sample dari tabung reaksi satu ke lainnya tidak terkontaminasi oleh mikroba jenis lain yang tidak diinginkan. Teknik yang digunakan untuk memindahkan bahan makanan yang telah diencerkan pada seri pengenceran 10-1-10-4 digunakan teknik pour plate, hal ini dilakukan menyebarkan sel-sel mikroba tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar (NA)) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak begitu banyak mengandung oksigen.

Setelah penanaman mikroba ke dalam petridish, selanjutnya melakukan inkubasi dengan menggunakan inkubator agar mikroba dapat tumbuh dengan baik pada suhu yang optimum untuk pertumbuhan yaitu sekitar 37C. setelah 24 jam didapatkan sejumlah mikroba yang tumbuh di medium. Hasil perhitungan didapat dengan perhitungan koloni mikroba yang ada dalam petridish. 4. Prosedur Kerja:

1.1 Metode Cawan Gores (Streak Plate)

Alat dan bahan :

a. Ose

b. Api bunsen

c. Larutan Alkohol

d. Cawan petri yang berisi media steril

1.2 Metode Cawan Tuang (Pour Plate)

Alat dan bahan :

a. 9 ml garam fisiologis (NaCl 0,85%) / larutan buffer fosfat

b. 1 ml suspensi

c. Media penyubur (nutrien agar)

d. Cawan petri steril

e. Inkubator

1.3 Metode Cawan Sebar (Spread Plate)

Alat dan bahan :

a. 0,1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan

b. Media penyubur steril

c. Batang drygalski

d. Inkubator

e. Larutan alkohol

f. Api bunsen

g. Ose

1.4 Prosedur praktikum :

a. Setiap mahasiswa melakukan penanaman kultur dari stok (hasil isolasi mikroba rongga mulut) dengan metode cawan tuang (pour plate) dan goresan kuadran (streakquadrant).

b. Melakukan penipisan seri dan cara menghitung kuman.

5. Pengamatan:

Tahap 1 : Pembuatan Goresan Kuadan (streakquadrant)

a. Menyediakan cawan petri yang akan dibuat goresan

b. Membagi cawan petri menjadi 4 bagian

c. Ose steril yang telah disediakan, dilekatkan dengan sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan yang berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horizontal di satu sisi cawan.

d. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.

e. Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi.

5.2 Penanaman kultur dari stok (hasil isolasi mikroba rongga mulut) dengan metode cawan tuang (pour plate)a. Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquadest sesuai dengan dilusi yang dikehendaki.

b. Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali.

c. Pipet media agar cair yang telah dipanaskan dengan suhu kurang lebih 50oC

d. Pindahkan pipet yang berisi media agar cair ke dalam tabung reaksi tadi.

e. Aduk kembali campuran tadi dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali.

f. Tuang larutan yang berada dalam tabung reaksi ke dalam cawan petri sebanyak kurang lebih 1 ml.

g. Inkubasi dengan posisi terbalik dengan suhu dan waktu yang sesuai dengan jenis bakteri.

h. Amati pertumbuhan koloni bakteri tersebut.