2

BAB IIIMETODE PENELITIAN3.1. Jenis PenelitianPenelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan menguji objek penelitian yaitu ekstrak daun salam dengan tiga macam pelarut yaitu etanol, etil asetat, dan n-heksana dalam berbagai konsentrasi untuk mendapatkan diameter zona hambat dan konsentrasi hambatan minimum.

3.2. Waktu dan Tempat PenelitianPenelitian ini dilaksanakan Laboratorium Mikrobiologi, UPTD Balai Laboratorium Kesehatan Propinsi Lampung Jalan Dr. Sam Ratulangi No 103 Penengahan Bandar Lampung pada bulan Januari 2013.

3.3. Objek penelitian Objek penelitian digunakan dalam penelitian ini adalah Daun salam.3.4. Besar SampelPenelitian ini dilakukan dengan 5 kelompok konsentrasi dari tiap peralut (12,5%, 15%, 17,5%, 20%, dan 22,5%). Banyaknya jumlah pengulangan ditentukan menggunakan rumus federer:

Keterangan:n: banyak pengulangank: banyak perlakuanPenelitian menggunakan enam kelompok yaitu satu kelompok kontrol dan lima kelompok perlakuan sehingga :diketahui: k =5(n- 1) (5-1) 15(n-1) 4 154n-4 154n 15+44n 19n 4,75Maka diperoleh nilai n 4,75 dibulatkan menjadi 5, dengan perlakuan antara lain: K1 =Disc blank yang diberi aquadest steril sebagai kontrol positif (+) K2 =Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan konsentrasi 12,5% K3 =Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan konsentrasi 15% K4 =Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan konsentrasi 17,5%

K5 =Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan konsentrasi 20% K6 =Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan konsentrasi 22,5%Berdasarkan perhitungan tersebut, maka jumlah pengulangan minimal yang diperlukan adalah 5 kali pengulangan.

3.5. Variabel Penelitian3.5.1. Variabel bebas:Variabel independent merupakan variabel resiko atau sebab yang mempengaruhi variabel terikat (variabe dependent).16Dalam penelitian ini yang menjadi variabel independent adalah ekstrak bawang bombai (Allium cepa L.) dengan konsentrasi 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, dan 22,5% .

3.5.2. Variabel TerikatVariabel dependent merupakan variabel efek atau akibat yang dipengaruhi oleh Variabel independent.16 Dalam penelitian ini yang menjadi variabel dependent adalah bakteri Staphylococcus aureus.

3.6. Definisi Operasional PenelitianTabel 3.1 Definisi OperasionalNo.VariabelDefinisiAlat ukurHasil ukurSkala ukur

1.Ekstrak Bawang bombai (Allium cepa L.)

Bawang Bombay yang telah diekstrak dengan konsentrasi 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, 22,5%.TimbanganMassa bawang bombai dalam gramRasio

2.Diameter Zona hambat perumbuhan Staphylococcus aureusDiameter yang terbentuk karena adanya daya antibakteri dari hasil ekstrasi bawang bombai (Allium cepa L.) dengan pelarut dalam berbagai konsentrasi terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureusJangka sorongHasil pengukuran diameter dinyatakan dalam satuan milimeterRasio

3.7. Alat dan Bahan3.7.1. Alat ujiPinset, sonde, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas ukur, labu erlenmeyer, bunsen, mikropipet,pipet serologis, jangka sorong, kertas cakram, jarum ose, botol fial, botol selai, botol hitam, rotavapor, laminar air flow, penanganan air, timbangan analitik, kulkas. Alat-alat ini disterilisasi dalam autoclave selama 30 menit.3.7.2. Bahan Penelitian3.7.2.1. Bahan UjiBahan penelitian adalah bawang bombai (Allium cepa L.) dengan konsentrasi 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, dan 22,5% aquades, larutan n-heksana, larutan etil asetat dan larutan metanol, Bawang bombai (Allium cepa L.), aquades, larutan Mac Farland, Larutan Fisiologis, alkohol, alumunium foil, kapas, kertas filter whatman.3.7.2.2. Bakteri UjiBakteri uji digunakan adalah biakan murni S. aureus, yang diperoleh dari Laboratorium Daerah Provinsi Lampung, yang dibiakkan selama 24 jam sebelum penelitian.

3.7.2.3. Media yang digunakanMedia yang digunakan Media Muller Hilton untuk menguji sensitivitas bawang Bombay ( Allium cepa L.) , aquadest sebagai kontrol.3.8. Cara Kerja3.8.1. Persiapan SimplisiaProsedur kerja persiapan simplisia adalah sebagai berikut:1. Bawang bombai dikupas dulu lalu dibersihkan dengan air dengan pelarut yang akan digunakan.2. Setelah itu bawang bombai ditimbang sebanyak 300 gram.3. Selanjutnya bawang bombai dihaluskan dengan blender.3.8.2. Ekstraksi Bawang bombai (Allium cepa L.)Bawang bombai diperoleh dari pasar Rajabasa, Ekstraksi bawang bombai (Allium cepa L.) diperoleh dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol, etil asetat, n-heksana. Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut:421. Simplisia itu dimasukkan dalam bejana yang tidak tembus cahaya.2. Ditambah pelarut n-heksana sebanyak 1 L.3. Diendapkan selama 2 hari dan sesekali dikocok.4. Dihari ketiga, campuran disaring utnuk mendapatkan filtrat.5. Filtrat pelarut n-heksana dievaporasi untuk mendapatkan ekstrak n-heksana.6. Ampas sisa dari hasil filtrasi pelarut n-heksana, dilarutkan kembali menggunakan pelarut etil asetat sebanyak 1 L.7. Ulangi langkah no. 5 sampai no. 7 pada pelarut etil asetat dan etanol untuk memperoleh ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol.Dari ketiga ekstrak ini akan didapat perbandingan pelarut yang paling signifikan dalam menghasilkan efek antibakteri dari zat terlarut akan dipilih sebagai larutan yang digunakan untuk menentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) pada tahapan percobaan selanjutnya.

3.8.3. Pembuatan Agar NA (Nutrient Agar)43Agar NA mengandung campuran yang terdiri dari : NA 1 gram Aquades 125 mlCara Pembuatan:1. 1 gram NA serbuk dilarutkan dalam 125 ml aquades dalam erlenyemer dan didihkan diatas penangas sambil terus diaduk.2. Siapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah.3. Masukkan agar NA yang telah dipanaskan kedalam tabung reaksi dengan komposisi 10 ml tiap satu tabung reaksi.4. Tabung tersebut kemudian distreilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 2 atm selama 15-20 menit.

3.8.4. Pembuatan Suspensi Standar Mc. Farland44Suspensi Standar Mc. Farland adalah suspensi yang menunjukkan konsentrasi kekeruhan bakteri sama dengan 108 CFU/ml.Komposisi: Larutan Asam sulfat 15b/v 9,5 ml Lartan Barium klorida v/v 0,5 mlCara Pembuatan:Dicampur kedua larutan tersebut dalam tabung reaksi dikocok dan dihomogenkan. Apabila kekeruhan suspensi bakteri uji adalah sama dengan kekeruhan suspensi standar berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 108 CFU/ml

3.8.5. Pembuatan Biakan Staphylococcus aureus451. Bakteri ditumbuhkan pada agar miring dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.2. Bakteri yang telah ditumbuhkan diambil dengan jarum ose steril dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi NaCI 0,9% yang dilarutkan dengan aquadest 100 ml, yang sebelumnya sudah disterilkan dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 121oC tekanan 1 atm, sampai didapatkan kekeruhan yang disesuaikan dengan standar kekeruhan Mc Farland 0,5 untuk mendapatkan bakteri sebanyak 108 cfu/ml.

3.8.6. Uji Sensitivitas Antibakteri Bawang Bombai (Allium cepa L.)Penentuan uji daya hambat dari ekstrak bawang bombai (Allium cepa L.) menggunakan metode difusi agar dengan Cakram Kirby-Bauer untuk bakteri Staphylococcus aureus. Metode difusi untuk bakteri Staphylococcus aureus dilakukan dengan cara:371. Setelah bakteri Staphylococcus aureus dibiakan dan diinokulasi pada cawan petri siapkan sediaan ekstrak (n-heksana, etil asetat, dan etanol) dalam botol-botol fial. Larutkan masing-masing ekstrak dengan konsentrasi 10% sebagai konsentrasi awal untuk uji aktivitas antibakteri. Lalu larutkan sehingga menghasilkan konsentrasi 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, dan 22,5% .2. Ekstrak etil asetat bawang bombai (Allium cepa L.) diteteskan pada masing-masing cakram dengan konsentrasi berturut-turut 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, dan 22,5% sebanyak 10L dan satu cakram lagi sebagai kontrol negatif.343. Kemudian, ke dalam medium yang berisi bakteri ditempatkan enam kertas cakram pada setiap cawan petri. Sebanyak lima kertas cakram untuk kontrol negatif. Pemasangan kertas cakram pada cawan petri diatur jaraknya satu sama lainnya+ 20-25 mm.4. Semua cawan petri yang telah diletakkan kertas cakram yang berisi ekstrak bawang bombai lalu di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.5. Mengulangi uji sensitivitas antibakteri sebanyak lima kali pengulangan untuk tiap-tiap konsentrasi dalam masing-masing pelarut.6. Hitung luas zona hambat yang terbentuk menggunakan jangka sorong.Setelah disimpan selama 24 jam suhu 37oC, diukur diameter hambatan yang terbentuk. Pengujian aktivitas antibakteri dikatakan positif bila disekitar kertas cakram terdapat zona bening yang bebas dari pertumbuhan bakteri. Pengukuran dapat dilakukan dengan menggunakan jangka sorong. Cara pengukuran tampak pada gambar di bawah ini:

EAFCBD

Gambar 3.6. Cara Pengukuran Diameter Zona Daya HambatSumber. Anonim 46Keterangan:Garis Tebal(1): Kertas cakramGaris Tipis(2): Zona inhibisi yang terbentukPengukuran I (mm): (A-B)Pengukuran II(mm): (C-D)Pengukuran III(mm): (E-F)Zona daya hambat (mm): ( pengukuran I+II+III/3)

3.9. Cara Pengumpulan DataSetelah dilakukan penelitian secara laboratorium terhadap materi yang diujikan dengan uji sensitivitas bawang bombai (Allium cepa L.) terhadap bakteri Stahphylococcus aureus menggunakan metode difusi agar memakai kertas cakram, maka dilakukan :a. Diameter zona hambatan (wilayah jernih) diukur dengan cara melewati tengah kertas cakram dengan satuan milimeter.b. Menghitung rata-rata diameter zona hambatan untuk setiap konsentrasi bawang bombai (Allium cepa L.). c. Analisis data menggunakan RAL (Rancangan Acak Lengkap)3.10. Alur Penelitian

Penelusuran kepustaka

Penyusunan proposal

Peninjauan proposal

Persiapan bahan dan alat

Melakukan penelitian

Pengolahan hasil penelitian

Penyajian hasil penelitian

Hasil penelitian

Gambar 3.7. Alur Penelitian.