23

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Penentuan panjang gelombang maksimum ini digunakan untuk mengetahui

pada serapan berapa zat yang dibaca oleh spektrofotometer UV secara optimum

karena detektor KCKT yang digunakan untuk penelitian ini adalah detektor UV.

Pada penelitian ini, hasil scanning panjang gelombang maksimum atorvastatin

dalam fase gerak metanol-air pH 3 (80:20 v/v) dengan konsentrasi 100 µg/mL

menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 200 – 400 nm

menunjukkan bahwa atorvastatin memiliki serapan maksimum pada 245 nm.

Berdasarkan penelitian Sawant et al., (2012), panjang gelombang maksimum

atorvastatin adalah 246 nm. Perbedaan panjang gelombang sebesar 1 nm masih

dalam batas toleransi yang diperkenankan menurut Depkes RI (1995), yaitu lebih

kurang 3 nm. Spektrum UV atorvastatin dapat dilihat pada gambar 2.

Gambar 2. Spektrum UV atorvastatin dalam fase gerak metanol : air pH 3 (80:20, v/v)

dengan konsentrasi 100 µg/mL.

B. Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak

Parameter hasil optimasi kondisi KCKT yang diamati meliputi waktu

retensi (Rt), resolusi (Rs), tailling factor (TF), dan nilai lempeng teoritis (N) dari

24

berbagai variasi komposisi dan kecepatan alir fase gerak. Prioritas pertama dalam

pemilihan perbandingan komposisi fase gerak adalah nilai resolusi yang dihasilkan

yaitu RS > 2. Nilai ini menunjukkan puncak yang dihasilkan terpisah sempurna

dengan puncak yang lain. Prioritas kedua adalah waktu retensi, semakin cepat maka

akan semakin baik karena menghemat waktu analisis. Prioritas ketiga adalah

tailling factor dari masing-masing puncak yang dihasilkan yaitu < 2 dan nilai N

yang dihasilkan > 2000.

Optimasi metode analisis atorvastatin dengan KCKT kondisi awal yaitu

kolom Cosmosil C18, ukuran partikel 5 µm, panjang kolom 150 mm dan diameter

dalam 4,6 mm, fase gerak campuran metanol-air pH 3, volume injeksi 20 µL,

detektor UV 245 nm, dan kecepatan alir fase gerak 1 mL/menit. Optimasi metode

analisis dilakukan dengan optimasi perbandingan komposisi fase gerak metanol-air

pH 3. Hasil optimasi komposisi fase gerak dapat dilihat pada tabel 2, sedangkan

kromatogram hasil optimasi perbandingan fase gerak metanol-air pH 3 dapat dilihat

pada lampiran 2.

Tabel 2. Hasil Optimasi Perbandingan Komposisi Fase Gerak Metanol-Air pH 3

Parameter

Perbandingan Komposisi Fase Gerak

(Metanol-Air pH 3)

Syarat

(Snyder

et al.,

2010) 70-30 75-25 80-20 85-15 90-10

Resolusi (Rs) 1,54 0,83 3,15 1,06 3,00 > 2

Rt (menit) 6,24 4,98 3,91 3,25 2,72 ≤ 10

Tailing factor 1,60 0,89 0,90 0,75 1,20 < 2

Jumlah lempeng

teoritis (N) 5784 5377 5184 4210 5980 > 2000

Dari hasil optimasi perbandingan komposisi fase gerak yang diperoleh,

dipilih perbandingan 80:20 karena menghasilkan nilai resolusi serta tailing factor

yang optimal dengan waktu retensi yang cukup cepat dibandingkan dengan

perbandingan komposisi fase gerak yang lain. Selain itu, nilai N yang dihasilkan

juga sudah memenuhi syarat yaitu >2000 (Snyder et al., 2010). Bila dilihat dari

25

kromatogram pada lampiran 3, peak yang dihasilkan memberikan hasil yang baik

pula.

Selanjutnya, hasil dari optimasi perbandingan komposisi fase gerak yang

dipilih yaitu metanol-air pH 3 (80:20) dilakukan optimasi kecepatan alir fase gerak.

Optimasi kecepatan alir yang dilakukan yaitu pada kecepatan 0,9; 1,0 dan 1,1

mL/menit. Hasil optimasi kecepatan alir dapat dilihat pada tabel 3.

Tabel 3. Hasil optimasi kecepatan alir fase gerak

Parameter

Kecepatan Alir Fase Gerak

(mL/menit) Syarat (Snyder et

al., 2010) 0,9 1,0 1,1

Resolusi (Rs) 3,00 3,15 2,63 > 2

Rt (menit) 4,49 3,91 3,61 ≤ 10

Tailing factor 1,12 0,90 0,75 < 2

Jumlah lempeng teoritis

(N) 5367 5184 5184 > 2000

Hasil optimasi kecepatan alir yang dipilih adalah 1 mL/menit, karena

menghasilkan nilai resolusi, tailing factor, nilai N, serta luas area yang optimal

dengan waktu retensi yang cukup cepat dibandingkan dengan kecepatan alir yang

lain.

Berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan diperoleh sistem kromatografi

sebagai berikut:

Fase diam : Cosmosil C18 (150 x 4,61 mm, 5 µm)

Fase gerak : Metanol-air pH 3 yang diatur dengan asam fosfat (80:20)

Kecepatan alir : 1 mL/menit

Detektor : UV 245

Vol. Injeksi : 20 µL

C. Uji Kesesuaian Sistem

Tujuan dilakukan uji kesesuaian sistem untuk mengetahui kesesuaian,

keefektifan serta menjamin bahwa metode yang digunakan dapat menghasilkan

akurasi dan presisi yang dapat diterima untuk analisis atorvastatin agar sistem

26

KCKT memberikan hasil yang baik (Gandjar dan Rohman, 2012). Syarat uji

kesesuaian sistem yang baik menurut Snyder et al. (2010), apabila waktu retensi

menghasilkan CV ≤ 1,0%, luas area dan intensitas menghasilkan CV ≤ 2,0%, nilai

resolusi > 2, tailing factor ≤ 2, dan nilai N > 2000. Hasil uji kesesuaian sistem dapat

dilihat pada tabel 4.

Tabel 4. Hasil uji kesesuaian sistem KCKT untuk analisis atorvastatin 120 ng/mL

dalam larutan fase gerak

Parameter Rerata SD CV (%)

Syarat

(Snyder et

al., 2010)

Waktu Retensi 3,96 0,01 0,17 CV ≤ 1,0 %

Luas Area 2726465 21018,89 0,77 CV ≤ 2,0 %

Tinggi Puncak 362225 1829,41 0,51 CV ≤ 2,0 %

Resolusi 2,45 0,05 2,02 Rs > 2

Tailing Factor 0,88 0,01 1,67 TF ≤ 2

Jumlah Lempeng

Teoritis (N) 6055 4,19 0,07 N > 2000

Hasil uji kesesuaian sistem terhadap kadar atorvastatin 120 ng/mL yang

dianalisis dengan KCKT menunjukkan bahwa kondisi yang digunakan untuk

analisis kadar atorvastatin dalam tablet memenuhi persyaratan uji kesesuaian

sistem.

D. Validasi Metode Analisis

1. Penentuan Selektivitas

Selektivitas menggambarkan kemampuan suatu metode untuk

mengukur zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen

lain. Pada penelitian ini, selektivitas metode analisis dilakukan dengan

membandingkan puncak dalam kromatogram atorvastatin standar, sampel

tablet atorvastatin, dan pelarut fase gerak yang dianalisis dengan KCKT pada

kondisi yang optimum. Selain itu juga dilakukan perhitungan nilai resolusi dari

atorvastatin standar.

27

Gambar 3. Profil kromatogram : A) standar atorvastatin, B) sampel tablet atorvastatin, C)

pelarut fase gerak

Parameter KCKT :

Fase diam : Cosmosil C18 (150 x 4,61 mm, 5 µm)

Fase gerak : Metanol-air pH 3 yang diatur dengan asam fosfat (80:20)

Kecepatan alir : 1 mL/menit

Detektor : UV 245

Vol. Injeksi : 20 µL

ATR

ATR

A

B

C

28

Pada penelitian ini dihasilkan kromatogram dengan puncak atorvastatin

standar dan sampel tablet atorvastatin pada waktu retensi 3,9 menit, serta tidak

terlihat adanya puncak pada kromatogram pelarut fase gerak. Hal ini

menunjukkan bahwa metode yang digunakan selektif terhadap senyawa

tertentu, dan menunjukkan tablet atorvastatin dapat dianalisis mengggunakan

metode ini dengan membandingkan dengan standar atorvastatin yang memiliki

waktu retensi yang sama.

Menurut Snyder et al. (2010), persyaratan uji selektivitas untuk

pengembangan metode analisis apabila memiliki nilai resolusi (Rs) > 2, hasil

perhitungan resolusi diperoleh dari kromatogram atorvastatin standar dengan

nilai resolusi sebesar 3,1 yang berarti memenuhi persyaratan. Hasil ini

menunjukkan metode KCKT yang digunakan untuk analisis atorvastatin

mempunyai selektivitas yang baik. Hasil kromatogram atorvastatin standar,

sampel tablet atorvastatin, dan pelarut fase gerak dapat dilihat pada gambar 3.

2. Penentuan Linearitas

Uji linearitas dilakukan dengan cara menginjeksikan 5 seri konsentrasi

atorvastatin pada sistem KCKT. Konsentrasi yang digunakan adalah 20, 40,

60, 80, 120 ng/mL. Data luas area atorvastatin yang diperoleh diplotkan dengan

seri konsentrasi atorvastatin. Persamaan garis yang dihasilkan antara seri

konsentrasi atorvastatin dengan luas area yang diperoleh dari kromatogram

adalah y = 10742607,432x – 1356494,324; koefisien korelasi (r) = 0,9995, dan

koefisien determinasi (r2) = 0,9990.

Menurut Chan et al. (2004), persyaratan linearitas untuk validasi

metode analisis bisa diterima jika nilai koefisien determinasi (r2) lebih besar

atau sama dengan 0,997. Pada penelitian ini, nilai r2 yang diperoleh adalah

0,9990 sehingga metode analisis yang digunakan telah memenuhi syarat

linearitas yang ditetapkan. Hasil kurva hubungan luas area kromatogram

terhadap konsentrasi atorvastatin pada penentuan linearitas dapat dilihat pada

gambar 4.

29

Gambar 4. Kurva hubungan luas area kromatogram atorvastatin terhadap konsentrasi

atorvastatin pada penentuan linearitas

3. Penentuan Akurasi dan Presisi

Salah satu syarat utama metode analisis adalah tepat dan teliti.

Ketepatan bisa dilihat dari parameter akurasi yang dalam penelitian ini

diperoleh dari nilai perolehan kembali (recovery). Ketelitian dapat dilihat dari

parameter presisi yang pada penelitian ini diukur sebagai simpangan baku

relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) (Rohman, 2009). Pada penelitian ini,

uji presisi yang dilakukan adalah keterulangan (repeatability) yaitu presisi pada

kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatanya, maupun

waktunya (Gandjar dan Rohman, 2012).

Penentuan presisi dan akurasi dilakukan pada 5 konsentrasi

atorvastatin, dimana pengukuran pada setiap konsentrasi sebanyak 5 kali. Pada

penelitian ini, uji presisi dan akurasi dilakukan pada konsentrasi atorvastatin

yaitu sebesar 20, 40, 60, 80, dan 120 ng/mL. Nilai perolehan kembali dan

koefisien variasi pengukuran atorvastatin hasil penelitian ini dapat dilihat pada

tabel 5.

y = 10.742,61x + 1.356.494,32R 2= 0,999

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0 20 40 60 80 100 120 140

Luas

Are

a A

torv

asta

tin

Konsentrasi Atorvastatin (ng/mL)

30

Tabel 5. Nilai Recovery dan Koefisien Variasi (CV)

Konsentrasi

Atorvastatin

diketahui

(ng/mL)

Replikasi Kadar Atorvastatin

terukur (ng/mL)

Recovery

(%) CV (%)

20

1 20,22 101,15

0,64

2 20,66 103,32

3 19,02 95,09

4 20,96 104,85

5 18,92 94,62

40

1 43,59 108,99

1,38

2 39,66 99,16

3 38,49 96,22

4 37,53 93,84

5 39,72 99,30

60

1 58,28 97,14

1,35

2 56,15 93,59

3 56,12 93,53

4 56,73 94,55

5 62,02 103,37

80

1 81,58 101,98

1,73

2 81,31 101,63

3 73,84 92,31

4 75,04 93,79

5 78,40 98,01

120

1 111,69 93,08

2,82

2 129,53 107,95

3 119,80 99,86

4 123,18 102,65

5 115,25 96,05

Suatu metode analisis yang menggunakan sampel dengan konsentrasi

di bawah 1000 ng/mL dikatakan memiliki akurasi yang baik apabila nilai

recovery yang diperoleh berkisar 80 – 110% dari nilai sebenarnya (Gonzalez

et al., 2010). Pada penelitian ini, semua nilai recovery yang didapatkan berada

pada rentang tersebut. Maka dari itu, metode analisis yang digunakan pada

penelitian ini memenuhi persyaratan akurasi.

31

Untuk uji presisi, apabila sampel yang digunakan memiliki konsentrasi

di bawah 1000 ng/mL maka syarat CV yang diterima menurut AOAC adalah

kurang dari 7,3% (Gandjar dan Rohman, 2012). Dengan demikian, metode

analisis yang digunakan dalam penelitian ini memenuhi persyaratan presisi.

4. Penentuan LOD (Limit Of Detection) dan LOQ (limit Of Quantifitation)

LOD adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi

dan masih memberikan respon signifikan, sedangkan LOQ adalah konsentrasi

terendah analit dalam sampel yang dapat ditentukan denga presisi dan akurasi

yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar

dan Rohman, 2012).

Pada penelitian ini, penentuan LOD digunakan dengan metode visual

instrumental dengan perhitungan signal to noise ratio (Ahuja and Dong, 2005).

Pengukuran dilakukan pada konsentrasi atorvastatin sebesar 0,05; 0,1; 0,2

ng/mL. Hasil penelitian diperoleh bahwa konsentrasi atorvastatin 0,05 dan 0,1

ng/mL tidak terlihat adanya puncak atorvastatin pada waktu retensi sekitar 3,9

menit, sedangkan pada konsentrasi 0,2 ng/mL terlihat adanya puncak

atorvastatin pada waktu retensi 3,96 menit. Hasil kromatogram penentuan LOD

dapat dilihat pada gambar 5.

Nilai LOD dapat dibuktikan dengan melakukan injeksi berulang

konsentrasi terpilih sebanyak 6 kali, apabila CV yang diperoleh lebih besar dari

50

𝑆/𝑁′=

50

3/1= 16,67%, maka nilai tersebut merupakan LOD (Snyder et al.,

2010). Pada penelitian ini, injeksi berulang konsentrasi 0,2 ng/mL dihasilkan

CV sebesar 30,07%, dapat dilihat pada tabel 6. Oleh karena itu, dapat

ditetapkan bahwa konsentrasi 0,2 ng/mL merupakan nilai LOD.

Hasil nilai LOD digunakan dasar perhitungan nilai LOQ, dimana

menurut Gandjar dan Rohman (2012), nilai LOQ diperoleh dari rumus LOQ =

10/3 LOD. Hasil dari perhitungan diperoleh nilai LOQ yaitu 0,7 ng/mL. Hasil

penentuan presisi dan akurasi untuk membuktikan nilai LOQ dapat dilihat pada

tabel 7. Pada hasil tersebut diperoleh presisi dan akurasi yang dapat diterima

dan memenuhi persyaratan presisi yaitu CV kurang dari 7,3 dan akurasi dengan

32

nilai recovery 80 – 110%. Oleh karena itu, ditetapkan konsentrasi 0,7 ng/mL

merupakan nilai LOQ.

Gambar 5. Profil kromatogram atorvastatin : A) konsentrasi 0,05 ng/mL, B) konsentrasi 0,1

ng/mL, C) konsentrasi 0,2 ng/mL

Parameter KCKT :

Fase diam : Cosmosil C18 (150 mm x 4,61 D, 5 µm)

Fase gerak : Metanol-air pH 3 yang diatur dengan asam fosfat (80:20)

Kecepatan alir : 1 mL/menit

Detektor : UV 245

Vol. Injeksi : 20 µL

ATR

A

B

C

33

Tabel 6. Hasil Injeksi Berulang Atorvastatin 0,2 ng/mL

Konsentrasi

Atorvastatin

(ng/mL)

Luas Area

Atorvastatin

Rerata Luas

Area

Atorvastatin

SD CV (%)

Syarat

(Snyder

et al.,

2010)

0,2

27105

2801,83 842,52 30,07 CV >

16,67

38624

16123

21844

28562

35873

Tabel 7. Nilai Recovery dan Koefisien Variasi (CV) pada penentuan LOQ

Konsentrasi

Atorvastatin

diketahui

(ng/mL)

Replikasi

Kadar

Atorvastatin

terukur

(ng/mL)

Recovery

(%) CV (%)

0,7

1 0,70 100,01

0,93

2 0,71 101,27

3 0,71 101,14

4 0,72 103,04

5 0,71 101,10

E. Uji Keseragaman Kadar Tablet

Pada penelitian ini, sampel yang dgunakan untuk uji keseragaman kadar

tablet atorvastatin adalah atorvastatin generik. Sampel ini dipilih karena

atorvastatin generik paling banyak beredar di pasaran dengan harga paling murah

dibandingkan merek lain. Hasil keseragaman kadar tablet atorvastatin generik dapat

dilihat pada tabel 8.

34

Tabel 8. Kadar Tablet Atorvastatin Generik

Tablet Kadar (%) SD CV (%)

1 105,09

1,79 1,75

2 100,52

3 105,82

4 102,45

5 102,55

6 101,93

7 103,60

8 100,34

9 102,09

10 101,51

Berdasarkan data di atas menunjukkan kadar atorvastatin generik dalam

sediaan tablet memenuhi persyaratan kadar menurut Aini et al. (2015) yaitu tidak

kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 110,0 % dari jumlah yang tertera pada etiket.

Untuk perhitungan dapat dilihat pada lampiran 10.

Uji keseragaman tablet yang dilakukan selain untuk membuktikan bahwa

metode analisis dengan KCKT yang dikembangkan dapat digunakan untuk analisis

tablet atorvastatin, juga digunakan untuk menjamin mutu, kualitas, serta keamanan

suatu produk obat dalam sediaan tablet.

35

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan

bahwa:

1. Metode analisis sederhana secara KCKT menggunakan kolom Cosmosil

C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm); menghasilkan kondisi optimum untuk

penetapan kadar tablet atorvastatin dengan fase gerak campuran

metanol-air pH 3 (80:20 v/v); kecepatan alir 1 mL/menit dan dideteksi

dengan detektor UV 245 nm.

2. Metode analisis sederhana yang dikembangkan telah memenuhi

persyaratan validasi metode analisis meliputi selektivitas; linearitas

pada rentang 20 – 120 ng/mL dengan r2 = 0,999; akurasi; presisi; Limit

of Detection (LOD) sebesar 0,2 ng/mL; dan Limit of Quantitation

(LOQ) sebesar 0,7 ng/mL.

B. Saran

Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik maka perlu dilakukan beberapa

hal seperti berikut:

1. Perlu dilakukan validasi dengan parameter yang lain seperti robustness

dan stabilitas larutan.

2. Perlu dilakukan uji keseragaman tablet atorvastatin dengan tablet merek

lain.

36