bab iv metode penelitian - eprints.umm.ac.ideprints.umm.ac.id/39165/5/bab iv.pdf · pembuatan...
TRANSCRIPT
24
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian experimental dengan menggunakan
desain penelitian The Post Test Only Control Group Design.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama empat minggu (Desember 2017-Januari
2018) di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas
Muhammadiyah Malang.
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian
4.3.1 Populasi penelitian
Populasi dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus Norvegicus)
jantan strain wistar.
4.3.2 Sampel penelitian
Sampel dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus)
jantan strain wistar yang dipilih secara acak dengan jenis kelamin jantan,
umur 2-3 bulan, berat badan 150-250 gram.
4.3.2.1 Kriteria inklusi
1) Tikus putih (Rattus Norvegicus) jantan strain wistar
2) Umur 2-3 bulan
3) Berat badan 150-200 gram
25
4) Sehat, gerakan yang aktif, berwarna putih serta
matanya jernih
4.3.2.2 Kriteria eksklusi
1) Tikus yang mati saat perlakuan
2) Tikus yang sakit saat penelitian (gerak tidak aktif, bulu
rontok dan menggumpal).
3) Tikus yang cacat
4.3.3 Teknik pengambilan sampel
Sampel ini diambil secara simple random sampling dari populasi tikus
putih (Rattus norvegicus) jantan strain wistar sebagai hewan coba. Sampel
terdiri dari 4 kelompok perlakuan.
4.3.4 Perhitungan besar sampel
Pencarian besar sampel pada penelitian ini menggunakan resource
equation method. Awalnya harus menghitung besar replikasi sampel
menggunakan rumus Federer. Terdapat 4 kelompok perlakuan yaitu satu
kelompok kontrol dan tiga kelompok perlakuan (tikus yang diberi ekstrak
kayu manis dosis 100mg/kgBB/hari, 200mg/kgBB/hari dan
400mg/kgBB/hari). Penentuan besar replikasi sampel dalam penelitian
ditentukan menggunakan rumus Federer (1999) dalam Rusda (2016) adalah
sebagai berikut:
(n-1) x (t-1) ≥ 15
(n-1) x (4-1) ≥ 15
(n-1) x 3 ≥ 15
26
3n -3 ≥ 15
3n ≥ 18
n ≥ 6
Keterangan : n = jumlah replikasi
t = banyaknya kelompok
Besar sampel yang digunakan dihitung menggunakan resource
equation methode dengan rumus sebagai berikut:
E = jumlah total hewan coba – jumlah kelompok perlakuan
E = (jumlah replikasi x jumlah kelompok perlakuan) – jumlah
kelompok perlakuan
E = (6x4) – 4 = 20 ekor
Keterangan: E = besar sampel
Untuk mengantisipasi adanya tikus yang drop out selama penelitian,
maka diperlukan adanya tikus cadangan dengan rumus koreksi besar
sampel (Sastroasmoro & Ismael, 2011) sebagai berikut:
n’ = [n/1-f]
n’ = 6/ (1-0,1) = 6,67 = 7
Jumlah tikus cadangan = jumlah kelompok x (n’ – jumlah replikasi)
Jumlah tikus cadangan = 4 x (7-6) = 4 ekor
Keterangan:
n’ = besar sampel terkoreksi
27
n = besar sampel minimum
f = perkiraan proporsi drop out, kira-kira 10% (f = 0,1)
Untuk menentukan jumlah tikus yang digunakan sebagai sampel
dalam penelitian ini menggunakan pendekatan Resource Equation (Arifin &
Zahiruddin, 2017). Maka dari itu, untuk mengetahui sampel minimal yang
dapat digunakan menggunakan rumus :
DF = N – k = kn – k = k (n-1)
n = DF/k+1
n = 10/4 + 1
n = 2,5 + 1 = 3,5
n = 4 ekor
Untuk mengetahui sampel maksimal yang dapat digunakan
menggunakan rumus :
DF = N – k = kn – k = k (n-1)
n = DF/k+1
n = 20/4 + 1
n = 5 + 1
n = 6 ekor
Keterangan :
DF : Derajat kebebasan komponen kesalahan
N : Jumlah sampel penelitian
k : Jumlah kelompok perlakuan
n : Jumlah subyek penelitian setiap kelopok
28
Jumlah total sampel penelitian didapatkan dari penjumlahan besar
sampel dan jumlah tikus cadangan yaitu sebesar 24 ekor tikus dalam 4
kelompok perlakuan, sehingga setiap kelompok diisi 4 ekor tikus.
a. Kelompok I: Kontrol positif diberi pakan standar dan
pemberian Aloksan tanpa ekstrak kulit kayu manis
(Cinnmamomum burmannii)
b. Kelompok II: Diberi pakan standar, pemberian Aloksan, dan
ekstrak ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum burmannii)
dengan pemberian dosis 100 mg/kgBB/hari
c. Kelompok III: Diberi pakan standar, pemberian Aloksan,
dan ekstrak ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum
burmannii) dengan pemberian dosis 200 mg/kgBB/hari
d. Kelompok IV: Diberi pakan standar, pemberian Aloksan,
dan ekstrak ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum
burmannii) dengan pemberian dosis 400 mg/kgBB/hari
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak kulit kayu manis
(Cinnamomum burmannii) dengan dosis 100mg/kgBB, 200mg/kgBB dan
400mg/kgBB yang diberikan kepada tikus putih (Rattus norvegicus) jantan
strain wistar (Rattus norvegicus) yang memenuhi kriteria inklusi.
4.4.2 Variabel tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah gambaran rerata
jumlah sel β pankreas tikus putih (Rattus norvegicus) jantan strain wistar.
29
4.5 Definisi Operasional
Tabel 4.1 Definisi Operasional
Variabel Definisi Operasional Hasil Ukur
(Indikator)
variabel
Cara Ukur Alat Ukur Skala
data
Ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum
burmannii)
Ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum burmannii) merupakan ekstrak ethanol kulit kayu manis yang dimaserasi dengan etanol 96% selama 5 hari kemudian disaring dan diambil filtratnya, dilakukan di UPT Materia Medica, Batu, Jawa Timur
Ekstrak kulit kayu manis kental. Dosis I : 100mg/kgBB tikus Dosis II : 200mg/kgBB tikus Dosis III : 400mg/kgBB tikus
Ekstrak kulit kayu manis dengan dosis 100mg/kgBB, 200mg/kgBB dan 400mg/kgBB diukur menggunakan neraca digital dan diberikan ke tikus secara peroral setiap hari selama 14 hari.
Timbangan (Miligram Balance)
Ordinal
Gambaran histopatologi sel β pankreas
Gambaran histopatologi sel β pankreas adalah bentuk sel yang seragam dan ukuran sitoplasma terlihat proposional terhadap inti dan berwarna biru dengan pengecatan aldehid fuschin
Rerata jumlah sel sel β pankreas pada pulau Langerhans per 5 lapang pandang.
Pewarnaan organ pankreas dengan pewarnaan aldehid fuschin dan pembacaan preparat dengan mikroskop pembesaran 400x.
Mikroskop perbesaran 400x
Rasio
30
4.6 Alat dan Bahan Penelitian
4.6.1 Alat
a. Timbangan untuk menimbang berat badan tikus
b. Alat pemeliharaan tikus :
Bak tikus
Penutup kandang dari anyaman kawat
Botol air
Sekam
c. Alat pembedah tikus
Scalpel
Pinset
Gunting
Jarum
Meja lilin
d. Alat pembuatan preparat histologi
Pisau
Kantong kasa
Botol fiksasi dan dehidrasi
Alat dehidrasi otomatis
Blok kayu dan alat potong beku
Mikrotom
Lemari pemanas
Alat pewarna jaringan
Mikroskop binokuler
31
Object glass
Cover glass
e. Alat Lain
Sonde
Mikrometer square
Spuit injeksi 3 ml
Tabung reaksi
Tabung Evendorf
Label
Handscoen
4.6.2 Bahan
a. Bahan pemeliharaan tikus
Makanan buatan pellet comfeed BR-1
Aquadest
b. Ekstrak Kulit Kayu Manis (Cinnamomum burmannii) dalam
berbagai dosis terbagi.
c. Bahan induksi
Aloksan (C4H2N2O4)
d. Bahan anastesi
Kloroform
e. Bahan untuk membuat sediaan histologi pankreas tikus
dengan cara embedding :
Parafin
Alkohol 30%, 50%, 70%, 85%, 95%, 100%
32
Larutan aldehid fuschin
Formalin 10%
Aquadest
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Adaptasi Hewan Percobaan
Tikus diaklimatisasi dahulu dengan lingkungan dan pakan selama satu
minggu di laboratorium sebelum injeksi aloksan sambil diamati
kesehatannya. Memberi makanan pada tikus 2 kali sehari. Makanan tikus
adalah broiler 1, sedangkan untuk minum diberikan aquades.
4.7.2 Pembuatan Larutan Aloksan
a. Menyiapkan larutan Aloksan 1,6% dengan cara melarutkan
1,6 g bubuk Aloksan dalam NaCl fisiologis hingga
mencapai 100 ml.
b. Menghitung kebutuhan Aloksan perhari sesuai berat badan
tikus. Berat badan tikus pada penelitian ini rata-rata 200
gram.
Kebutuhan Aloksan adalah sebagai berikut :
Berat badan tikus (gr) Kebutuhan Aloksan
200 160
1000 × 200 = 32 𝑚𝑔
Karena diberikan secara intraperitonial, maka dosis kebutuhan
Aloksan diberikan 2 kali dari dosis semula (kebutuhan larutan Aloksan yang
semula 2 ml menjadi 4 ml). Hal ini disesuaikan dengan dasar teori
33
(Szkudelski, 2001) yang mengatakan apabila Aloksan diberikan secara
intraperitonial atau sub cutan, maka dosis efektif Aloksan harus dinaikkan 2
– 3 kali lebih tinggi.
4.7.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Kayu Manis
Timbang serbuk kulit kayu manis sebanyak 380 g. Lakukan
pembasahan dengan pelarut etanol 96% sebanyak 300 ml. Masukkan serbuk
yang telah dibasahi dengan pelarut ke dalam toples, diratakan dan
ditambahkan pelarut etanol 96% sampai terendam (pelarut digunakan
minimal dua kali berat atau lebih). Pelarut ditambahkan sebanyak 1,5 L.
Tutup toples dengan rapat selama 24 jam. Dan di shaker diatas shaker
digital dengan kecepatam 50 rpm.saring ekstrak cair dengan penyaring kain.
Tampung ekstrak dalam Erlenmeyer. Ampas dimasukkan lagi dalam toples
dan tambahkan pelarut sampai terendam (minimal pelarut 5 cm diatas
permukaan), dalam hal ini digunakan 1 L. Biarkan semalam atau 24 jam
diatas shaker dengan kecepatan 50 rpm. Remaserasi dilakukan sampai
infiltrat atau ekstrak lebih jernih, menggunakan 1 L pelarut. Hasil ekstrak
cair pertama sampai dengan terakhir dijadikan satu dan diuapkan dengan
menggunakan rotary evaporator. Diperlukan waktu 4 jam untuk evaporasi.
Ekstrak yang dihasilkan di evaporasi atau diuapkan diatas water bath selama
2 jam. Pengekstrakan dilakukan oleh Balai Materia Medica Kota Batu.
34
4.7.4 Penentuan Dosis
4.7.4.1 Dosis Aloksan
Larutan Aloksan diberikan pada kelompok II, III dan IV
dengan dosis tunggal 160 mg/kgBB secara intraperitoneal (Ashok
et al., 2007).
4.7.4.2 Dosis Ekstrak Kulit Kayu Manis
Dosis Ekstrak kayu manis (Cinnamomum burmannii) yang
digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian
sebelumnya yang dilakukan oleh (Longe, Momoh & Adepoju,
2015). Pada penelitian tersebut telah dibuktikan ekstrak kayu
manis dengan dosis 200 mg/kgBB dapat menurunkan glukosa
darah, profil lipid, dan mengurangi kerusakan hepar akibat
induksi aloksan. Sehingga dosis perlakuan I, II, dan III pada
penelitian ini sebagai berikut :
D1 = ½ x D2 = ½ x 200 mg/ kgBB = 100 mg/ kgBB/hari
D2 = 200 mg/ kgBB/hari
D3 = 2 x D2 = 2 x 200 mg/ kgBB/hari = 400 mg/ kgBB/hari
4.7.5 Percobaan
a. Tahap persiapan tikus putih (Rattus norvegicus) jantan
strain wistar.
Mengambil tikus yang telah dikelompokkan berdsarkan
perlakuan secara satu persatu. Pengambilan tikus dilakukan
dengan hati – hatidan perlahan, sehingga tikus tidak takut
dan stres. Tikus yang ketakutan dan stres akan
35
mempengaruhi kerja hormonnya, sehinggaakan
berpengaruh pada absobrsi ekstrak kulit kayu manis di
dalam tubuh tikus. Setelah itu tikus dipegang dengan cara
memegang badan tikus dan menaruh bagian ekor serta
menjepitnya pada jari antara kelingking dengan jari manis,
lalu menyilangkan kaki depan tikus danmenjepitnya pada
jari antara jari telunjuk dengan jari tengah, sehinggaposisi
tikus siap untuk diberi ekstrak kulit kayu manis.
b. Pemberian ekstrak kulit kayu manis
Kelompok I sebagai kelompok kontrol positif diberi
pakan standar dan perlakuan injeksi Aloksan, sedangkan
pada kelompok II, III, dan IV selain pemberian ekstak kulit
kayu manis dan pakan standar juga diberiperlakuan injeksi
larutan Aloksan intraperitonial pada hari ke 8. Ekstrak kulit
kayu manis diberikan secara peroral dengan sonde masing-
masingdengan dosis 100mg/kgBB/hari untuk kelompok II,
200 mg/kgBB/hari untuk kelompok III dan
400mg/kgBB/hari untuk kelompok IV. Untuk keseragaman
maka pemberian ekstrak kulit kayu manis dilakukan setiap
hari selama 14 hari.
c. Pembuatan tikus hiperglikemia
Dua puluh lima ekor tikus kemudian dibagi dalam 5
kelompok secara random, masing-masing sebanyak 4 ekor
ditambah 1 ekor tikus cadangan dalam masing-masing
36
kelompok. Kelompok I (kontrol positif), II, III dan IV
diberi perlakuan pemberian injeksi larutan Aloksan dengan
dosis tunggal 160 mg secara intaperitoneal pada hari ke 8
untuk mendapatkan tikus hiperglikemia. Menurut penelitian
sebelumnya (Ashok et al., 2007), Kondisi hiperglikemia
pada tikus tersebut akan bertahan selama 1 bulan.
d. Pengambilan pankreas tikus
Setelah semua perlakuan diberikan, semua hewan
percobaan dikorbankan dengan cara cervical dislocation.
Kemudian organ pankreas bagian caput diambil untuk
selanjutnya dibuat preparat histologi dengan metode blok
parafin dan pengecatan aldehid fuschin. Irisan dilakukan
pada bagian medial dari caput pankreas dengan ketebalan
irisan 4-5 mikron. Pengambilan irisan pada bagian medial
caput pankreas ini hanya untuk homogenitas saja.
e. Pewarnaan dengan aldehid fuschin (Bancroft dan Gamble,
2008)
a. Pembuatan larutan aldehid fuschin dikombinasikan
dengan alcian blue. Larutkan pewarna dasar fuschin
ke dalam alkohol dan tambahkan pareldehid serta
HCl. Biarkan pada suhu ruangan selama 2-3 hari,
saring lalu dinginkan di dalam mesin pendingin.
Larutan ini harus ibuat setiap 3-6 bulan dengan pH
larutan 1,7.
37
b. Pembuatan larutan alcian blue (dalam 3% asam
asetat). Larutkan alcian blue 8GX sebanyak 1 gram
dilarutkan dalm 3% asam asetat.
c. Langkah-langkah pewarnaan :
1. Masukkan sediaan yang telah diberi parafin ke
dalam xylene dan keringkan pada larutan
ethanol 70%.
2. Masukkan ke dalam pewarna aldehid fuschin
selama 20 menit.
3. Bilas sediaan dengan larutan ethanol 70%.
4. Bilas dengan cepat dengan air mengalir/air
keran.
5. Masukkan ke dalam pewarna alcian blue (pH
3,5) selama 30 menit.
6. Bilas dengan air mengalir/air keran selama 20
menit.
7. Keringkan dengan ethanol dan bersihkan
dengan xylene.
8. Tutup dengan cover glass.
f. Perlakuan terhadap hewan coba setelah dibedah
Tikus yang telah diambil organ yang akan diteliti
dipastikan mati, bangkai tikus diletakkan dalam wadah
baskom. Bangkai tikus percobaan dikubur di tanah dengan
kedalaman minimal 50 cm dan luas lubang 0,25 m2. Setiap
38
lubang hanya digunakan untuk mengubur 10 tikus secara
bersama, hal ini untuk mencegah bangkai tikus digali oleh
hewan lain seperti kucing. Lubang ditutup kembal dengan
tanah lalu lubang dipadatkan agar tidak tercium bau dari
bangkai tikus tersebut (Sylvestris et al, 2012 dalam Rusda,
2016).
4.7.6 Pengamatan hasil
Sediaan diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran
400x. Hasil pengamatan akan diperoleh rerata jumlah sel endokrin pada
pulau Langerhans pada tikus kelompok I (kontrol positif), II, III dan IV
39
4.8 Alur Penelitian
Tabel 4.2 Alur Penelitian
Pengamatan dengan mikroskop
Rerata jumlah sel β pankreas
Hasil penelitian
Analisis data
Pengumpulan 24 ekor tikus putih (Rattus novregicus) jantan strain wistar
Kelompok IV 5 ekor tikus
Kelompok III 5 ekor tikus
Kelompok II 5 ekor tikus
Kelompok I 5 ekor tikus
Adaptasi tikus baik pakan maupun lingkungan (hari ke 1-7)
Injeksi Aloksan dengan dosis 160 mg/KgBB/hari pada hari ke-8
Kelompok I
(kontrol
positif) Pemberian
pakan BR-1 + dan minuman aquadest tanpa
pemberian ekstrak kulit kayu manis
(Cinnamomum
burmannii) setiap hari
selama 14 hari (hari 12-25)
Kelompok IV Pemberian
pakan BR-1 + ekstrak kulit kayu manis
(Cinnamomum
burmannii) dosis
400mg/kgBB 1 kali sehari per
sonde dan minuman
aquadest setiap hari selama 14 hari (hari 12-
25)
Kelompok III Pemberian
pakan BR-1 + ekstrak kulit kayu manis
(Cinnamomum
burmannii) dosis
200mg/kgBB 1 kali sehari per
sonde dan minuman
aquadest setiap hari selama 14
hari (hari 12-25)
Kelompok II Pemberian
pakan BR-1 + ekstrak kulit kayu manis
(Cinnamomum
burmannii) dosis
100mg/kgBB 1 kali sehari per
sonde dan minuman
aquadest setiap hari selama 14
hari (hari 12-25)
Setiap tikus dianestesi dengan kloroform secara inhalasi pada hari ke-26
Cek glukosa darah (hari ke-11)
40
4.9 Metode Analisis Data
Data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan uji
normalitas, uji homogenitas, uji ANOVA, uji tukey, uji korelasi, dan uji
regresi yang pengolahannya menggunakan SPSS 23.
a. Uji normalitas bertujuan untuk mengetahui sebaran data normal atau
tidak dengan menggunakan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang
digunakan ≤ 50. Sebaran data dikatakan normal apabila p > 0,05.
Apabila sebaran data tidak normal, maka dilakukan transformasi data
terlebih dahulu. Apabila hasil transformasi data normal, dilanjutkan
dengan uji One Way Anova dan uji Post-Hoc Bonferroni. Apabila
sebaran data tetap tidak normal, maka menggunakan uji Kruskal-
Wallis dan uji Post-Hoc Mann-Whitney.
b. Uji homogenitas bertujuan untuk mengetahui varian atau
kehomogenan data yang diperoleh dengan menggunakan uji Levene
Test. Data dikatakan homogen apabila p > 0,05.
c. Uji One Way Anova digunakan untuk membuktikan adanya perbedaan
yang bermakna antara kontrol dengan perlakuan. Apabila sebaran data
normal dan data homogen, maka dilanjutkan dengan uji One Way
Anova. Apabila diperoleh sebaran data tidak normal dan data tidak
homogen, maka dilanjutkan dengan uji non parametrik yaitu uji
Kruskal-Wallis.
d. Uji Post-Hoc dilakukan untuk mengetahui dosis minimal ekstrak kulit
kayu manis yang memberikan efek di antara dosis yang digunakan. Uji
Post-Hoc Bonferroni digunakan apabila varian data homogen dan sama
41
sedangkan Post-Hoc Games-Howell atau Tamhane digunakan apabila
varian data tidak homogen.
e. Uji regresi linier untuk mengetahui seberapa kuat hubungan yang
diperoleh dari analisa korelasi, untuk mengetahui seberapa kuat
pengaruh dosis ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum burmannii)
terhadap rerata jumlah sel β pankreas dan untuk memprediksi pengaruh
ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum burmannii) terhadap rerata
jumlah sel sel β pankreas.