Til SFR Klinisk mikrobiologi N. Frimodt-Møller & J.M. Bangsborg 060218

1

Baggrund

Forebyggelse af tidlig (early onset, EO) invasiv infektion med hæmolytiske streptokokker

gruppe B (GBS) hos nyfødte med intrapartum antibiotika (AB) følger en af to algoritmer

(Centers for Disease Control and Prevention, 2010) (Guideline fra Dansk Selskab for

obstetrik og gynækologi, 2012). Værdien af begge algoritmer har vist sig i nedbringelse i

forekomsten af EO GBS sygdom i de lande, som anvender disse.

I begge algoritmer vil man altid give intrapartum AB profylakse, hvis den gravide tidligere

har født et barn med invasiv GBS infektion.

1. Screeningsbaseret tilgang med podning af den gravide i uge 35-37 (ideelt fra både

vagina og rectum) og dyrkning for GBS. Intrapartum AB profylakse gives ved

fødslen, hvis bærertilstand er påvist. Hverken et positivt eller et negativt

screeningsresultat i uge 35-37 kan dog sikkert forudsige bærertilstand på

fødselstidspunktet. Udover til gravide med påvist bærertilstand benyttes også

intrapartum AB til visse risikofødsler efter denne algoritme.

2. Risikobaseret tilgang, hvor a) præmatur fødsel (før uge 37), b) langvarig

vandafgang (> 18 timer) eller c) feber hos den gravide ved fødslen udløser

intrapartum AB, i Danmark penicillin i.v. hver 4. time, så længe fødslen foregår.

Udover tilstedeværelse af risikofaktorer vil man altid give intrapartum AB, hvis der i

graviditeten har været bakteriuri med GBS.

Ved algoritme 2 vil en del gravide, der ikke er GBS bærere, få intrapartum AB profylakse,

der ikke er nødvendig, dvs. i relation til specifikt at forebygge GBS sygdom hos barnet.

Med traditionelle dyrkningsmetoder, som med anbefalet opformering tager 2-3 døgn, har

man ikke tidligere haft mulighed for at udpege de fødende kvinder, som ikke er bærere af

GBS. Nyere hurtigmetoder baseret på PCR med svartid inden for få timer har imidlertid

muliggjort, at GBS bærertilstand kan undersøges med svarafgivelse, der er relevant inden

for tidsforløbet af en risikofødsel. På Århus Universitetshospital, Skejby Sygehus, har man

afprøvet GeneXpert (Cepheid) analysen til påvisning af GBS (Helmig and Gertsen, 2017).

Resultaterne har vist, at indførelse af intrapartum screening for GBS med GeneXpert

kunne have sparet intrapartum AB profylakse hos 67 % (49/73) af fødende kvinder med

langvarig vandafgang, og et ikke nærmere defineret antal indlæggelsesdage, da nyfødte,

også uden tilstedeværelse af symptomer, holdes under observation i mindst 48 timer, hvis

der er givet intrapartum AB profylakse (Yde et al., 2015). I Skejby undersøgelsen fandt

man i en kohorte på 106 fødende en sensitivitet af GeneXpert analysen på 100 %

sammenholdt med dyrkning for GBS (i alt 25 dyrkningspositive blev også påvist med

PCR). Til dyrkning som guld standard anvendtes direkte udsåning på særlige

chromagarplader uden opformering, en metode der er tilnærmelsesvis lige så følsom som

dyrkningsmetoder med opformering (El Aila et al., 2010). Screeningsmetoden med

GeneXpert vurderes nu i et større studie på Skejby Sygehus (Gertsen JB, personlig

meddelelse). På Vejle KMA er en anden kommercielt tilgængelig PCR metode (BD Max,

Til SFR Klinisk mikrobiologi N. Frimodt-Møller & J.M. Bangsborg 060218

2

Becton-Dickinson) undersøgt til screeningsformål på Sygehus Lillebælt i Kolding med en

lavere sensitivitet (83 %) end GeneXpert (Khalil et al., 2017).

Forudsætninger

Sensitiviteten af kommercielt tilgængelige PCR metoder til påvisning af GBS er meget

svingende, afhængigt af producent, anvendt dyrkningsmetode som guld standard (medier

± opformering), podningslokalisation (vagina ± rektum) (Poncelet-Jasserand et al., 2013).

GeneXpert metoden er formentlig den bedst fungerende test, med en analysetid på lidt

under en time og en sensitivitet på 91-96 (100?) % (Gavino and Wang, 2007)(Plainvert et

al., 2017). Det er imidlertid velbeskrevet, at pålideligheden af resultaterne (sensitivitet og

specificitet) er stærkt afhængig af det personale, der håndterer prøvebehandling og

besvarelse. De bedste resultater opnås med uddannede bioanalytikere i KMA (Helmig and

Gertsen, 2017), dårligere ”bed-side” med fødeafdelingens personale (El Helali et al., 2012)

(Håkansson et al., 2014) (Plainvert et al., 2017).

I Region H er der service 24/7 på undersøgelse af mikrobiologiske hasteprøver. Denne

service omfatter spinalvæsker, bloddyrkninger, malariaundersøgelse, vævsprøver fra

nekrotiserende infektioner, men ikke PCR analyser med undtagelse af screening for VRE,

MRSA, C. difficile og influenza/RSV, som er mulig i tidsrummet kl 08-20. I det ønskede

screeningsopsæt for GBS forventes service 24/7 med en svartid inden for 4 timer.

Reagensprisen for hver test er 420 kr. Der skal anvendes særligt prøvetagningssæt til

kombineret vaginal og rektal podning (Cepheid Sample Collection Device, pris ukendt).

GeneXpert udstyr er tilgængeligt på alle regionens tre KMAer, med størst kapacitet på

KMA Herlev. Hvis 24/7 bioanalytiker service skal tilbydes, kræver det en omlægning af den

nuværende regionale vagtordning, som ikke vil være omkostningsneutral. Den ønskede

service mht GBS screening kan derfor ikke etableres inden for de eksisterende rammer.

Forudsat tilgængeligt udstyr og personale, muliggør de geografiske afstande i regionen

dog besvarelse inden for 4 timer efter prøvetagning ved prøvetransport med taxa, så i

tidsrummet (ankomst af prøven) kl 08 – 20 er undersøgelsen mulig på to af regionens tre

KMAer.

Imidlertid kan man ikke udelukke, at intrapartum AB profylakse givet alene pga

tilstedeværelse af risikofaktorer, også ved negativt GBS fund, kunne tænkes at forebygge

udvikling af infektion hos det nyfødte barn med anden ætiologi (hæmolytiske streptokokker

gruppe A, pneumokokker, Listeria). Denne bekymring kan kun undersøges nærmere med

et randomiseret studie med et stort antal fødsler og er måske ikke realistisk. Litteraturen

giver belæg for større diversitet i relation til intrapartum infektioner (Doyle et al.,

2017)(Rodriguez et al., 2015)

Vi anbefaler, at man afventer resultater af det igangværende studie fra Skejby. Når disse

foreligger, vil en medicinsk teknologivurdering være mulig.

Et tiltag som det beskrevne bør også vurderes i SFR for Gynækologi og Obstetrik i

RegionH.

Til SFR Klinisk mikrobiologi N. Frimodt-Møller & J.M. Bangsborg 060218

3

Referencer

El Aila NA, Tency I, Claeys G, Saerens B, Cools P, Verstraelen H, et al. Comparison of different sampling techniques and of different culture methods for detection of group B streptococcus carriage in pregnant women. BMC Infect Dis 2010;10. doi:10.1186/1471-2334-10-285.

Centers for Disease Control and Prevention. Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease. Mmwr 2010;59:1–32. doi:10.1097/01.EDE.0000032431.83648.8D.

Doyle RM, Harris K, Kamiza S, Harjunmaa U, Ashorn U, Nkhoma M, et al. Bacterial communities found in placental tissues are associated with severe chorioamnionitis and adverse birth outcomes. PLoS One 2017;12:1–23. doi:10.1371/journal.pone.0180167.

Gavino M, Wang E. A comparison of a new rapid real-time polymerase chain reaction system to traditional culture in determining group B streptococcus colonization. Am J Obstet Gynecol 2007;197:1–4. doi:10.1016/j.ajog.2007.06.016.

El Helali N, Giovangrandi Y, Guyot K, Chevet K, Gutmann L, Durand-Zaleski I. Cost and effectiveness of intrapartum group B streptococcus polymerase chain reaction screening for term deliveries. Obstet Gynecol 2012;119:822–9. doi:10.1097/AOG.0b013e31824b1461.

Helmig RB, Gertsen JB. Diagnostic accuracy of polymerase chain reaction for intrapartum detection of group B streptococcus colonization. Acta Obstet Gynecol Scand 2017;96:1070–4. doi:10.1111/aogs.13169.

Håkansson S, Källén K, Bullarbo M, Holmgren PÅ, Bremme K, Larsson Å, et al. Real-time PCR-assay in the delivery suite for determination of group B streptococcal colonization in a setting with risk-based antibiotic prophylaxis. J Matern Neonatal Med 2014;27:328–32. doi:10.3109/14767058.2013.818128.

Khalil MR, Uldbjerg N, Thorsen PB, Henriksen B, Møller JK. Risk-based screening combined with a PCR-based test for group B streptococci diminishes the use of antibiotics in laboring women. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2017;215:188–92. doi:10.1016/j.ejogrb.2017.06.019.

Plainvert C, El Alaoui F, Tazi A, Joubrel C, Anselem O, Ballon M, et al. Intrapartum group B Streptococcus screening in the labor ward by Xpert® GBS real-time PCR. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2017:1–6. doi:10.1007/s10096-017-3125-2.

Poncelet-Jasserand E, Forges F, Varlet MN, Chauleur C, Seffert P, Siani C, et al. Reduction of the use of antimicrobial drugs following the rapid detection of Streptococcus agalactiae in the vagina at delivery by real-time PCR assay. BJOG An Int J Obstet Gynaecol 2013;120:1098–108. doi:10.1111/1471-0528.12138.

Rodriguez BF, Mascaraque LR, Fraile LR, Perez IC, Kuder K. Streptococcus pneumoniae: The forgotten microorganism in neonatal sepsis. Fetal Pediatr Pathol 2015;34:202–5. doi:10.3109/15513815.2015.1033073.

Yde S, Helmig R, Pryds O, Brink T. Forebyggelse af tidligt indsættende neonatal GBS sygdom. Dansk Pædiatrisk Selsk 2015:4–8.

Gruppe B streptokok-syndrom. Fælles obstetrisk instruks, RM*Udgiver Fælles specialespecifikke dokumenter

Fagligt ansvarlig Rikke Bek Helmig/RIKHEL/RegionMidtjylland Version 12

Kvalitetsansvarlig Charlotte Egholm Lyngsø/CHALYN/RegionMidtjylland Gældende fra 03-02-2017

Ledelsesansvarlig Ole Bredahl Rasmussen/OLRASM/RegionMidtjylland Næste revision 02-02-2020

Ændringskommentar Teknisk *-markeret: tilføjelse af vejledning omkring GBS undersøgelse på AUH (PCR test).

Lokal tilføjelse for Aarhus Universitetshospital > Kvindesygdomme og Fødsler

Følgende kvinder fra gruppe 3 (igangværende fødsel) undersøges for GBS med intrapartum PCR test

1. Ved vandafgang ≥14 timer efter uge 37+0

2. Ved gestationsalder 35+1 - 36+6 (ved ankomst, uanset om der er vandafgang eller ej)

Se vejledning til prøvetagning fra Klinisk Mikrobiologi: 1.3. GBS-PCR: Hæmolytiske streptokokker gruppe B.

Ved positiv test for GBS opstartes antibiotikaprofylakse, straks svaret foreligger.

Hvis svaret på testen ikke foreligger efter 18 timers vandafgang eller ved "invalid test", opstartes antibiotika i henhold til instruks.

Ved positiv testsvar efter fødsel af barnet anbefales, at mor og barn indlægges til observation i 24 timer.

Ved negativ test har kvinden mulighed for ambulant fødsel, hvis forholdene i øvrigt berettiger til dette.

IndholdsfortegnelseFormålPatientgruppe/patientforløb/anden målgruppeDefinition af begreberFremgangsmådeDokumentationAnsvarReferencer

FormålRegional instruks vedrørende håndtering af gravide med Gruppe-B Streptokok Syndrom (GBS) i graviditeten

Patientgruppe/patientforløb/anden målgruppe

Gravide med GBS-syndrom eller i risikogruppe for GBS infektion.

Definition af begreber Diagnose kode DO235A.

10-20 % af alle gravide kvinder er koloniseret med gruppe-B streptokokker (GBS) anogenitalt. Hos nogle af disse giver GBS anledning til alvorlige neonatale infektioner såsom pneumoni, sepsis eller meningitis.Mere end 90 % af ”early onset sygdom” hos børnene, og næsten 100% af de fatale tilfælde optræder mindre end 24 timer efter fødsel (median 1 time).Langt over halvdelen af børn med ”early onset sygdom” debuterer med respiratoriske problemer og herefter klinisk sepsis, 10 % med meningitis.Børn med gestationsalder <35 uger har RR = 10-15 for GBS sygdom i forhold til børn med højere gestationsalder.Samme gælder langvarig PROM.

Disse tre grupper behandles som GBS syndrom

1. Tidligere graviditet

1. Barn med alvorlig klinisk infektion (sepsis/meningitis/ pneumoni og andet) også hvor GBS ikke er isoleret.2. Abort i 2.trimester eller foetus mortuus, hvor GBS mistænkes som ætiologisk agens.3. Præterm fødsel med mulig GBS ætiologi (f.eks. GBS i vaginalpodning).

2. Aktuelle graviditet

1. GBS-uri på hvilket som helst tidspunkt i denne graviditet. (Se Urinvejsinfektion hos gravide. Fælles obstetrisk instruks,RM).2. Tilfældigt fund af GBS i vagina i 3. trimester (normalt er ikke indikation for podninger ved f.eks. plukkeveer og screening af symptomfrie praktiseres ikke i Danmark)

3. Igangværende fødsel

1. Tp ≥38,0°C.Rektalt (38,2°C ved samtidig epidural blokade i fødslen, se Feber under fødslen. Fælles obstetrisk instruks, RM).2. Vandafgang >18 timer (se PPROM. Fælles obstetrisk instruks, RM og PROM. Fælles obstetrisk instruks, RM).3. GA <37+0 uge..

Fremgangsmåde

Behandling under graviditeten

Konservativ behandling. Dvs. hverken podning eller antibiotikaprofylakse.

Behandling under fødslen

G-penicillin 5 mill IE efterfulgt af 2 mill IE hver 4. time.

Behandlingen seponeres umiddelbart efter fødslen.

Ved penicillinallergi anvendesCefuroxim 1½ g i.v. hver 8. time.

Ved tidligere type 1 anafylaktisk reaktion imod penicillin anvendesClindamycin 900 mg i.v. hver 8. time.

Behandling ved sectio

Akut sectio håndteres som vaginal fødsel.

Elektivt sectio indicerer sædvanligvis ikke antibiotika ud over den vanlige antibiotikaprofylakse.

Overvågning efter fødslen

Gruppe B streptokok-syndrom. Fælles..., version 12.Udskrevet: 11-05-2017 af Anonymous 1 af 2

1. Ved klinisk infektion af barnet gøres diagnostik og behandling ved pædiater (bloddyrkning, CRP, L+D, Hgb, trombocytter, BS. Lumbalpunktur efter skøn. Røntgen af thorax efter skøn, Antibiotika).

2. Ved adækvat intrapartum antibiotikaprofylakse = 1. dosis antibiotika >4 timer før føddsel, gestationsalder >37+0 og ingen klinisk mistanke om infektion af barnet, da kan udskrivelse tilobservation i hjemmet overvejes efter 24 timer.Det kræver, at forældrene fuldt forstår instruktioneerne for observation i hjemmet.Observation er primært af respirationsbesvær (hurtig eller uregelmæssig vejrtrækning) og sløvhed (fravær af spiselyst, dier kortvarigt/falder hen ved brystet).

3. Hvis ovenstående kriterier ikke er opfyldt, indlægges barnet til observation på hospital > 48 timer.

4. Hvis der ikke er tegn på klinisk infektion af barnet, 1. dosis antibiotika er givet <4 timer før fødsel, gestationsalderen >37+0, og der har været vandafgang <18 timer observeres barnet påhospital > 48 timer. Hvis kliniske tegn på infektion opstår, da diagnostik og behandling af barnet som under punkt 1.

5. Hvis der ikke er tegn på klinisk infektion af barnet, 1. dosis antibiotika er givet <4 timer før fødsel, gestationsalderen <37+0 eller vandafgang >18 timer, indlægges barnet til observation påhospital > 48 timer. Der måles CRP x 1 i tidsrummet 18-24 timer post partum.

CRP 35-50 mg/l: klinisk vurdering ved pædiater. Overvej antibiotika og/eller gentagelse af CRP efter 6-12 timer.

CRP >50 mg/l tyder på bakteriel infektion.

Hvis kliniske tegn på infektion opstår, da diagnostik og behandling som under punkt 1

Dokumentation

EPJ.

Ansvar

Gynækologisk/obstetriske afdelinger, region Midt

(26 feb, 2005, RBH, justeret 02-01-07 ved Niels Uldbjerg, Richard Farlie, Tine Brink Henriksen)

4. januar 2007: Godkendt til implementering pr 1. februar 2007Oktober 2011: rev. i forhold til antibiotika behandling. Nov 2013 revision. Marts 2015 revision.

Referencer

Dansk Pædiatrisk Selskab (2015). Forebyggelse af tidligt indsættende GBS syndrom. Retningslinje DPS

Dansk Selskab for Obstetrik og Gynækologi (2012). Retningslinie. DSOG GBS.pdf

Gruppe B streptokok-syndrom. Fælles..., version 12.Udskrevet: 11-05-2017 af Anonymous 2 af 2

Kære Nini.

Vi indførte GBS intrapartum screening test i februar måned 2017.

Vi har indført testen for to grupper af de kvinder, som ellers rutinemæssigt har fået

antibiotika i hht GBS-instruks.

1. Ved vandafgang ≥14 timer efter uge 37+0

(Vi valgte 14 timer, da vi ikke ønsker at pode med det samme, da nogle føder hurtigt

og bar kan gå hjem. Det er et valgt vi har gjort, som muligvis ændres, når vi er mere

fortrolige med testen)

2. Ved gestationsalder 35+1 - 36+6 (ved ankomst, uanset om der er vandafgang eller

ej)

(Børnelægerne er trygge ved ikke at give antibiotika ved præterm fødsel i disse

gestationsaldre, hvis GBS testen er negativ og mater iøvrigt er afebril)

(se vedhæftede instruks GBS Streptokok-syndrom)

Vi bruger ikke GenomEra maskinen.

Vi har valgt et PCR kit fra GeneXpert, som tidligere er brugt og valideret på flere

franske fødesteder og i Sverige.

Vi har i egen afdeling gennemført et valideringstudie af GeneXpert PCR-testen og

arbejdet er netop er publiseret i ACTA.

Vi har valgt ikke, at have en maskine stående på fødegangen til test, men istedet at

sende vores podninger til Klinisk Mikrobiologisk afd, som har GeneXpert test

maskiner stående. De bruger dem bla til Clostridium og Staphylococcus us, og er vant

til det.

Grunden til, at vi har valgt denne metode er

1) at et er muligt fordi KMA har valgt GBS-testen som vagtarbejde, dvs den kan laves

24 timer i døgnet

2) at der i flere studier er vist, at selvom testen er beregnet til bedside, så er der færre

"invalid"-test, hvis den udføres af trænet personale og

3) vi får vores svar registreret direkte i vores Elekrtoniske patientjournal, så de ikke

forsvinder, eller bliver overset.

I valideringsstudiet havde vi valideret PCR-testen imod optimeret dyrkning a la det,

der anbefales i seneste CDC-retningslinie om GBS sygdom.

Vi havde ca 24% positive for GBS (podet i vagina+rektum), hvilket var ca hvad vi

havde forventet.

Vi havde disse resultater for Sensitivitet: 100% [86,28%-100%] og Specificitet:

97,5% [91,26%-99,70%].

Vi fik svaret på testen indenfor få timer.

Jeg har lavet en foreløbig opgørelse over, hvor mange der kunne undgå at få

antibiotika, i de første 34 dage med testen.

Vi podede 64, heraf var 12 positive. Af de 64 podede, kunne 40 undgå antibiotika

(=62%). Så vi har en rigtig god fornemmelse af denne test.

Jeg har vedhæftet vores instruks.

Vi kan snakke videre når vi ses.

Kærlig hilsen Rikke

Acta Obstet Gynecol Scand. 2017 Sep;96(9):1070-1074. doi: 10.1111/aogs.13169. Epub 2017 Jun 22.

Diagnostic accuracy of polymerase chain reaction for intrapartum detection of group B streptococcus colonization.

Helmig RB1, Gertsen JB2.

Author information Abstract

INTRODUCTION:

Many pregnant women are treated with antibiotics during labor to prevent transmission of group B

streptococcus (GBS, Streptococcus agalactiae) to their baby during passage of the birth canal, and so

reduce the risk of serious infection of the newborn. Methods for intrapartum testing for GBS have been

introduced to select women to whom intrapartum antibiotic prophylaxis should be offered. For such an

intrapartum test to be useful in clinical practice, it has to be specific as well as sensitive. The aim of the

present study is to evaluate the accuracy of the polymerase chain reaction (PCR) assay compared with

an optimized culture method for GBS.

MATERIAL AND METHODS:

In the period from 12 May 2015 to 18 December 2015 we collected rectovaginal swabs from 106

women in the labor ward presenting in labor between gestational week 35+0 and 36+6 or presenting with

prelabor/preterm prelabor rupture of membranes (PROM/PPROM) for > 14 h after gestational week

34+0 . We performed GBS culture (reference standard) and a molecular GBS test (Xpert GBS, Cepheid

Ltd., Sunnyvale, CA, USA).

RESULTS:

Based on intrapartum culture, 23.6% (25/106) were colonized with GBS. Intrapartum PCR showed a

colonization rate of 25.7% (27/105). The sensitivity of the test was 100% (86.28-100%). The specificity

of the test was 97.5% (91.26-99.70%). The positive predictive value was 92.6%. In one case, we had

no result with PCR testing, giving an invalid test rate of < 1%.

CONCLUSION:

The PCR test has sufficient accuracy to direct intrapartum antibiotic prophylaxis for GBS transmission

during delivery.

© 2017 Nordic Federation of Societies of Obstetrics and Gynecology.

Utvärdering av Xpert® GBS med GeneXpert® för diagnostisering av GBS hos kvinnor i förlossningsskedet

HUVUDOMRÅDE: Biomedicinsk laboratorievetenskap

FÖRFATTARE: Simone Johansson och Elin Kvist

HANDLEDARE: Maysae Quttineh

EXAMINATOR: Emma Carlsson

JÖNKÖPING 2017 Juni

Sammanfattning Grupp B Streptococcus (GBS) koloniserar ofta tarmen hos människor. Prevalensen för bärarskap av GBS i Sverige är mellan 10-30 %. Risk finns för överföring till barnet som kan drabbas av neonatala infektioner som neonatal sepsis om modern är koloniserad vid partus. Idag är Golden standard odling, vilket tar tre dygn och metoden kan inte användas som intrapartal screening utan antibiotika sätts in i förebyggande syfte utan vetskap om kvinnans koloniseringsstatus. Xpert® GBS är en snabbare analys jämfört med odling. Xpert® GBS innehåller reagens för en direkt detektion av mål GBS-DNA inom en timma. Syftet med studien var att utvärdera om Xpert® GBS realtids PCR-analys är tillräckligt känslig för att användas som intrapartal screening i förlossningsskedet jämfört med golden standard. Studien omfattade 13 kvinnor som skrevs in på förlossningen. Prov togs både vaginalt och rektalt på deltagarna. Resultatet av Xpert® GBS sensitivitets- och specificitettest var 100 % respektive 95 %. Resultaten tyder på att Xpert® GBS är likvärdig med golden standard. Xpert® GBS kan fungera som intrapartal screening och ett snabbare resultat kan erhållas med förhoppning om minskad antibiotikaanvändning. Nyckelord: Grupp B Streptococcus, Xpert® GBS, Golden standard, Gravida kvinnor, Neonatal sepsis

Abstract Group B Streptococcus (GBS) is a common colonizer of the intestine of humans. The prevalence of GBS colonization in Sweden is between 10-30%. There is a risk of mother-child transmission and the child may develope neonatal GBS sepsis if the mother is colonized. Today, Golden standard is culture, which yield is time consuming and cannot be used for intrapartum screening. Intrapartal antibiotica is administrated without knowing colonization status of the women. The Xpert® GBS is a rapid assay that includes reagens for the simultaneous detection of the target GBS DNA within one hour. The aim of the study was to evaluate Xpert® GBS realtime PCR assay is sufficiently sensitive to be used for intrapartum screening in the delivery when compared to the golden standard. The study included 13 women and enrolled to the obstetric for labor. Samples were taken vaginally and rectally on all participants. The results of the sensitivity- and specificity of Xpert® GBS are 100 % and 95 % respectively. These results indicate that Xpert® GBS is equivalent to golden standard. The Xpert® GBS could act as a intrapartal screening and results can be obtained more rapid with the hope of reducing preventive antibiotica use.

Keywords: Group B Streptococcus, Xpert® GBS, Golden standard, Pregnant women, Neonatal sepsis

Innehållsförteckning

1 Bakgrund ........................................................................................... 1

1.1 Grupp B Streptococcus ................................................................................................................. 1 1.1.1 Neonatal sepsis orsakad av Grupp B Streptococcus ........................................................... 1

1.1.2 GBS i urin hos kvinnor under graviditet .............................................................................. 2

1.1.3 Prevalens av GBS hos kvinnor .............................................................................................. 2

1.1.4 GBS guidelines i USA, Europa och Sverige.......................................................................... 2

1.2 Diagnostik ...................................................................................................................................... 3 1.2.1 Golden Standard ................................................................................................................... 3

1.2.2 Polymeras Chain Reaction och Real-tids Polymeras Chain Reaction ................................ 4

1.3 Behandling ..................................................................................................................................... 5 1.3.1 Antibiotikaresistens .............................................................................................................. 5

1.3.2 Intrapartalt antibiotikaprofylax (IAP) ................................................................................. 5

2 Syfte .................................................................................................. 6

6 Material och metod ................................................................................. 7

3.1 Studiepopulation ........................................................................................................................... 7 3.2 Studiematerial ............................................................................................................................... 7 3.3 Utrustning och mätmetodik ......................................................................................................... 7 3.4 Analytisk sensitivitet ..................................................................................................................... 7

3.4.1 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar till odling.................... 7

3.4.2 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar för Xpert® GBS .......... 8

3.5 Analys av patientprover med Xpert® GBS och odling samt konfirmation med Maldi Biotyper® ................................................................................................................................................... 8

3.5.1 Vidare analys vid Error 2008 i Xpert® GBS ........................................................................ 9

3.6 Statistisk analys av patientprover................................................................................................. 9 3.7 Etiska överväganden ................................................................................................................... 10

4 Resultat ............................................................................................ 11

4.1 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar för odling och Xpert® GBS 11 4.2 Analys av patientprover med Xpert® GBS samt odling ............................................................ 13 4.3 Sensitivitet och specificitet för Xpert® GBS gentemot odling vid analys av GBS .................... 13

5 Diskussion ....................................................................................... 14

5.1 Resultatdiskussion ...................................................................................................................... 14 5.1.1 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar för odling och Xpert® GBS 14

5.1.2 Analys av patientprover med Xpert® GBS samt med odling ............................................ 15

5.2 Metoddiskussion ......................................................................................................................... 16 5.2.1 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar för odling och Xpert® GBS 16

5.2.2 Analys av patientprover med Xpert® GBS samt med odling ............................................ 16

5.3 Slutsatser ..................................................................................................................................... 17

6 Omnämnande .................................................................................. 17

7 Referenser ....................................................................................... 18

1

1 Bakgrund

Grupp B Streptococcus (GBS) är vanligaste orsaken till livshotande neonatala infektioner så som sepsis, pneumoni och meningit hos nyfödda (1). Grupp B Streptococcus förekommer som human normalflora i tarmen och prevalensen av bärarskap hos gravida kvinnor i rektum och/eller vagina är 10 - 30 % i Sverige (1, 2, 3, 4). Etnicitet och socioekonomiska förhållanden bidrar till variationer i prevalensen (1). Om gravida kvinnor vid partus är koloniserad med GBS vaginalt, riskerar barnen att bli smittad vid partus eller förvärva GBS under de tre första levnadsmånaderna. En kolonisering i rektum smittar inte barnen, däremot kan en kolonisering i rektum överföras till vagina (3, 4). En frågeställning är om kvinnor kan vara kolonisera i vagina men inte i rektum. Problematiken idag är att golden standard för GBS är odling som tar upp till tre dygn innan analyssvaret kan svaras ut. En ny metod måste vara likvärdig eller bättre än odling samt vara tillräckligt känslig för att sjukvårdspersonalen ska kunna avstå från att ge antibiotika vid ett negativt resultat. Undersökning av bärarskap görs vanligtvis inte i Sverige eftersom alla gravida kvinnor anses vara potentiella bärare av bakterien. Alla kvinnor som uppfyller någon utav riskerna för GBS enligt riktlinjerna från Socialstyrelsen för intrapartalt antibiotikaprofylax (IAP) behandlas (2, 3). I Sverige har en tidigare populationsbaserad kohortstudie gjorts om påverkan och riskfaktorer för tidigt debuterande GBS (5). Däremot har inte Xpert® GBS med GeneXpert® utvärderats som metod för GBS i Sverige. Xpert® GBS skulle kunna förenkla det laborativa arbetet och minska svarstiderna. Eftersom antibiotikaresistens är ett ökande problem i samhället vill förlossningspersonal vid Länssjukhuset Ryhov minska antibiotika i förebyggande syfte. Ett snabbt resultat skulle kunna bidra till minskad antibiotikaanvändning, om insättning av antibiotika kan vänta tills det säkerställts att kvinnan är koloniserad med GBS (6).

1.1 Grupp B Streptococcus Grupp B streptococcus (GBS), även kallad Streptococcus agalactiae, är en betahemolytisk fakulativt grampositiv diplokock. Bakterien är enda arten som har grupp B-antigen och tillhör Lancefield grupp B (7, 8). Länge förmodades att bakterien endast orsakade infektioner hos djur, till exempel mastit hos kor. Senare visade det sig att det även kunde orsaka allvarliga infektioner hos nyfödda barn vid partus (2, 4). GBS kan även orsaka infektioner hos icke gravida och drabbar oftast hud och mjukdelar, ofta associerat med diabetes och trycksår (2, 3).

1.1.1 Neonatal sepsis orsakad av Grupp B Streptococcus Grupp B Streptococcus (GBS) överförs till barnen genom vertikal transmission av bakterien under partus om gravida kvinnor är koloniserade. Nyfödda kan bli smittade med GBS när de passerar förlossningskanalen genom att barnet utsätts för bakterien. Barnet blir koloniserad på slemhinnan i magen och/eller luftvägarna (9). I de flesta fall utvecklas neonatal sepsis när barnet får ner fostervatten, innehållande GBS, i lungorna i samband med partus. Barnet utvecklar först en pneumoni, sedan sprids bakterierna via sköra kapillärer i lungorna ut i blodet och en sepsis uppkommer (9, 10). Barnet insjuknar under de första levnadsdygnen (11). Kejsarsnitt förhindrar inte att GBS överförs till det nyfödda barnet om mamman är koloniserad vid partus, eftersom GBS

2

kan passera intakta fostermembran. Överföringsrisken hos fullgångna spädbarn är låg och sällan drabbas barnet av en tidig debuterande GBS infektion (9). Tidig GBS-infektion kan ge sepsis, pneumoni eller meningit hos barnet (2). Vanligast är sepsis som drabbar 1 av 2000 barn (10, 12). Symtom som uppträder är feber, andningssvårigheter och ett nedsatt allmäntillstånd. Neonatal sepsis delas in i tidigt och sent debuterande. Tidigt debuterande sepsis orsakas av en vertikal transmission av bakterien från modern till barnet och sker oftast i förlossningsskedet. GBS är vanligaste etiologiska orsaken till tidigt debuterande sepsis. Sent debuterande sepsis uppkommer mellan en vecka upp till tre månader efter partus och orsakas av en vertikal transmission av bakterier från omgivningen och är förknippad med lång sjukhusvistelse. Vanligtvis drabbas prematura barnen som blir inlagda på neonatalavdelningen (2, 11). GBS är särskilt farligt för prematura barn eftersom de inte hunnit få några antikroppar av modern och blir extra utsatta (6). En obehandlad GBS infektion kan ge permanenta neurologiska skador hos spädbarnet, som utvecklingsstörning, förlust eller nedsatt hörsel och syn. Trots behandling kan spädbarnen få bestående skador av infektionen (2). Andel nyfödda som dör till följd av en GBS infektion varierar mellan 4-20%. Högre andelen representerar prematura barn (11, 13).

1.1.2 GBS i urin hos kvinnor under graviditet GBS hittas i urinen hos 2-7 % av alla gravida kvinnor. GBS bakterieuri hos gravida kvinnor är en markör för hög kolonisation genitalt. Infektionen kan vara asymtomatisk, men kan även visas som diffus urinvägsinfektion och diagnostiseras med en urinodling under graviditeten (2, 9). Även om kvinnan får antibiotika vid GBS i urinen under graviditeten, försvinner inte GBS gastrointestinalt eller genitalt utan risk för en återkolonisering kan ske efter avslutad antibiotikabehandling (9).

1.1.3 Prevalens av GBS hos kvinnor I europeiska länder varierar prevalensen av GBS kolonisation hos gravida kvinnor mellan 6,5 till 36 % (14). I Storbritannien är 14-30% av kvinnorna koloniserade med GBS gastrointestinalt och/eller genitalt (15). Etniciteten och geografisk variation påverkar andelen kvinnor som är koloniserade med GBS. Regionala variationer i kolonisation är: Östeuropa 19,7- 29,3%, Västeuropa 11-21%, Skandinavien 24,3-36% och Sydeuropa 6,5–32%. Antal barn som drabbas av GBS-relaterade infektioner i europeiska länder varierar mellan 0,40–2,0 per 1000 levande födda. Europeiska länder uppvisar liknande resultat som finns rapporterade i andra industriella länder till exempel USA, Canada och Nya Zealand (14). I Sverige är prevalensen av bärarskap av GBS hos gravida kvinnor cirka 30 % och 1 av 2000 barn drabbas (1, 10, 12). I USA drabbades 7500 nyfödda per år av neonatal GBS infektion innan ett aktivt förebyggande av infektion inleddes. Idag är 10-30% av alla gravida kvinnor i USA koloniserade med GBS i rektum och/eller vagina och 1-2% av de nyfödda koloniseras och får en tidig debuterande sepsis (9, 14).

1.1.4 GBS guidelines i USA, Europa och Sverige I syfte att minska GBS sepsis hos nyfödda barn har olika riktlinjer införts i olika länder runt om i världen. Sedan riktlinjer för GBS infördes har GBS sepsis minskat i samtliga länder oberoende av vilka riktlinjer som införts (5, 9, 14).

3

1.1.4.1 USA I USA görs screening för GBS och vid negativt resultat fem veckor innan partus, ges inget IAP. GBS minskade på 1990-talet efter sammarbetsinsatser mellan olika vård-och forskningsgrupper och rekommendationer för intrapartal profylax infördes för att förebygga GBS infektion. År 2002 infördes screening av gravida kvinnor i USA, vilket minskade fall av neonatal GBS infektion ytterligare (7, 9). Främsta riskfaktorerna för kolonisering av GBS i USA är etnicitet, högt Body Mass Index (BMI) och vårdpersonal. För att förebygga GBS används IAP, som har visat sig vara ett kostnadseffektivt alternativ (16).

1.1.4.2 Europa Kvinnor i Storbritannien som uppfyller någon utav riskfaktorerna får antibiotika utan att undersökas för GBS kolonisation. Metoden skiljer sig från USA och andra europeiska länder där de screenar prenatalt för GBS under slutet av graviditeten och får antibiotika vid positivt resultat (15). I Frankrike utförs en prenatal screening av gravida kvinnor i vecka 35-37 för att undersöka om de är koloniserade och därmed behöver få IAP vid partus. Golden standard för att identifiera GBS är odling, metoden är inte anpassad för intrapartal screening (16). Nyfödda prematura barn har större risk att drabbas av GBS infektion således ges alltid IAP till mödrarna, utan vetskap om kolonisering status (6). En risk med riktlinjen är att kvinnor kan förvärva bakterien från tiden för screening fram till partus (1, 11, 16).

1.1.4.3 Sverige Sverige har till skillnad från många andra länder ingen screening utan har en risk-baserad profylax strategi för GBS hos gravida kvinnor. Vid fynd av GBS under graviditeten kommer antibiotikaprofylax att ges vid partus för att förhindra att barnet koloniseras. Antibiotikaprofylaxet ges intrapartalt och ska helst ges fyra timmar innan partus för att ge effektivt skydd åt barnet (9). Viktiga faktorer som avgör kostnadseffektiviteten av profylax är förekomsten av GBS infektioner och effektiviteten av den förebyggande behandlingen. Ett lämpligt GBS profylax är kostnadseffektivt om incidensen är 0,65 per 1000 levande födda eller högre samt skyddar mot neonatal sepsis och pneumoni. Nuvarande svenska riktlinjer för att förhindra neonatal GBS infektion kommer från socialstyrelsen och innefattar följande riskfaktorer: fynd av GBS i urin under graviditeten, feber under partus, längre än 18 timmars vattenavgång, tidigare barn med GBS och prematura barn födda tidigare än vecka 37. Eftersom det inte görs någon screening för GBS förekomst hos gravida kvinnor, ges IAP i förebyggande syfte till kvinnor med någon av riskfaktorerna (5).

1.2 Diagnostik

1.2.1 Golden Standard Golden standard för GBS idag är odling (3). Innan odling görs en anrikning i Todd-Hewitt (TH) buljong innehållande Gentamicin och Nalixinsyra (1, 17). TH-buljongen används för att selektera bort annan normalflora som Stafylococcous spp och Enterobacteriacea spp som även kan kolonisera genitalt (17). Det negativa med odling är att det tar 24-48 timmar innan bakterien växt på agarplattan och bakterien kan typas och erhålla ett resultat (3, 18). För att kunna typa GBS används agglutinationstest för att undersöka Lancefield tillhörighet (1). Alternativet till agglutinationstest är Matrix Assisted Laser Desorption/ionization time of flight masspectrometry (Maldi-Tof MS) (19). Maldi-Tof MS innebär att peptider kommer att omvandlas till joner

4

genom antingen en förlust eller tillskott av protoner. Jonbildningen påverkar inte provet avsevärt mycket. Provet för analys framställs genom en provblandning av en lösning med energiabsorberande organisk lösning, kallad matrix. Matrixen kristalliserar runt provet och provet joniseras med en laserstråle. Jonerna accelerera och detekteras för att sedan mätas med olika mass-analysatorer, till exempel time of flight (Tof) som vanligtvis används vid bakterietypning. Vid Tof mäts jonen genom att bestämma den tid det tar för jonen att färdas genom röret. Kända peptidmassfingeravtryck (PMF) finns för olika organismer. PMF jämförs med en databas för att artbestämma bakterien (19).

1.2.2 Polymeras Chain Reaction och Real-tids Polymeras Chain Reaction

Polymerase chain reaction (PCR)-tekniken utvecklades under 1980-talet av kemisten Kary Mullis (20). PCR metoden baseras på förmågan hos DNA:t att utföra självreplikation med hjälp av enzymet polymeras. För att självreplikationen ska fungera behövs en primer eftersom DNA-polymeras endast kan lägga till en nukleotid på en redan befintlig 3’OH-grupp (20). Provet upphettas till 96 grader tills denaturering sker och det dubbelsträngade DNA:t delas upp och bli två enkelsträngade DNA. Därefter sänks temperaturen och annealing sker där primrarna binder in till målsekvensen. Temperaturen höjs igen och extension sker. Extensionen är en DNA-syntes som gör att polymeraset syntetiserar en kopia av templatet genom att lägga till nukelotider till ändarna av primern och syntetiserar en komplementär DNA sträng till målgenen. Efter de tre stegen börjar reaktionen om igen för att öka mängden DNA. Cykeln upprepas 40-50 gånger, varvid den specifika regionen på DNA:t till sist kommer att amplifieras upp till miljarder kopior (3). En begränsning med PCR är att amplifieringen av målsekvensen till en början är exponentiell. På grund av inhibering i polymerasreaktionen i provet kommer PCR reaktionen tillslut att sluta amplifiera målsekvensen och det uppstår en ”platåeffekt”. ”Platåeffekten” bidrar till att den slutliga kvantifieringen av PCR-produkten inte är tillförlitlig. På grund av begränsningen hos PCR har Real-tids PCR utvecklats (20). Instrumentet GeneXpert® är ett realtids-PCR instrument som är utvecklad efter PCR-metoden (20). Systemet använder sig av kassetter med en automatiserad och integrerad lysering av bakterier samt rening av DNA och real-tids PCR av en specifik målgen. Målgenen i GBS genomet är cfb genen. GBS detekteras med kassetten Xpert® GBS och målgenen i kassetten är cfb genen (1, 7, 21, 22). I metoden tillsätts en hydrolysprobe, även kallad TaqMan-probe, märkt med en quencher i 3´ ändarna och en reporter i 5´ändarna. Vid anealingen binder TaqMan-proben in till målgenen och polymeraset klyver proben och quenchern och reportern skiljs åt. När quenchern inte längre absorberar reporterns energi kan flourescensens detekteras i GeneXpert®. När flourescensen mäts tyder det på att specifika DNA-produkten har bildats. DNA-produkten genererar en amplifieringskurva där cykeltröskelvärde (Ct-värde) är den cykel där den exponentiella fasen har börjat. Ett lågt Ct-värde innebär att det finns en större mängd DNA i provet, medan ett högt Ct-värde indikerar på en mindre mängd DNA i provet. Real-tids PCR har hög känslighet, är snabb och kan kvantitativt bedöma mängden specifikt DNA som finns i provet (3, 21, 23).

5

1.3 Behandling

1.3.1 Antibiotikaresistens Antibiotikaresistens blir allt vanligare och det finns restriktioner för när och hur antibiotika bör användas. Även för IAP, för att förhindra GBS infektion hos nyfödda, finns en ökad oro för utvecklingen av resistens (9). Vissa GBS isolat har ett ökat minsta hämmande koncentrationsvärde (MIC-värde) mot penicillin samt ampicillin. Klindamycin och erytromycin var länge ett alternativ för behandling av GBS. Idag är klindamycin och erytromycin inte rekommenderade utan att ett känslighetstest görs innan användning eftersom resistensen har ökat de senaste åren (11, 13).

1.3.2 Intrapartalt antibiotikaprofylax (IAP) När antibiotikaprofylax ges till GBS koloniserade kvinnor minskar risken för en neonatal GBS sepsis. Långvarig antibiotikabehandling påverkar dock normalfloran negativt och kan istället öka risken för neonatala gramnegativa infektioner hos barnen, till exempel Escherichia coli samt Pseudomonas spp (12). Länder som har infört IAP till modern under partus har visat sig ha lägre frekvens av tidig debuterande GBS sepsis, jämfört med länder som inte ger IAP (24). Doseringen av penicillin och ampicillin som används som intrapartalt GBS profylax har till syfte att uppnå tillräckliga nivåer i fostrets cirkulation och fostervatten snabbt. Samtidigt ska potentiella neurotoxiska serumnivåer hos modern eller fostret undvikas. IAP bör ges fyra timmar före partus för att förebygga vertikal transmission av GBS och förhindra tidig debut av GBS sepsis (9). GBS är känslig för penicillin, ampicillin och cefalosporiner, ibland kan även penicillin och ampicillin behöva kombineras (3). Klindamycin och erytromycin har en begränsad bakteriedödande verkningsgrad i fostrets cirkulation och fostervatten eftersom de inte når fostervävnaden (9). I dagens laboratorieverksamhet används odling för att diagnostisera GBS hos gravida kvinnor. Problematiken med metoden är att kolonisering genitalt kan ske fram till partus och odling kan inte användas som intrapartal screening eftersom svarstiden är tre dygn. Om kvinnan uppfyller någon utav Socialstyrelsens risker ges IAP i förebyggande syfte, utan vetskap om kvinnan är koloniserad eller inte. All antibiotika-användning leder till en ökad antibiotikaresistens i samhället. Xpert® GBS bidrar till en snabbare analys och minskar arbetsbelastningen i det laborativa arbetet. En snabbare diagnostik ger ett snabbare resultat som skulle kunna bidra till minskad antibiotikaanvändning i samband med partus.

6

2 Syfte

Syftet med studien var att utvärdera om Xpert® GBS realtids PCR-analys är tillräckligt känslig för att användas som intrapartal screening i förlossningsskedet jämfört med golden standard.

7

6 Material och metod

3.1 Studiepopulation Studien avsåg att inkludera 100 konsekutiva kvinnor som skrevs in på förlossningsavdelningen vid Länssjukhuset Ryhov, Region Jönköping. Kvinnorna lämnade medgivande till deltagandet. Kriterierna för deltagandet var: inte använt olja och smörjningsmedel i de genitala regionerna de senaste två dagarna, ingen antibiotikaanvändning de senaste fyra veckorna samt inga akuta inskrivningar till förlossningen. Under den avsatta tiden för studien lyckades endast 13 kvinnor falla inom avsatta kriterier, samtliga lämnade medgivande till deltagandet.

3.2 Studiematerial De vaginala och rektala proverna togs separat med särskilda provtagningspinnar, Cepheid collection device (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). Cepheid collection device är en dubbelpinne som placerades i ett konserveringsmedium. Pinnen hade en markering för avbrytning cirka 5 centimeter från bomullstoppsen. Två provtagningspinnar togs från alla inkluderade kvinnor. Ena paret togs vaginalt och andra paret rektalt. Pinnar i samma transportrör avlägsnades från korken och roterades runt varandra för att homogenisera provet. Ena pinnen analyserades i kassetten Xpert® GBS, den andra pinnen med odling. Det vill säga, en pinne rektalt och en pinne vaginalt till Xpert® GBS respektive odling.

3.3 Utrustning och mätmetodik

Proverna analyserades med GeneXpert® GBS (Cepheid, Sunnyvale, CA) i kassetten Xpert® GBS (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) enligt tillverkarens rekommendationer. Företaget bibehåller rättigheter att inte uppge innehåll i Xpert® GBS. Vid växt av bakterier på GBS-plattan typades bakterien med Maldi-Tof MS metod med Bruker Maldi Biotyper® (Bruker, Billerica Massachusetts, CA, USA).

3.4 Analytisk sensitivitet Den analytiska sensitiviteten (minsta detekterbara nivån) undersöktes med hjälp av spädningsserier.

3.4.1 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar till odling

Seriespädning av referensstam Grupp B Streptococcus CCUG 4208 från 0,5 McFarlandstandard ((1,5 x 108 colony forming unit/milliliter (CFU/ml)) tillreddes. Tiopotensspädning tillreddes från 1,5 x 108 CFU/ml till 1,5 x 101 CFU/ml. Trettio µl 0,5 McFarlandstandard späddes med 270 µl natriumklorid, total volym 300 µl. Från varje suspension med koncentrationerna 1,5 x 106 CFU/ml till 1,5 x 101 CFU/ml pipetterades 100 µl spädning till TH-buljong med antibiotika, innehållande Todd Hewitt Broth 6 g (Beef Heart Infusion from solids 3,1 g/l, Peptone 20,0 g/l, Dextrose 2,0 g/l, Sodium chloride 2,0 g/l, di-sodium phosphate 0,4 g/l, sodium carbonate 2,5 g/l), avjoniserat vatten 200 ml samt Gentamicin 0,16 mg och Nalidixinsyra 0,30 mg, Länssjukhuset Ryhov Jönköping, Sverige. Resterande ursprungsmängd av respektive suspension absorberades upp med hjälp av en bomullspinne som placerades i TH-buljong. TH-buljongerna inkuberades i 35oC i 20 timmar. Därefter pipetterades 100 µl av respektive buljong på en selektiv GBS-platta (CHROMagar strep B, agar, peptones and yeast

8

extract, salt, chromogenmix, avjoniseratvatten, CHROMagar strep B supplement 1, CHROMagar strep B supplement, Länssjukhuset Ryhov Jönköping, Sverige), och odlades ut med racklingsmetod med hjälp av 10 µl platinös. Plattorna inkuberades i 35oC, i 20 timmar. Plattorna avlästes visuellt genom att bakterietillväxten studerades. Bakterieväxten bedömdes visuellt som växt eller inte växt. Vid växt av GBS framträdde rosa/ljuslila kolonier. Dubbelprov av seriespädning från fem positiva patientstammar för GBS utfördes med samma tillvägagångssätt som med referensstam CCUG 4208. Enbart pinne i buljong användes och endast spädningarna 1,5 x 103 CFU/ml till 1,5 x 101 CFU/ml användes till TH-buljongerna. Hundra µl av suspension i rören pipetterades bort innan bomullspinnarna placerades i rören och fick absorbera upp vätskan. Pinnarna placerades i en TH-buljong innehållande antibiotika. Resterande steg skedde med samma tillvägagångssätt som med referensstam CCUG 4208.

3.4.2 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar för Xpert® GBS

Referensstam CCUG 4208 seriespäddes från 1,5 x 108 - 101 CFU/ml. Hundra µl från spädningarna 1,5 x 102 CFU/ml, 1,5 x 103 CFU/ml och 1,5 x 105 CFU/ml pipetterades till två olika rör för respektive spädning. En Copan-pinne placerades i respektive rör och vätskan absorberades. Pinnarna från samma spädningskoncentration roterades runt varandra för att erhålla ett homogent prov. Ena pinnen placerades i TH-buljong innehållande antibiotika och den andra pinnen placerades i kassetten Xpert® GBS. Xpert® GBS placerades i GeneXpert® och analyserades. Analysen tog upp till 52 minuter. TH-buljongen inkuberades i 35oC i 20 timmar och odlades ut på GBS-platta med racklingsmetod och inkuberades i samma miljö och tid. Patientstammarna hanterades som referensstam CCUG 4208, förutom att spädningen 1,5 x 104 CFU/ml analyserades först i Xpert® GBS och odlades ut. Vid positivt resultat (Ct-värde <42) i Xpert® GBS vid 1,5 x 104 CFU/ml analyserades spädningen 1,5 x 103 CFU/ml och vid negativt resultat (Ct-värde 0 eller >42) analyserades istället spädningen 1,5 x 105 CFU/ml. Dessutom pipetterades 10µl av referensstam CCUG 4208 och patiensstam 1 av spädningen 1,5 x 105 CFU/ml på varsin GBS-platta som odlades ut med racklingsmetod. Plattorna inkuberades i 35oC i 20 timmar.

3.5 Analys av patientprover med Xpert® GBS och odling samt konfirmation med Maldi Biotyper®

Konsultremisser med personnummer och providentitet skannades in i IT-systemet C5 LIMS med tillhörande märkta patientprov. Provtagning skedde rektalt och vaginalt med provtagningspinnarna Cepheid collection device på varje deltagande kvinna av förlossningspersonalen. Handskar användes i alla följande steg gällande hantering av Xpert® GBS. De vaginala provtagningspinnarna avlägsnades från korken och roterades runt varandra för att få ett homogent prov. Pinnarna vidrördes inte nedanför brytningsmärket. Samma process utfördes med de rektala provpinnarna. Provpinnar med rikligt synligt sekret torkades försiktigt av på ett papper. Ena pinnen från varje par, från vaginalt och rektalt prov, placerades i varsin Xpert® GBS för analys. Resultat erhölls negativt eller som positivt med ett Ct-värde. Andra pinnen från varje par placerades i TH-buljong och inkuberades i 35oC i 20 timmar. Pinnen odlades från TH-buljongen på en GBS platta som inkuberades i 35oC i 20 timmar och avlästes visuellt.

9

Visuell avläsning bedömdes som växt eller inte växt. Vid ingen växt eller endast få små kolonier reinkuberades plattan i 35oC i 20 timmar. Vid växt typades bakteriekolonin från GBS plattan med Maldi Biotyper®. Med hjälp av en tandpetare togs en mindre bakteriekoloni upp och roterades på en separat brunn på Maldi Biotyper®-plattan. En µl matrix lösning pipetterades till varje brunn och metallplattan fick torka i rumstemperatur. Plattan placerades i Maldi Biotyper® och analyserades. Resultat avlästes utifrån score där den mest möjliga bakterien angavs. Score <1,7 innebar ett icke tillförlitligt resultat, medan score >1,7 ansågs vara godkända.

3.5.1 Vidare analys vid Error 2008 i Xpert® GBS Vid erhållna error 2008 för patientproverna vid analys med Xpert® GBS togs en CLASSIQSwabs™ (Copan, Italien) och placerades i original transportmediet Cepheid collection device och roterades mot botten. Pinnen placerades i Xpert® GBS och analyserades i GeneXpert®.

3.6 Statistisk analys av patientprover Den analytiska sensitiviteten och specificiteten för patientproverna räknades ut enligt tabell I. Sensitiviteten räknades ut med formeln: a/(a+c) och specificiteten räknades ut med formeln: d/(b+d).

Tabell I. Uträkningsmall för sensitiviteten och specificiteten för Xpert® GBS i förhållande till odling. De sanna positiva samt falska negativa utfallen och de falska positiva respektive de sanna negativa utfallen ställs emot varandra.

Positiv odling Negativ odling Summa

Positivt Xpert®

GBS

sant positiv (a) falskt positiv (b) alla positiva testresultat (a +

b)

Negativt Xpert®

GBS

falsk negativ (c) sant negativ (d) alla negativa testresultat (c +

d)

Summa a + c b + d a + b + c + d

10

3.7 Etiska överväganden

Eftersom prover togs på gravida kvinnor och proverna egentligen inte skulle tagits, har en etikprövning godkänts av Etiknämnden i Linköping, diarienummer: 2017/186-31. Prover togs på gravida kvinnor som lämnat sitt medgivande till studien. Samtycke lämnades på särskild blankett till förlossningspersonalen. Provtagningen orsakade inget obehag och det förelåg ingen risk för skada. Kvinnorna underrättades varken vid positivt eller negativt resultat, eftersom Xpert® GBS i dagsläget inte var tillräckligt utvärderad för att kunna svara ut ett resultat. I dagsläget kunde inga etiska problem identifieras.

11

4 Resultat

4.1 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar för odling och Xpert® GBS

Odlingar av referensstammen CCUG 4208 med spädningar från 1,5 x 106 CFU/ml till 1,5 x 102 CFU/ml från 100 µl TH-buljong samt pinne från TH-buljong gav växt på GBS-plattorna (tabell II). Odling på GBS-platta från spädning 1,5 x 101 CFU/ml gav ingen växt, vare sig från TH-buljong eller pinne från TH-buljong. Patientstam 1 gav växt vid koncentrationerna 1,5 x 103 CFU/ml – 1,5 x 101 CFU/ml vid TH-buljong och pinne från TH-buljong, se tabell II.

Tabell II. Odlingsresultat för referensstam CCUG 4208 och patientstam 1 odlat med 100µl TH-buljong respektive pinne från TH-buljong vid seriespädning 1,5 x 106 CFU/ml – 1,5 x 101

CFU/ml för jämförelse mellan TH-buljong och pinne. Resultaten bedömdes som växt (+) och ingen växt (-).

Koncentration Referensstam CCUG 4208 Patientstam 1

CFU/ml TH-Buljong Pinne TH-Buljong Pinne

1,5x106 + +

1,5x105 + +

1,5x104 + +

1,5x103 + + + +

1,5x102 + + + +

1,5x101 - - + +

Resultat för odling vid de tre lägsta koncentrationerna (1,5 x 103 CFU/ml – 1,5 x 101 CFU/ml) med enbart pinne från TH-buljong för alla fem patientstammar med dubbelprov ses i tabell III. Endast patientstam 5 kunde detekteras vid koncentrationen 1,5 x 101 CFU/ml. Vid koncentrationen 1,5 x 102 CFU/ml kunde ena eller båda dubbelproverna detekteras, förutom för patientstam 2, där ingen utav dubbelproverna detekteras. Vid koncentrationen 1,5 x 103 CFU/ml kunde alla patientstammar detekteras, förutom ett dubbelprov för patientstam 2.

12

Tabell III. Odlingsresultat från dubbelprov med pinne från TH-buljong av patientstammarna 1-5 med koncentrationerna 1,5 x 103 - 1,5 x 101 CFU/ml. Växt (+) och ingen växt (-).

Koncentration (CFU/ml) 1,5 x 103 1,5 x 102 1,5 x101

Patientstam 1 + + -

Patientstam 1 + + -

Patientstam 2 - - -

Patientstam 2 + - -

Patientstam 3 + + -

Patientstam 3 + - -

Patientstam 4 + + -

Patientstam 4 + - -

Patientstam 5 + + +

Patientstam 5 + + +

Jämförelse mellan odling och Ct-värden från Xpert® GBS vid koncentrationerna 1,5 x 105 CFU/ml – 1,5 x 102 CFU/ml för referensstam CCUG 4208 och patientstam 1-5 ses i tabell IV. Alla prover som analyserades med Xpert® GBS vid koncentrationerna 1,5 x 105 CFU/ml och 1,5 x 104 CFU/ml erhöll Ct-värden. Ct-värdena låg mellan 34,5 – 43,1. Det enda provet som erhållit ett Ct-värde vid koncentrationen 1,5 x 103 CFU/ml var patientstam 5 med Ct-värde 39,4. Den lägsta koncentrationen som var detekterbar var 1,5 x 103 CFU/ml. Resultaten från tabell IV visar att koncentrationen 1,5 x 104 CFU/ml var den lägsta gemensamma detektionsgränsen för Xpert® GBS. Odlingen gav växt vid alla koncentrationer förutom för patientstam 2 vid koncentrationen 1,5 x 105 CFU/ml och patientstam 4 vid koncentrationerna 1,5 x 104 CFU/ml och 103 CFU/ml. Patientstam 1 analyserades i Xpert® GBS en första omgång vid koncentrationen 1,5 x 105 CFU/ml och endast 10µl pipetterades från spädningsröret och odlades ut direkt på GBS-platta utan inkubering i TH-buljong. Odlingen gav växt och Ct-värdet 37,3 erhölls.

Tabell IV. Resultat av odling och erhållna Ct-värden från analys med Xpert® GBS vid koncentrationerna 1,5 x 105 – 1,5 x 102 CFU/ml för referensstam CCUG 4208 och patientstammar 1-5. Växt (+) och ingen växt (-).

Koncentration (CFU/ml) 1,5 x 105 1,5 x 104 1,5 x 103 1,5 x 102

Odling Ct-värde Odling Ct-värde Odling Ct-värde Odling Ct-värde

Referensstam Patientstam 1

+ +

36,9 36,1

+

43,1*

0

0

Patientstam 2 - 34,5 + 42,7*

Patientstam 3 + 41,1 + 0

Patientstam 4 - 39 - 0

Patientstam 5 + 36,8 + 39,4

*Proverna utföll negativa i Xpert® GBS, dock erhölls Ct-värde.

13

4.2 Analys av patientprover med Xpert® GBS samt odling

Av 26 analyserade patientprover, från 13 patienter, för GBS med Xpert® GBS var totalt sex prover positiva i rektum och/eller vagina hos fem av patienterna. Tre patienter utföll positiva i endast rektum och en patient utföll positiv i endast vagina. En patient erhöll positivt resultat i rektum och vagina. Patientproverna erhöll Ct-värden mellan 0 - 40,6. Error-värdet 2008 erhölls för Xpert® GBS hos sex patientprover (23 %), varav fem vaginala prover och ett rektalt prov. Efter omkörning utföll två vaginala prover positiva med Ct-värde 40,2 respektive 38,0. De resterande tre vaginala proverna samt det rektala prover utföll negativa. Totalt utföll fem av 26 patientprover positiva vaginalt och/eller rektalt i odlingen hos fyra patienter. Två patienter utföll positiva endast rektalt och en patient positiv endast vaginalt. En patient utföll positiv rektalt och vaginalt. Resterande prover utföll negativa. De fem positiva resultaten i odlingen kunde verifieras som GBS med Maldi Biotyper®. Samtliga GBS-plattor hade riklig växt av andra bakterier i 25 utav 26 fall, även på de fem som hade växt av GBS. I ett fall fanns ingen bakterieväxt på GBS-plattan. Samtliga patientprover överensstämde för GBS i odling och Xpert® GBS förutom patientprov 13. Patientprov 13 utföll negativ i odlingen vaginalt och rektalt, men Xpert® GBS detekterade GBS med Ct-värdet 40,6 rektalt. Jämförelse mellan positiva odlingar och Xpert® GBS Ct-värden ses i tabell V. Tabell V. Positiva utfall av GBS i vagina och/eller rektum med växt (+) och inte växt (-) i odling samt jämförelse med erhållna Ct-värden från Xpert® GBS.

Patient Odling Xpert® GBS

Vagina Rektum Vagina Rektum

3 - + 0 28,8

6 + - 40,2* 0

10 - + 0 29,1

12 + + 38,0* 33,1

13 - - 0 40,6 *Proverna har vid en första analys i Xpert® GBS erhållit error 2008, vid omkörning har dessa blivit

positiva med erhållet Ct-värde.

I studien utföll prevalensen för GBS positiva patienter i Xpert® GBS till 38 % (5 av 13), innefattat GBS-positivt i rektum och/eller vagina. Prevalensen för endast bärarskap i rektum med Xpert® GBS utföll till 23 % (3 av 13), medan prevalensen för bärarskap i endast vagina utföll till 8 % (1 av 13) i studien. Total prevalensen för GBS positiva patienter med odling utföll till 31 % (4 av 13). Prevalensen för endast bärarskap i rektum med odling utföll till 15 % (2 av 13) och bärarskap i endast vagina utföll till 8 % (1 av 13). Prevalensen för bärarskap i vagina samt rektum utföll till 8 % (1 av 13) oberoende metod.

4.3 Sensitivitet och specificitet för Xpert® GBS gentemot odling vid analys av GBS

Sensitiviteten och specificiteten räknades ut med hjälp av tabell I med formlerna: a/(a+c) för sensitiviteten och d/(b+d) för specificiteten. Sensitiviteten utföll till 100 % och specificiteten för Xpert® GBS utföll till 95 %.

14

5 Diskussion

Syftet med studien var att utvärdera om Xpert® GBS realtids PCR-analys är tillräckligt känslig för att användas som intrapartal screening i förlossningsskedet jämfört med golden standard. Utifrån resultaten från den analytiska sensitiviteten är Xpert® GBS och odling likvärdiga metoder i syfte att detektera tillräckligt kliniskt låga koncentrationer av GBS. Resultaten från patientproverna visar att GBS kan finnas i vagina utan att finnas i rektum samt tvärtom. Prevalensen för bärarskap i studien utföll till 38 %.

5.1 Resultatdiskussion

5.1.1 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar för odling och Xpert® GBS

Resultatet från tabell II visade att pinne och suspension i buljong är likvärdiga metoder för odling på GBS-plattan. På grund av likvärdigheten i studien användes endast pinne vid fortsatt detektionsnivåundersökning, eftersom det är likt provtagningspinnen, Cepheid collection device som används vid patientprovtagning.

Odling av referensstammen CCUG 4208 med olika koncentrationer visade växt till koncentrationen 1,5 x 102 CFU/ml. I och med resultatet valdes att endast analysera koncentrationerna 1,5 x 103-101 CFU/ml för att undersöka lägsta detektionsnivån för patientstammarna. Koncentrationen 1,5 x 101 CFU/ml gick bara att detektera i patientstam 5. En av fem stammar är för få för att kunna dra slutsatsen att bakterien är detekterbar vid koncentrationen 1,5 x 101 CFU/ml. Koncentrationen 1,5 x 102

CFU/ml är en osäker detektionsnivå eftersom resultaten varierar från prov till prov och även i vissa fall mellan dubbelproverna. Tänkbar anledning kan vara spädningsfel, att koncentrationen är för låg för att kunna detektera bakterien i vissa prover alternativt att bakterien saknas. Resultaten visar att koncentrationen 1,5 x 103 CFU/ml är den lägsta detekterbara nivån för odlingen.

Vid analys av Xpert® GBS för referensstammen CCUG 4208 vid koncentrationerna 1,5 x 103 CFU/ml och 1,5 x 102 CFU/ml undersöktes för att se om det gick att detektera vid de låga koncentrationerna, inga resultat erhölls. På grund av det analyserades koncentrationen 1,5 x 105 CFU/ml och ett positivt resultat erhölls. Koncentrationen 1,5 x 105 CFU/ml analyserades för patientstam 1 för att undersöka om koncentrationen var detekterbar även på patientstammen. Ett positivt resultat erhölls. I referensstam CCUG 4208 och patientstam 1 växte det i odlingarna vilket visar att det inte är någon skillnad mellan odling och Xpert® GBS vid koncentrationen 1,5 x 105 CFU/ml. Utifrån resultatet valdes att undersöka om det gick att detektera patientstammarna vid 1,5 x 104 CFU/ml. Vid positivt resultat undersöktes koncentrationen 1,5 x 103 CFU/ml, vid negativt undersöktes istället koncentrationen 1,5 x 105 CFU/ml för att hitta den lägsta detekterbara koncentrationen för Xpert® GBS och kunna jämföra med odling. Tabell IV visar att resultaten kan skilja sig vid samma koncentration. Troliga anledningar till att olika resultat erhållits vid samma koncentrationer är att det föreligger en viss variation inom arten. Vissa GBS-bakterier är mer känsliga för natriumklorid som användes vid spädningen vilket kan bidragit till resultatvariationen. Dessutom är spädningarnas koncentrationer är nära detektionsgränsen, vilket också kan bidragit till resultatvariationen. Vid alla typer av spädningar kan spädningsfel uppkomma, dock

15

är suspensionerna till odlingen och Xpert® GBS tagna ur samma spädningsrör. Om ett spädningsfel föreligger borde det påverkat båda metoderna.

Enligt GeneXpert® för kassetten Xpert® GBS är den lägsta nivån för positiv kontroll 620 CFU/swab som motsvarar Ct-värde 36 för GBS. Den negativa kontrollen är 17000 CFU/swab av Lactobacillus acidophilus som motsvarar Ct-värde 0 eller >42 (22). Två patientstammar har växt i odlingen men blivit negativa i Xpert® GBS dock har Ct-värden >42 erhållits, vilket ger det negativa resultatet.

5.1.2 Analys av patientprover med Xpert® GBS samt med odling Patientprov 6 har endast GBS i vagina, eftersom GBS vanligtvis återfinns i rektum och sedan koloniserar vagina är resultatet av intresse. Antingen tyder det på att GBS kan återfinnas i endast vagina utan att behöva återfinnas i rektum, eller är provet feltaget. Det går inte säkerhetsställa att rätt etikett är placerad på rätt prov, och provet kan ha varit det rektalt tagna provet. Däremot har tidigare studie visat att prevalens för bärarskap av GBS i endast vagina i Europa varierar mellan 6,5–36 % bland de koloniserade, vilket gör det möjligt att koloniseringen endast i vagina kan vara ett sant resultat (15).

Patientprov 13 erhöll positivt resultat rektalt vid Xpert® GBS, dock återfanns ingen GBS i odlingen. Ct-värdet 40,6 tyder på en låg kolonisation. Låg kolonisation i kombination med riklig växt av annan bakterieart på GBS-plattan, som inte selekterats bort i TH-buljongen, gör det svårt att identifiera GBS. En tidigare studie har uppvisat samma problematik med att annan växt tar över på plattan och hindrar isoleringen av GBS (7). Reinkubation av GBS-plattan ytterligare ett dygn hade kunnat bidrag till tillväxt av eventuella GBS kolonierna. Dock innebär reinkubation ytterligare ett dygns svarstid, jämfört med Xpert® GBS som erhöll ett resultat inom 52 minuter. Utfallet återfinns dock endast hos ett patientprov, vilket kan ha varit slumpmässigt. Med dagens rutindiagnostik golden standard hade dock patientprovet misstagits för att vara negativt.

I Sverige är prevalensen av bärarskap av GBS i vagina och/eller rektum omkring 10-30 % (1, 2, 3, 4). Studiens prevalens utföll till 38 % vilket ligger lite högre än prevalensen i Sverige. Studien utfördes vid Länssjukhuset Ryhov, region Jönköpings län med endast 13 stycken deltagande kvinnor i studiegruppen. Vid en större studiepopulation samt deltagande från fler regioner hade ett mer tillförlitligt resultat kunnat erhållas och resultatet hade kunnat generaliseras på populationen. Studien avsåg att inkludera 100 kvinnor, således pågår studien fortfarande och fler prover samlas in.

Lägsta sensitivitetsnivån som laboratoriemedicin vid Länssjukhuset Ryhov ville uppvisa för Xpert® GBS var 80 - 85%. I och med att odlingen är Golden standard är det bevisat att metoden har hög sensitivitet och specificitet för GBS. Däremot visar även Xpert® GBS hög sensitivitet på 100 % och specificitet på 95 %. Sensitivitets – och specificitetresultaten tyder på att det fungerar att använda Xpert® GBS som rutindiagnostik, dock är det viktigt med vetskap om att en liten provmängd analyserats. Tidigare studier visar sensitivitet på 86,7-90,9 % och specificitet 95,6-98,4 % (7, 17). Sensitiviteten i studien ligger högre än vad tidigare studierna har visat och specificiteten ligger i högre delen av intervallet jämfört med tidigare studier. Dock har en mindre studiepopulation deltagit vid studien. Vid en större studiepopulation hade

16

troligtvis en annan sensitivitet och specificitet erhållits, likt tidigare studier. Således skulle Xpert® GBS vara användningsbar som rutindiagnostik för GBS.

5.2 Metoddiskussion

5.2.1 Seriespädning av referensstam CCUG 4208 och patientstammar för odling och Xpert® GBS

Eftersom det är kliniskt viktigt att hitta GBS i urin ner till koncentrationen 1,5 x 104

CFU/ml, är Xpert® GBS tillräckligt känslig som metod. Koncentrationen 1,5 x 104

CFU/ml används som ”cut off”-värde eftersom det inte verkar finnas signifikans att rapportera lägre koncentrationer (25). Hög kolonisation ställer till besvär vid förlossningen därför är det kliniskt viktigast att kunna detektera högre koncentrationer av GBS, vilket Xpert® GBS och odlingen kan göra.

5.2.2 Analys av patientprover med Xpert® GBS samt med odling

Eftersom GBS-statusen kan ändras under graviditeten är det viktigt med en snabb diagnostik som kan utnyttjas vid förlossningsskedet. Andra studier har visat att kvinnor som inte varit koloniserade vaginalt av GBS fram till vecka 35-37, ändå kunde vara koloniserade under förlossningen. På grund av det gavs inget IAP till kvinnorna, vilket medförde risk för överföring till barnen vid partus (1). Prevalensen för ändrad kolonisationsstatus har undersökts i olika studier och är omkring 10 %. Av de kvinnor som fött barn vilka drabbats av tidigt debuterande GBS sepsis, uppskattas 60 % varit negativa vid prenatal screening och sedan varit positiva vid förlossningen (11, 16). Det är av vikt att ha en snabbare metod för att vid partus kunna avgöra om kvinnan är koloniserad eller inte, om kvinnan uppvisar några av riskfaktorerna.

Återkommande error-värde i studien var error 2008 som uppkom sex gånger (23 %). I tidigare utförda studier har 0 - 6% error uppvisats (7, 17). Problemet är att error-värden inte uppvisar något resultat. Patientprover som erhållit error-värden i Xpert® GBS analyserades om. Error-värdena i studien är procentuellt fler än vad tidigare studier uppvisat på grund av den minimala provmängden. Flera tänkbara faktorer kan föreligga varför error-värden uppkommer. Vid error 2008 är viskositeten för hög i provmaterialet för att kunna analyseras i Xpert® GBS och maxtrycket överstigs. När det inträffar slumpmässigt är det ofta på grund av hög viskositet i provet (26). Även om provtagningspinnen försiktigt torkats av, kan rikligt med sekret finnas kvar i pinnen vilket stör analysen. I och med att original provtagningspinnarna hade förbrukats, valdes att placera en likvärdig provtagningspinne i original transportmediet för att analyseras i Xpert® GBS. Om provtagningen kommer användas inom förlossningsvården kommer prov endast tas vaginalt. Eftersom provtagningspinnen Cepheid collection device innehåller två pinnar kommer en av pinnarna med provmaterial finnas kvar om error-värden uppkommer på Xpert® GBS vid första analysen. Om error-värden uppstår medföljer en merkostnad eftersom provet måste analyseras om och en ny Xpert® GBS kassett används. Problematiken är att fem av sex error-värden uppkom i vaginala prover. Eftersom proverna kommer tas vaginalt bör få error-värden uppvisas för att slippa analysera om provet alternativt ta nytt prov. Uppkomsten av error-värden förväntas dock inte bli stor om metoden införs som rutindiagnostik om provtagningen och provhanteringen sker enligt

17

rekommendationer samt vetskapen om faktorer som bidrar till error-värden. En ekonomisk vinning finns inte i att analysera rektalt och vaginalt prov på varje patient eftersom GBS normalt kan finnas i tarmen (3, 4).

Xpert® GBS har utvärderats i andra studier, däremot skiljer sig tillvägagångssättet. En studie har analyserat på fostervatten och en annan har tagit ett rektalt och ett vaginalt prov, dock med provtagningspinnen Copan Venturi Transystem collection device (Copan innovation, Corona, CA, USA) (7, 17). En möjlig fördel med Cepheid collection device är att den innehåller två provtagningspinnar. Ett dubbelprov erhålls utan två provtagningar och möjliggör en andra analys vid behov. Provtagning med Cepheid collection device är inget förlossningspersonalen har i sitt rutinarbete, på grund av orutin kan fel i provtagningen uppstå. Eftersom provtagningen är första steget i en tillförlitlig analys är det av vikt att lära upp rätt provtagningsmetod för förlossningspersonalen. Mänskliga faktorn finns som felkälla när praktiska moment utförs i provtagning och i det laborativa arbetet. Med avseende på mänskliga faktorn i laboratorieverksamheten är Xpert® GBS ett bättre alternativ än odlingen på grund av färre praktiska moment.

Analysen Xpert® GBS är dyrare än odling. I och med tidsvinsten som uppkommer med Xpert® GBS är det inte försvarbart att använda kostnaden som en faktor att enbart använda odling. Med Xpert® GBS som rutindiagnostik är det en bidragande faktor i minskad antibiotikaanvändning inom förlossningsvården med avseende på GBS. Generellt är Xpert® GBS en mer specifik metod jämfört med odling eftersom metoden påvisar förekomst av GBS-DNA medan odlingen kan påvisa flera arter på GBS-plattan vilket kan försvåra identifieringen av GBS.

5.3 Slutsatser

Resultaten från Xpert® GBS tyder på att det fungerar att detektera till koncentrationen 1,5 x 104 CFU/ml jämfört med odlingen som kan detektera ner till 1,5 x 103 CFU/ml med rena GBS patientstammar. Xpert® GBS är likvärdig med odlingen i och med att liknande resultat erhålls vid båda metoderna. I och med att Xpert® GBS är ett snabbare alternativ i jämförelse med odling och även kan användas under förlossningsskedet är Xpert® GBS att föredra. Xpert® GBS är inte lika arbetskrävande för laboratoriepersonalen, dessutom visar Xpert® GBS hög sensitivitet och specificitet i studien. På grund av liten studiepopulation kan inga generella slutsatser dras. Vidare studier bör undersöka en större studiepopulation för att generalisera om Xpert® GBS kan fungera som rutindiagnostik för GBS.

6 Omnämnande

Ett stort tack till handledaren Maysae Quttineh för stort stöd, hjälpsamhet samt engagemang under studiens praktiska och skriftliga arbete. Ett stort tack önskas också tillägnas personalen på förlossningsavdelningen vid Länssjukhuset Ryhov, Region Jönköping, för provtagning samt provinsamling. Slutligen önskas tack riktas till personalen på Mikrobiologiska enheten samt Klinisk kemi vid Länssjukhuset Ryhov,

18

region Jönköping, för gott bemötande och hjälpsamhet under studiens praktiska arbete.

7 Referenser

19

1. Martinez de Tejada B, Pfister RE, Renzi G, Francois B, Irion O, Boulvain M, et al. Intrapartum Group B streptococcus detection by rapid polymerase chain reaction assay for the prevention of neonatal sepsis. Clin Microbiol Infect 2011;17

2. Danielsson D. Medicinsk mikrobiologi: Infektionsimmuniteter. Örebro: Liber;2002. p. 39-41, 49-52, 77-79.

3. Bennet R, Eriksson M, editors. Infektioner hos barn. Lund: studentlittertur;2013. p. 162-164,199,224.

4. Håkansson S, Källén K. Impact and risk factors for early-onest group B streproccal morbidity: analysis of a national, population-based cohort in Sweden 1997-2001. Blackwell 2006

5. McQuaid F, Pask S, Locock L, Davis E, Stevens Z, Plumb J, et al. Attitudes towards anternatal vaccination, Group B streptococcus and participation in clinical trails: insights from focus groups and interviews of parents and healthcare professionals. Elsevier Vaccine. 2016;34

6. Patten S, Robinson Vollman A, Manning SD, Mucenski M, Vidakovich J, Davies HD. Vaccination for Group B steptococcus during pregnancy: Attitudes and concerns of women and health care providers. Social science and medicine. 2005; 63

7. Park JS, Cho DH, Jang JH, Kim MY, Shin SM, Kim EC, et al. Usefulness of a Rapid Real-time PCR Assay in Prenatal Screening for Group B Streptococcus Colonization. Annals of labratory medicine. 2013:33

8. Steen M, Degré M, editors. Mikrobiologi. Lund: studentlitteratur; 2011. p. 233-234

9. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Medical Microbiology. Ort: Sauders; 2012. p.198-199

10. Navér L, Rex K, Schollin J, Tessin I. Vårdprogram: Bakteriella infektioner hos nyfödda,

11. Frieden TR. Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease: Revised Guidelines from CDC, 2010; 59: 5-6.

12. Tegnell A. Prevention av tidiga infektioner med grupp B-streptokocker (GBS) hos nyfödda: Rekommendationer för riskbaserad profylax baserade på underlag från experter. www.socialstyrelsen.se 2008-130-7

13. Lagercrantz H, Hellström Westas L, Norman M, editors. Neonatologi. Upplaga 2:1. Lund: Studentlitteratur; 2015. p. 319- 325, 328

14. Folkhälsomyndigheten; sjukdomsinformation om grupp B streptokocker (GBS). Solna; 2013[cited 2017 Mars 9]. Available from: https://www.folkhalsomyndigheten.se/smittskydd-beredskap/smittsamma-sjukdomar/grupp-b-streptokocker-gbs/

15. Barcaite E, Bartusevicius A, Tameliene R, Kliucinskas M, Maleckiene L, Nadisauskiene R. Prevalence of maternal group B streptococcal colonisation in European countries. Acta Obstetricia et gynecologica. 2008;87

16. Gavino M, Wang E. A comparison of a new rapid real-time polymerase chain reaction system to traditional culture in determining group B streptococcus colonization. Am J Obstret Gynecol 2007;197:388

17. Bourgeois-Nicolaos N, Cordier AG, Guillet-Caruba C, Casanova F, Benachi A, Doucet-Populaire F. Evaluation of the Cepehid Xpert GBS assay for rapid detection of group B streptococci in amniotic fluids from pregnant women with premature rupture of membranes. Journals ASM. 2013;51:4

18. http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/w/Bilaga_1:_Substratrecep-Hud,_mjukdelar,_skelett_och_inre_organ#11._Selektiv_anrikningsbuljong_f

20

.C3.B6r_betahemolyserande_streptokocker_.28h.C3.A4r_anv.C3.A4nd_som_.E2.80.9DGBS-buljong.E2.80.9D.29 2017-05-03

19. Bonner P, Hargreaves AJ. Basic bioscience laboratory techniques: a pocket guide. UK: Wiley-Blackwell; 2011. p. 169-171.

20. NCBI: National Center for Biotechnology information. USA; 2015 [cited 2017 Mars 13]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4525378/

21. NCBI: National Center for Biotechnology information. USA; 2014 [cited 2017 Mars 10]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/¨

22. Cepheid innovation GeneXpert Xpert® GBS. 300-89-07 Rev D, september 2011.

23. http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/w/Realtids-PCR#Realtids-PCR 2017-05-03

24. Schrag SJ, Verani JR. Intrapartum antibiotic prophylaxis for the prevetion of perinatal group B streptococcal disease: Experience in the United States and implications for a potential group b streptococcal vaccine. Elsevier Ltd 2013;31S.

25. https://www.cdc.gov/groupbstrep/lab/qas-lab.html 2017-05-11 26. https://www.ghdonline.org/uploads/Improving_your_experience_of_Xpert_

MTB_RIF.pdf 2017-05-16

ORIGINAL ARTICLE

Rapid diagnosis of acute norovirus-associated gastroenteritis:evaluation of the Xpert Norovirus assay and its implementationas a 24/7 service in three hospitals in Jönköping County, Sweden

A. J. Henningsson1& A. Nilsson Bowers1 & J. Nordgren2

& M. Quttineh1&

A. Matussek1,3,4& S. Haglund1

Received: 13 February 2017 /Accepted: 3 May 2017# The Author(s) 2017. This article is an open access publication

Abstract Noroviruses are a leading cause of epidemic andsporadic cases of acute gastroenteritis worldwide. The rapiddiagnosis of norovirus infection is important for prompt infec-tion control measures and may reduce the need for additionaldiagnostic testing. Here we evaluated the performance of therapid Xpert Norovirus assay, and assessed the turn-aroundtime (TAT) before and after the implementation of the analysisas a 24/7 service at all the three hospitals in Jönköping County,Sweden. We describe the implementation process which wasperformed in two steps during 2014. A total number of 276clinical samples (stool and vomitus) from patients with symp-toms of acute gastroenteritis were included in 2014–2015. Thesamples were analysed with the Xpert Norovirus assay and thealready existing routine method: an in-house reverse transcrip-tion real-time PCR. Samples showing discrepant results withthe two assays were further analysed by a third PCR method.The Xpert Norovirus assay performed well with a sensitivityof 100% and a specificity of 93% compared to the gold

standard (defined as the result obtained by at least two of thethree PCR methods). The median TAT decreased from 22hours in 2013 to 2.4 hours in 2015 (p<0.001). We concludethat the performance of the Xpert Norovirus assay was excel-lent, and that the implementation of the analysis as a 24/7service at all three hospitals in the county has greatly reducedthe time to diagnosis which is beneficial for both patients andhealthcare providers.

Introduction

Noroviruses (NoV) are highly infectious non-enveloped RNAviruses and a leading cause of acute gastroenteritis worldwide[1]. There are seven known genogroups, designatedgenogroup I (GI) to GVII, and over 40 genotypes [2]. TheGI and GII are the most important for human infection [3,4]. NoV infections are typically self-limiting, but may causesevere disease in the most vulnerable, i.e. immunocompro-mised persons, elderly and small children [5]. NoV is easilytransmitted in semi-closed units, such as hospitals and seniorcare facilities. Rapid and reliable laboratory diagnostics forearly identification of outbreaks and sporadic cases are essen-tial for prompt infection control measures and prevention ofnosocomial spread [6–10].

Laboratory methods for detection of NoV in clinical sam-ples have evolved over time, and nucleic acid amplificationtests (NAAT) have now become the mainstay [11]. Stool isgenerally regarded as the sample of choice due to the higherviral load as compared to vomitus.

The annual number of NoV samples in Jönköping County,Sweden, is around 1300, and NoV diagnostics used to becentralized at the clinical microbiology laboratory (CML) atthe County Hospital Ryhov, Jönköping. The analysis, an in-house one-step reverse transcription (RT) real-time PCR based

Electronic supplementary material The online version of this article(doi:10.1007/s10096-017-3005-9) contains supplementary material,which is available to authorized users.

* A. J. Henningssonanna.jonsson.henningsson@rjl.se

1 Clinical Microbiology, Laboratory Medicine, Region JönköpingCounty, S-551 85 Jönköping, Sweden

2 Medical Microbiology, Department of Clinical and ExperimentalMedicine, Linköping University, Linköping, Sweden

3 Karolinska University Laboratory, Karolinska University Hospital,Solna, Sweden

4 Division of Clinical Microbiology, Department of LaboratoryMedicine, Karolinska Institute, Karolinska University Hospital,Huddinge, Sweden

Eur J Clin Microbiol Infect DisDOI 10.1007/s10096-017-3005-9

on Kageyama et al. [12], was performed once to twice daily,and analyses were delayed by transportation and batching ofsamples. The Xpert® Norovirus assay, a NAAT for theGeneXpert instrument (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA), is asingle-unit rapid easy-to-use test which can be run on demandand requires little hands-on time. Therefore, the analysiscould, after an initial evaluation, be decentralized from thesole CML (open 7.30 a.m. to 7.00 p.m.) to the clinical chem-istry laboratories (CCLs) (open 24 h a day, every day of theweek [24/7]) at the three hospitals in our county: Jönköping,Eksjö and Värnamo.

The aim of this study was to evaluate the diagnostic accu-racy of the Xpert Norovirus assay and to assess the medianturn-around time (TAT) before and after the implementation ofthe analysis as a 24/7 service.

Materials and methods

Implementation of the Xpert Norovirus assay at all threehospitals

After an initial evaluation at the CML, GeneXpert instrumentsand the Xpert Norovirus assay were set up at the CCLs at allthree hospitals in the county during spring 2014. Education ofthe staff and local validation of the analysis was performed byspecialists in molecular diagnostics, who also kept the respon-sibility for the method’s accuracy and the follow-up of exter-nal quality controls. Implementation in clinical routine wasperformed in two steps. From May to November 2014, theanalysis was performed daytime in the CCLs in Eksjö andVärnamo, whereas the analysis remained at the CML inJönköping in order to monitor and identify unexpected prob-lems. During November 2014, the analysis was implementedas a 24/7 service at all three CCLs in the county.

The GeneXpert and the routine method in parallel

Following the initial evaluation, samples were continuouslyanalyzed in parallel at the CCLs and at the CML in order tofollow the quality and performance of the Xpert Norovirusassay in clinical practice. A total number of 276 samples(stool, n = 257; vomitus, n = 19) from patients with symptomsof acute gastroenterits were included in the study in 2014–2015.

Xpert Norovirus assay with GeneXpert

All samples were prepared and analyzed with the XpertNorovirus kit on GeneXpert at the CCLs according to theinstructions from the manufacturer. Briefly, a small amountof feces or vomitus was transferred to a vial of sample reagent,vortexed and transferred to the assay cartridge. A sample

processing protocol and a probe check control were containedin each cartridge and analyzed in conjunction with each sam-ple. Each cartridge detected NoV GI and GII simultaneouslywith hydrolysis probes. Samples were interpreted as positiveor negative based on their threshold cycle (Ct value) and end-point signal, via an algorithm in the GeneXpert software, andthe presented results included detected GI or GII.

Routine in-house method

The in-house one-step RT real-time PCR for detection of NoVGI and GII was based on Kageyama et al. [12], with thefollowing modifications: the probe for detection of NoV GII(RING2-TP) was labeled with LC670 to allow multiplex PCRand detection, and a BlackBerry quencher was used instead ofTamra. BlackHole quenchers were used on RING1(a) andRING1(b) for detection of NoV GI (TibMolBiol, Berlin,Germany). RING1(a) was used at 6 pmol, RING1(b) andRING2-TP were used at 2 pmol. Briefly, RNAwas extractedfrom 10 μL feces dissolved in 300 μL H2O or from 300 μL ofliquid samples. After a brief centrifugation of the samples,viral RNA was extracted using the MagAttract Viral RNAM48 kit (Qiagen, Hilden, Germany) with the BioRobot M48according to the manufacturer’s instructions. One-step RTreal-time PCR was performed with 5 μL of template in a finalreaction volume of 20 μL using the LightCycler RNAAmplification HybProbe kit and a LightCycler 480 (Roche,Applied Science, IN, USA). Thermocycling was performedusing the following conditions: 55 °C for 10 min, followedby 95 °C for 30 s, 45 cycles at 95 °C for 15 s and 56 °C for45 s. Positive and negative controls were included in each runand manual analysis of the amplification curves wasperformed.

Samples with discrepant results

Samples showing discrepant results with the two assays werefurther analyzed by a third PCR method modified fromNordgren et al. [13, 14]. Viral RNAwas extracted from 300 μLof (10%v/W) fecal supernatant using theMagAttract Viral RNAM48 kit (Qiagen) as described above. Four μl of purified RNAwas added to a reaction mixture consisting of 10 μl of iTaq uni-versal probes reaction mix (BioRad, Stockholm, Sweden),0.8 μL (10 pmol/μL) of each GI and GII primers (NVG1f1band NVG1rlux, NVG2flux1 and COG2R), and 0.4 μl(10 pmol/μL of GI and GII probes, 0.5 μL of iScript advancedreverse transcriptase and 1.5 μL of RNAse free water, to a finalvolume of 20μl. The one-step RT real-time PCR reactions wereperformed in a 96-well reaction plate using the CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad). The RT real-time PCRwas performed under the following conditions: 50 °C for 10minfollowed by 95 °C for 3 min and 45 cycles of 95 °C for 5 s, and60 °C for 30 s.

Eur J Clin Microbiol Infect Dis

Turn-around time

The median TATwas measured before (2013) and after (2015)the GeneXpert® Norovirus assay was implemented as a 24/7service at all three hospitals in the county. TATwas measuredfrom the time point that the sample was sent from thehealthcare unit to the time point when the laboratory reportedthe result. The percentage of test results reported within 4 hwas measured from the time point that the sample arrived atthe laboratory to the time point when the result was reported.The data were retrieved from DivePort, version 7.0(Dimensional Insight Inc., Burlington, MA, USA).

Definition of the gold standard

The gold standard test result was defined as the result obtainedby at least two of the following methods: the Xpert Norovirusassay, the in- house PCR method based on Kageyama et al.[12], and the PCR method based on Nordgren et al. [13, 14].

Statistics

For group comparisons, the Mann-Whitney U-test was used.Data are expressed as median. Statistical analyses were per-formed using Statistica version 12.7 (StatSoft Inc., Tulsa, OK,USA). P-values <0.05 were considered significant.

Results

Comparison between the Xpert Norovirus assayand the gold standard

The results from the comparison between the Xpert Norovirusassay and the gold standard test results are presented inTable 1. The sensitivity of the Xpert Norovirus assay was100% and the specificity was 93%. The positive predictivevalue was 87% and the negative predictive value 100%.Using the Xpert Norovirus assay, 12 samples were positivefor GI, and 85 for GII, whereas according to the gold standard,nine samples were positive for GI and 75 for GII. The positiveand negative agreement between the Xpert Norovirus assayand the gold standard was 95%.

There were 18 samples (stool, n = 17; vomitus, n = 1) withdiscrepant results between the Xpert Norovirus assay and thein-house PCR; all of them showing positive test results withthe Xpert Norovirus assay (GI, n = 6; GII, n = 12), and neg-ative with the in-house PCR. When these 18 samples wereanalyzed with the third PCR method [13, 14], four showedpositive results (GI, n = 3; GII, n = 1). The mean Ct value forthe 14 samples that had positive results only in the XpertNorovirus assay was 35.5 (range, 30.4–40.0). Both the in-house PCR and the Xpert Norovirus assay were able to detectNoV in both stool and vomitus.

Effects on turn-around time

The overall median TAT from arrival of the samples to thelaboratories to available test results decreased from 22 h in2013 to 2.4 h in 2015 (p < 0.001) (Table 2). For samples takenat primary healthcare centers, the median TAT decreased from38 h to 14 h (p < 0.001, data not shown).

The percentage of analytical test results reported within 4 hwas nearly 100% after the introduction of the 24/7 service, ascompared to 10–30% before the implementation of the newmethod (Fig. 1).

Table 1 Comparison between the gold standard test resulta and theXpert Norovirus assay for detection of noroviruses (NoV)

Method of detection Gold standarda

Positive Negative Total

Xpert NoV Positive 84 13 97

Negative 0 179 179

Total 84 192 276

aGold standard: the result obtained by at least two of the three followingmethods for detection of NoVs: the Xpert Norovirus assay, the in-housemethod based on Kageyama et al. [12], and the method based onNordgren et al. [13, 14].

Table 2 The median turn-aroundtime (TAT) before and after theGeneXpert® Norovirus assaywas implemented at thelaboratories of clinical chemistryas a 24/7 service at all threehospitals in the county

Setting 2013 2015 P-value

TAT; hours (n) IQR TAT; hours (n) IQR

All clients 22 (1124) 14–30 2.4 (1289) 2.0–4.2 ***

All clients excl. PHC 20 (933) 11–26 2.3 (1123) 2.0–3.2 ***

Jönköping 19 (583) 7.8–25 2.4 (778) 2.0–3.4 ***

Eksjö 20 (140) 14–26 2.0 (161) 1.9–2.5 ***

Värnamo 24 (194) 19–29 2.2 (195) 2.0–3.6 ***

PHC only 38 (191) 27–48 14 (166) 6.4–22 ***

PHC primary healthcare centre, TAT median turn-around time from sampling to available test result, IQR inter-quartile range

*** P < 0.001

Eur J Clin Microbiol Infect Dis

Discussion

NoV is the most common cause of gastroenteritis in all agegroups globally [15]. A rapid and accurate diagnosis is crucialfor appropriate infection prevention measures and reduces thenecessity of additional diagnostic procedures.

The results of the Xpert Norovirus assay presented hereindicate high performance regarding detection and differenti-ation of the prominent NoVs genogroups, which has also beenshown by others [11]. In fact, the Xpert Norovirus assayseemed to have a higher sensitivity and to be more reliablein detecting both NoV GI and GII than the in-house PCR [12]as well as the third PCR [13, 14]. The samples that showedpositive test results only with the Xpert assay had high Ct

values, indicating a low viral load in the samples or possiblyunspecific nucleic acid amplification. However, we think thatunspecific PCR products are a less plausible explanation,since all patients had symptoms of acute gastroenteritis.

The median TAT was substantially reduced when single-unit analysis on demand was practicable and the same 24/7laboratory service could be provided at all three hospitals.Rapid identification of NoV cases facilitates adequate infec-tion control measures, as well as planning of medical staffresources and is likely to reduce the healthcare costs, althoughwe have not studied these economic aspects in this work.

The Xpert Norovirus assay is rapid and easy to use, andrequires little hands-on time. Manual interpretation and regis-tration of test results have now been replaced by interpretationby the Xpert software and automatic data transfer from theGeneXpert instrument to the laboratory information system.Single sample analysis reduces TATsince no batching of sam-ples is necessary, and furthermore, it decreases the risk forcontamination and mix-up of samples.

Even though we see several advantages in the decentrali-zation of easy-to-use assays, like the Xpert Norovirus assay, tofacilities open 24/7, we believe that it is important that spe-cialists with experience from molecular virology maintain theresponsibility for validation and follow up of the diagnosticperformance, and that in-house PCRmethods are available forcomplementary analysis when required.

In conclusion, we found that the diagnostic performance ofthe Xpert Norovirus assay was excellent, and since the ana-lytical platform and the ease of performing the test allowed itsimplementation as a 24/7 service at all hospitals in our county,it has entailed a significant time gain for the patients and thehealthcare providers, as well as a more efficient, automatedand less stressful work flow in the laboratory.

Acknowledgements The authors would like to thank Dr. JonasSwanberg, Clinical Microbiology, Jönköping, for help with retrieval ofTAT data. We would also like to thank the staff at the laboratories ofclinical chemistry at the hospitals in Jönköping, Eksjö and Värnamo forpleasant and fruitful collaboration.

Compliance with ethical standards

Funding The study was funded by the Laboratory of ClinicalMicrobiology, LaboratoryMedicine, Region Jönköping County, Sweden.

Conflict of interest The authors declare that they have no conflict ofinterest.

Ethical approval The study was approved by the head of LaboratoryMedicine, Region Jönköping County, Sweden, as part of the diagnosticdevelopment of the laboratory.

Informed consent For this study, rest material of clinical samples (stooland vomitus) submitted for routine testing was used. Upon routine testingsamples were anonymized and during the initial technical evaluation, the

Fig. 1 Percentage of test resultsreported within 4 hours fromsample arrival at the laboratorybefore and after the GeneXpert®Norovirus assay wasimplemented at the laboratories ofclinical chemistry as a 24/7service at all three hospitals in thecounty. May 2014: analysis wasperformed during the daytimewith GeneXpert. November2014: analysis of NoV wasimplemented as a 24/7 service

Eur J Clin Microbiol Infect Dis

results from the Xpert Norovirus assay were not disclosed, and therefore,did not have an impact on the management of the patients. TATs wereretrieved retrospectively and anonymously from the laboratory informa-tion system. Thus, due to the study design, formal consent was notrequired.

Open Access This article is distributed under the terms of the CreativeCommons At t r ibut ion 4 .0 In te rna t ional License (h t tp : / /creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which permits unrestricted use,distribution, and reproduction in any medium, provided you giveappropriate credit to the original author(s) and the source, provide a linkto the Creative Commons license, and indicate if changes were made.

References

1. Glass RI, Parashar UD, Estes MK (2009) Norovirus gastroenteritis.N Engl J Med 361:1776–1785

2. Vinjé J (2015) Advances in laboratory methods for detection andtyping of norovirus. J Clin Microbiol 53:373–381

3. Lysén M, Thorhagen M, Brytting M, Hjertqvist M, Andersson Y(2009)Genetic diversity among food-borne andwaterborne norovirusstrains causing outbreaks in Sweden. J ClinMicrobiol 47:2411–2418

4. Matthews J, Dickey B, Miller R, Felzer J, Dawson B (2012) Theepidemiology of published norovirus outbreaks: a systematic re-view of risk factors associated with attack rate and genogroup.Epidemiol Infect 140:1161–1172

5. Ramani S, Atmar RL, Estes MK (2014) Epidemiology of humannoroviruses and updates on vaccine development. Curr OpinGastroenterol 30(1):25–33

6. Cheng FW, Leung TF, Lai RW, Chan PK, Hon EK, Ng PC (2006)Rapid control of norovirus gastroenteritis outbreak in an acute pae-diatric ward. Acta Paediatr 95(5):581–586

7. Cheng VC, Wong LM, Tai JW, Chan JE, To KK, Li IW et al (2011)Preventionof nosocomial transmissionof norovirus by strategic infec-tion control measures. Infect Control Hosp Epidemiol 32(3):229–237

8. MacCannell T, Umscheid CA, Agarwal RK, Lee I, Kuntz G,Stevenson KB, Healthcare Infection Control Practices AdvisoryCommittee-HICPAC (2011) Guideline for the prevention and con-trol of norovirus gastroenteritis outbreaks in healthcare settings.Infect Control Hosp Epidemiol 32:939–969

9. Division of Viral Diseases, National Center for Immunization andRespiratory Diseases, Centers for Disease Control and Prevention(2011) Updated norovirus outbreak management and disease pre-vention guidelines. MMWR Recom Rep RR-3:1–18

10. The Swedish Public Health Agency (2014) Vinterkräksjuka ivården. Kunskapsunderlag för att minska spridningen av norovirus.Available at www.folkhalsomyndigheten.se/publicerat-material/.Accessed 15 May 2017

11. Gonzalez MD, Langley LC, Buchan BW, Faron ML, Maier M,Templeton K et al (2016) Multicenter evaluation of the Xpertnorovirus assay for detection of norovirus genogroups I and II infecal specimens. J Clin Microbiol 54:142–147

12. Kageyama T, Kojima S, Shinohara M, Uchida K, Fukushi S,Hoshino FB et al (2003) Broadly reactive and highly sensitive assayfor Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reversetranscription-PCR. J Clin Microbiol 41(4):1548–1557

13. Nordgren J, Bucardo F, Dienus O, Svensson L, Lindgren PE (2008)Novel light-upon-extension real-time PCR assays for detection andquantification of genogroup I and II noroviruses in clinical speci-mens. J Clin Microbiol 46:164–170

14. Oluwatoyin Japhet M, Adeyemi Adesina O, Famurewa O,Svensson L, Nordgren J (2012) Molecular epidemiology of rotavi-rus and norovirus in Ile-Ife, Nigeria: high prevalence of G12P[8]rotavirus strains and detection of a rare norovirus genotype. J MedVirol 84(9):1489–1496

15. Ahmed SM, Hall AJ, Robinson AE, Verhoef L, Premkumar P,Parashar UD et al (2014) Global prevalence of norovirus in casesof gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. LancetInfect Dis 14:725–730

Eur J Clin Microbiol Infect Dis