BAHAN DAN METODA

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Oktober 2008 sampai Maret 2009.

Tempat penelitian di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Kampus IPB Darmaga Bogor.

Bahan

Isolat bakteri denitrifikasi yang digunakan adalah isolat NFR1, NFR4 yang

diisolasi oleh Marnis (2008) dari muara sungai Cimandiri Pelabuhan Ratu

Sukabumi, isolat LNF, HNF5 oleh Syahputra (2008) dari muara sungai Cisadane

Tanggerang Banten. Isolat-isolat tersebut merupakan koleksi Laboratorium

Mikrobiologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. IPB Bogor.

Konfirmasi dan Peremajaan Isolat

Isolat bakteri ditumbuhkan pada medium agar padat denitrifikasi dengan

metode gores secara kuadran dan diinkubasi selama tujuh hari di dalam Anaerobik

Jar BBL (Oxoid Ltd.Hamspire. England) selama 7 hari. Medium denitrifikasi

yang digunakan memiliki komposisi perliter sebagai berikut: 10 g Natrium asetat,

4,2 g NaNO3, 3,0 yeast ekstrak, 0,5 g (NH4)2SO4, 0,9 g K2HPO4.3 H2O , 0,5 g

MgSO4.7H2O, 0,2 g KH2PO4, 0,1 g CaCl2.2H2O dengan salinitas 2% dan pH 7

(Rodina 1972). Media padat dibuat sama dengan media cair ditambah agar Bacto

20 g per liter. Media disterilisasi pada suhu 121ºC dengan tekanan 1 atm selama

15 menit.

Koloni-koloni yang tumbuh terpisah kemudian digores kuadran lagi sampai

didapatkan koloni-koloni yang murni. Isolat murni yang didapat disimpan pada

medium agar miring dan gliserol sebagai biakan stok. Kemudian dilakukan

pengamatan morfologi koloni meliputi; bentuk, warna dan tepian. Karakterisasi

dan morfologi dilakukan dengan teknik pewarnaan gram dan diamati dibawah

mikroskop (Hadioetomo 1983).

Konfirmasi isolat secara fisiologi dilakukan dengan uji fermentasi

menggunakan glukosa sebagai sumber karbon dan bromcressol purple sebagai

12

indikator keasaman pada tabung reaksi dengan tutup ulir. Inkubasi dilakukan pada

kondisi anaerob. Uji dilakukan untuk melihat kemampuan fermentasi tiap isolat.

Hasil positif ditunjukan dengan berubahnya warna medium dari ungu menjadi

kuning. Jika tidak ada perubahan warna berarti isolat bukanlah bakteri fermentatif.

Peremajaan bakteri pada medium cair dilakukan dengan cara memasukkan

medium cair sebanyak 20 ml ke dalam botol yang berukuran 75 ml . Dibuat

kondisi anaerobik dengan cara menghilangkan oksigen yang terdapat di dalam

tabung. Gas nitrogen bebas oksigen dialirkan ke dalam botol reaksi dengan

menggunakan jarum/syringe steril selama 5 menit. Sebelum gas dimasukkan gas

terlebih dahulu disaring dengan filter steril diameter 47 mm dengan ukuran 0,45

mikro meter. Masing-masing isolat diinokulasikan sebanyak 1 ml dengan jarum

suntik steril, kemudian diinkubasikan pada suhu 28-310C selama 48 jam,

kemudian sebanyak 1ml isolat yang telah diinkubasi diinokulasikan kembali ke

dalam 50 ml medium cair, diinkubasi selama 24 jam. Isolat yang sudah

diremajakan ini dipakai untuk perlakuan selanjutnya.

Uji Aktivitas Reduksi Nitrat untuk Pemilihan Isolat

Pengukuran aktivitas reduksi nitrat pada konsentrasi oksigen berbeda

dilakukan dengan menggunakan 7 botol serum steril 75 ml yang ditutup dengan

butyl rubberseptum. Setiap botol diisi dengan 23 ml medium cair, volume head

space 50 ml.

Selanjutnya dibuat komposisi saturasi udara pada head space dengan

konsentrasi 0%, 1%, 10%, 30%, 50%, 80% dan 100%. Pengkondisian saturasi

udara dilakukan dengan memperhitungkan volume head space botol serum.

Konsentrasi udara 0% didapatkan dengan cara mengalirkan gas Nitrogen bebas

oksigen (OFN) selama lima belas menit. Saturasi udara 1% dengan cara di OFN

kemudian dikeluarkan 0.5 ml gas dalam botol dan dimasukan 0,5 ml udara.

Saturasi udara 10% dibuat dengan mengeluarkan 5 ml gas dari dalam botol dan

memasukan 5 ml udara. Konsentrasi saturasi udara 30% dilakukan dengan

mengeluarkan 15 ml gas dari dalam botol dan dimasukan 15 ml udara. Saturasi

udara 50 % dengan cara mengeluarkan 25 ml gas dari botol lalu dimasukan 25 ml

13

udara saturasi. Konsentrasi 80% dilakukan dengan mengeluarkan 10 ml gas dari

botol dan dimasukan 40 ml udara. Kegiatan tersebut dilakukan secara aseptik.

Konsentrasi saturasi udara 100% adalah botol yang terisi media tanpa perlakuan

OFN. Sebanyak 1ml isolat peremajaan diinokulasikan kedalam botol yang telah

terisi media dan telah dikondisikan konsentrasi saturasi udaranya, dan diikubasi

selama 96 jam (Su et al 2001) pada suhu ruang 28-31ºC diatas mesin penggoyang.

Setelah diinkubasi pada konsentrasi oksigen yang berbeda, dilakukan

pengukuran densitas sel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620

nm. Kultur biakan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit

untuk mendapatkan supernatan. Selanjutnya supernatan kultur biakan di analisis

untuk diuji kadar nitat, nitrit dan amoniumnya.

Analisis nitrit

Analisis nitrit menggunakan metode Sulfanilamide Cleseri et al (1989).

Nitrit dengan amina aromatik pada sulfalinamide akan membentuk diazonium.

Senyawa tersebut dengan NED (N-I-Naphtyl Ethylene Diamine Dyhidrochloride)

membentuk gugus kromofor yang berwarna merah muda (Lampiran 5). Kadar

nitrit ditentukan dengan cara memasukkan 5 ml sampel yang telah diencerkan

kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,1 ml sulfadilamid dan dikocok, setelah

homogen lalu ditambahkan 0,1 ml Naftalena Etilena Diamina (NED) kemudian

didiamkan selama 30 menit dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 540 nm. Nilai absorban yang diperoleh kemudian dikonversi dengan

menggunakan kurva standar hingga diperoleh satuan konsentrasi dalam (mM).

Kurva standar natrium nitrit dengan konsentrasi : 0; 0.2; 0,4; 0,6; 0,8, dan 1,0 mg/l

digunakan untuk menentukan konsentrasi nitrit pada sampel (Lampiran 9)

Analisis nitrat

Analisis senyawa nitrat dengan menggunakan metode Greenberg (1992).

Kadar nitrat ditentukan dengan cara memasukkan 20 ml sampel yang telah

diencerkan ke dalam tabung reaksi lalu dilewatkan di kolom cadmium. Selama

melewati kolom, nitrat akan direduksi menjadi nitrit. Sampel sebanyak 5ml

14

diberi reagen seperti pada analisis nitrit dan diukur pada panjang gelombang

540 nm. Konsentrasi nitrat akan didapatkan dengan mengurangkan nitrit yang

dihasilkan setelah melewati kolom dengan nitrit yang tidak melewati kolom. Nilai

absorban dikonversi dengan menggunakan kurva standar nitrit.

Analisis amonium

Pengukuran konsentrasi amonia menggunakan metode phenate (Cleseri

et al.1989) kadar amonia ditentukan dengan cara 5 ml sampel yang diencerkan,

dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,2 ml larutan fenol alkohol

(C6H5OH) lalu dihomogenkan, diamkan selama 1 menit lalu tambahkan 0,2 ml

Na-Dihidro Nitroprusid(Na2[Fe(CN)NO]2H2O), kemudian ditambahkan 0,5 ml

larutan oksidan yang terdiri dari Natrium Sitrat (C6H5Na3O7.2H2O) dan Natrium

hipoklorit (NaOCl2) dan dibiarkan selama satu jam pada suhu ruang (28-31)o C.

Sampel yang telah direaksikan dengan reagen akan membentuk indofenol

berwarna biru diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 640 nm

(Lampiran 6). Konsentrasi amonium dalam (mM) didapat setelah dikonversi

dengan menggunakan kurva standar amonium. Kurva standar amonium klorida

sebesar: 0; 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 2,0; 4,0; dan 8,0 mg/l digunakan untuk menghitung

konsentrasi amonium pada sampel (Lampiran 10).

Setelah masing-masing sampel diketahui kandungan nitrat (NO3), nitrit

(NO2) dan amonium (NH4). Jumlah nitrat yang tereduksi dengan rumus :

[NO3-]red = [NO3

-] kontrol – [NO3-]inokulasi

% [ NO3

-]red = [NO3-] red

[NO3-] kontrol

Jumlah senyawa nitrit yang terbentuk dihitung dengan humus:

[NO2]terbentuk = [NO2]perlakuan – [NO2]kontrol

%[NO2]terbentuk = [NO2]perlakuan – [NO2]kontrol

X 100

X 100 [NO3] tereduksi

15

Jumlah senyawa amonium yang terbentuk dihitung dengan rumus:

[NH4+]terbentuk = [NH4

+]perlakuan – [NH4+]kontrol

%[NH4+]terbentuk = [NH4

+]perlakuan – [NH4+]kontrol

X 100 [NO3

-] tereduksi

Estimasi gas yang terbentuk dihitung dengan rumus

[Gas ] = [NO3-]tereduksi – [NO2

-] terbentuk – [NH3-] terbentuk

%[ Gas] = [Gas ] X 100 [NO3

-] red

Keterangan : Konsentrasi nitrat kontrol didapatkan dari sediaan medium steril

tanpa bakteri.

Uji Aktivitas Reduksi Nitrat dan Kinetika Isolat Bakteri Denitrifikasi

Dua isolat terbaik dalam mereduksi nitrat, dan responsif terhadap perbedaan

konsentrasi oksigen dipilih untuk diuji dan diamati kinetikanya. Botol serum steril

volume 125 ml diisi dengan media 50 ml medium cair. Sebanyak 1ml kultur

peremajaan diinokulasikan pada masing-masing media pada botol serum. Saturasi

udara pada head space dikondisikan menjadi 1%, 10% dan 100%. Setiap

perlakuan sebanyak 5 ulangan. Inkubasi dilakukan selama 96 jam pada suhu rang

28-31ºC pada inkubator dengan mesin penggoyang (Su et al. 2001).

Pengukuran nilai Optical Density (OD) sel dilakukan setiap 12 jam pada

masing-masing isolat dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang 620 nm. OD dikonversi dengan menggunakan kurva standar untuk

menghitung jumlah sel jumlah sel. Laju pertumbuhan spesifik maksimum (µmaks)

didapat dengan cara mencari Regresi dari ln jumlah sel. koefisien X merupakan

nilai µmaks (Maier 2000). Kurva standar pertumbuhan isolat NFR1 dan NFR4

dapat dilihat pada Lampiran 13.

Analisis nitrat, nitrit dan amonium dilakukan setiap 12 jam, dengan cara

yang sama pada tahap seleksi isolat. Hasilnya digambarkan dalam bentuk grafik

yang memperlihatkan hubungan jumlah sel, jumlah nitrat, nitrit, dan amonium.

Kecepatan reduksi nitrat sel tiap isolat pada masing-masing konsentrasi saturasi

udara berbeda dihitung dan dianalisa.