Y HỌCSản xuất các protein tái tổ hợp

Một trong những kịch tính và tác động nhanh chóng của kỹ thuật gen là sản xuất các protein được mã hóa bởi gen người trong số lượng lớn vi khuẩn. năm 1982, insulin, được thể hiện từ gen insulin của người trên plasmid đã chèn vào E.coli, là gen biến đổi đầu tiên điều trị tác nhân được chấp nhận cho sử dụng lâm sàng ở người. Insulin sản xuất từ vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh tiểu đường, không thể phân biệt trong cấu trúc của nó và tác dụng lâm sàng từ insulin tự nhiên. Hocmon sinh trưởng người, một protein được sản xuất bởi tuyến yên, là sản phẩm như vậy thứ hai. Thiếu tiết hcg ở trẻ em kết quả là lùn. Trước khi sự ra đời của công nghệ DNA tái tổ hợp Hcg được chuẩn bị từ tuyến yên lấy ra từ tử thi người. việc cung cấp những chế phẩm như vậy là hạn chế và chí bị quá cao. Hơn nữa, có những mối nguy hiểm trong quản lý của họ, có những dẫn dút di từ thị trường. Một số bệnh nhân được điều trị bằng cách tiêm Hcg từ tuyến yên phát triển một căn bệnh gây ra bởi loài vius bị ô nhiễm chậm, hội chứng Jakob–Creutzfeldt, chúng dẫn đến chứng mất trí và cái chết.hcg có thể được sản xuất trong E.coli biến đổi gen vói số lượng lớn, chi phí tương đối thấp và miễn phí từ các chất gây ô nhiễm như vậy. Human tissue plasminogen activator (tPA), một enzyme thủy phân protein, (một“serin” protease) với một ái lực cho fibrin (chất làm máu đông) đông là một đại lý trị liệu có sẵn với số lượng lớn, giống như là hệ quả của công nghệ DNA tái tổ hợp. Tại bề mặt của các cục máu đông fibrin, tPA cắt các liên kết peptit trong plasminogen dể tạo thành một serin protease, plasmin, sau đó làm giảm các cục máu đông. Sự suy giảm các cục máu đông của tPA làm nó, một cuộc sống tiết kiệm thuốc của những bệnh nhân điều trị bệnh nhồi máu cơ tim. Insulin người và hCG tái tổ hợp cung cấp bằng chứng ấn tượng cho thử nghiệm lâm sàng hiệu quả và an của các protein người được làm bởi/ kỹ thuật vi sinh vật. Ví dụ danh sách trong bảng 2.1, một danh sách các sản phảm gen người tái tổ hợp thể hiện trong vi khuẩn và nấm tiếp tục phát triển nhanh chóng. Chương 3 và 5 thảo luận về vấn đề sản xuất protein dị thể và vaxcin trong những sinh vật này.

Bảng 2. Ví dụ những protein người được nhân bản trong E.coli: chức năng sin học của chúng và hiện tại hoặc dự kiến sử dụng điều trị.

Protein Chức năng Sử dụng điều trịα1-Antitrypsin Chất ức chế protease Điều trị tràn khíCalcitonin ảnh hưởng quá trình trao đổi

Ca2+ và phosphateĐiều trị chứng loãng xương

Colony stimulating factors- nhân bản yếu tố

Kích thích tạo máu Chống ung thư

kích thíchEpidermal growth factor- yếu tố tăng trưởng biểu bì

Phát triển tế bào biểu mô, mọc răng

Chữa lành vết thương

Erythropoietin Kích thích tạo máu Điều trị thiếu máuFactor VIII Yếu tố đông máu Phòng chống chảy máu

trong bệnh hay chảy máuFactor IX Yếu tố đông máu Phòng chống chảy máu

trong bệnh hay chảy máuGrowth hormone releasing factor- yếu tố giả phóng hocmon tang trưởng

bài tiết hocmon kích thích tăng trưởng

Thúc đẩy tẳng trưởng

Interferons (α, β,γ ) Một họ từ 20- 25 protein khối lượng phân tử thấp, làm cho tế bào đề kháng với sự sinh trưởng rộng rãi của nhiều loại vius

Chống virus, chống ung thư, chống viêm

Interleukins 1, 2, and 3 Chất kích thích hệ thống các tế bào miễn dịch

Chống ung thư, điều trị các rối loạn miễn dịch

Lymphotoxin Một yếu hấp thụ xương sản xuất bởi bạch cầu

Chống ung thư

Somatomedin C (IGF-I) Hấp thu sunfat bởi sụn Xúc tiến tăng trưởngSerum albumin Thành phần protein chủ yếu

của plasmaBổ sung plasma

Superoxide dismutase Phân hủy miễn phí các gốc superoxide tự do trong máu

Phòng chống nguy hiểm khi máu giàu oxy, oxy trong mô bị mất, ứng dụng điều trị bệnh tim và cấy ghép nội tạng

Tumor necrosis factor Một sản phẩm của thực bào đơn nhân gây độc những dòng tế bào ung thư

Chống ung thư

Urogastrone Kiểm soát tiêu hóa Chống loétUrokinase Chất hoạt hóa plasminogen Thuốc kháng đông (giải

thể các cục máu đông)

Vac xin DNA

Vào đầu những năm 1990, sự chú ý tập trung vào các cơ hội tiềm năng trên phạm vi rộng được cung cấp bởi vaxcin DNA. Vắc xin DNA bao gồm DNA plasmid được thiết kế một cách thích hợp chuẩn bị trên quy mô lớn trong E.coli. Những lợi thế rõ ràng của vắc xin DNA plasmid là chúng kohoong lây nhiễm, không tái tạo và chỉ mã hóa protein qua tâm. Không giống như các loại vắc xin, nó không có thành phần protein, và do đó cảm ứng của một đáp ứng miễn dịch chống lại chủng ngừa tiếp theo được giảm thiểu. Một vắc xin plasmid bao gồm các thành phần chính sau đây: một hệ thống promoter mạnh cho sự biểu hiện trong tế bào nhân chuẩn của các protein kháng nguyên ( ví dụ protein vỏ vius), ngay lập tức đầu promoter của cytomegalovirus thường được sử dụng, một vị trí nhân bản cho sự chèn gen mã hóa protein kháng nguyên, và một vị trí kết thúc đầu chuỗi poly A thích hợp. Hầu hết các mRNA nhân điển hình có chứa một đuôi poly A, chúng xuất hiện là quan trọng đối với hiệu quả dịch mã và sự ổn định của mRNA. Plasmid này cũng bao gồm gốc tái bản của sinh vật nhân sơ, cho sản phẩm của chúng trong E.coli và lựa chọn chỉ thị, chẳng hạn nhứ gen kháng ampicillin, cho phép lựa chọn các tế bào vi khuẩn có chứa plasmid. Vắc xin DNA thường được giới thiệu bằng cách tiêm. Đó là vẫn không biết những tế bào nội hóa DNA như thế nào sau khi tiêm. Kháng nguyên mã hóa được tiếp tục biểu hiện intisu trong các tế bào người nhận vắc xin và tạo ra một đáp ứng miễn dịch. Các loại vắc xin này có tính năng hấp dẫn. Các kháng nguyên miễn dịch có thể bắt nguồn từ virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, khối u. Kháng nguyên có thể biểu hiện đơn lẻ hoặc kết hợp nhiều. Trong một trường hợp, vắc xin DNA chứ nhiều biến thể của một gen có thể thay đổi cao,ví dụ, gen mã hóa gp120, một protein nằm bên ngoài bề mặt của HIV.

Giống như các tế bào T, tế bào Th phát sinh trong tuyến ức. Các tế bào Th1 thuộc vào taaoj hợp CD4+ của các tế bào bạch cầu, chúng tham gia vào quá trình miễn dịch tế bào trung gian. Chúng là rất cần thiết để chống lại các tác nhân gây bệnh nội bào, chẳng hạn như virus và một số vi khuẩn, ví dụ Listeria monocytogenes (sinh vật gây bệnh của listeriosis) và Mycobacteriumtuberculosis (sinh vật gây bệnh lao). Box 2

Trong các loại vắc xin khác, toàn bộ bộ gen của vi sinh vật truyền nhiễm được đưa vào bộ khung plasmid bằng “shotgun cloning”. Vắc xin DNA bao gồm cả hai phản ứng miễn dịch (sự xuất hiện của kháng thể huyết thanh chống lại kháng nguyên) và vác phản ứng của tế bào (kích hoạt các tế bào T khác nhau. Các phản ứng đã được ghi nhận trong các mô hình động vật mắc bệnh, trong đó sự bảo vệ

được trung chuyển bởi các phản ứng như vậy. Vấn đề quan trọng vẫn cần được giả quyết trước khi vắc xin DNA mất một vị trị thường xuyên diễn ra bên cạnh các loại vắc xin. Trong các thử nghiệm lâm sàng, vắc xin sốt rét, viêm gan B, HIV cho thấy chỉ đáp ứng ở mức trung bình trong tình nguyện viên. Đánh giá các loại vắc xin DNA mã háo trình tự bảo tồn cao protein của virus cúm kết luận rằng có một sự cần thiết phải tăng cường các phản ứng miễn dịch chủng ngừa DNA trước khi vắc xin như vậy trở thành một cách tiếp cận dầy hứa hện đối với con người. Hơn nữa, DNA plasmid chính nos kích thích tế bào Th1 và do đó có thể góp phần vào sự phát triển hoặc xấu đi của Th1 trung gian, cơ quan cụ thể bị rối loạn miễn dịch (xem Box 2). Mối quan tâm tiềm năng khác cũng được xác định.

Chất chuyển hóa thứ cấp như là nguồn thuốcVi sinh vật sản xuất phần lớn các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ thường

được mô tả như là chất chuyển hóa thứ cấp.Một cách tiếp cận truyền thống để phát hiện cái mới, các phân tử có hoạt tính sinh học tự nhiên, sử dụng “màng lọc”. Một màng lọc là một thủ tục khảo nghiệm cho phếp thử nghiệm rất nhiều hợp chất cho một hoạt động cụ thể. Hàng ngàn, hàng chục các chất chuyển hóa thứ cấp và các hợp chất khác đã được kiểm tra hoạt tính sinh học trong các sinh vật khác nhau và nhiều chất đã chứng minh có giá trị nhừ kháng khuẩn, các tác nhân kháng nẩm, chống ung thư, thuốc ức chế miễn dịch, thuốc diệt cỏ, các công cụ cho nghiên cứu và nhiều loại tương tự ( Bảng 2.2). Vi sinh vật biến đổi gên đã được thiết kế để sản xuất các hợp chất như vậy với số lượng lớn. Trong ssos này, thuốc kháng sinh là các chất chuyển hóa thứ cấp được xem xét quan trọng trong hầu hết các phương pháp điều trị ở người và việc sử dụng lớn nhất màng lọc là trong việc tìm kiếm các hợp chất có độc tính chọn lọc vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh. Người ta ước tính rằng, kháng sinh sinh học tự nhiên cung cấp điểm khởi đầu cho hơn 75 % thị trường thuốc diệt vi khuẩn. Chương 10 được dành cho một cuộc thảo luận rộng rãi các thuốc kháng sinh.Ba ví dụ tiếp theo minh họa tầm quan trọng đặc biệt của sản phẩm tự nhiên trong các ứng dụng điều trị quan trọng.

AVERMECTINSNhiều vi sinh vật bản địa trên mặt đất, vi khuẩn đặc biệt là xạ khuẩn và nhiều

loại nấm, sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học trung gian. Chiếu chuyên sâu văn hóa supernatant ( thường được gọi là quá trình lên men nước canh), giàu chất chuyển hóa thứ cấp, đã dẫn đến việc phát hiện ra nhiều kháng sinh lâm sàng, với penicillin là ví dụ nổi tiếng nhất, nhưng nhiều loại hợp chất có giá trị khác cũng tốt. Các cấu trúc của các hợp chất mới được đặc trưng với thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu, và hoạt động nematocidal từ vi sinh vật đất được mô tả trong các tài liệu khoa học với tỷ lệ vài trăm lần mỗi năm.

Hợp chất Nguồn vi sinh vật Chú thíchActinomycin Streptomyces

chrysomallusActinomycin, bleomycin, và griseofulvin,

Bleomycin Streptomyces verticillus

ức chế sự sao chép DNA

Griseofulvin Penicillium griseofulvum

Rifamycin Amycolatopsis mediterranei

ức chế sự phiên mã bở cá chất ức chếDNA-dependent RNA polymerase.Có giá trị trong điều trị bệnh lao

Chloramphenicol Streptomyces venezuelae

Chloramphenicol,tetracycline,lincomycin,và erythromycin ức chế dịch mã bởi ribosome 70STetracycline Streptomyces

aureofaciensLincomycin Streptomyces

lincolnensisErythromycin Streptomyces

erythreusCycloheximide Streptomyces

griseusức chế dịch mã bởi ribosome 80S

Puromycin Streptomyces alboniger

ức chế Puromycin và axit fusidic

Fusidic acid Acremonium fusidioides

Dịch mã bởi ribosome 70s và ribosome 80s

Cycloserine Streptomyces sp. Cycloserine, bacitracin, penicillin,cephalosporin, vancomycin, vàteicoplanin ức chế tổng hợp peptidoglycan

Bacitracin Bacillus licheniformis

Penicillin Penicillium chrysogenum

Cephalosporin Cephalosporium acremonium

Vancomycin Amycolatopsis orientalis

Teicoplanin Actinoplanes teichomyceticus

Polymyxin Paenibacillus polymyxa

Polymyxin và amphotericin là polyether bề mặt đó chúng là lo ngại cho màng tế bàoAmphotericin Streptomyces

nodosus

Gramicidin Bacillus brevis hình thành kênh ionophoreMonensin Streptomyces

cinnamonensisDi động cung cấp ionophore; đại lý cầu trùng

Avermectins Streptomyces avermitilis

Avermectins có hoạt động cao ởgiun sán và động vật chân đốt

Clavulanic acid Streptomyces clavuligerus

Một chất ức chế penicillinase chất đó bảo vệ Penicillin từ việc bất hoạt bởi cách kháng các tác nhân gây bệnh, sử dụng cùng với penixilin

Kasugamycin Streptomyces kasugaensis

Kasugamycin và polyoxins là thuốc diệt nấm

Polyoxins Streptomyces cacaoi

Nikkomycin Streptomyces tendae

Nikkomycin và spinocins là thuốc trừ sâu

Spinosins Saccharopolyspora spinosa

Bialaphos Streptomyces hygroscopicus

thuốc diệt cỏ

Cyclosporin A Tolypocladium inflatum

Cyclosporine, FK506, và rapamycin Là thuốc ức chế miễn dịch choghép cơ quan ở người nhậnFK-506

(tacrolimus)Saccharopolyspora erythrea

Rapamycin Streptomyces hygroscopicus

Doxorubicin Streptomyces peucetius

Một loại thuốc chống ung thư được sử dụng trong điều trịgiai đoạn cuối của khối u

Ergot alkaloids Claviceps purpurea Co thắt tử cungLovastatin (mevinolin)

Aspergillus terreus Đại lý làm giảm cholesterol ở người vàđộng vật

Acarbose Actinoplanes sp. Ức chếi glucosidase đường ruột của con người

Gibberellins Gibberella fujikurol

Điều chỉnh sự phát triển ở thực vật

Zearalenone Gibberella zeae Đại lý Anabolic được sử dụng trong cáct trang trại vật nuôi

Nấm được thể hiện bằng chữ màu đậm

Các avermectins được phát hiện vào đầu những năm 1980 như là một kết quả của một cố ý tìm kiếm các hợp chất anthelmintic được sản xuất bởi các vi sinh vật đất. Giun sán là giun ký sinh gây nhiễm trùng đường ruột của bất kỳ động vật không may ăn trứng của chúng. Có hai tính năng đặc biệt đáng chú ý của chương trình sàng lọc. Đầu tiên, dung dịch quá trình lên men vi sinh vật đã được thử nghiệm bằng cách quản lý trong chế độ ăn uống với những con chuột bị nhiễm khuẩn với giun tròn Nematospiroides dubius. Tuyến trùng là một phân lớp phụ của giun sán bao gồm giun tròn và threadworms. Mặc dù như vậy khảo nghiệm in vivo là đắt tiền, đồng thời thử nghiệm hiệu quả của việc chuẩn bị chống lại giun tròn và độc tính với ký chủ. Thứ hai, để tăng cơ hội phát hiện các loại hợp chất mới, việc lựa chọn các vi sinh vật để thử nghiệm đã được thiên vị đối với những người có tính trạng hình thái khác thường và nhu cầu dinh dưỡng. Các đặc điểm hình thái của Streptomyces avermitilis, nhà sản xuất của avermectins, không giống như những loài khác được biết đến như là loài Streptomyces. S. avermitilis tạo ra một họ lactones macrocyclic liên quan chặt chẽ (Hình 2.1), các hợp chất là hoạt động chống lại một số loài giun tròn và động vật chân đốt ở liều rất thấp, nhưng có độc tính tương đối thấp với động vật có vú. Những avermectins và dẫn xuất của chúng, như các hợp chất đến được gọi là, có hiệu quả cao dùng trong thú y và trong điều trị nhiễm ký sinh trùng ở người. Avermectins hoạt động trên động vật không xương sống bằng cách kích hoạt kênh glutamate-gated chloride trong dây thần kinh của chúng và cơ bắp, làm gián đoạn chức năng hầu và vận động. Ký sinh trùng bị liệt rất có thể bỏ đói chết. Độc tính chọn lọc của chúng – chúng không gây hại cho các loài động vật có xương sống đã dẫn kết luận rằng avermectins ảnh hưởng đến một mục tiêu di động cụ thể hoặc vắng mặt hoặc không thể tiếp cận trong các vi khuẩn đề kháng. Các avermectins không di chuyển trong đất từ các trang vị trí của các ứng dụng và có thể thoá hóai quang học nhanh chóng và phân hủy vi khuẩn. Do đó,avermectins không được dự kiến sẽ tồn tại cùng thời gian trong phân của động vật được điều trị. Các hoạt động sinh học và độc tính chọn lọc của các avermectins có thể đã không được dự đoán ngay cả khi các cấu trúc của các hợp chất này đã được biết đến. Cấu trúc của một phân tử nhỏ tự nhiên có hoạt tính sinh học mong muốn thường được sử dụng như điểm khởi đầu cho việc thiết kế và chuẩn bị của các dẫn xuất bán tổng hợp với các hoạt động được cải thiện, chọn lọc, và các đặc tính ổn định. .Điều này đã chứng tỏ là trường hợp cho avermectins.Ivermectin (IVM; 22,23-dihydroavermectin B1a, Hình 2.1), một bán tổng hợp phái sinh của avermectin B1a, là một loại thuốc không thể thiếu trongn chương trình điều trị hàng loạt để loại trừ hai bệnh phổ biến nghiêm trọng ảnh hưởng đến hàng triệu người dân và được gây ra bởi giun tròn: mù sông (onchocerciasis) và giun chỉ bạch huyết (Hộp 2.2).