Bakteri Tahan Asam

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat

yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna

dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu

cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah

dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk

mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui

serangkaian pengecatan.

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen (ZN) tetap

mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol, sehingga tidak

mampu mengikat warna kedua. Bakteri tersebut ketika diamati dibawah mikroskop

tampak berwarna merah dengan warna dasar biru muda. Terdapat lebih dari 50

spesies Mycobacterium, antara lain banyak yang merupakan saprofit.

Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri tahan asam, berbentuk batang dan

bersifat aerob obligat yang tumbuh lambat dengan waktu generasi 12 jam atau

lebih. Mycobacterium tuberculosis menyebabkan tuberculosis dan merupakan

patogen yang berbahaya bagi manusia. Mycobacterium leprae menyebabkan lepra.

Mycobacterium avium-intracellulare (kompleks M. avian) dan mikobakteria apitik

lain yang sering menginfeksi pasien AIDS, adalah patogen ortunistik pada orang-

orang dengan fungsi imun yang terganggu lainnya, dan kadang-kadang

menyebabkan penyakit pada pasien dengan sistem imun yang normal. 

Sumber penularan adalah penderita TB yang dahaknya mengandung kuman TB

hidup (BTA positif). Infeksi kuman ini paling sering disebarkan melalui udara (air

borne, droplets infection). Penyebaran melalui udara berupa partikel-partikel

percikan dahak yang mengandung kuman berasal dari penderita saat batuk, bersin,

tertawa, bernyanyi atau bicara. Partikel mengandung kuman ini (berukuran

diameter 1-5 µm) akan terhisap oleh orang sehat dan menimbulkan infeksi di

saluran napas.

Terdapat beberapa macam bahan spesimen dalam pemeriksaan laboratorium

tuberkulosis yaitu:

Sputum (dahak), harus benar-benar dahak bukan ingus juga bukan ludah.

Air kemih pagi hari, pertama kali keluar merupakan urin pancaran tengah.

Air kuras lambung, umumnya anak-anak atau penderita yang tidak dapat

mengeluarkan dahak. 

Bahan-bahan lain, misalnya nanah, cairan cerebrospinal, cairan pleura, dan

usapan tenggorokan.

Pewarnaan kuman BTA dapat dilakukan dengan 3 macam pewarnaan yaitu Ziehl-

Neelsen, Tan Thiam Hok (Kinyoun-Gabbett) dan Auramin–phenol fluorochrome.

Umumnya pewarnaan Ziehl-Neelsen dan Tan Thiam Hok yang sering digunakan.

Hasil yang didapat disamakan dengan penilaian IUATLD (International Union Against

Tuberculose Lung Diseases)

Pembuatan Sediaan Apus Sputum

1. Ose dipanaskan di atas api spirtus sampai merah dan didinginkan.

2. Sputum disiapkan (hati-hati, hindari droplet/percikan sputum), diambil sedikit

dari bagian yang kental dan berwarna kuning kehijauan (purulen) menggunakan

ose.

3. Sputum dioleskan secara merata (seperti obat nyamuk) pada objek glass (dengan

ukuran 2x3 cm).

4. Ose yang telah digunakan dimasukkan ke dalam alkohol sambil digoyang-

goyangkan sampai sisa-sisa sputum bersih, kemudian dibakar.

5. Sediaan yang telah dibuat dikeringkan di udara terbuka sekitar 15-30 detik,

jangan sampai terkena matahari langsung.

6. Sediaan diambil dengan pinset dan difiksasi selama 3-5 menit.

Pewarnaan/Pengecetan

Ziehl-Neelsen

1. Sediaan yang telah kering dilakukan fiksasi 5 menit.

2. Sambil difiksasi, digenangi dengan carbol fuchsin 0,3%, dipanaskan di atas

pembakar spirtus sampai menguap tetapi jangan sampai mendidih atau kering

selama 5 menit.

3. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

4. Warna merah dilarutkan pada sediaan sampai bersih dengan 3% alkohol-asam.

5. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

6. Digenangi dengan larutan methylen blue selama 20-30 detik.

7. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

8. Diamati di bawah mikroskop cahaya.

b. Pembacaan dan Penilaian

Pembacaan

1. Sediaan yang telah kering ditetesi minyak imersi, dilihat dengan mikroskop

dengan pembesaran 100 kali.

2. Dicari dengan adanya batang panjang atau pendek yang berwarna merah

dengan latar belakang berwarna biru.

Penilaian

1. BTA negatif : apabila dalam 100 LP atau 15 menit pengamatan tidak dijumpai

adanya BTA.

2. BTA positif : apabila dalam pengamatan dijumpai adanya BTA. BTA posiif apabila

dibuat sediaan langsung dan diwarnai dengan Ziehl-Neelsen atau Kinyoun Gabbert

maka dapat dilakukan penilaian sebagai berikut :

Penilaian menurut IUATLD (International Union Against Tuberculose Lung Diseases)

Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA.

Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP.

Positif 1 : Ditemukan 10-90 BTA/100 LP.

Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP.

Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP.

Mycobacterium tuberculosis, pertama kali ditemukan oleh Robert Koch tahun 1882,

termasuk Ordo Actinomycetales Familia Mycobacteriaceae, Genus Mycobacterium

dan mempunyai banyak spesies. Penyakit yang ditularkan oleh basil tersebut

dikenal dengan sebutan TBC atau Tb-paru. Kuman TBC masuk ke paru-paru melalui

pernafasan (aerosol) (Girsang, 2002).

Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies-spesies tertentu dari genus

Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoid (berlemak) di dalam dinding-

dinding selnya. Hal ini mengakibatkan dinding sel tersebut relatif tidak permeable

terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak

terwarnai oleh metode-metode pewarna biasa. Kedua genus tersebut mengandung

spesies-spesies yang patogenik bagi manusia. Bakteri yang paling dikenal

diantaranya adalah M. tuberculosis, penyebab penyakit tuberculosis dan M. leprae

penyebab penyakit lepra. Menunjang diagnosis penyakit-penyakit tersebut, bakteri

penyebabnya harus dapat diisolasi dari spesimen si sakit dan dibuat tampak serta

mudah dibedakan dengan bakteri-bakteri yang lain. Akibat sifat dinding selnya yang

demikian itu maka untuk memenuhi tujuan tersebut harus digunakan pewarna

khusus (Hadioetomo, 1993).

Teknik pewarnaan khusus itu disebut juga pewarnaan tahan asam, mula-mula

dikembangkan oleh Paul Ehrlich pada tahun 1882 ketika meneliti M.tuberculosis.

Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa kini merupakan hasil

perbaikan teknik Ehrlich yang asli, yaitu pewarna Ziehl-Neelsen, dinamakan

menurut kedua orang peneliti yang mengembangkannya pada akhir 1800-an.

Prosedur ini menggunakan pewarna utama dengan pemanasan, dan biru metilena

Loeffler sebagai pewarna tandingan. Modifikasi teknik ini yang berkembang

kemudian, perlakuan panas diganti dengan penggunaan pembasah (suatu deterjen

untuk mengurangi tegangan permukaan lemak) untuk menjamin penetrasi,

pewarna yang mengandung bahan pembasah ini disebut pewarna Kinyoun

(Hadioetomo, 1993).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan

zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang

bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam

ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan

alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi

pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam

dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal,

pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh

alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin

dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel,

sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993). 

Pewarnaan Ziehl Neelsen menurut Kurniawati 2005, larutan carbol fuchsin 0,3%

dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan di atas nyala api

sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit.

Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna

dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam

alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4

menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan

dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutupi seluruh

permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir. 

Pewarnaan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna

merah dengan latar berwarna biru. Bakteri tahan asam akan mempertahankan

warna pertama yang diberikan. Hasil yang didapat adalah terdapatnya bakteri

tahan asam.

Mycobacterium tuberculosis memiliki ciri khas yaitu dalam jaringan, basil tuberkel

merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4x3 µm. Perbenihan buatan,

terlihat bentuk kokus dan filamen. Mikobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai

Gram positif atau Gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa, warna

tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meskipun dibubuhi iodium. Basil

tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95% etil alkohol

yang mengandung 3% asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan

menghilangkan warna bakteri kecuali mikobakteria. Sifat tahan asam ini tergantung

pada integritas struktur selubung berlilin. Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen

dipergunakan untuk identifikasi bakteri tahan asam. Dahak atau irisan jaringan,

mikobakteria dapat diperhatikan karena memberi fluoresensi kuning-jingga setelah

diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin, rodamin) (Annonimous,

2008).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,

substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup

(Dwidjoseputro, 1994). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang

salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion

bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan

bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna

berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri

(Sutedjo, 1991).

Diagnosis ditegakkan dengan pemeriksaan 3 spesimen sputum Sewaktu Pagi

Sewaktu (SPS). Pelaksanaan pengumpulan sputum SPS yaitu :

1. S (sewaktu), sputum dikumpulkan pada saat suspek TB datang pertama kali. Saat

pulang suspek membawa sebuah pot sputum untuk sputum hari kedua.

2. P (pagi), sputum dikumpulkan di rumah pada pagi hari kedua segera setelah

bangun tidur.

3. S (sewaktu), sputum dikumpulkan di UPK pada hari kedua saat menyerahkan

sputum pagi.

Sediaan dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali dengan

meneteskan minyak emersi tanpa menyentuh sediaan untuk mencegah transfer

BTA antar sediaan. Pelaporan jumlah BTA sesuai dengan skala IUATLD (International

Union Againts Tuberculosis and Lung Diseases) yaitu :

• Negatif (-), tidak ada BTA dalam 100 lapangan pandang.

• Meragukan (ditulis jumlah kuman yang ditemukan), 1-9 BTA dalam 100 lapangan

pandang.

• Positif 1 (+), 10 – 99 BTA dalam 100 lapangan pandang

• Positif 2 (++), 1-10 dalam 1 lapangan pandang minimal dibaca 50 lapang

pandang.

• Positif 3 (+++), >10 BTA dalam 1 lapangan pandang minimal dibaca 20 lapang

pandang (Saad, 2005).

Biakan perbenihan untuk biakan primer mikobakteria sebaiknya meliputi

perbenihan nonselektif dan perbenihan selektif. Perbenihan selektif mengandung

antibiotik untuk mencegah pertumbuhan berlebihan bakteri dan jamur. Terdapat

tiga formulasi umum yang dapat dipergunakan untuk perbenihan selektif maupun

nonselektif (Annonimous, 2008). 

Sifat-sifat pertumbuhan mikobakteria adalah aerob obligat dan mendapat energi

dari oksidasi berbagai senyawa karbon sederhana. Kenaikan tekanan CO2

meningkatkan pertumbuhan. Aktivitas biokimianya tidak khas, dan laju

pertumbuhannya lebih lambat dari kebanyakan bakteri lain. Waktu penggandaan

basil tuberkel adalah sekitar 12 jam. Bentuk saprofit cenderung tumbuh lebih cepat,

berkembangbiak dengan baik pada suhu 22-23oC, menghasilkan lebih banyak

pigmen, dan kurang tahan asam dari pada bentuk yang patogen (Annonimous,

2008).

Reaksi terhadap faktor fisik dan kimia mikobakteria cenderung lebih resisten

terhadap faktor kimia dari pada bakteri yang lain karena sifat hidrofobik permukaan

selnya dan pertumbuhan bergerombol. Zat-zat warna (misalnya hijau malakit) atau

antibiotika (misalnya pinisilin) yang bersifat bakteriostatik terhadap bakteri lain

dapat dimasukkan ke dalam perbenihan tanpa menghambat pertumbuhan basil

tuberkel. Asam dan basa memungkinkan sebagian basil tuberkel yang terkena tetap

hidup, sifat ini dipergunakan untuk memekatkan bahan pemeriksaan dari klinik

dengan membunuh sebagian organisme lain yang mengkontaminasi. Basil tuberkel

cukup resisten terhadap pengeringan dan dapat hidup lama dalam dahak yang

kering (Annonimous, 2008).