BAKTÉRIUMOK BAKTÉRIUMOK TENYÉSZTÉSETENYÉSZTÉSE

A növekedést befolyásoló tényezők• Tápanyagok

– Szénforrás (CH, AS szénlánca), nitrogénforrás (pepton, ammónia) !!

– növekedési faktorok, vitaminok, nyomelemek

• Hőmérséklet– pszichrofil (<20°C)– mezofil – termofil (>50

Thermus aquaticus)

• pH– acidofil (Lactobacillus) – alkalofil (Vibrio

cholerae), legtöbb 7,2-7,6

Oxigénigény

• Obligát aerob (csak O2 jelenlétében M. tuberculosis) / fakultatív anaerob / obligát anaerob (Clostridiumok, toxikus az O2,)

• CO2 atmoszféra mértéke

– légköri = 0.03%– Mikroaerofil (alacsony O2, magas CO2, C. jejuni ), aerotoleráns (02

jelenlétében is fermentál S.pyogenes)

• Toxikus oxigénformák közömbösítésének képessége:

Szuperoxid diszmutáz (2 O2- + 2 H+ H2O2 + O2)

Kataláz (2 H2O2 2 H2O + O2)

Táplálkozási típusok - I

• Autotróf

– szervetlenből szervest építenek fel

– ehhez energiaforrás:• fény (fotoautotrófok)• oxidáció (kemoautotrófok)

pl. szulfid szulfát, nitrit nitrát

– kórtani jelentőségük nincs

Táplálkozási típusok - II

• Heterotróf– szerves tápanyagot igényelnek– C-forrás: glükóz, tejsav, keményítő, …– N-forrás: aminosavak, …– majdnem az összes patogén ide tartozik

• Paratróf– csak élő sejtekben tudnak szaporodni – pl. lepra kórokozója (egértalpban), rickettsiák

Energianyerés típusai• Légzés (aerobok!)

– van kataláz és szuperoxid-diszmutáz enzim– szénhidrát anyagcsere:

glükóz piroszőlősav citrátkör légzési lánc sok ATP + CO2 + H2O

– terminális elektron-akceptor = O2

• Fermentáció (anaerobok!)– nincs enzim a káros oxidációs termékek semlegesítésére

glükóz etanol + tejsav kevés ATP + CO2 + H2

Baktériumok növekedési görbéje

Idő

Log

sej

tszá

m

IV

III

II

I

I. Lag fázis (adaptáció)

II. Log fázis (exponenciális növekedés)

III. Stacioner fázis (élő sejtszám változatlan)

IV. Deklinációs fázis (hanyatlás, fogyás)

Generációs idő 20/40 perc de M. tuberculosis 20h !!

Táptalajok - I• Halmazállapot szerint

– folyékony (húslé, buillon)– szilárd (lemez, magas, ferde agar, Koch találta ki) Petri Petri

csésze!csésze!

• Előállítás szerint– természetes (epe, tej, húslé, ...)– mesterséges

• Funkció szerint– „normál”– szelektív (pl antibiotikummal gátlódik ami nem érdekel minket)

– differenciáló ( biokém tul alapján elkülöníthetőek a hasonló baktériumok)

– dúsító

STERILITÁS !!!

Táptalajok - II

• Bouillon

• Ferde és magas agar

• Dúsítók: húsos és szérum bouillon

Táptalajok - III

Egyszerű lemez agar

Véres agar

Csokoládé agar

Telepmorfológiai jellemzők

• telep nagysága• telep fénye (tükröződő, opál, áttetsző)• telep alak (ép szélű, csipkézett, köldökös ,

kerek, platószerű)• telep állaga (sima, száraz, gumiszerű, elfolyós)• telep színe (pigment termelés)• hemolízis: és • tenyészet szaga (hársfa, fokhagyma)

• Hogy ezeket lássuk, IZOLÁLT TELEPEK-re van szükségünk:

Telepmorfológiai jellemzők

Mintatenyészetek - I

• Escherichia coli agar táptalajon– semmi különös jellemző, átlagos

telepek

• Klebsiella agar táptalajon– nagy poliszaccharid tok

nyálkás telepek

Mintatenyészetek - II

• Bacillus cereus agar táptalajon– erősen nyálkás, csipkézett szélű, felhő-szerű

(„medúzafő-szerű”) tenyészet, ritka az izolált telep

Mintatenyészetek - III

• Proteus mirabilis agar táptalajon– rajzás !

Mintatenyészetek - IVIntracelluláris pigmenttermelés

• Staphylococcus aureus– arany pigment

• Staphylococcus epidermidis– fehér pigment

• Serratia marcescens– vérvörös pigment

Mintatenyészetek - V Extracelluláris pigmenttermelés

• Pseudomonas auruginosa– többféle pigment, extracellulárisan az egész

táptalaj elszíneződik– a zöld pigment dominál táptalajon

Mintatenyészetek - VI - hemolízis-hemolízis:

– Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus

– teljes feltisztulás

-hemolízis:– Streptococcus pneumoniae,

zöldítő streptococcusok– zöld terület a telepek körül Véres agaron Csokoládé agaron

Csak véres agaron

Anaerob tenyésztésI - Fizikai módszerek

• O2 kiforralása

• O2 kiszívása (vákuum – anaerosztát)

• Szúrt tenyészet magas agaron (karácsonyfa)

Anaerob tenyésztésII - Kémiai módszerek

1. Redoxpotenciál csökkentése– Holman médium (apróra

darált húsdarabkák)– tioglikolátos médium– indikátor jelzi az

átlevegősödést– lezárás paraffin gyűrűvel

Anaerob tenyésztésII - Kémiai módszerek

2. Preis módszer– erősen O2-igényes reakció

játszódik le a tenyésztési térben– GasPak: a tenyészetek

behelyezése után a felszakított zacskókban levő reagensek reagálni tudnak egymással, elvonva az oxigént (CO2

fejlesztés)

Anaerob tenyésztésIII - Biológiai módszer

• Fortner eljárás– elavult!!– A két részre osztott Petri csésze egyik térfelén

erősen aerob baktériumot (pl. Serratia) tenyésztünk, ami elvonja az összes oxigént

Hemokultúra - I

• Vér vagy más steril minta tenyésztésére

• Milyen esetben alkalmazzuk:– meningitis, endocarditis, bacteraemia,

szisztémás fertőzés gyanúja, peritonitis, FUO (=ismeretlen eredetű láz), mesterséges lélegeztetés során kialakuló fertőzés, kórokozó váltás terápia alatt, implantáció utáni láz, …

• Inkubációs idő: 7-10 nap– de: 80-90%-ban már az első 24 óra alatt pozitív

lesz!

Hemokultúra - II• Fontos szabályok

– Legalább két minta kell: kül. helyekről, kül. időben !

– Frissen szúrt vénából !!– legjobb a láz kezdetén– elegendő mennyiséget kell levenni (2-30 ml)

• Sterilitás!!

• Antibiotikum kezelés alatt:– ab-kötő gyöngyökkel

• Aerob / anaerob palackpár

Hemokultúra - III

Transzport médiumok - I• Transzport közeg

– példa: Stuart médium– a baktériumok maximum 48 óráig túlélnek, de

nem szaporodnak– 0,2%-os agar– Tárolás szobahőn!– anaerobok is túlélnek

Transzport médiumok - II

• Transzport táptalajok– A baktériumok szaporodnak is benne, mire a

laborba érnek – Példák: Uriline, Uricult, Gonoline, stb.– Műanyag lemez két oldalán két vagy három

különböző táptalaj (szelektívek is)

Biofilm - I• Jelentősége

– vízben élő mikroorganizmusok 99,9%-a biofilmként él a felszíneken

– élő szervezetben: felületek kolonizációja (natív és beültetett)

• Kialakulása– előkészítő réteg (slime képzés): elektrolitok (Ca2+,

Mg2+), fehérjék, stb.– baktériumok letapadása, konzorcium létrehozása– biofilm leszakadása (disszemináció) planktonikus

Biofilm - II

• Kimutatása– elektronmikroszkóppal– üvegcső falán, festéssel

• Antibiotikum rezisztencia nagyobb– penetráció gátolt– szaporodás lassúbb– géntranszfer sokkal

intenzívebb (+leszakadáskor elviszik!)

Antibiotikum rezisztencia: biofilm versus planktonikus fázis

Baktérium Antibiotikum MIC [mg/L] a planktonikus fázisban

MIC [mg/L] a biofilmben

Staph. aureus vancomycin 2 20

Pseudomonas aeruginosa

imipenem 1 1024

E. coli ampicillin 2 512

P. pseudomallei ceftazidim 8 800

Str. sanguis doxycyclin 0.063 3.15

Donlan, Clin Microbiol Rev. 2002; 15(2): 167–193.

Biofilm - III• Kórképek biofilmmel:

– natív szívbillentyű endocarditis (Streptococcus, S. aureus, Enterococcus , Candida, Aspergillus)

– beültetett eszközök: érpálya kanülök (pl. centrális vénás, perifériás), húgyúti katéterek (Enterococcus, Gram -, Pseudomonas, Serratia, Citrobacter), műbillentyű, intrauterin eszközök, fogászati implantátumok (titánium), kontakt lencse, beültetett szemlencse, csípőprotézis, térdprotézis, …

– krónikus bakteriális prostatitis– CF (cisztikus fibrózis): Pseudomonas aeruginosa, S.

aureus, Burkholderia, H. influenzae (alginát képzés!)– periodontitis, fog plaque