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8/7/2019 biluribin skin

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B i o c h e m . J . ( 1 9 7 3 ) 1 3 6 , 3 5 - 4 3P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

U p t a k e a n d R e l e a s e o f B i l i r u b i n b y S k i nB y CHIRANJIV L . KAPOOR a n d COIMBATORE R . KR ISH NA MUR TI

D i v i s i o n o f B i o c h e m i s t r y , C e n t r a l D r u g R e s e a r c h I n s t i t u t e , L u c k n o w , I n d i aa n d PRAKASH C . BAJPAID e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s , K i n g G e o r g e M e d i c a l C o l l e g e , L u c k n o w , I n d i a( R e c e i v e d 2 5 S e p t e m b e r 1 9 7 2 )

1 . S k i n e p i t h e l i u m o f a l b i n o r a t , mouse a n d g u i n e a p i g w a s s h o w n t o a c c u m u l a t e b i l i r u b i nf r o m a m e d i u m c o n t a i n i n g f r e e o r b o u n d b i l i r u b i n . 2 . T h e K m v a l u e s f o r b o u n d b i l i r u b i nw e r e 2 . 2 2 x 1 0 - 3 , 1 . 3 3 x 1 0 - 3 a n d 9 . 5 x 1 0 - 4 M f o r r a t , mouse a n d g u i n e a p i g r e s p e c t i v e l ya n d t h e c o r r e s p o n d i n g Km v a l u e s f o r f r e e b i l i r u b i n w e r e 5 . 2 x 1 0 - 4 , 4 . 0 x 1 0 - 4 , 1 . 8 x 1 0 - 4 M ;t h e V , , , . . v a l u e s o f b o u n d a n d f r e e b i l i r u b i n w e r e u n c h a n g e d . 3 . T h e u p t a k e s h o w e d s a t u r a -t i o n k i n e t i c s . B o u n d b i l i r u b i n w a s r e l e a s e d t o g e t h e r w i t h s e r u m p r o t e i n s . F r e e b i l i r u b i nb o u n d t o s k i n w a s n o t r e l e a s e d i n t o t h e m e d i u m . 4 . F r e e z i n g a n d t h a w i n g o f s k i n e p i t h e l i u md i d n o t c a u s e a n y s i g n i f i c a n t l o w e r i n g o f t h e u p t a k e o f b i l i r u b i n b u t h e a t - d e n a t u r e d s k i ne p i d e r m i s t o o k u p o n l y 50% o f t h e b o u n d b i l i r u b i n o r f r e e b i l i r u b i n t a k e n u p b y c o n t r o lu n h e a t e d s k i n e p i t h e l i u m . 5 . T h e u p t a k e o f f r e e a n d b o u n d b i l i r u b i n w a s p r e v e n t e d b yH g C 1 2 b u t n o t b y s o d i u m a r s e n a t e , NaCN, N a F , c y c l o h e x i m i d e , 2 , 4 - d i n i t r o p h e n o l o ri o d o a c e t a t e . 6 . M o s t o f t h e f r e e b i l i r u b i n w a s b o u n d t o t h e l i p i d s o r l i p o p r o t e i n f r a c t i o no f s k i n e p i t h e l i u m a n d c o u l d b e e x t r a c t e d b y s o l v e n t s . 7 . R a t s k i n s h o w e d t h e h i g h e s ta c c u m u l a t i o n a n d e f f l u x o f b i l i r u b i n .

Y e l l o w d i s c o l o u r a t i o n o f s k i n occurs i n h y p e r b i l i -r u b i n a e m i a o f t h e n e w b o r n a n d i n o l d e r p e o p l e . Ag l u c u r o n a t e - t r a n s f e r m e c h a n i s m t h a t c a n c o n v e r tb i l i r u b i n i n t o i t s g l u c u r o n i d e i s p r e s e n t i n t h e e p i t h e l i a ll a y e r s o f t h e i n t e s t i n e s ( S t e v e n s e n & D u t t o n , 1 9 6 2 )a n d t h e e x i s t e n c e o f an u p t a k e m e c h a n i s m f o r b i l i -r u b i n i n f a t - c e l l s , e p i d e r m a l c e l l s and nervous t i s s u eh a s b e e n s u g g e s t e d ( B e h r m a n & H s i a , 1 9 6 9 ) . I t i sp r e s u m a b l e f r o m t h e s e r e p o r t s t h a t t h e s k i n i se q u i p p e d w i t h a m e c h a n i s m f o r t h e u p t a k e , c o n c e n t r a -t i o n a n d m e t a b o l i s m o f b i l i r u b i n . As p a r t o f a n i n -v e s t i g a t i o n on t h e d e t o x i c a t i o n o f b i l i r u b i n b y p h o t o -t h e r a p y i n h y p e r b i l i r u b i n a e m i a o f t h e n e w b o r n( B a j p a i e t a l . , 1 9 7 3 ) , t h e p r e s e n t s t u d y d e a l s w i t h t h ek i n e t i c s o f u p t a k e a n d e f f l u x o f b i l i r u b i n b y s k i n s e g -m e n t s o f t h e a l b i n o r a t , m o u s e a n d g u i n e a p i g .E x p e r i m e n t a lC h e m i c a l s a n d r e a g e n t s

C r y s t a l l i n e b i l i r u b i n f o r b i o c h e m i s t r y wa s a p r o d u c to f E . M e r c k , D a r m s t a d t , G e r m a n y , a n d gaveE8 0 0 0 - 6 1 0 0 0 l i t r e - m o l 1 * c m - a t 450nm i n c h l o r o -f o r m . S e p h a d e x G - 1 0 ( p a r t i c l e s i z e 4 0 - 6 0 , ) was o b -t a i n e d f r o m P h a r m a c i a , U p p s a l a , S w e d e n . CyanogumR 4 1 ( m i x t u r e o f a c r y l a m i d e a n d N N ' - m e t h y l e n e -b i s a c r y l a m i d e ) was f r o m A m e r i c a n C y a n a m i d e C o . ,W a y n e , N . J . , U . S . A . , N N N ' N ' - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e -d i a m i n e f r o m Eastman O r g a n i c C h e m i c a l s , R o c h -e s t e r , N . Y . , U . S . A . , D e x t r a n B l u e f r o m S e r v a F i n eV o l . 1 3 6

B i o c h e m i c a , H e i d e l b e r g , G e r m a n y , T r i s ( u l t r a p u r e )f r o m Mann R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s I n c . , Ne w Y o r k ,N . Y . , U . S . A . a n d b o v i n e s e r u m a l b u m i n , humans e r u m a l b u m i n a n d i o d o a c e t a t e f r o m S i g m a C h e m i c a lC o . , S t . L o u i s , M o . , U . S . A . p - I o d o a n i l i n e was pre-p a r e d i n t h e l a b o r a t o r y b y s t a n d a r d m e t h o d s ( V o g e l ,1 9 6 8 ) . T h e o t h e r c h e m i c a l s u s e d wer e o f A n a l a Rg r a d e .A n i m a l s

T h e a n i m a l s u s e d were d r a w n f r o m t h e S t o c kC o l o n y o f t h e C e n t r a l Drug R e s e a r c h I n s t i t u t e ,L u c k n o w .M e t h o d s

P r e p a r a t i o n o f s k i n s e g m e n t . A n i m a l s wer e s t a r v e do v e r n i g h t a n d p o r t i o n s on t h e a b d o m i n a l r e g i o ns h a v e d w i t h a n e l e c t r i c s h a v e r . T h e a n i m a l s we r ek i l l e d b y d e c a p i t a t i o n , s k i n p i e c e s w e r e c u t o u t( a p p r o x . 5 c m 2 ) a n d t r a n s f e r r e d t o c h i l l e d 150mM-K C I . T h e p r o c e d u r e o f S a h i b & K r i s h n a M u r t i ( 1 9 6 9 )b a s e d on t h a t o f Van S c o t t ( 1 9 5 2 ) was u s e d f o r sep ara-t i n g e p i d e r m a l l a y e r s .B i l i r u b i n s o l u t i o n . B i l i r u b i n s o l u t i o n wa s p r e p a r e db y q u i c k l y d i s s o l v i n g 20mg o f t h e c r y s t a l l i n e com-p o u n d i n 0 . 5 m l o f 0 . 1 M-NaOH a n d m a k i n g t h e v o l -ume up t o 1 0 m l w i t h d i s t i l l e d w a t e r . T h e p H wasi m m e d i a t e l y a d j u s t e d t o a b o u t 9 . T h e s o l u t i o n wa s

3 5


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C . L . KAPOOR, C . R . KRISHNA MURTI AND P . C . BAJPAI

k e p t i n t h e d a r k a t a b o u t 5 C , i t s c a t 440nm w a s5 1 2 0 0 l i t r e m o l - c m - l a n d i t w a s u s e d w i t h i n 1 ho f p r e p a r a t i o n .Human s e r u m s a t u r a t e d w i t h b i l i r u b i n . B l o o d t a k e nf r o m d o n o r s o f t h e B l o o d B a n k o f K . G . M e d i c a lC o l l e g e , L u c k n o w , w a s a l l o w e d t o c l o t a n d t h e s e r u mr e c o v e r e d . P o r t i o n s ( 1 0 - 2 0 m l ) o f s e r u m w e r e m i x e dw i t h 3 0 - 6 0 m g o f b i l i r u b i n d i s s o l v e d i n a f e w d r o p s o f0 . 1 M-NaOH a n d t h e p H o f t h e s u s p e n s i o n a d j u s t e dt o 7 . 5 w i t h 3 v o l . o f K r e b s - R i n g e r p h o s p h a t e b u f f e ro f t h e f o l l o w i n g c o m p o s i t i o n : N a C l , 1 2 2 m M ; K C 1 ,5 . 0 m M ; M g S O 4 , 1 . 2 m M ; C a C 1 2 , 1 . O m M ; N a 2 H P O 4 ,1 6 m M . T h e s o l u t i o n w a s p l a c e d i n 1 2 m l p l a s t i cc e n t r i f u g e t u b e s a n d c e n t r i f u g e d i n a n o . 4 0 r o t o r o fa S p i n c o m o d e l L p r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g e a t3 9 0 0 0 r e v . / m i n ( 1 0 0 3 2 8 g ; r a , . 5 . 9 c m ) f o r 1 h a t 5 C .T h e s u p e r n a t a n t w a s s a v e d a n d u s e d a s s e r u ms a t u r a t e d w i t h b i l i r u b i n .

A l t e r n a t i v e l y t h e s e r u m - b u f f e r m i x t u r e w a s f i l t e r e dt h r o u g h a c o l u m n ( l 0 c m x 1 . 2 c m ) o f S e p h a d e x G - 1 0p r e v i o u s l y e q u i l i b r a t e d w i t h K r e b s - R i n g e r p h o s -p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 . T h e f i l t r a t e w a s u s e d a s s e r u ms a t u r a t e d w i t h b i l i r u b i n .U p t a k e a n d e f f l u x s t u d i e s . To f l a s k s ( 2 5 m l E r l e n -m y e r ) e a c h c o n t a i n i n g 0 . 5 g p o r t i o n s o f e p i d e r m a ls e g m e n t s a n d 5 m l o f K r e b s - R i n g e r b u f f e r , p H 7 . 5 ,

4 .9 - ~._

w a s a d d e d s e r u m s a t u r a t e d w i t h b i l i r u b i n o r a na q u e o u s s o l u t i o n o f b i l i r u b i n t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o no f 0 . 4 2 7 m M . W i t h t h e i r m o u t h s c l o s e d w i t h a l u m i -n i u m f o i l , t h e f l a s k s w e r e s h a k e n i n t h e d a r k i n am e t a b o l i c s h a k e r ( 6 0 s t r o k e s / m i n , a m p l i t u d e 2 c m )f o r t h e r e q u i r e d p e r i o d . T h e s k i n s e g m e n t s w e r e t h e nw a s h e d f r e e f r o m m e d i u m , h o m o g e n i z e d a n d u s e df o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f b i l i r u b i n . I n t h e e f f l u xs t u d i e s , s k i n s e g m e n t s p r e i n c u b a t e d i n s e r u m s a t u -r a t e d w i t h b i l i r u b i n o r a q u e o u s s o l u t i o n o f b i l i r u b i nw e r e w a s h e d t w i c e w i t h c h i l l e d K r e b s - R i n g e r b u f f e r ,p H 7 . 5 , a n d t h e n t r a n s f e r r e d t o f r e s h l o t s o f K r e b s -R i n g e r b u f f e r a n d s h a k e n a g a i n f o r 2 h . T h e m e d i u mw a s r e c o v e r e d a n d u s e d f o r t h e a s s a y o f e f f l u x e d b i l i -r u b i n a n d p r o t e i n s .P r e p a r a t i o n o f h o m o g e n a t e s . T h e e p i d e r m a l s t r i p sw e r e s u s p e n d e d i n 1 5 0 m M - K C l a n d k e p t f r o z e n a t- 1 8 C a n d a l l o w e d t o t h a w a t 4 0 - 4 5 0 C . F r e e z i n g a n dt h a w i n g w e r e r e p e a t e d a t l e a s t f o u r t i m e s ; t h e s u s -p e n s i o n w a s t h e n m a d e u p t o 9 v o l . w i t h 1 5 0 m M - K C la n d h o m o g e n i z e d i n a p o w e r - d r i v e n P o t t e r - E l v e h j e mg l a s s h o m o g e n i z e r f i t t e d w i t h a T e f l o n p e s t l e o r i n aP y r e x ( A . H . T h o m a s , P h i l a d e l p h i a , P a . , U . S . A . ) n o .7 7 2 5 g l a s s h o m o g e n i z e r . B y r u n n i n g t h e h o m o g e n i z e ra t m a x i m u m s p e e d f o r 2 0 m i n o n e c o u l d g e t a f a i r l yu n i f o r m h o m o g e n a t e b y t h e a b o v e p r o c e d u r e . A l t e r -

T i m e ( h )F i g . 1 . U p t a k e o f b i l i r u b i n b y r a t , m o u s e a n d g u i n e a - p i g s k i n e p i d e r m i s w i t h t i m e

A , F r e e b i l i r u b i n ; e , b o u n d b i l i r u b i n . S k i n e p i t h e l i u m s t r i p s ( 5 0 0 m g ) w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 C i n 5 m l o f i n c u b a t i o nm e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 4 2 7 m M - b o u n d b i l i r u b i n o r 0 . 4 2 7 m M - f r e e b i l i r u b i n . A t v a r i o u s t i m e - i n t e r v a l s u p t a k e o fb i l i r u b i n w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . T h e v e r t i c a l b a r s a r e t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n( S . D . ) o f t h e m ean v a l u e s f r o m a t l e a s t t h r e e e x p e r i m e n t s . ( a ) R a t ; ( b ) g u i n e a p i g ; ( c ) m o u s e .

1 9 7 3

3 6


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BILIRUBIN IN SKIN

n a t i v e l y t h e e p i d e r m a l s e g m e n t s w e r e t h r o w n i n t ol i q u i d a i r , t h e f r o z e n p e l l e t s t h a w e d a t roomt e m p e r a t u r e a n d t h e o p e r a t i o n r e p e a t e d t o g e t ap u l p y m a s s t h a t c o u l d b e h o m o g e n i z e d i n t h eP o t t e r - E l v e h j e m h o m o g e n i z e r a s a b o v e .H e a t - t r e a t m e n t . E p i d e r m a l s e g m e n t s i n K r e b s -R i n g e r b u f f e r , p H 7 . 5 , w e r e k e p t a t t h e r e q u i s i t e t e m -p e r a t u r e f o r 5 m i n .D e t e r m i n a t i o n o f b i l i r u b i n . F r e e b i l i r u b i n i n c r u d eh o m o g e n a t e s o r e f f l u x m e d i a w a s d e t e r m i n e d b y t h ep r o c e d u r e d e s c r i b e d b y Van Roy e t a l . ( 1 9 7 1 ) w h i c hg a v e o v e r 94% r e c o v e r y o f b i l i r u b i n a d d e d t o s k i nh o m o g e n a t e s . T h e a z o p i g m e n t s w e r e e x t r a c t e d w i t hb u t y l a c e t a t e . T h e c o n c e n t r a t i o n o f b i l i r u b i n i n

m e d i u m w a s d e t e r m i n e d b y t h e m i c r o m e t h o d o fM a l l o y & E v e l y n ( 1 9 3 7 ) .P r o t e i n . P r o t e i n i n e f f l u x m e d i u m o r s e r u m w a sm e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f L o w r y e t a l . ( 1 9 5 1 ) w i t hd r y b o v i n e s e r u m a l b u m i n a s s t a n d a r d .I d e n t i f i c a t i o n o f e f f l u x e d p r o t e i n s . T h e p r o t e i n sr e l e a s e d b y 5 g o f r a t e p i d e r m i s w e r e p o o l e d , d i a l y s e do v e r n i g h t a g a i n s t g l a s s - d i s t i l l e d w a t e r a n d f r e e z e -d r i e d . P o l y a c r y l a m i d e - g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e p r o -t e i n s w a s d o n e a s d e s c r i b e d b y C l a r k e ( 1 9 6 4 ) . G l o b u -l i n p r e s e n t i n t h e p r o t e i n s w a s i d e n t i f i e d b y i m m u n o -d i f f u s i o n a g a i n s t C o o m b ' s s e r u m a s d e s c r i b e d b yK a b a t & M a y e r ( 1 9 6 1 ) .P r e p a r a t i o n o f l i p i d m i c e l l e s . R a t s k i n e p i t h e l i a l

T a b l e 1 . E f f e c t o f t i s s u e c o n c e n t r a t i o n o n u p t a k e o f b i l i r u b i n b y r a t , n m u s e a n d g u i n e a p i gE p i d e r m a l t i s s u e ( 2 0 0 - 1 0 0 0 m g ) w a s i n c u b a t e d i n 5 . 0 m l o f i n c u b a t i o n m e d i u m ( p H 7 . 5 ) c o n t a i n i n g 0 . 4 2 7 m M -b o u n d b i l i r u b i n o r 0 . 4 2 7 m M - f r e e b i l i r u b i n a t 3 7 C f o r 2 h . T h e u p t a k e o f b i l i r u b i n w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d i nt h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n .

B o u n d b i l i r u b i n ( u m o l )R a t3 67 81 2 61 6 82 1 0

G u i n e a p i g3 46 91 0 01 3 61 7 6

F r e e b i l i r u b i n ( u m o l )M o u s e

3 47 21 0 61 4 41 7 0

R a t1 2 82 5 54 4 45 4 46 7 0

G u i n e a p i g8 01 6 82 7 43 0 44 0 0

Mouse1 0 82 0 43 3 64 3 25 4 0

A B C D E A B C D E A B C D EF i g . 2 . U p t a k e o f b i l i r u b i n b y r a t , mouse, a n d g u i n e a - p i g s k i n as a f f e c t e d b y t e m p e r a t u r e o f i n c u b a t i o nE p i d e r m a l s t r i p s ( 5 0 0 m g ) we r e i n c u b a t e d a t A ( 4 0 C ) , B ( 1 5 +1C), C ( 2 5 1 0 C ) , D ( 3 7 1 O C ) , E (52 1 O C ) i n5 m l o f i n c u b a t i o n medium c o n t a i n i n g 0.427mM-bound b i l i r u b i n or 0 . 4 2 7 m M - f r e e b i l i r u b i n f o r 2 h . Each v a l u ep l o t t e d r e p r e s e n t s t h e mean o f two o r more s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . o , F r e e b i l i r u b i n ; * , bound b i l i r u b i n .V o l . 1 3 6

Wet w t . o ft i s s u e( g )0 . 2 00 . 4 00 . 6 00 . 8 01 . 0 0

' 4 -0

. 0. _ 1* m

3 7


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C . L . KAPOOR, C . R . KRISHNA MURTI AND P . C . BAJPA

h o m o g e n a t e w a s e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m - m e t h a -n o l ( 2 : 1 , v / v ) m i x t u r e b y t h e p r o c e d u r e o f F o l c he t a l . ( 1 9 5 7 ) . S a m p l e s o f t o t a l l i p i d s ( 1 0 m g ) d i s p e r s e di n 5 0 m M - s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 , 5 0 m M -T r i s - H C l b u f f e r , p H 7 . 5 , w e r e e x p o s e d t o u l t r a s o n i cw a v e s f o r 1 0 m i n a t 2 0 k H z ( M u l l a r d , L o n d o n W . C . 1 ,U . K . ) . A f t e r s o n i c d i s r u p t i o n s a m p l e s w e r e c e n t r i -f u g e d a t 5 C a t 1 0 0 3 2 8 g ( r a , . 5 . 9 ) f o r 6 0 m i n . T h es u p e r n a t a n t w a s u s e d a s t h e s o u r c e o f l i p i d m i c e l l e s( K a p o o r e t a l . , 1 9 7 2 ) .R e s u l t sB i l i r u b i n b i n d i n g c a p a c i t y o f h u m a n s e r u m

A t p H 7 . 5 2 5 2 m g o f b i l i r u b i n w e r e b o u n d / l i t r e o fs e r u m . A n a l y s i s o f 1 2 d i f f e r e n t s e r a g a v e b i l i r u b i nb i n d i n g c a p a c i t y o f 2 2 0 - 2 7 4 m g o f b i l i r u b i n / 1 0 0 m l( 2 6 . 0 x 1 0 2 0 m o l e c u l e s / l i t r e o f s e r u m ) . T h e b i n d i n gc a p a c i t y i n c r e a s e d w h e n t h e p H w a s a d j u s t e d f r o m 6t o 8 . 5 . T h e r e f o r e t h e s e r u m u s e d f o r p r o v i d i n g b o u n db i l i r u b i n c o n t a i n e d t h e a b o v e c o n c e n t r a t i o n o f b o u n db i l i r u b i n .

E f f e c t o f p r e h e a t i n g s k i n o n b i l i r u b i z u p t a k eT h e e f f e c t o f p r e h e a t i n g s k i n s e g m e n t s t o d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s o n i t s c a p a c i t y t o c o n c e n t r a t e b i l i r u b i nf r o m t h e m e d i u m i s i l l u s t r a t e d i n T a b l e 3 a n dF i g . 6 .

S i t e s o f b i n d i n g o f b i l i r u b i n o n s k i nS i n c e t h e e f f l u x o f b i l i r u b i n f r o m s k i n w a s m o s t l ya c c o u n t a b l e a s b i l i r u b i n b o u n d t o s e r u m p r o t e i n s , i tw a s o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e t h e a m o u n t b o u n d a n dh e l d i n t h e e x t r a v a s c u l a r s p a c e b y s k i n c o m p o n e n t so t h e r t h a n s e r u m p r o t e i n s . F o r t h i s , s k i n s e g m e n t si n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f f r e e a n d b o u n d b i l i r u b i nw e r e s u b j e c t e d t o f r e e z i n g a n d t h a w i n g a n d h e a t -t r e a t m e n t a n d s o l v e n t e x t r a c t i o n a n d t h e r e s u l t s a r es u m m a r i z e d i n T a b l e s 4 a n d 5 .B i n d i n g o f b i l i r u b i n t o i s o l a t e d s k i n l i p i d m i c e l l e s

S k i n l i p i d m i c e l l e s p r e p a r e d f r o m r a t s k i n e p i -t h e l i u m w e r e a l l o w e d t o i n t e r a c t w i t h a q u e o u s b i l i -U p t a k e o f b i l i r u b i n b y e p i d e r m a l s e g m e n t s

T h e u p t a k e o f b i l i r u b i n a s f r e e b i l i r u b i n a n d a sb o u n d b i l i r u b i n b y r a t , m o u s e a n d g u i n e a - p i g e p i -d e r m a l s e g m e n t s a s a f f e c t e d b y t i m e o f i n c u b a t i o n i si l l u s t r a t e d i n F i g . 1 . T h e e f f e c t o f c o n c e n t r a t i o n o ft i s s u e o n t h e u p t a k e i s i l l u s t r a t e d i n T a b l e 1 , t h ee f f e c t o f t e m p e r a t u r e o f i n c u b a t i o n i n F i g . 2 a n d t h ee f f e c t o f p H o n t h e u p t a k e i n F i g . 3 .T h e r a t e o f u p t a k e a s a f f e c t e d b y c o n c e n t r a t i o n o fb i l i r u b i n i n t h e m e d i u m i s s h o w n i n F i g . 4 . T h e K mv a l u e s f o r b o u n d b i l i r u b i n w e r e 2 . 2 2 x 1 0 - 3 , 1 . 3 3 x 1 0 - 3a n d 9 . 5 x 1 0 - 4 M f o r r a t , m o u s e a n d g u i n e a - p i g s k i nr e s p e c t i v e l y a n d t h e K m v a l u e s f o r f r e e b i l i r u b i n w e r e5 . 2 x 1 0 - 4 , 4 . O x 1 0 - 4 a n d 1 . 8 x 1 0 - 4 M r e s p e c t i v e l y .E f f e c t o f i n h i b i t o r s

S o d i u m a r s e n a t e , NaCN, N a F , d i n i t r o p h e n o l a n dc y c l o h e x i m i d e d i d n o t i n h i b i t t h e u p t a k e o f b i l i r u b i n( T a b l e 2 ) . H g C l 2 ( 1 0 m M ) , h o w e v e r , c a u s e d 5 0 % i n h i -b i t i o n o f t h e u p t a k e .E f f l u x o f b i l i r u b i n f r o m s k i n

R e s u l t s o f e f f l u x e x p e r i m e n t s a r e r e p r e s e n t e d i nF i g . 5 . Mean r a t e s o f e f f l u x w e r e 0 . 8 1 , 0 . 8 0 a n d0 . 7 0 n m o l / m i n p e r g f o r r a t , m o u s e a n d g u i n e a - p i gs k i n r e s p e c t i v e l y . T h e e f f l u x w a s f a s t i n i t i a l l y , u p t o3 0 m i n .T h e e f f l u x m e d i u m c o n t a i n e d , t o g e t h e r w i t h b i l i -r u b i n , p r o t e i n s , w h i c h w e r e i d e n t i f i e d b y p o l y a c r y l -a m i d e - g e l e l e c t r o p h o r e s i s o r b y i m m u n o g e l - d i f f u s i o nt e c h n i q u e a s s e r u m a l b u m i n a n d g l o b u l i n ( r e s u l t s n o tg i v e n ) .

C . -0o n

. 9*;: =m q

o6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5p H

F i g . 3 . U p t a k e o f b i l i r u b i n a s a f f e c t e d b y t h e pH o ft h e m e d i u mE p i d e r m a l s t r i p s ( 5 0 0 m g ) w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r2 h i n 5 m l o f i n c u b a t i o n m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 4 2 7 mM-b o u n d o r - f r e e b i l i r u b i n . U p t a k e a n d d e t e r m i n a t i o n o fb i l i r u b i n w e r e f o l l o w e d a s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i -m e n t a l s e c t i o n . E a c h v a l u e p l o t t e d r e p r e s e n t s t h em ean o f t w o o r m o r e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . 0 , F r e eb i l i r u b i n i n r a t s k i n ; A , f r e e b i l i r u b i n i n m o u s e s k i n ;o , f r e e b i l i r u b i n i n g u i n e a - p i g s k i n ; * , b o u n d b i l i -r u b i n i n r a t s k i n ; A , b o u n d b i l i r u b i n i n m o u s e s k i n ;* , b o u n d b i i r u b i n i n g u i n e a - p i g s k i n .

1 9 7 3

3 8


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BILIRUBIN IN SKIN

r u b i n a n d t h e E 4 4 0 c h a n g e s w e r e f o l l o w e d . R e s u l t sa r e p r e s e n t e d i n F i g . 7 .D i s c u s s i o n

F r e e b i l i r u b i n i s r e l a t i v e l y i n s o l u b l e i n a q u e o u sm e d i u m ( B u r n s t i n e & S c h m i d , 1 9 6 2 ) a n d l i k e o t h e rw e a k l y a c i d i c s u b s t a n c e s i s t r a n s p o r t e d b y s e r u mb o u n d t o t h e p r o t e i n s ( K l a t s k i n & B u n g a r d s , 1 9 5 0 ;O s t r o w & S c h m i d , 1 9 6 3 ; C o o k e & R o b e r t , 1 9 6 9 ) . T h er e l a t i v e d i s t r i b u t i o n o f b i l i r u b i n i n v a r i o u s t i s s u e s

w o u l d d e p e n d t h e r e f o r e o n t h e b i l i r u b i n b i n d i n gc a p a c i t y o f s e r u m c o n s t i t u e n t s .T h e r e i s i n c r e a s i n g e v i d e n c e t h a t l i v e r i s p r e f e r e n -t i a l l y a b l e t o t r a n s f e r b i l i r u b i n f r o m p l a s m a t o p a r e n -c h y m a l c e l l s ( B r o w n e t a l . , 1 9 6 5 ; B e r n s t e i n e t a l . ,1 9 6 6 ) a n d c e r t a i n a n i o n - b i n d i n g p r o t e i n s l o c a t e d i nt h e c y t o p l a s m a r e i n v o l v e d i n t h e u p t a k e ( L e v i e t a l . ,1 9 6 9 ; F l e i s c h n e r & A r i a s , 1 9 7 0 ) . H a r g r e a v e s & P r i c e( 1 9 6 6 ) s t u d i e d t h e u p t a k e o f b i l i r u b i n b y l i v e r a n dk i d n e y s l i c e s i n v i t r o .T h e p r e s e n t s t u d i e s p r o v i d e u n e q u i v o c a l e v i d e n c e

1 / s ( m m - , )

8 0 0 -

3,,,,-,,< ',._0 6 0 0, 0

0 l o 2 0 3 0 4 0 5 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0B i l i r u b i n i n i n c u b a t i o n m e d i u m ( m g % o )F i g . 4 . U p t a k e o f b i l i r u b i n f r o m ( d ) r a t , ( e ) g u i n e a - p i g a n d ( f ) m o u s e s k i n e p i t h e l i u m a n d L i n e w e a v e r - B u r k d o u b l e -r e c i p r o c a l p l o t s o f t h e u p t a k e o f b i l i r u b i n b y ( a ) r a t , ( b ) g u i n e a - p i g a n d ( c ) m o u s e s k i n e p i t h e l i u m s h o w i n g t h e g r a p h i c a lc a l c u l a t i o n s o f K m v a l u e s( a ) - ( c ) * , U p t a k e f r o m b o u n d - b i l i r u b i n m e d i u m ; o , f r o m f r e e - b i l i r u b i n m e d i u m . ( d ) - ( f ) A , F r e e b i l i r u b i n ; * ,b o u n d b i l i r u b i n . S k i n s t r i p s ( 5 0 0 m g ) w e r e i n c u b a t e d i n i n c r e a s i n g 5 - 5 0 m g % ( 0 . 0 8 5 4 - 0 . 8 5 4 m M ) c o n c e n t r a t i o n so f b o u n d a n d f r e e b i l i r u b i n i n i n c u b a t i o n medium ( p H 7 . 5 ) a t 3 7 C f o r 2 h . T h e u p t a k e a n d d e t e r m i n a t i o n o fb i l i r u b i n w e r e f o l l o w e d a s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . T h e b a r s r e p r e s e n t t h e S . D . o f t h e mean v a l u e sf r o m a t l e a s t t h r e e e x p e r i m e n t s .V o L . 1 3 6

3 9


6/9

C . L . KAPOOR, C . R . KRISHNA MURTI AND P . C . BAJPAIT a b l e 2 . E f f e c t o f i n h i b i t o r s o n t h e u p t a k e o f b i l i r u b i n b y r a t s k i n e p i t h e l i u m

S k i n e p i t h e l i u m s t r i p s ( 5 0 0 m g ) w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 2 h i n 5 m l o f i n c u b a t i o n m e d i u m ( K r e b s - R i n g e r b u f f e r ,p H 7 . 5 ) c o n t a i n i n g 0 . 4 2 7 m M - b o u n d o r - f r e e b i l i r u b i n a s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . I n h i b i t o r s w e r ea d d e d t o t h e i n d i c a t e d f i n a l c o n c e n t r a t i o n s . E a c h r e s u l t i s t h e mean o f t h e v a l u e s f r o m t w o s e p a r a t e e x p e r i m e n t s .B i l i r u b i n ( n m o l / g o f t i s s u e )

C o n c e n t r a t i o n B o u n d F r e eI n h i b i t o r ( m M ) b i l i r u b i n b i l i r u b i nN i l 2 0 4 7 8 0S o d i u m a r s e n a t e 0 . 1 1 8 6 8 1 01 . 0 2 1 4 7 9 01 0 . 0 2 2 0 7 4 0N a C N 0 . 1 2 0 0 8 1 01 . 0 1 8 6 7 7 01 0 . 0 2 0 3 7 4 0Na F 0 . 1 2 0 0 7 6 01 . 0 1 9 4 7 2 0

1 0 . 0 1 8 0 7 4 0H g C I 2 0 . 1 1 8 0 8 0 01 . 0 1 6 0 6 2 41 0 . 0 1 0 0 4 1 0C y c l o h e x i m i d e 0 . 1 2 0 6 7 8 01 . 0 2 0 4 8 3 01 0 . 0 2 0 0 8 4 02 , 4 - D i n i t r o p h e n o l 0 . 1 1 9 0 7 6 61 . 0 1 9 2 7 0 01 0 . 0 1 9 6 8 8 0l o d o a c e t i c a c i d 0 . 1 2 0 6 8 2 01 . 0 1 8 4 8 3 0

1 0 . 0 1 6 0 7 4 4250-60( a ) ( b ) ( c ) 6 .- ~ 2 0 0 5 . -

o.-4 . 0 4 -150~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~.~002 . 0 '

1 . 0 ~

0 1 . 0 2 . 0 0 1 . 0 2 . 0 0 1 . 0 2 . 0T i m e ( h )F i g . 5 . E f f l u x o f b i l i r u b i n f r o m r a t , m o u s e a n d g u i n e a - p i g s k i n e p i t h e l i u mT i s s u e ( 5 0 0 m g ) w a s i n c u b a t e d i n 5 m l o f i n c u b a t i o n m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 4 2 7 m M - b o u n d b i l i r u b i n ( c o n t a i n i n g3 6 . 5 m g o f s e r u m p r o t e i n ) a t 3 7 C f o r 2 h , w a s h e d f r e e f r o m m e d i u m a n d t h e n i n c u b a t e d i n 5 m l o f K r e b s - R i n g e rb u f f e r ( p H 7 . 5 ) . T h e r e l e a s e o f b i l i r u b i n ( M ) a n d p r o t e i n ( o ) w e r e f o l l o w e d f o r 2 h . T h e b a r s r e p r e s e n t t h e S . D . o ft h e mean v a l u e s f r o m t h r e e o r m o r e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . ( a ) R a t ; ( b ) g u i n e a p i g , ( c ) m o u s e . X , I n i t i a l b i l i r u b i nc o n t e n t o f s k i n s t r i p s . 1 9 7 3

4 0


7/9

BILIRUBIN IN SKIN

8 0 0

6 0 0

' . 40t oi 4 0 0. 0-4. S

F -

2 0 0 _

v 2 5 f 5 0 7 5 1 0 0T e m p e r a t u r e ( C )

F i g . 6 . E f f e c t o f p r e h e a t i n g o n t h e u p t a k e o f b i l i r u b i n b yr a t s k i nA , F r e e b i l i r u b i n ; * , b o u n d b i l i r u b i n . T i s s u e ( 5 0 0 m g )w a s d e n a t u r e d b y h e a t i n g a t 3 7 0 , 5 0 0 , 6 0 0 , 8 0 0 a n d1 0 0 C f o r 5 m i n , c o o l e d t o room t e m p e r a t u r e ( 2 8 0 C )a n d u s e d i n t h e u p t a k e s t u d i e s a t 3 7 C i n 5 m l o f i n c u -b a t i o n m e d i u m ( p H 7 . 5 ) c o n t a i n i n g 0 . 4 2 7 m M - b o u n do r 0 . 4 2 7 m M - f r e e b i l i r u b i n f o r 2 h . T h e b a r s r e p r e s e n tt h e S . D . o f t h e mean v a l u e s f r o m t h r e e o r m o r e s e p a r -a t e e x p e r i m e n t s . T h e a r r o w s h o w s t h e i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e .

t o s h o w t h a t e p i d e r m a l s e g m e n t s o f t h e t h r e e m a m -m a l s s t u d i e d c a n p i c k u p b i l i r u b i n f r o m t h e m e d i u mw h e n t h e l a t t e r i s p r e s e n t e i t h e r i n t h e f r e e f o r m o r i nt h e b o u n d f o r m . T h e b o u n d f o r m i s p r e s u m a b l ye x c h a n g e d w i t h s e r u m p r o t e i n s p r e s e n t i n s k i n a s i se v i d e n t f r o m t h e e f f l u x s t u d i e s . T h e m a j o r p a r t o f t h eu p t a k e i s , h o w e v e r , a s f r e e b i l i r u b i n .D e n a t u r a t i o n e x p e r i m e n t s i n d i c a t e t h a t t h e r e a r es i t e s l o c a t e d o n t h e s k i n i t s e l f t h a t a c c o u n t f o r t h el a r g e u p t a k e o f f r e e b i l i r u b i n . P a r t o f t h i s u p t a k ec o u l d b e b y l i p i d s p r e s e n t i n s k i n , a s i s e v i d e n t f r o mb i n d i n g o f b i l i r u b i n t o s k i n l i p i d s i n v i t r o a n d t h e f a c tt h a t h e a t i n g o f s k i n s t r i p s a f t e r u p t a k e e x p e r i m e n t sr e l e a s e s s o m e o i l y s u b s t a n c e s c o n t a i n i n g b i l i r u b i n .E x t r a c t i o n w i t h s o l v e n t a l s o r e m o v e s m o s t o f t h eb i l i r u b i n p i c k e d u p b y s k i n s e g m e n t s . T h i s i s n o ts u r p r i s i n g f r o m t h e o b s e r v a t i o n t h a t e r y t h r o c y t em e m b r a n e l i p i d s c a n b i n d b i l i r u b i n ( K a p o o r e t a l . ,1 9 7 2 ) .T h e m a j o r p a r t o f f r e e b i l i r u b i n p i c k e d u p b y e p i -d e r m i s g o e s i n t o s o m e t i g h t b i n d i n g w i t h , p r e s u m a b l y ,t h e l i p o p r o t e i n s o f s k i n . S t e n h a g e n & R i d e a l ( 1 9 3 9 )s h o w e d t h a t b i n d i n g c a n t a k e p l a c e b e t w e e n p h e n o l i ch y d r o x y l g r o u p s o f b i l i r u b i n a n d t h e p r i m a r y a m i n og r o u p s o f p r o t e i n s o f s e r u m . I n t h e c a s e o f s e r u m a l b u -m i n , t h e f r e e a m i n o g r o u p s a r e p r e s u m a b l y c o n t r i -b u t e d b y i t s 5 5 l y s i n e r e s i d u e s a n d w h e n t h e s e a r eb l o c k e d b y m e t h y l i s o u r e a , b i n d i n g i s v e r y muchd i m i n i s h e d ( M a r t i n , 1 9 4 9 ) . H o w e v e r , i m m u n o g l o b u -l i n G , w h i c h h a s a h i g h l y s i n e c o n t e n t , d o e s n o t b i n db i l i r u b i n a n d h e n c e p r o p e r t i e s o t h e r t h a n f r e e l y s i n er e s i d u e s o f t h e p r o t e i n m o l e c ul e m u s t b e i n v o l v e di n t h e b i n d i n g .T h e b i n d i n g o f b i l i r u b i n t o s k i n c o n s t i t u e n t s t a k e sp l a c e w i t h i n a p H r a n g e o f 6 - 9 . T h i s b e h a v i o u r i ss o m e w h a t d i f f e r e n t f r o m t h a t o f a l b u m i n , t h e b i n d i n gp r o p e r t y o f w h i c h i s l i m i t e d t o a n a r r o w p H r a n g e( H a r g r e a v e s , 1 9 6 8 ) . T h e b i n d i n g o f f r e e b i l i r u b i n t os i t e s o n e p i d e r m i s i s s e n s i t i v e t o t e m p e r a t u r e a n d o nh e a t i n g f r o m 5 0 0 t o 7 5 C m o r e t h a n t w o - t h i r d s o f t h eo r i g i n a l a c t i v i t y i s l o s t . I n c o n t r a s t , h e a t - d e n a t u r e d

T a b l e 3 . E f f e c t o f h e a t i n g o f s k i n e p i t h e l i u m s t r i p s o n t h e u p t a k e o f b i l i r u b i nT h e e p i d e r m a l s e g m e n t s w e r e k e p t a t 1 0 0 C f o r 5 m i n , c o o l e d a n d u s e d i n u p t a k e s t u d i e s a t 3 7 C . Medium c o n -t a i n e d 0 . 4 2 7 m M - b i l i r u b i n b o u n d t o s e r u m o r 0 . 4 2 7 m M - b i l i r u b i n i n a q u e o u s m e d i u m . U p t a k e w a s a l l o w e d t op r o c e e d i n a n i n c u b a t i o n m e d i u m a s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . E a c h v a l u e r e p r e s e n t s t h e m e a n o ft w o t o f o u r s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . B i l i r u b i n ( n m o l / g o f t i s s u e )

E x p e r i m e n t a l a n i m a l . . .

N o r m a l s k i n e p i t h e l i u m s t r i p sH e a t e d s k i n e p i t h e l i u m s t r i p s

R a tB o u n d F r e e

2 0 8 6 9 08 5 3 0 0

MouseI IB o u n d F r e e

1 9 0 5 9 48 8 2 4 4

G u i n e a p i gIBound F r e e

1 5 0 4 1 07 2 1 5 0V o l . 1 3 6

4 1


8/9

C . L . KAPOOR, C . R . KR ISH NA MUR TI AND P . C . B A J P A I

T a b l e 4 . E f f e c t o f f r e e z i n g a n d t h a w i n g o f r a t s k i n e p i t h e l i u m o n t h e u p t a k e o f b i l i r u b i nE p i d e r m a l s t r i p s w e r e f r o z e n a t - 1 8 0 C ( l i q u i d a i r ) a n d t h a w e d a t room t e m p e r a t u r e ( 2 8 C ) ; f r e e z i n g a n d t h a w i n gw e r e r e p e a t e d f o u r t i m e s . T h e u p t a k e a n d m e a s u r e m e n t s o f b i l i r u b i n w e r e f o l l o w e d a s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i -m e n t a l s e c t i o n . T h e r e s u l t s s h o w t h e a m o u n t o f b i l i r u b i n h e l d b y t h e t i s s u e a f t e r e a c h t r e a t m e n t . F r e e z i n g a n dt h a w i n g d o n o t c a u s e a n y s i g n i f i c a n t l o w e r i n g i n t h e u p t a k e o f b i l i r u b i n , b u t h e a t i n g o f s u c h f r o z e n a n d t h a w e dt i s s u e d e c r e a s e d u p t a k e o f b o t h b o u n d a n d f r e e b i l i r u b i n b y a b o v e 5 0 % . E a c h v a l u e r e p r e s e n t s t h e mean o f t w ot o f o u r s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . B i l i r u b i n ( n m o l / g o f t i s s u e )

T r e a t m e n t sC o n t r o lF r o z e n a n d t h a w e dF r o z e n , t h a w e d a n d c e n t r i f u g e dF r o z e n , t h a w e d , c e n t r i f u g e d a n d h e a t e d

B o u n d1 9 11 5 51 7 49 5

F r e e7 4 37 0 36 4 83 7 0

T a b l e 5 . E f f e c t o f f r e e z i n g a n d t h a w i n g o n r a t s k i n e p i t h e l i u m a l l o w e d t o a c c u m u l a t e b i l i r u b i nE p i d e r m a l s t r i p s w e r e a l l o w e d t o a c c u m u l a t e b i l i r u b i n a s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n a n d t h e n f r o z e na n d t h a w e d . T h e a m o u n t o f b o u n d b i l i r u b i n p r e s e n t i n s k i n b e f o r e f r e e z i n g a n d t h a w i n g w a s 2 0 0 n m o l / g a n d f r e eb i l i r u b i n 6 7 0 n m o l / g . E a c h v a l u e i s t h e m e an o f t w o o r more s e p a r a t e e x p e r i m e n t s .

B i l i r u b i n a c c u m u l a t e d b y s k i ne p i t h e l i u m w i t hB o u n d b i l i r u b i nF r e e b i l i r u b i n

1 . 0 ~ 4 4 01 . 0 ( a )0 . 80 . 6 -0 . 4 4 50 . 2 " - - -

3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0W a v e l e n g t h ( n m )

B i l i r u b i n ( n m o l / g o f t i s s u e o rr e l e a s e d i n m e d i u m b y g o f t i s s u e )9 21 0

0 1 2 3 4 5T i m e ( m i n )

F i g . 7 . A b s o r b a n c e c h a n g e o f b i l i r u b i n s p e c t r u m o n b i n d i n g t o s k i n e p i t h e l i u m l i p i d m i c e l l e s( a ) C u r v e 1 . A b s o r p t i o n s p e c t r a o f 1 7 . 1 p M - b i l i r u b i n i n 5 0 m M - s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 , 5 0 m M -T r i s - H C I b u f f e r , p H 7 . 5 . C u r v e 2 . S a m e a s c u r v e 1 + 2 0 , u g o f l i p i d m i c e l l e s / m l . ( b ) D e c r e a s e o f E 4 4 0 o f b i l i r u b i ni n t h e p r e s e n c e o f s k i n l i p i d m i c e l l e s a s a f f e c t e d b y t i m e . * , N o l i p i d m i c e l l e s ; o , + 2 0 , u g o f l i p i d m i c e l l e s / m l .

s e r u m p r o t e i n i s r e p o r t e d t o h a v e a h i g h a f f i n i t y f o rb i l i r u b i n ( N o s s l i n , 1 9 6 0 ) ; b u t t h e b e h a v i o u r o f h e a t -d e n a t u r e d p r o t e i n s o f s k i n i n t h i s r e s p e c t a p p e a r s t ob e q u i t e d i f f e r e n t .H a r g r e a v e s & P r i c e ( 1 9 6 6 ) h a v e r e p o r t e d t h a t N a Fa n d N a C N d o n o t i n h i b i t t h e u p t a k e o f b i l i r u b i n b y

l i v e r s l i c e s s u g g e s t i n g t h a t o x i d a t i v e e n z y m e s may n o tb e i n v o l v e d i n t h e u p t a k e p r o c e s s . H e a t - d e n a t u r e dl i v e r s l i c e s h a v e b e e n s h o w n t o t a k e u p m o r e c o n j u -g a t e d b i l i r u b i n t h a n n o r m a l s l i c e s . T e m p e r a t u r e sa b o v e 5 5 - 6 0 C c a u s e d g r e a t e r d e n a t u r a t i o n o f l i v e rs l i c e s a n d g r e a t e r u p t a k e o f b i l i r u b i n p e r h a p s o w i n g

1 9 7 3

4 2

5


9/9

BILIRUBIN IN SKIN 4 3

t o e x p o s u r e o f m o r e b i l i r u b i n - b i n d i n g s i t e s ( H a r -g r e a v e s & P r i c e , 1 9 6 6 ; M a c k a y & M a r t i n , 1 9 5 7 ) . T h eb e h a v i o ur o f s k i n w a s i n c o n t r a s t w i t h t h i s , b e c a u s ea b o v e 5 0 C t h e r e w a s a s h a r p d e c l i n e i n t h e u p t a k e o fb o t h f r e e a n d b o u n d b i l i r u b i n .B i l i r u b i n i s c l o s e l y b o u n d t o p l a s m a a l b u m i n a n da s s u c h i s t r a n s p o r t e d t o t h e l i v e r o r o t h e r t i s s u e s f r o mt h e s i t e o f i t s f o r m a t i o n . T h e i n t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no f b i l i r u b i n w o u l d d e p e n d o n t h e p r e s e n c e o f i n t r a -c e l l u l a r b i n d i n g f o r c e s o f s u f f i c i e n t s t r e n g t h t o c o m -p e t e w i t h t h e b i n d i n g o f a l b u m i n p r e s e n t i n t h e e x t r a -c e l l u l a r c o m p a r t m e n t . T h a t s u c h f o r c e s d o e x i s t i ns k i n i s a p p a r e n t f r o m t h e p r e s e n t s t u d y .C o m m u n i c a t i o n n o . 1 7 8 3 f r o m C e n t r a l Drug R e s e a r c hI n s t i t u t e , L u c k n o w ( I n d i a ) . T h e a u t h o r s t h a n k t h e I n d i a nC o u n c i l o f M e d i c a l R e s e a r c h , N e w D e l h i f o r g e n e r o u sf i n a n c i a l a s s i s t a n c e .

R e f e r e n c e sB a j p a i , P . C . , M i s r a , P . K . , D a s , V . K . , S i n g h , D . , K a p o o r ,C . L . & K r i s h n a M u r t i , C . R . ( 1 9 7 3 ) I n d i a n J . M e d . R e s .6 1 , 5 7 7 - 5 8 8B e h r m a n , R . E . & H s i a , D . Y . Y . ( 1 9 6 9 ) J . P e d i a t . 7 5 ,7 1 8 - 7 2 6B e r n s t e i n , L . H . , B e r E z z e r , J . , G a r t n e r , L . & A r i a s , I . M.( 1 9 6 6 ) J . C l i n . I n v e s t . 4 5 , 1 1 9 4 - 1 2 0 1B r o w n , W . R . , G r o d s i k y , C . M. & C a r b o n e , S . V . ( 1 9 6 5 )A m e r . J . P h y s i o l . 2 0 7 , 1 2 3 7 - 1 2 4 1B u r n s t i n e , R . C . & S c h m i d , R . ( 1 9 6 2 ) P r o c . S o c . E x p .B i o l . M e d . 1 0 9 , 3 5 6 - 3 5 8C l a r k e , J . T . ( 1 9 6 4 ) A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 2 1 , 4 2 9 - 4 3 6C o o k e , J . R . & R o b e r t , L . B . ( 1 9 6 9 ) C l i n . C h i m . A c t a 2 6 ,4 2 5 - 4 3 6F l e i s c h n e r , G . & A r i a s , I . M. ( 1 9 7 0 ) A m e r . J . M e d . 4 9 ,5 7 6 - 5 8 9

F o l c h , J . , L e e s , M. & S l o a n e - S t a n l e y , G . H . ( 1 9 5 7 ) J . B i o l .C h e m . 2 2 6 , 4 9 7 - 5 0 9H a r g r e a v e s , T . ( 1 9 6 8 ) L i v e r a n d B i l e M e t a b o l i s m , p p . 6 9 -1 2 1 , Ne w Y o r k , N o r t h H o l l a n d P u b l i s h i n g C o m p a n y ,A m s t e r d a mH a r g r e a v e s , T . & P r i c e , V . ( 1 9 6 6 ) B i o c h e m . P h a r m a c o l . 1 5 ,6 5 7 - 6 6 7K a b a t , E . A . & M a y e r , M. M . ( 1 9 6 1 ) E x p e r i m e n t a l I m -m u n o c h e m i s t r y , p p . 2 2 - 9 6 , C h a r l e s C . T h o m a s ,S p r i n g f i e l d , I l l i n o i sK a p o o r , C . L . , K r i s h n a M u r t i , C . R . & B a j p a i , P . C . ( 1 9 7 2 )I n d i a n J . M e d . R e s . 6 0 , 9 1 8 - 9 2 8K l a t s k i n , G . & B u n g a r d s , L . ( 1 9 5 0 ) J . C l i n . I n v e s t . 2 9 ,6 6 0 - 6 7 6L e v i , A . J . , G a t m a i t a n , Z . & A r i a s , I . M . ( 1 9 6 9 ) J . C l i n .I n v e s t . 4 8 , 2 1 5 6 - 2 1 5 7L o w r y , 0 . H . , R o s e b r o u g h , N . J . , F a r r , A . L . & R a n d a l l ,R . J . ( 1 9 5 1 ) J . B i o l . C h e m . 1 9 3 , 2 6 5 - 2 7 5M a c k a y , M. E . & M a r t i n , N . H . ( 1 9 5 7 ) B i o c h e m . J . 6 5 ,2 8 4 - 2 8 8M a l l o y , H . T . & E v e l y n , K . A . ( 1 9 3 7 ) J . B i o l . C h e m . 1 1 9 ,4 8 1 - 4 9 0M a r t i n , N . H . ( 1 9 4 9 ) J . A m e r . C h e m . S o c . 7 1 , 1 2 3 0 - 1 2 3 2N o s s l i n , B . ( 1 9 6 0 ) S c a n d . J . L a b . C l i n . I n v e s t . 1 2 , S u p p l . 4 9O s t r o w , J . D . & S c h m i d , R . ( 1 9 6 3 ) J . C l i n . I n v e s t . 4 2 ,1 2 8 6 - 1 2 9 7S a h i b , M. K . & K r i s h n a M u r t i , C . R . ( 1 9 6 9 ) J . B i o l . C h e m .2 4 4 , 4 7 3 0 - 4 7 3 4S t e n h a g e n , E . & R i d e a l , E . K . ( 1 9 3 9 ) B i o c h e m . J . 3 3 , 1 5 9 1 -1 5 9 8S t e v e n s o n , I . H . & D u t t o n , G . J . ( 1 9 6 2 ) B i o c h e m . J . 8 2 ,3 3 0 - 3 4 0V a n R o y , F . P . , M e u w i s s e n , J . A . T . P . , D e M e u l e r , F . &H e i r w e g h , K . P . M . ( 1 9 7 1 ) C l i n . C h i m . A c t a 3 1 , 1 0 9 - 1 1 8V a n S c o t t , E . J . ( 1 9 5 2 ) J . I n v e s t . D e r m a t o l . 1 8 , 3 7 7 - 3 7 9V o g e l , A . I . ( 1 9 6 8 ) P r a c t i c a l O r g a n i c C h e m i s t r y , 3 r de d n . , p . 6 4 7 , E n g l i s h L a n g u a g e B o o k S o c i e t y a n dL o n g m a n s G r e e n a n d C o . L t d . , L o n d o n

V o l . 1 3 6

biluribin skin

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