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BioAnalyzerを使用したLibrary QC とトラブルシューティング

田中敦成イルミナ株式会社

テクニカルアプリケーションサイエンティスト

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概要

どのようにして BioAnalyzerをlibrary QCのためのツールとして使うのか

最終ライブラリーの理想的なトレースとは

起こりうる問題点とは

起こってしまった問題点の解決法と回避方法

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トラブルシューティングの内容

理想的な結果

• 理想的なトレースとは？

• 理想的な最終ライブラリーのトレースとは？

異常なサイズ

• サンプルのオーバーロード

• 小さすぎるライブラリー

• 大きすぎるライブラリー

ピークの

消失

• 予想される産物が回収されない

大きなピーク

• AMPureの持ち越み

• PCR artifacts

小さなピーク

• アダプターダイマー

• プライマーダイマー

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理想的な結果理想的な結果

異常なサイズ異常なサイズ

ピークの消失ピークの消失

大きなピーク大きなピーク

小さなピーク小さなピーク

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BioAnalyzerでの解析に適したサンプル

マーカー

平らなベースライン






マーカー適切な範囲

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理想的なトレース: TruSeq

TruSeq RNATruSeq ChIP

TruSeq DNA- gel selection TruSeq DNA- gel free(TruSeq Enrichment)






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理想的なトレース: TruSeq Nano

350 bp インサート+

~130bp アダプター






TruSeq NanoキットはSPBビーズによるサイズセレクションがある。最終ライブラリーにはインサートと~120 bp (LT)もしくは ~135 bp(HT)のアダプターが含まれる。

550 bp インサート+

~130bp アダプター

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理想的なトレース: TruSeq PCR-Free






350 bp insert 550 bp insert

~ 1 kb ~ 5 kb

~350 bp ~550 bp

最終ライブラリーのトレース

lll

llll

lllllll

lllllll

シーケンス結果から得られた平均イン

サートサイズ

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理想的なトレース: TruSeq Small RNA

ゲルからの切り出し精製をする範囲: ~145-160bp

Final library






~145-160 bp

対象となるsmall RNA: 22ntと30nt

145 bp

160 bp

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丸いピークなだらかなピーク

理想的なトレース: Nextera






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Bioanalyzerを用いたトラブルシューティング

サンプルのピークがある。

多くのケースではシーケンス可能。

サンプルピークがない。

再調整が必要。

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ピークの消失



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異常なサイズ：サンプルのオーバーロード

適切な範囲






オーバーロード

解決法: サンプルを希釈したのち、再解析

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異常なピーク: Nextera

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異常なサイズ: Nextera小さすぎるサンプル






Tagmentation過多原因：インプットDNA量が少なすぎる回避方法： DNA量を正確に定量する

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異常なピーク: Nextera大きすぎるサンプル






~1 kb

Tagmentation不足原因：インプットDNA量が多すぎる回避方法：DNAを希釈する

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25ng インプット 50ng インプット

平均ライブラリーサイズ: 500bp 平均ライブラリーサイズ: 1kb






最終ライブラリーのBioanalyzerのトレースは違うが、シーケンスの解析結果には大きな影響を与えない。

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インプットDNA

ライブラリーサイズの中央値

BioAnalyzer (bp)

インサートサイズの中央値

Sequencing (bp)Diversity (# of Unique Bases)

25ng 500 230 2.53X109

50ng 1000 346 2.65X109






*sequence data performed in duplicate (50ng) and triplicate (25ng)

最終ライブラリーのトレースは違うが、シーケンスの解析結果には大きな影響を与えない。

Bioanalyzerはtagmentationが行われたことの検証用に使う。多少異なるDNAサイズでもシーケンスデータに大きな影響を与えない。

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タグメンテーション不足原因：tagmentation酵素が阻害されている。

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DNA精製キットから混入しうるtagmentation酵素の阻害物質

https://icom.illumina.com/MyIllumina/Bulletin/QqttpskaC0ywyl9co83qXg/considerations-for-dna-isolation-when-using-nexter

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異常なピーク: TruSeq

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異常なピーク: TruSeq DNA小さすぎるサンプル

正確なサイズセレクションのためには、SYBR Goldで前染色したゲルが必要

SYBR Gold, 前染色

340 bp300-400 gel slice

SYBR Gold, 後染色

290 bp

300-400 gel slice






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異常なピーク: TruSeq小さすぎるサンプル

Post-stainingSYBR Green

Ethidium BromideE-gels

Pippin Prep






ゲルの条件が違うとライブラリーラダーマーカーの泳動度に影響が出る

ゲルの条件をプルトコルに沿って選ぶ

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ピークの消失: TruSeq small RNA






Small RNA由来の145-160 bpピークが見えない本キットによりsmall RNAが回収されなかった。

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ピークの消失: TruSeq small RNA

起こりえる原因解決策

質の低いインプット高品質なRNAを確保するためにインプットのQCをする

アダプターオリゴの二次構造の形成

70˚C で温めた直後に氷上に移す

Small RNAが、精製したRNA中に存在しない

Small RNAの精製に対応したキットを使う






Small RNA由来の145-160 bpピークが見えない本キットによりsmall RNAが回収されなかった。

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ピークの消失: TruSeq and Nextera






ライブラリーのピークが見えない、もしくはダイマーのピークしか見えない。シークエンスすべきではない。

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ピークの消失






起こりえる原因解決策

質の低いインプットもしくは量が不十分

PicogreenやQubitを用いてインプットのQCをする

ビーズ精製時のサンプルの喪失 Best practices の手法に従う

Thermocyclerの蓋が加温されていない

Thermocyclerが室度以上に加温

時される時は、蓋の温度を100℃にする

不完全なfragmentation Fragmentation後のサイズ分布をチェックする

酵素の劣化酵素を消費期限内に使用する。凍結融解をしない。

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大きなピークAMPure beadの持ち込み

解決策：サンプルが透明になるまで磁石の上に静置したのち、ライブラリーを回収する回避方法: AMPure beads使用時にbest practices に従う

Large trailing hump






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大きなピークPCR artifacts

二次的な産物

目的産物






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Overamplified “bubble”

二次的な産物

目的産物

• OveramplificationによるArtifactピーク• PCR反応に必要な試薬が枯渇すると, 相補的でないライブラリー鎖が

末端にある相補的なアダプターでアニールする。• Semi-single stranded productができる

目的産物






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確認方法: サンプルを95℃、5分間再加熱したのち、ヒートブロック中でゆっくり室温にする。サンプルのサイズがシフトするかどうかを調べる。回避方法: PCR サイクルを減少させる。インプット量を減少させる。

Overamplified “bubble”

目的産物目的産物

二次的な産物






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解決策: 再精製回避方法: 適切なインプット量

小さなピーク: TruSeqアダプターダイマー

~120bp






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回避方法: 適切な量のインプットを使用する

小さなピーク: Nexteraプライマーダイマー

~45bp






原因：インプットDNAが少なすぎる

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本日のまとめ

理想的な結果

•理想的なトレース: 平坦なベースライン, マーカーの範囲内サンプル量とサイズ

異常なサイズ

•オーバーロード: サンプル量がマーカーよりも多い. 再希釈する

•サンプルが小さすぎる: ゲルの条件が違う(T), タグメンテーション過多(N)、サンプル量を増やす

•サンプルが大きすぎる: タグメンテーション不足 (N), 酵素の阻害剤の存在を疑う

•ピークが1kbpぐらいまでならシーケンス可能

ピークの消失

•反応産物が回収できない。サンプルに合ったキットを選ぶ。.•調製時にサンプルがなくなる。すべてのステップでサンプルを確認する。

•ライブラリーの再調製が必要。

大きなピーク

•AMPureの持ち込み: 1kbを超えるこぶのようなピーク, 再精製し、再ラン。

•PCR artifacts: overamplification, サンプルを再加熱し、サンプルのシフトを確認する。

•シーケンス可能

小さなピーク

•アダプターダイマー~120bp (T)•プライマーダイマー~45bp (N)

(T) TruSeq (N) Nextera

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Questions?

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ご清聴ありがとうございました。ご質問は[email protected]でも承ります。

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