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BioanalyzerとqPCRを使用した

ライブラリの定性・定量評価

酒井名朋子

イルミナ株式会社

テクニカルサポート

2

Libraryの定性・定量評価

ゲル泳動

Agilent

Bioanalyzer

定性評価 定量評価

qPCR

ライブラリ調製後の手順

3

Libraryの10%を2%Agarose gelにロードする

確認項目：

– Libraryサイズが予想通りかどうか

– Adapter Ligation後の想定DNAサイズと同程度かどうか

– 126bpに強いバンドが存在しないか（アダプターダイマー）

存在する場合はGel Purificationのステップを繰り返す

Library QCの手段:

Gel visualization

500bp

400bp

4

Library QCの手段:

Agilent 2100 Bioanalyzer

ターゲットサイズ・量によりチップを使い分け

Bioanalyzer トレースはサイズ分布を知る目的で利用、定量結果は不確か

トラブルシューティングの際に必要

Image from www.genomics.agilent.com

http://www.chem.agilent.com/Library/flyers/Public/5990-5056JAJP_NGS-BioA.pdf

5

Agilent Bioanalyzer 2100:

概要

6

Agilent Bioanalyzer Workflow

手順

ゲルとDyeを混ぜる

*

チップを準備する

サンプルとラダーをチップに乗せる

チップを

Voltexする

Bioanalyzerにチップをセットし泳動を開始す

る

Data評価

*if first time using kit

7

Bioanalyzer用チップの準備

1. ゲルとDyeを混ぜ、30分室温に置く

2. チップを用意し、Chip Priming

Stationに置く

3. 9uLのゲルDye混合液を該当Well

におく

– 泡が入らないように注意すること

4. 付属シリンジで圧をかけ,ゲルをチップに注入する

– シリンジを押し込み60秒間ホールドする留め具をつける

– プランジャーをリリースし、5秒間待つ

– Chip Priming Stationから外す

5. 次のスロットにゲルDye混合物をロードする.

9uL gel-dye mix 9uL gel-dye mix

ゲルとDyeを混ぜる*

チップを準備する

8

Loading Agilent chips

6. 5uLのマーカーをすべてのWellに注入する

7. 該当箇所にDNAラダーを入れる

8. 必要のある場合はLibraryを希釈する

9. 1uLのサンプルとDNAマーカーをロードする

1uL DNA ladder

1uL sample or DNA ladder per well

ゲルとDyeを混ぜる*

チップを準備する

サンプルとラダーをチップに乗せる

チップをVoltexする

Bioanalyzerにチップをセットし泳動を開始す

る

9

Bioanalyzerトレースを理解する

Lower Marker

Upper Marker

Sample Peaks

理想的なBioanalyzer結果とは：

サンプル由来のピークが二つのマーカー(35bpと10Kbp）のピークの間に存在する

ベースラインが安定して低い

マーカーのIntensityがベースラインより十分大きい

マーカーのピークがサンプルピークと被っていないこと

Data評価

10

Bioanalyzerレポートを理解する

チェック項目

• ピークは1本か

• Adapter Dimer、ビーズの持越しがないか

11

TruSeq DNA libraryの理想的なBioanalyzerトレース

Gel

Gel-free

12

サンプルをオーバーロードすると定量結果が不正確

Bioanalyzerの定量結果が正確でない理由

1:5 希釈の場合16ng/uL と表示 1:20 希釈の場合36ng/ulと表示

定量にはQubitやqPCRをご使用ください。

13

Gel Images ゲル電気泳動結果

Libraryが期待したサイズであること Adapter dimerが存在しないこと

Agilent BioAnalyzer 2100

Libraryが期待したサイズであること Adapter dimerが存在しないこと ピークが1本であること – ビーズの持越し – PCRでのOveramplification由来の産物

Library QC:

Summary

14

qPCRを使用したLibraryの定量

15

最適クラスター数はデータ量を増やす

20pM 10pM 5pM 1pM

Optimized flow cell clustering determines

data quality and overall data yield

Over clusterになってしまうと・・

• Quality とYieldが下がる

• Focusが合わなくなる

• Runの失敗

Cluster 数が少ないと・・

• Data量が少ない

• サンプルが無駄になる

• Focusが合わなくなる

• Runの失敗

16

最適クラスター数

Sequencing Platform Raw Cluster Density in Kcluster/mm2

GAII and GAIIx 700,000 to 800,000

HiSeq v3 750,000 to 850,000

MiSeq v1 750,000 to 850,000

MiSeq v2 ～1500,000

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

0 5 10 15 20 25

Clusters

線形 (Clusters)

pM

Clu

ste

r D

en

sit

y

17

MultiplexでサンプルをPoolする際には特に注意！

ライブラリの一つが10倍高く濃度が見積もられていた場合

ライブライの一つが10倍低く見積もられていた場合

Sample Expected

Output

Actual

Output

1 16% 66%

2 16% 6%

3 16% 6%

4 16% 6%

5 16% 6%

6 16% 6% Sample

Expected

Output

Actual

Output

1 16% 20%

2 16% 20%

3 16% 20%

4 16% 20%

5 16% 20%

6 16% 2%

18

Flow Cell のTitration

85

90

95

100

20pM 10pM 5pM 1pM

>=

Q30 (

%)

20pM 10pM 5pM 1pM

Cluster Density Q30 Score

Flow Cell Titration

どの程度のLibrary 濃度でどの程度のクラスター数が出るか

FCの3-4レーンを

使用

Libraryによってはデータを使用可能

19

Flow Cell Titrationにおける注意事項

使用するqPCR装置、Sequence装置、試薬のバージョンは一定にする

Titration結果に影響を及ぼすParameter

– Sequencer（GA、HiSeq、MiSeq）

– クラスター形成装置（Cluster Station、cBot、MiSeq）

– Denatureの方法

– Library 長とGC含量

20

• 核酸以外の物質も検出

• Contaminants が値を左右する

• Sample prepのInputやvalidationには使用不可

UV- 吸光 Nanodrop

•希釈とサンプルのHandlingによりAccuracyが変わる

•Qualityのチェックにのみ使用

Bioanalyzer 2100

• ds DNAを特定的に検出

•不完全なLibraryも検出

蛍光ベースの ds-DNA assay

Qubit or PicoGreen

•完全なLibraryのみを検出

•検出限界が低い qPCR

Libraryの定量方法

21

qPCRの原理

1. Sybr GreenがPCR Mixに含まれる

2. PCR Primerがアニーリングし、

3. 伸長反応が起こるとSybr Greenが取り込まれる

4. 取り込まれたSybr

Greenが発光する

5. 蛍光を検出

6. その後のサイクルでは1-4を繰り返す

22

qPCR Amplification Curve

検量線

Threshold

Cq :Thresholdに達した際のサイクル数、

立ち上がりサイクル、quantifictaion cycle

23

qPCRではクラスター形成可能なLiraryのみを検出

– FC上のオリゴP5 とP7 配列の一部に該当するPCR Primerを使用

– Adapterが両端についたLibraryのみを検出

qPCR Overview

24

検量線用のDNAを準備

検量線用DNAの希釈

Libraryの希釈

qPCR試薬の準備、装置の運転

qPCRデータの解析

qPCRでの定量の準備

Step 1

Step 2

Step 3

Step 4

Step 5

25

1.検量線用のDNAを準備

検量線にふさわしいDNA

– P5 P7配列を両端に持ったIlluminaシーケンサー用Library

– サンプルと同様の長さ、GC含量のもの

– サンプルと同様の種類のLibrary（gDNA, RNA, small RNA)

– 分注して保存されているもの

– 2-20pMの範囲でCluster 数が適正に検出されるもの

qPCR 用キット

– KAPA Library Quantification Kit

– http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4332

– KK4824、4835、4844、4854

26

2.検量線用DNAの希釈

2nM程度のLibrary原液から調製

– 20pM まで100倍希釈 （0.1% Tween 20もしくはMilliQ水）

2倍希釈を 0.1% Tween 20で行う

しっかりVoltexしたのち分注する

20pM 10pM 5pM 2.5pM 1.25pM 0.625pM 0.3125pM

Final Concentrations

1 3 4 5 6 7 2

27

サンプルの希釈

Bioanalzyerトレースより大まかな濃度の予想

~2nM のQiagen EB Bufferに保持したサンプルより開始

500倍希釈し、~ 4pM程度に調製する

– 2倍希釈をTriplicate になるように調製する

– しっかりVoltexしたのち分注する

3.サンプルの希釈

2nM 4pM

2µL unknown

+

998µL 0.1% Tween 20

28

PCRMixはキットに沿って調製

– Primerは10uMになるように調製する

Thermal cycling conditions の例

4.qPCR Runの開始

29

4.qPCR Runのレイアウト（例）

Unknown

Standard

Non-Template Control

検量線

– 7 点

– 2-fold dilution factor

サンプル – 8 samples

– Technical triplicates

Negative control

– 1点

SBS Library Quantification Template

30

検量線の評価:

– Efficiency（増幅効率）は +/- 10% from 100%

Efficiency= 10^(-1/Slop)

– Slope ：-3.60 to -3.10

検量線の傾き

– R2 > 0.99

– Outlierをはずす(replicate でCq の違いが 0.5以上あるもの)

サンプルが検量線の中に入っているかどうか

– Outlierをはずす(replicate でCq の違いが 0.5以上あるもの)

5.結果の評価

Slope -3.278

R2 0.997

Efficiency 101.86%

31

5.結果の評価

検量線の濃度計算

– DNA定量値（ng/uL)より、DNAの平均分子量、検量線サンプルの長さより濃度(nM)

を計算

– 希釈倍率を考慮に入れる

Bioanalyzer、Qubitと比較してqPCRの定量結果と大幅にずれる場合

– 一つの方法からの結果を採用する

– qPCRが最も正確

定量されたサンプルを希釈し、Cluster Generation進んでください。

32

ご清聴ありがとうございました。