biofizyka ii

Część III: Opis oddziaływań międzycząsteczkowych

1

Biofizyka II

przedmiot obieralny Materiały pomocnicze do wykładów

prof. dr hab. inż. Jan Mazerski

CZĘŚĆ I II : OP I S OD D Z I AŁY W AŃ MIĘD Z Y C ZĄS T E C Z K O W Y C H Układy biologiczne zbudowane są na poziomie molekularnym z trwałych cząsteczek o

zdefiniowanej strukturze i jednoznacznie określonych właściwościach chemicznych i

fizykochemicznych (białka, kwasy nukleinowe, polisacharydy itp.). Za ich stabilność odpowiedzialne

są przede wszystkim wiązania kowalencyjne. Jednakże na poziomie funkcjonalnym cząsteczki te

musza mieć zdolność do dynamicznego, odwracalnego łączenia się i rozdzielania. Za dynamikę

układów biologicznych odpowiedzialne są więc dużo słabsze i odwracalne w warunkach

fizjologicznych oddziaływania niekowalencyjne (fizykochemiczne). Zapewniają one plastyczność

układu, czyli umożliwiają dopasowanie się układu do zmiennych warunków zewnętrznych bez zmiany

natury układu.

Kompleksy międzycząsteczkowe powstają samorzutnie, a więc towarzyszyć im musi spadek entalpii

swobodnej (funkcji Gibbsa) układu:

G = H -TS

Spadek ten wynikać może z obniżenia się entalpii, H, i mówimy wtedy, że za powstawanie kompleksu

odpowiedzialny jest czynnik energetyczny. Jednakże może wynikać także ze wzrostu entropii, S,

układu, czyli być wynikiem działania czynnika entropowego. Znane są również kompleksy

międzycząsteczkowe, których powstaniu towarzyszy zarówno zmiana entalpii jak i entropii układu. W

takim przypadku wymagane jest jedynie, aby łączny efekt tych zmian prowadził do obniżenia entalpii

swobodnej.

Z wpływem czynnika energetycznego mamy do czynienia, gdy powstawaniu kompleksu

towarzyszy wystąpienie oddziaływań fizykochemicznych nie występujących w przypadku

izolowanych składników. W zależności od budowy chemicznej składników oddziaływaniami tymi

mogą być:

• wiązania wodorowe,

• oddziaływania dyspersyjne (Van der Waalsa), lub

• oddziaływania elektrostatyczne.

Zwykle mamy do czynienia z wszystkimi tymi oddziaływaniami jednocześnie.

Jest charakterystyczne, że na powyższej liście oddziaływań nie ma oddziaływań hydrofobowych.

Wynika to z ich odmiennej natury – oddziaływania hydrofobowe są wynikiem działania czynnika

entropowego a nie energetycznego.


3.1 Pojęcie mikrostanu układu Proces powstawania kompleksu molekularnego rozpatrywać można z wielu różnych stron, np.

w aspekcie prawa działania mas. Rozważmy przykładowo proste zjawisko dimeryzacji związku A:

A + A = 2A ⇔ D

Z prawa działania mas wynika, że istnieje określona relacja pomiędzy stężeniem związku A i

stężeniem jego dimeru D:

[ ][ ]2A

DK =

W danej temperaturze wielkość K jest stała i nosi nazwę stałej równowagi procesu, w tym przypadku

stałej procesu dimeryzacji, lub krócej stałej dimeryzacji. Na uwagę zasługuje przy tym fakt, że istotne

jest jednoznaczne określenie kierunku przebiegu procesu.

Tworzenie kompleksu A + A ⇒ D

Stała asocjacji: [ ][ ]2A A

DK =

Rozpad kompleksu D ⇒ A + A

Stała dysocjacji: [ ][ ]DA

K1K

2

AD ==

Stała równowagi procesu powiązana jest ze zmianą entalpii swobodnej procesu zależnością:

KlnRTG0 −=∆gdzie: jest zmianą standardowej entalpii swobodnej. 0G∆

Co kryje się pod tą nazwą? Zmiana standardowej entalpii swobodnej procesu dotyczy sytuacji gdy

stężenia wszystkich indywiduów biorących udział w procesie są sobie równe i wynoszą 1 mol/l. Jeżeli

proces, np. dimeryzacji, przebiega przy innych stężeniach to obowiązuje bardziej rozbudowany wzór:

[ ][ ]2A

DlnRTKlnRTG +−=∆

Z powyższego wzoru wynika, że zmiana entalpii swobodnej procesu zależy od 2 czynników:

1. zmiany standardowej entalpii swobodnej która jest charakterystyczna dla danego procesu

2. rzeczywistych warunków przebiegu procesu, a w szczególności od stężeń indywiduów

chemicznych biorących udział w procesie.

Należy w tym miejscu wyraźnie podkreślić, że o kierunku przebiegu procesu decyduje zmiana

aktualnej, a nie standardowej entalpii swobodnej.

Przykład 1:

Chcemy opisać zjawisko dysocjacji kwasu octowego AcH ⇐⇒ Ac- + H+

z wykorzystaniem pojęcia zmiany entalpii swobodnej. Standardowa zmiana entalpii swobodnej dysocjacji kwasu octowego wynosi ∆G0 = +28,14 kJ/mol. Interesuje nas zachowanie się cząsteczek kwasu octowego w stężeniu 0,001 mol/L. Stopień dysocjacji kwasu octowego

2


wynosi przy takim stężeniu α = 0,15. Oznacza to, że stężenie formy zdysocjowanej [Ac-] i formy niezdysocjowanej [AcH] wynosi odpowiednio: 1,5*10-4 i 8,5*10-4 mola/L. Spróbujmy określić kierunek przebiegu dysocjacji przy dwóch wartościach pH:

a) pH = 3 b) pH = 7

Ad a) [H+] = 1*10-3 mola/L [ ][ ]

[ ] 94,5105,8

101105,1ln569,214,28AcH

HAclnRTGG 4

340 +=

⋅⋅⋅⋅

+=+∆=∆ −

−−+−

Dodatnia wartość ∆G wskazuje, że reakcja przebiegać będzie od strony prawej do lewej, czyli wzrośnie stężenie formy niezdysocjowanej. Ad b) [H+] = 1*10-7 mola/L

[ ][ ][ ] 72,17

105,8101105,1ln569,214,28

AcHHAclnRTGG 4

740 −=

⋅⋅⋅⋅

+=+∆=∆ −

−−+−

Zdecydowanie ujemna wartość ∆G wskazuje, że w środowisku obojetnym reakcja przebiegać będzie od strony lewej prawej do prawej, czyli wzrośnie stężenie formy zdysocjowanej.

Omawiana powyżej stała równowagi procesu dotyczy tzw. makroskopowego opisu układu. W

zagadnieniach biofizycznych posługujemy się często innym, tzw. mikroskopowym opisem układu.

Rozróżniamy też odpowiednio makro- i mikro- stany układu. Czym się różnią te dwa opisy?

W opisie makroskopowym posługujemy się wyłącznie wielkościami które można wyznaczyć

doświadczalnie dysponując mierzalnymi właściwościami układu. W opisie mikroskopowym

rozważamy pewne teoretyczne stany układu zdając sobie doskonale sprawę, że nigdy nie będziemy ich

w stanie zaobserwować. Opis mikroskopowy jest więc z założenia modelem teoretycznym. Jego

poprawność możemy ocenić dopiero po zamianie parametrów mikroskopowych na makroskopowe.

Zdaję sobie sprawę, że powyższe wyjaśnienia właściwie niczego nie wyjaśniają. Dlatego też

rozważmy pewien prosty przykład.

Przykład 2: Chcemy opisać zjawisko dysocjacji kwasu dwukarboksylowego na poziomie makro- i mikroskopowym.

Opis makroskopowy Proces dysocjacji takiego kwasu obejmuje dwa etapy:

H2A ⇔ H+ + (HA)-

(HA)- ⇔ H+ + A-2

i odpowiadają im dwie stałe dysocjacji:

( )[ ][ ]

[ ]AHHHAK

21

+−=

[ ][ ]( )[ ]−

+−=

HAHAK

2

2

Opis mikroskopowy Załóżmy, że potrafimy odróżnić obie grupy karboksylowe i że dysocjują one niezależnie od siebie. Przy

czym każdy akt dysocjacji ma taką samą mikroskopową stałą dysocjacji. Zgodnie z takim opisem proces dysocjacji kwasu dwukarboksylowego można przedstawić następującym układem równań: HAH ⇔ H+ + -AH HAH ⇔ HA- + H+

AH ⇔ A2- + H+

HA- ⇔ H+ + A2-

Odpowiadają im odpowiednie stałe dysocjacji:

[ ][ ]

[ ]HAHHAHk

+−= => [ ] [ ]

[ ]+− =

HHAHkAH

[ ][ ]

[ ]HAHHHAk

+−= => [ ] [ ]

[ ]+− =

HHAHkHA => [-AH] = [HA-]

3


[(HA)-] = [-AH] + [HA-] => ( )[ ] [ ][ ]+

− =H

AHk2HA 2

[ ][ ]

[ ]AHHAk

2

−

+−= => [ ] [ ]

[ ]+

−− =

HAHkA 2

[ ][ ]

[ ]−

+−=

HAHAk

2 => [ ] [ ]

[ ]( )[ ][ ]+

−

+

−− ==

HHAk

21

HHAkA 2

Podstawiając wyprowadzone zależności do wzorów na makroskopowe stałe dysocjacji otrzymujemy:

[ ][ ] [ ][ ] k2

AH

HH

AHk2

K2

2

1 ==

++

( )[ ][ ] [ ]( )[ ] k

21

HA

HH

HAk21

K 2 ==−

++

−

Okazuje się ponadto, że przy poczynionych założeniach stosunek obu stałych dysocjacji powinien być stały:

4KK

2

1 =

W praktycznych obliczeniach często zamiast stałymi dysocjacji posługujemy się ich formą zlogarytmowaną:

pKa1 – pKa2 = log4 ≈ 0,6

Oczywiście, w przypadku rzeczywistych kwasów dwukarboksylowych różnice pomiędzy wartościami

pKa dla obydwu stopni dysocjacji mogą być bardzo różne. W seriach homologicznych obserwuje się

jednak charakterystyczne tendencje. I tak dla alifatycznych kwasów z grupami karboksylowymi na

krańcach prostego łańcucha otrzymujemy szereg:

Kwas n pKa1 pKa2 ∆pKaszczawiowy 0 1,27 4,27 3,00 malonowy 1 2,86 5,69 2,83 bursztynowy 2 4,21 5,64 1,43 glutarowy 3 4,34 5,27 0,93 adypinowy 4 4,42 5,28 0,86 pimelinowy 5 4,51 5,31 0,80 korkowy 6 4,52 5,35 0,83 kamforowy X 4,57 5,10 0,53

4

Występujące tendencje widać szczególnie wyraźnie na

zamieszczonym obok wykresie. Gdy odległość pomiędzy grupami

karboksylowymi jest nieduża dysocjacja jednej z nich wpływa

niekorzystnie na możliwość dysocjacji drugiej - ∆pK ok. 3 !

Jednakże gdy grupy są oddzielone dwiema, a zwłaszcza 3 lub

więcej grupami metylenowymi różnica pKa zdecydowanie maleje i

stabilizuje się na wartości ok. 0,8 jednostki. Jest to jednak wartość 0 1 2 3 4 5 6

Liczba grup metylenowych

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00 pKa1

a2

∆


5

decydowanie większa niż przewidywana dla w pełni niezależnych grup karboksylowych.

ńcucha alifatycznego: łańcuch

onformacji zwiniętej pozwalającej

ą hipotezę należało znaleźć kwas

raktycznie niemożliwe. Sytuacja

owany i niearomatyczny układ

abeli, różnica pKa wynosi 0,53, co

p.) zmienia się liniowo

wraz ze wzrostem stężenia, aż do pewnego stężenia

tępnie praktycznie przestaje zależeć od

eni

j.

ele stosowane do opisu zjawiska agregacji

z

Wysunięto hipotezę, że wynika to z labilności konformacyjnej ła

zawierający 3 lub więcej grup metylenowych może występować w k

na wpływ jednej grupy karboksylowej na drugą. Aby potwierdzić t

dwukarboksylowy w którym oddziaływanie grup na siebie byłoby p

taka występuje np. w terpenach posiadających sztywny, mostk

pierścieni. I tak dla kwasu kamforowego, ostatni wiersz powyższej t

mieści się już w granicach błędu.

3.2 Agregacja Dla niektórych związków liczne wielkości

fizykochemiczne zależą w charakterystyczny sposób od

stężenia roztworu. Istnieją dwie formy zależności

wskazujące, że w roztworze dochodzi do agregacji.

W pierwszym przypadku mierzalna właściwość roztworu

(lepkość, napięcie powierzchniowe, współczynnik

załamania światła, absorbancja, it c

A

c

A krytycznego, a nas

stęż a. Taka forma zależności wskazuje, że mierzalna

wielkość, A, zależy od stężenia formy monomerycznej

związku, a dla formy lub form zagregowanych ma

wartość dużo mniejszą niż dla formy monomeryczne

W drugim przypadku, dla niskich stężeń związku

wielkość A jest prawie niemierzalna i pojawia się dopiero

po przekroczeniu pewnego stężenia, a następnie wzrasta l

że mierzona wielkość związana jest z formą zagregow

monomerycznej.

W niniejszym rozdziale przedstawimy typowe mod

oraz pokażemy jak modele takie powstają.

iniowo ze wzrostem stężenia. Wskazuje to,

aną i nie występuje w przypadku formy

3.2.1 Jak opisać agregację

Zanim omówimy wybrane modele agregacji warto przedstawić podstawowe wielkości

ązek występuje co najmniej w

ych. Symbolem Ai oznaczać

będziemy formę zagregowana składającą się z i cząsteczek monomeru. Ogólne stężenie związku w

badanym roztworze równe jest c moli/litr. Dla uproszczenia w zapisie stężeń poszczególnych form

związane z tym procesem. Najczęściej przyjmujemy, że badany zwi

dwóch formach: jako monomer, M, i jedna lub kilka form zagregowan


6

dnoznacznie określa czy mówimy o formie czy o jej stężeniu.

pisują

ależnie w jakiej formie występuje, czyli rozpatrywać tzw.

pominiemy nawiasy kwadratowe. Tak więc symbol Ai raz oznaczać będzie i-tą formę zagregowaną (w

równaniach reakcji), a innym razem jej stężenie. Nie powinno to jednak nastręczać kłopotów, gdyż

rodzaj równania je

O c skład roztworu można poddać bilansowaniu dwie rzeczy:

• liczbę moli badanego związku niez

bilans cząsteczkowy

c = M + 2A2 + 3A3 + ... + nAn = M + ∑=

n

2iiiA

• liczbę moli poszczególnych form w jakich dany związek występuje, czyli rozpatrywać tzw.

bilans molowy

z = M + A2 + A3 + ... + An = M + ∑=

n

2iiA

Wielkość z nazywamy funkcją podziału. Pomiędzy stężeniem, c, a funkcją podziału, z, istnieje bardzo użyteczna zależność:

M

Mc∂

= z∂

Sto

sunek stężenia, c, do funkcji podziału, z, nosi nazwę średniego stopnia agregacji, ν:

∑+ iiAMz

∑+n

iM

c

=

===ν n

2i

2iiA

oraz zwykle st y monomerycznej, M. Kolejnym krokiem jest stworzenie teoretycznego

modelu procesu, co pozwala wyrazić stężenie poszczególnych form zagregowanych jako funkcję

tężeni form wnow gi opisujących poszczególne etapy procesu.

W typowych doświadczalnych badaniach zjawiska agregacji znamy ogólne stężenie związku

ężenie form

s a y monomerycznej oraz stałych ró a

Porównanie danych eksperymentalnych z wnioskami wynikającymi z modelu pozwala na jego

weryfikację.

3.2.2 Dimeryzacja

cesu wygląda

następująco:

Stan równowagi tego procesu opisuje stała dimeryzacji, KD:

Najprostszym przypadkiem agregacji jest dimeryzacja. Równanie pro

D2M ⇔

2D MDK = .

Stężenie dimeru daje się opisać zależnością:

2DMKD = .

Możemy teraz wykonać bilans molowy:


y:

D2

D +=+= ,

( )MK1MMKMDMz D2

D +=+=+=

i cząsteczkow

( )MK21MMK2M D2Mc +=

aby ostatecznie wyznaczyć średni stopień agregacji:

( )( ) MK1

MK1MK1

MKMK1MK1MK21

MK1MMK21M

zc

D

D

D

DD

D

D

D

D

++=

+++

=+

+=

++

==ν

jest tylko

iewiele większa od 1. Z kolei dla dostatecznie dużych stężeń, gdy

iloczyn K M >> 1, średni stopień agregacji będzie asymptotycznie

ν

ą logarytmu ogólnego stężenia lub logarytmu stężenia formy

oszacować, czy w procesie

gregacji mamy do czynienia tylko z tworzeniem dimerów, czy też

czące ilości agregatów wyższych rzędów.

Do oceny stopnia agregacji w funkcji s żenia można również wykorzystać odpowiednio

zakładając, że znamy ogólne stężenie c i potrafimy wyznaczyć stężenie formy monomerycznej M.

do równania bilansu

, ale w postaci iloczynowej:

)D

eraz wykres l c w funkcji logM (linia

czerwona).

Dla niskich stężeń, gdy iloczyn KDM << 1, wartość ν

7

n

D

dążył do 2. Wyniki przedstawia się zwykle na wykresie na którym

jest funkcj

monomerycznej. Wykres taki pozwala

a

pojawiają się zna

tę

przekształcony bilans cząsteczkowy:

2DMK2Mc += ,

Teraz przenosimy stężenie M na stronę lewą:

2DMK2Mc =− .

Jeżeli na wykresie (c-M) w funkcji M2 otrzymamy linię

prostą przechodzącą przez początek układu, to wykażemy

tym samym, że agregacja ogranicza się do dimeryzacji ze

stałą KD równą połowie tangensa kąta nachyleniu tej prostej.

Wykres tego typu jest jednak bardzo wrażliwy na

błędy pomiarowe kilku ostatnich punktów, które decydują o

nachyleniu prostej. Dlatego zaproponowano również inny typ

wykresu. Wróćmy ponownie

-8 -6 -4logC

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

ν

-8 -6 -4logM

-8

-6

-4

logC

0

4E-6

8E-6

1.2E-5

C-M

0 2E-13 4E-13 6E-13M^2

cząsteczkowego

( )MK21Mc D+=

i zlogarytmujmy to równanie:

( K21logMlogclog ++= M

Wykonajmy t og


Dla 2KDM << 1 możemy przyjąć, że ( )MK21log D+ jest w przybliżeniu równy log(1) czyli 0. Tak

więc dla małych stężeń powinniśmy otrzymać linię prostą log c = log M o nachyleniu równym 1

(zielona prosta).

Dla 2KDM >> 1 możemy z kolei przyjąć, że ( )MK21log D+ jest w przybliżeniu równy log(2KDM),

czyli:

( ) )K2log(MlogMK21logMlogclog

8

)K2log(Mlog2Mlog DDD +=++≈++=

W efekcie otrzym

.

ujemy równanie linii prostej o nachyleniu równym 2 i wyrazie wolnym log(2KD),

linia niebieska.

3.2.3 Trimeryzacja

wersja jednoetapowa

Naszą analizę rozpoczniemy od bardzo prostego,

chociaż niezbyt realistycznego modelu trimeryzacji.

nie się trimeru jest

a ze stałą równowagi KT równą:

Przyjmiemy mianowicie, że tworze

procesem jednoetapowym: trzy cząsteczki monomeru

spotykają się i łącza w nową formę - trimer. Można to wyrazić

równaniem:

TM3 =

Proces przebieg

3TTK =

M

ć stężenie trimeru jako:

,

Możemy wyznaczy3 TMKT =

co pozwala napisać bilans cząsteczkowy:

( )2T

3T MK31MMK3MT3Mc +=+=+=

i molowy:

( )2T

3T MK1MMKMTMz +=+=+=

oraz wyznaczyć średni stopień agregacji:

( )( ) 2

T

2T

2T

2T

2T

2T

2T

2T

2T

MK1MK21

MK1MK2MK1

MK1MK31

MK1

MMK31M

zc

++=

+++

=++

=++

==ν

Korzystając z bilansu cząsteczkowego:

( )2TMK31Mc = +

można otrzymać zależność:

( )21clog = TMK3 logMlog ++ .

Analogicznie jak dla dimeryzacji rozpatrzmy 2 przypadki graniczne:

-8.00 -4.00log M

1.00

2.00

3.00

ν


(

9

Dla KTM << 1 możemy przyjąć, że )2+ jest w

wny log(1) czyli 0. Tak więc dla małych stężeń

otrzymać linię prostą log c = log M o nachyleniu

ona prosta).

TMK31log

przybliżeniu ró

powinniśmy

równym 1 (ziel

Dla KTM >> 1 możemy z kolei przyjąć, że ( )2TMK31log + jest

w przybliżeniu równy log(3KTM2), czyli:

( ) )K3log(Mlog3Mlog2)K3log(MlogMK31logMlogclog 2T +≈++= TT +=+ .

efekcie otrzymujemy równanie linii prostej o nachyleniu równym 3 i wyrazie wolnym log(3KT),

ersja dwuetapowa

erzenie trójcentrowe, jest z punktu

rmodynamiki statystycznej zdarzeniem bardzo ma

gający na utworzeniu najpierw dimeru, a w kolejnym etapie

onomeru:

ępują dwie stałe równowagi: stała dimeryzacji KD

(pierwsze równanie) i stała przyłączenia monomeru KM (drugie równanie). Zwykle jednak zakłada się,

ako stałe agregacji KA. Stężenie dimeru można wtedy

yrazić jako:

o:

+=+ ,

W

linia niebieska.

w

Jednoczesne spotkanie się 3 cząsteczek, czyli tzw. zd

widzenia te ło prawdopodobnym. Dużo bardziej

prawdopodobny jest ciąg zdarzeń pole

utworzenia trimeru na skutek przyłączenia kolejnej cząsteczki m

⎩⎨⎧

=+=

TDMDM2

W przypadku ogólnym w procesie tym wyst

że stałe te są sobie równe i traktuje się je j

w

2AMKD = ,

a stężenie trimeru jak

32AA MKMDKT ==

Można teraz wyznaczyć ogólne stężenie związku:

32A

2A MK3MK2MT3D2Mc ++=++=

oraz funkcję podziału:

Mz ++= 32A

2A MKMKMTD

co pozwala obliczyć średni stopień agregacji:

22AA

22AA

3A

2A

32A

2A

MKMK1

MK3MK21

MKMKM

MK3MK2M

++

++=

++

++=ν 2

-10.00 -8.00 -6.0 -4.00 0log M

-8.00

-4.00

log

C

logC = logM

logC = 3*logM + 14.48

-9.00 -8.00 -7.00 -6.00log M

1.00

M + T

2.00ν

M + D + T

3.00


10

opnia agregacji dla obu modeli

imeryzacji. Widać że w przypadku modelu dwuetapowego (linia czerwona) średni stopień agregacji

odelu jednoetapowego (linia purpurowa).

Rozważmy teraz czego można oczekiwać na wykresie logc = f(logM):

+++=

la KAM << 1 możemy przyjąć, że

Na wykresie powyżej przedstawiono przebieg zmian średniego st

tr ,

rośnie wolniej niż w przypadku m

)MK3MK21log(Mlogclog 22AA

( )2AA MK3MK21log ++D jest w przybliżeniu równy log(1) czyli

ych stężeń powinniśmy otrzymać linię prostą log c = log M o nachyleniu

równym 1.

A

0. Tak więc dla mał

( )2AA MK3MK21log ++Dla K M >> 1 możemy z kolei przyjąć, że jest w przybliżeniu równy

g(3KAM2), czyli:

lo

( )≈++= 2A

)K3log(Mlog3Mlog2)K3log(Mlog AA

MK31logMlogclog

+=++≈

Tak więc otrzymujemy równanie linii prostej o nachyleniu równym 3 i

wyrazie wolnym log(3KA). Na wykresie obok przedstawiono przebieg

z iależności dla obydwu modeli trimeryzacji. W dać wyraźnie, że dla

dużych stężeń obie linie biegną równolegle, czyli mają jednakowe

nachylenie.

3.2.4 Agregacja nieograniczona

W wielu przypadkach proces agregacji nie zatrzymuje się na etapie małych agregatów

imerów, trimerów, itp.) lecz tworzy się całe spektrum agregatów. Opis matematyczny takiego

e możliwy do przeprowa

łowych modeli matematycznych. Poniżej przedstawię 3 typowe przykłady takich

odeli.

wersja etapowa

odel nieograniczonej agregacji zakł i

otrzymamy model:

n1n AAM =+ − MKA −=

Możemy teraz określić bilans cząsteczkowy:

(d

procesu jest trochę bardziej skomplikowany, al dzenia. W literaturze znaleźć

można wiele szczegó

m

Najprostszy m ada etapowy przebieg tego procesu. Jeżel

ponadto przyjmiemy, że stałe agregacji na każdym etapie są takie same, to

M43

32

2

AAMATAMADMM

=+==+==+

43

A3A4

32A2A3

2A2

MKMAKAMKMAKA

MKA

==

==

=

M M

Mn1n

An

-8.00

-6.00

-4.00

log

C

-8.00 -6.00log M


− n1nA

3 MnK

olow

a w przypadku bilansu cząsteczkowego nie jest proste. Na szczęście w przypadku bilansu

do czynienia z szeregiem geometrycznym o ilorazie q = KAM. Jak wiadomo, suma

eskoń

++= 2A

2A MK3MK2Mc LL +++

i m y:

LL +++++= − n1nA

32A

2A MKMKMKMz

Należy zauważyć, że są to wyrażenia o nieskończonej liczbie składników i wyznaczenie ich sumy,

zwłaszcz

molowego mamy

ni czonego szeregu geometrycznego dana jest wzorem:

q1

aS 1= .

−∞

W naszym przypadku a1 = M, a więc:

MK1

MzA−

= .

Suma ta ma skończoną wartość tylko wtedy, gdy |q| < 1. Tak więc pojawia się nowa, ciekawa

zależność:

1 ==> MKA <AK

1M <

mówiąca, że stężenie monomeru w układzie nie rośnie nieograniczenie jak

przypadku dimeryzacji czy trimeryzacji, lecz istnieje pewna graniczna

dzy stężeniem

całkowitym c i funkcją podziału z:

-9.0 -8.0 -7.0 -6.0logM

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

40.0

45.0

ν

25.0

30.0

35.0

w

wartość równa 1/KA, którą oznacza się symbolem MMC (ang. Maximal

Monomer Concentration).

Pozostaje jeszcze problem wyznaczenia bilansu cząsteczkowego. Najłatwiej

to zrobić korzystając z podanej wcześniej zależności pomię

MzMc

∂∂

= .

W naszym przypadku daje to:

( ) ( )( ) ( ) ( )2AAA MK1

MMK1MK1 −−−

Tak więc średni stopień agregacji dany jest wzorem:

2AA

2AA

A

MKMK1M

KMMK11M

MK1M

MMc =

+−=

−−−=⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

−∂∂

=

( )

11

( ) MK11

MMK1

Mzc

2 −=

−==ν

do wartość granicznej

pień agregacji dąży do

nieskończoności.

MK1 A−

AAWarto zwrócić uwagę, że w miarę jak stężenie monomeru M zbliża się

MMC = 1/KA wartość mianownika dąży do 0, co oznacza, że średni sto


Istnienie MMC odbija się również na kształcie zależności

12

ersja dwuetapow

Nie zawsze założenie o jednakowych wartościach stałych

łaszcza w układach biologicznych

ę układy w których stała równowagi pierwszego etapu

(dimeryzacji) jest dużo większa niż następne. Zmienia się wtedy

gują już nie pojedyncze cząsteczki (monomery),

cz dimery.

Poniżej przedstawiono model takiego procesu:

DAA2MKKDAKA ==

o modelu ma postać:

-9.0 -8.0 -7.0 -6.0logM

-9.0

-8.0

-7.0

-6.0

-3.0

logc od logM: występuje wyraźna asymptota pionowa umożliwiająca

łatwe wyznaczenie logMMC (rysunek obok). -5.0

-4.0

logC logC = logM

log(MMC)

w a

agregacji jest prawdziwe. Zw

obserwuje si

również charakter następnych etapów agregacji: agre

le

M

M

n1n AAD =+ −

M

Mn2n

D1n

An MKKA −=

32

2AAD

ADDDMM

=+=+=+

422

2D

MKKDKAMKD

==

=

63D

2A2A3

Funkcja podziału teg

=++++++= LL n32 AAADMz

LL ++++++= − n2nD

1nA

63D

2A

42DA

2D MKKMKKMKKMKM

W powyższym wyrażeniu możemy zaobserwować, że poczynając

czynienia z szeregiem geometrycznym o a

od drugiego wyrazu mamy do

DM2. A więc: 1 = KDM2 i ilorazie q = KAK

2

2D

MKK1

MKMz

−+=

-9.0 -8.0 -7.0 -6.0logM

-9.0

-8.0

-7.0

-6.0

-5.0

-4.0

-3.0

logC logC = logM

log(MMC)

DA

Tym samym całkowite stężenie związku można przedstawić jako:

( )22

DA

2D

MKK1

MK2M

MzMc

−+=

∂∂

=

Podobnie jak w przypadku nieograniczonej agregacji etapowej

również przy agregacji dimerów pojawia się wielkość MMC

zeregu geometrycznego.

ym razem wynosi ona:

wynikająca z warunku skończonej sumy s

T

DAKK1MMC =


13

O ile wyznaczenie wartości MMC z powyższego wykresu nie nastręcza trudności, o tyle oszacowanie

artości stałych KD i KA nie jest już możliwe na drodze graficznej i wymaga zastosowania

h.

3.2.5

w

numerycznego dopasowywania krzywej do danych doświadczalnyc

Agregacja micellarna

Od szeregu lat dla związków powierzchniowoczynnych stosuje się specyficzny model agregacji

zwany agregacja micellarną. Jest to model jednoetapowy zakładający, że n cząsteczek monomeru

żnosci:

.

Funkcja podziału przyjmuje w tym modelu postać:

tworzy agregat zwany micellą:

nM = A

ze stałą agregacji nAK . Stężenie micelli można wtedy okreslić z zale

nnAMKA =

nnAMKMAMz +=+= ,

a całkowite stężenie związku wynosi:

nn MnKMnAMc +=+= .

-10.0 -9.0 -8.0 -7.0 -6.0logM

-10.0

-9.0

-8.0

-5.0

-4.0

-3.0

A

Po zlogarytmowaniu tej zależności otrzymujemy:

( )1nnAMnK1logMlogclog −++= .

Dla KAM << 1 możemy prz

-7.0

-6.0

logC

yjąć, że ( )1n − jest w

rzybli ny log(1) czyli 0. Tak więc dla małych stężeń

ym

wnym 1.

nAMnK1log +

p żeniu rów

powinniśmy otrz ać linię prostą log c = log M o nachyleniu

ró

Dla KAM >> 1 możemy z kolei przyjąć, że ( )1nnAMnK1log −+ jest w

rzybliżeniu równy p ( )1−nnAMnKlog , czyli:

( )≈++= −nnAMnK1logMlogclog 1

1n)nKlog(Mlog AnA ++=−++≈

achyleniu równym n.

a wykresie powyżej przedstawiono przebieg zależności dla tego

do wykresu wyzn

ży w tym miejscu wyraźnie powiedzieć, że jednoznaczne

odróżnienie agregacji micellarnej dla n większego niż kilkanaście od obu powyższych modeli

logCMC

-9.0 -8.0 -7.0 -6.0logM

-9.0

-8.0

-7.0

-6.0

-5.0

-4.0

-3.0

logC

Asocjacja micellarna

Asocjacja etapowa

Asocjacja dimer w

log( ) )Klog(nnlogMlognM

Tak więc otrzymujemy równanie linii prostej o n

N

modeli agregacji. Przedłużenie stycznej acza na osi

poziomej wielkość CMC (ang. Critical Micellar Concentration).

Nale


14

ożliwe. Wynika to po pierwsze z faktu występowania

nieuniknionych błędów pomiarowych. Po drugie, należy pamiętać, że wszystkie 3 modele są tylko

elami rzeczywistego procesu agregacji w którym upraszczające założenia

oczynione przy konstruowaniu modeli nie muszą być spełnione.

.3 Oddziaływanie małocząsteczkowego ligandu z biopolimerem gadnieniem oddziaływania

iego oddziaływania modele

ia.

ząsteczka M posiadająca n miejsc

iążących ligand. Na gruncie makroskopowym zachodzące procesy możemy wtedy opisać

Przy tworzeniu modelu takiego oddziaływania znamy ogólne stężenie biopolimeru M oraz ogólne

w jesteśmy w stanie

eśli

agregacji nieograniczonej jest w zasadzie niem

przybliżonymi mod

p

3 W badaniach biofizycznych spotykamy się często z za

małocząsteczkowych ligandów z biopolimerem, np. białkiem. Do opisu tak

wyprowadzone na gruncie chemii ogólnej nie znajdują zwykle zastosowan

Załóżmy, że w badanym układzie znajduje się makroc

w

zależnością:

⎪⎪⎪

⎩

⎪⎪⎪

⎨

⎧

+⇔

+⇔+⇔+⇔

− LMM

LMMLMMLMM

1nn

23

12

01

M

stężenie ligandu c. Zakładamy zwykle ponadto, że z odpowiednich pomiaró

okr ć stężenie wolnego ligandu, L. Podstawowy problem sprowadza się do ustalenia

poszczególnych stałych dysocjacji kompleksów ligand-biopolimer, Ki:

i

i MK =

Pomocą może służyć opis mikroskopowy wraz z pewnymi założeniami upraszczającymi.

3.3.1

1i LM ⋅−

Niezależne miejsca wiązania

Najprostsze założenie jakie zwykle czynimy w modelach tego typu polega na rozważaniu

ji gdy n miejsc wiązania ligandu jest od siebie niezależnych. W opisie mikroskopowym oznacza

to, że mikroskopowe stałe kolejnych kompleksów są sobie równe.

jeden rodzaj miejsc wiązania

nym

stanom makro.

sytuac

Zwykle zakłada się również, że makrocząsteczka posiada tylko jeden rodzaj miejsc wiązania.

Oznacza to, że mikroskopowa stała dysocjacji w danym miejscu wiązania nie jest zależna od tego co

dzieje się w innych miejscach. Jednakże ponieważ jest to opis mikro, więc rozróżniamy poszczególne

miejsca wiązania. Pojawia się teraz pytanie ile różnych stanów mikro odpowiada poszczegól


15

ocząsteczki zawierającej n = 4 miejsca wiązania: Rozpatrzmy to na przykładzie makr

Stan makro Stany mikro Liczba stanów mikro M0 1

M1 4

M2 6

M3 4

M4 1 Można wykazać, że liczba stanów mikro dla n miejsc wiązania z których i jest obsadzonych równa jest

liczbie kombinacji i-elementowych z n-elementowego zbioru:

( ) !i!in!nCi=Ω ni,n −

=

Jeżeli założymy, że wszystkie miejsca wiązania są jednakowe i niezależne, to wartości

makroskopowych stałych dysocjacji wyrazić można zależnością:

kKi,n

1i,ni Ω

Ω= −

Dla n = 4 otrzymamy:

14641

4,4

3,4

2,4

1,4

0,4

=Ω=Ω=Ω=Ω=Ω

k4kK

k23kK

k32kK

k41kK

4,4

3,44

3,4

2,43

2,4

1,42

1,4

0,41

=ΩΩ

=

=ΩΩ

=

=ΩΩ

=

=ΩΩ

=

Wyznaczmy teraz stężenie związanego ligandu, B:

gdzie:

n321 nMM3M2MB ++++= L

1

01 K

LMM =

21

20

2

12 KK

LMK

LMM ==

321

30

3

23 KKK

LMK

LMM ==

n321

n0

n

1nn KKKK

LMK

LMM

L== −

Analogicznie bilans różnych form makrocząsteczki wyraża się zależnością:


n3210 MMMMMM +++++= L

16

Bez utraty ogólności roz my te wzory do przypadku, gdy n = 4:

ważań zastosuj

=++++= 43210 MMMMM

M

=++++=4K321

40

321

30

2

20

1

00 KKK

LMKKK

LKKLM

KLM

M 1

M

=⋅⋅⋅

+⋅⋅

+⋅

++=4320

k423

32

41k

23

32

41k

32

41k

41M 0

30

200 MLMLMLM

4L

4

40

3

30

2

200

0 k

LM

k

LM4

k

LM6

kLM

4M ++++=

Po wyłączeniu M0 i niewielkich przekształceniach otrzymamy:

⎥⎥⎦

⎤⎡ ⎞⎛⎞⎛⎞⎛⎞⎛432 LLLL

⎢⎢⎣

⎟⎠

⎜⎝

+⎟⎠

⎜⎝

+⎟⎠

⎜⎝

+⎟⎠

⎜⎝

+= 0 kk4

k6

k41MM

ach kwadratowych jest rozwinięciem wzoru 4

kL1 ⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ +Wyrażenie w nawias , otrzymamy więc

statecznie:

on

0 kL1MM ⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ +=

Zastosowanie analogicznych podstawień do bilansu związanego ligandu prowadzi do zależności:

=+⋅+⋅+= 4

40

3

30

2

200

k

LM4

k

LM43

k

LM62

kLM

4B

3

0

32 LLLL ⎤⎡ ⎞⎛⎞⎛⎞⎛ 0 kL1

kLM4

kk3

k31

kM4 ⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ +=

⎥⎥⎦⎢

⎢⎣

⎟⎠

⎜⎝

+⎟⎜⎝

+⎟⎠

⎜⎝

+=

padku ogóln m otrzymamy:

⎠

W przy y1n

0 kL1

kLnMB

−

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ +=

Możemy teraz obliczyć średni stopień obsadzenia makrocząsteczki, ν, czyli liczbę moli związanego

ligandu przypadająca na mol makrocząsteczki:

kL1

kLn

kL1M

kL1

kLnM

MB

n

0

1n −

0

+=

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ +

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ +

==ν

nika: Dokonajmy teraz kilku przekształceń. Rozpocznijmy od pozbycia się mianow


17

kLn

kL

=ν+ν

y teraz obie strony przez stężenie wolnego ligandu, L:

Podzielm

kn

kL=

ν+

ν

i przenieśmy ν/k na prawą stronę:

ν−=ν

k1

kn

Jeżeli nasze założenia co do istnienia n jednakowych i niezależnych miejsc wiązania są

prawdziwe, to wykres zależności ν/L w funkcji ν, czyli tzw. wykres Scatcharda powinien mieć

α = -1/k. Jak można się ć analizując powyższy wzór linia

w punkcie ν/L = n/k. Tak więc wykres Scatcharda

możliwia wyznaczenie obydwu parametrów modelu:

liczby miejsc wiązania, n, i mikroskopowej stałej

Pojawia się jednak pytanie skąd wziąć wartość

śmy się przecież, że dysponujemy tylko

iedzą o ogólnym stę makrocząsteczki, M, i

ligandu, c, oraz znamy z pomiaru stężenie wolnego

ożna obliczyć ν. Powróćmy do definicji:

L

postać linii prostej o nachyleniu tg przekona

ta przecina oś poziomą w punkcie ν = n, a oś pionową

u

dysocjacji, k.

ν? Umówili

w żeniu

ligandu, L. Okazuje się, że dysponując tymi danymi

m

MB

=ν .

Ponieważ B = c – L, więc:

M

Lc −=ν .

Uzyskanie na wykresie Scatcharda zależności w postaci linii prostej potwierdza założenie o

istnieniu tylko jednej puli jednakowych i niezależnych miejsc wiązania.

catcharda jeżeli makrocząsteczka posiada dwa rodzaje

miejsc wiązania o zdecydowanie różnych stałych dysocjacji. Sytuacja taka występuje często w

rzypadku białek. Posiadają one niewielką ść miejsc specyficznie i silnie wiążących ligand (miejsca

receptorowe) oraz pewną liczbę miejsc gdzie może dochodzić do niespecyficznego i słabego

oddziaływania z ligandem, np. na powierzchni białka.

dwa niezależne rodzaje miejsc wiązania

Zobaczmy jak będzie wyglądał wykres S

p ilo

0.0 2.0 4.0ni

0.0

2.0

4.0

Y = -0.991 * X + 3.97

µni/[

L]

n = 3,97k = 1,01 M


18

Załóżmy, że makrocząsteczka posiada n1 miejsc receptorowych o stałej dysocjacji k1 oraz n2

niespecyficznych miejsc wiązania o stałej dysocjacji k2. Pomiędzy stałymi dysocjacji zachodzi przy

nia są od siebie niezależne, więc dla

ażdego z nich mo emy napisać wyrażenie na średni stopień obsadzenia:

tym zależność: k1 < k2. Ponieważ obydwa rodzaje miejsc wiąza

k ż

1

11 k

n=ν1

kL1

L

+

2

22

2

kL1

kLn

+=ν

Ogólny stopień obsadzenia jest sumą stopni obsadzenia obu typów miejsc wiązania:

⎟⎟⎞

⎜⎜⎝

⎛+

++

=+

++

=ν+ν=νnnL

kLk

kLn

kLk

kLn

2

2

1

1

2

2

2

2

1

1

1

1

21

Po podzieleniu obu stron równania przez stężenie wolnego

⎠LkLk

ligandu otrzymamy:

Lkn

Lkn

L 2

2

1

1+

++

=ν

Jest to zależność analogiczna do równania Scatcharda, jednak jej kształt nie jest tak oczywisty jak przy

kać wiele informacji rozpatrując przypadki

ie wartości ν oznaczają jednocześnie niskie

gą tylko przy wysokich lub bardzo wysokich

żność

jednym rodzaju miejsc wiązania. Można jednak uzys

graniczne. Należy przy tym zdać sobie sprawę, że nisk

stężenie wolnego ligandu, a duże wartości ν wystąpić mo

stężeniach wolnego ligandu.

Zobaczmy więc jak będzie się zachowywała nasza zale

przy granicznych wartościach L:

2

2

1

1

2

2

1

1

0L kn

kn

0kn

0kn

Llim +=+

++

=ν

→

0Llim

L=

ν

∞→

212

2

1

1

Lnn

LkLn

LkLnlim +=

++

+=ν

∞→ 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

ni

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

ni/[

L]

Y = -0.152 * X + 1.74

Y = -1.53 * X + 4.98

n1 = 3,25k1 = 0,65 Mµ

n1 + n2 = 11,4k2 = 6,58 Mµ

Tak więc krzywa na wykresie Scatcharda w przypadku dwóch niezależnych typów miejsc wiązania

ędzie b przecinać oś pionową w punkcie o rzędnej n1/k1+n2/k2, a oś poziomą w punkcie o odciętej

n1+n2. Ponieważ zwykle k1<<k2, więc w pierwszym przybliżeniu można przyjąć, że:

1

1

2

2

1

1kn

kn

kn

≈+ i 221 nnn ≈+ .


Można ponadto wykazać, że gdy L→0, to tgα→-1/k1, a gdy L→∞,

to tgα→-1/k2. Pozwala to wyznaczyć graficznie przybliżone

wartości parametrów modelu. Parametry te można znacznie

udokładnić w kolejnych cyklach obliczeń korzystając z wartości z

19

poprzedniego cyklu.

okładne wartośc parametrów ożna jednak otrzymać

dopiero po zastosowaniu numerycznego dopasowania krzywej. W

uzyskane metodami graficznymi.

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0ni

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

ni/[

L]

n1 = 2,01k1 = 0,50 Mµ

D i tych m

większości przypadków wystarczają jednak wartości przybliżone

3.3.2 Zależne miejsca wiązanie

W rozpatrywanych dotychczas modelach zakładaliśmy niezależność miejsc wiązania.

Wiadomo jednak doskonale, że w układach biologicznych istnieją również przypadki gdy związanie

y związanie pierwszej

ząsteczki ligandu przeszkadza wiązaniu następnych mówimy o

ułatwia mamy do czynienia z kooperatywnością wiązania.

pisują bowiem podobną sytuację: w

d

raz mniejszym powinowactwie.

ozróżnienie tych dwóch modeli tylko na podstawie wykresu

Scatcharda jest w praktyce niemożliwe.

ooperatywne miejsca wiążące

Dużo korzystniejsza sytuacja istnieje w przypadku wiązania

ooperatywnego. Ten typ oddziaływania miejsc wiążących

prowadzi bowiem do bardzo charakterystycznego kształtu wykresu

odciętej równej n.

Do analizy wiązania ligandu do miejsc kooperatywnych

zaproponowano specjalny, jednoetapowy model:

pierwszej cząsteczki ligandu zmienia zdolność wiązania kolejnych ligandów. Gd

c antykooperatywności wiązania, a gdy

antykooperatywne miejsca wiążące

Wykres Scatcharda uzyskiwany w przypadku

antykooperatywnych miejsc wiążących jest podobny do wykresu

dla modelu dwóch różnych, niezależnych typów miejsc

wiążących. Obydwa modele o

n2 = 10,02k2 = 10,12 M

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0ni

0.0

1.0

2.0

3.0

ni/[

L]

4.0

5.0

6.0Antykooperatywne miejsca wiążące

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0ni

0.0

2.0

3.0

miarę wzrostu średniego obsadzenia makrocząsteczki ligan

wiąże się do miejsc wiązania o co

R

k

Kooperatywne miejsca wiążącek

Scatcharda (rysunek obok). Jednakże do interpretacji ilościowych

nadaje się jedynie prawa część wykresu. Można wykazać, że

styczna do tego fragmentu krzywej przecina oś poziomą w punkcie

1.0

ni/[

L]

o


20

nLMM 0n +⇔ n

n0n

MLM

K ==> n

0= n

n0

n MK

LMM

Opis taki zakłada całkowitą, idealną kooperatywność: związanie

zwiększa powinowactwo pozostałych miejsc wiązania, że zostają o

jest to model bardzo w

KL

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛==

pierwszego ligandu tak bardzo

ne zaraz obsadzone. Jak widzimy

yidealizowany, ale warto zobaczyć do jakich wniosków prowadzi.

Dla tego modelu wielkość ta ma

puje jedynie w dwóch stanach:

wzajemne proporcje obu stanów

adzenia pojedynczej makrocząsteczki.

Wyznaczmy sobie najpierw średni stopień obsadzenia, ν.

nieco odmienną interpretację. Ponieważ makrocząsteczka wystę

wolnym i obsadzonym, jest to więc wielkość charakteryzująca

makrocząsteczki, a nie stopień obs

nn

n

n

nn

n

nn

00

n0

n0

n

LKnL

KLK

K

KLMMK

LnM

MMnM

MB

+=

+=

+=

+==ν

Zależność tą należy teraz poddać kilku przekształceniom:

nn nL

n

nn LKL

=ν n +

( ) nnn LLKn

=+ν

-6.0 -4.0 -2.0 0.0 2.0log(n/ni - 1)

nnn LLn

Kn

=ν

+ν

-1.0

0.0

1.0

logL

[ M

]

2.0

Y = -0.252*X - 0.001

nnnn Ln

nLn

LKn

ν−=

ν−=

ν

( ) nn LnK ν−=ν

nn L1nK ⎟⎞

⎜⎛ −=

⎠⎝ ν

Ostatnią zależność należy teraz zlogarytmować i po kilku prostych

zależność:

przekształceniach otrzymujemy

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −

ν−= 1nlog

n1KlogLlog .

Jeżeli teraz na osi pionowej odłożymy wartości logL, a na osi poziom

wykres Hilla. Jeżeli układ spełnia nasze założenia, to powinniśmy ot

tgα = -1/n przecinając

ej log(n/ν-1) to otrzymamy tzw.

rzymać linię prostą o nachyleniu

ą oś pionową w punkcie o rzędnej logK.

przypadku poprawnie dobranej

uje się zależność w przybliżeniu liniową, ale o

W praktyce okazuje się, że sprawa nie jest taka prosta. Nawet w

wartości n (np. z wykresu Scatcharda) otrzym


21

nachyleniu różnym od -1/n. Wskazuje to, że kooperatywność nie jest tak idealna jak zakłada model.

rzyjęto więc, że: P

H

1tgα

−=α

gdzie αH nosi nazwę stałej Hilla. Stała ta przyjmuje wartości od 1 do n. Gdy bliska jest 1 oznacza to

brak kooperatywności, a im bliższa jest n tym kooperatywność jest silniejsza. I tak np. dla wiązania

tlenu do hemoglobiny (n = 4) otrzymujemy αH w zakresie od 2,5÷3,0.

3.3.3 Liniowa matryca miejsc wiązania

Opisane powyżej modele zostały stworzone dla makrocząsteczki w której miejsca wiązania nie

są ułożone w jakiś szczególny sposób. Dlatego ich zastosowanie ogranicza się w zasadzie do białek.

ednakże jednym z ważnych obiektów badań biofizyki są również kwasy nukleinowe, a w

szczególności DNA. W tej cząsteczce miejsca wiązania są jednak ustawione w porządku linearnym

wzdłuż podwójnej helisy. Jeżeli jednocześnie wiążący się ligand zajmuje kilka sąsiadujących ze sobą

ają się nieodpowiednie.

Podstawowy problem polega na tym, że ligand nie ma

dostępu do miejsc wiązania tworzących ciągi krótsze niż liczba

ajmowanych miejsc (patrz rysunek poniżej dla n = 3). Liczba

dostępnych miejsc maleje więc nieliniowo wraz ze wzrostem

topnia obsadzenia matry y. Zjawisko to nazwano wiązaniem z wykluczeniem sąsiada (ang. neighbour

exclusion binding). Zaproponowano szereg modeli matematycznych opisujących takie oddziaływanie.

ajszersze zastosowanie spośród nich zdobył model zaproponowany przez McGhee i von Hippel.

W modelu tym zakładamy, że matryca jest bardzo długa, tak że można ją traktować jako

nieskończoną. Ligand wiąże się z matrycą ze stałą dysocjacji k zajmując n kolejnych miejsc wiązania.

rak jest przy tym odd ływań pomiędzy sąsiadującymi ze sobą ligandami. Niech ν oznacza średnią

ć jako stężenie związanego ligandu, B, podzielone przez stężenie DNA wyrażone w

parach zasad, Z:

J

miejsc wiązania, np. n, to modele opracowane dla białek st

z

s c

N

B zia

liczbę ligandów przypadających na jedno miejsce wiązania, np. parę zasad w DNA. Makroskopowo

można ν wyrazi

ZB

=ν

Wyprowadzenie równań modelu McGhee - von Hippel wymaga znajomości dosyć zaawansowanych

metod kombinatorycznych zapoznamy się wiec tylko z ostateczną zależnością. 1n−

( ) ( )1n1n1n1k

L ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ν−−

ν−ν−=

ν

gdzie: L oznacza stężenie wolnego ligandu.


22

ania modelu do danych doświadczalnych. Przybliżone wartości można jednak

szacować z odpowiednich wykresów.

Dokładne wartości parametrów modelu: n oraz k, można wyznaczyć tylko przez numeryczne

dopasowanie równ

o

0.4

0.6

1.2

600

800

1000

ni/L

1200

n = 1n = 2n = 4

0.8

1

ni*n

n = 1n = 2n = 4

400

0

0.2

1.0E-06 1.0E-05 1.0E-04 1.0E-03 1.0E-02 1.0E-01 1.0E+00L

0

200

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1ni

Jeden z takich wykresów jest analogiem wykresu Scatcharda (powyżej po lewej). Od oryginału różni

się jednak znaczeniem wielkości ν: teraz jest to liczba cząsteczek ligandu przypadająca na jedną parę

zasad. Ze względu na omówione powyżej problemy z dostępem do niektórych miejsc wiązania

ależno o dla wiązania antykooperatywnego.

na zależność przecina osie wykresu w

i pionowej odpowiada stałej wiązania

barczone jest zwykle dużymi błędami

esu

iędzy sąsiadującymi ze sobą ligandami. Wprowadzono w tym celu parametr

kooperatywności, ω.

la ω > 1 obecność związanego ligandu sprzyja przyłączeniu w jego bezpośrednim sąsiedztwie

w jego bezpośrednim

sąsiedztwie. Wiązanie ma więc charakter antykooperatywny.

la ω = 1 mamy do czynienia z w zaniem niekooperatywnym. Ligand wiąże się z matrycą bez

z ść ma charakter nieliniowy, podobny do obserwowaneg

Jedynie dla n = 1 obserwujemy zależność prostoliniową. Uzyska

charakterystycznych punktach (rysunek). Punkt przecięcia na os

k, a na osi poziomej 1/n. Jednakże wyznaczenie tych punktów o

ponieważ dane doświadczalne urywają się z daleka od obu osi, a zależność ma charakter nieliniowy.

Innym typem wykresu pomocnym przy analizie danych z zastosowaniem modelu

McGhee - von Hippel jest tzw. wykres wysycenia (powyżej po prawej). Na osi pionowej wykr

znajduje się iloczyn n*ν będący ułamkiem wysycenia wszystkich miejsc wiązania, a na osi poziomej

stężenie wolnego ligandu, zwykle w skali logarytmicznej. Z zamieszczonego obok wykresu widać, że

wraz ze wzrostem liczby miejsc zajmowanych przez cząsteczkę ligandu przy niezmiennej wartości

stałej wiązania coraz trudniej jest uzyskać pełne wysycenie matrycy.

Model McGhee - von Hippel można jeszcze rozbudować uwzględniając oddziaływania jakie

mogą wystąpić pom

D

kolejnego ligandu. Wiązanie ma więc charakter kooperatywny.

Dla ω < 1 obecność związanego ligandu przeszkadza związaniu kolejnego

D ią

względu na sąsiedztwo.


0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

200

400

600

800

1000

1

1.2

1.0E-06 1.0E-05 1.0E-04 1.0E-03 1.0E-02 1.0E-01 1.0E+00L

ni*n

omega = 0,1omega = 1

1200

1400

1600

0 0.1 0.2 0.3 0.4ni

ni/L

omega = 0,1omega = 1omega = 10 omega = 10

Rodzaj oddziaływania z sąsiednim ligandem znajduje swoje odzwierciedlenie zarówno na wykresie

typu Scatcharda (powyżej po lewej) jak i na wykresie wysycenia (powyżej po prawej).

Pełny model McGhee - von Hippel ma już bardzo skomplikowana postać matematyczną. Dla

porządku przedstawię go jednak poniżej:

( ) ( )( )( )( )

( )( )

21n

n12R1n1

n112Rn112n1k

L ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ν−

+ν+−⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ν−−ω

−ν+ν−+ων−=

ν−

gdzie: ( )[ ] ( )ν−ων+ν+−= n141n1R 2

Jednakże nawet przy zastosowaniu tak skomplikowanych modeli w praktyce zdarzają się

czasami układy wyraźnie odbiegające od przyjętych założeń. Najczęściej jest to wynikiem:

• dużych różnic w powinowactwie do różnych sekwencji zasad - więcej niż jedna stała wiązania

• różnic w stechiometrii wiązania - więcej niż jedna wartość n

oddziaływanie ligandu nie tylko z najbliższymi sąsiadami - więcej niż jedna wartość ω.

•

23

biofizyka ii

Documents