bioprospecÇÃo de atividade Álcool...
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Biofar, Rev. Biol. Farm. Campina Grande/PB, v. 9, n. 1, p. 01-12, março/maio, 2013
Revista de Biologia e Farmácia. Universidade Estadual da Paraíba. Centro de Ciências Biológicas e da Saúde. Departamento de Biologia. Av.
Juvêncio Arruda, s/n, Bodocongó, Campina Grande, PB, BRASIL. Cep: 58.109-753. E-mail: [email protected] ou [email protected]
BIOPROSPECÇÃO DE ATIVIDADE ÁLCOOL DESIDROGENASE (ADH) DE FUNGOS
ANEMÓFILOS ISOLADOS DO CENTRO VOCACIONAL TECNOLÓGICO DO
MUNICÍPIO DE TAUÁ-CE
Ana Raquel Carneiro Ribeiro1a
; Luiz Francisco Wemmenson Gonçalves Moura1a
; Messias Vital de
Oliveira1a
; Daniele Rodrigues de Lima2a
; João Gláucio Siqueira Matos Mota3ab
; Francisco Ernani
Alves Magalhães4ab
RESUMO - Dados reportados na literatura apontam as enzimas álcool desidrogenases (ADHs)
como uma das classes de enzimas de maior emprego biotecnológico, pois são bastante empregas em
química sintética devido ao seu grande potencial de resolução de centros quirais, utilizados para
síntese de fármacos. Diante deste contexto, esse trabalho teve como objetivo realizar a
bioprospecção de atividade álcool desidrogenase (ADH) de fungos anemófilos isolados do Centro
Vocacional Tecnológico do Município de Tauá–CE. Inicialmente, sete espécies fúngicas
identificadas como Aspergillus niger, Aspergillus glaucus, Alternaria sp., Cladosporium
cladosporioides, Cladosporium sphaerospermum, Phoma sp., Aureobasidium pullulans, e duas
cepas anemófilas não identificadas FA6-CVT e FA12-CVT, arquivadas em micotecas no
Laboratório de Bioprospecção de Produtos Naturais e Biotecnolgia - LBPNB, foram repicadas em
meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) por sete dias. Posteriormente, foram submetidos a
ensaios de atividade ADH através do método difusão em gel, em placas de Petri, utilizando-se dois
meios de culturas distintos: o Meio I para caracterização dos substratos de redução e Meio II para
caracterização do substrato de oxidação (Meio II) da enzima. O crescimento vegetativo foi realizado
até o 15º dia nos dois meios e na ausência de luz para o Meio II, ambos a temperatura ambiente
(30±2ºC). Os ensaios foram realizados em triplicata e o fungo Fusarium oxysporum foi utilizado
como controle positivo. Como resultado deste trabalho, das nove espécies fúngicas testadas, cinco
(55%) apresentaram atividade ADH positiva, expressando a enzima via substrato de oxidação
(Meio II). As espécies fúngicas que e mostraram ativas foram Aspergillus glaucus, Cladosporium
cladosporioides, Phoma sp. e as duas cepas não identificadas FA6-CVT e FA12-CVT.
Unitermos: Aspergillus glaucus, Cladosporium cladosporioides, Phoma sp.
BIOPROSPECTING ALCOHOL DEHYDROGENASE (ADH) ACTIVITY OF AIRBORNE
FUNGI ISOLATED OF VOCATIONAL TECHNOLOGICAL CENTER (VTC) OF THE
TAUÁ TOWN
ABSTRACT - Data reported in the literature indicate the alcohol dehydrogenase enzymes (ADHs)
as one of the major classes of enzymes biotechnological use because they are quite empregas in
synthetic chemistry because of their great potential for resolution of chiral centers, used for
1 Licenciado (a) em Ciências Biológicas (UECE-Tauá-CE), Especialista em Biologia e Química (URCA- Tauá-CE),
[email protected]; [email protected]; [email protected]; 2 Licenciada em Química (UECE-Tauá-CE), [email protected]; 3 Licenciado em Ciências Biológicas
(UECE-Tauá-CE), Especialista em Educação Ambiental (URCA), Estudante de Especialização em Bioquímica e
Biologia Molecular Aplicadas à Saúde (UECE), [email protected]; 4 Licenciado em Química (UFC), Doutor
em Biotecnologia (UECE), [email protected]; a Laboratório de Bioprospecção de Produtos Naturais e Biotecnologia, Universidade Estadual do Ceará, Centro de Educação, Ciências e Tecnologia da Região dos
Inhamuns, CEP 63660-000, Rua Solon Medeiros, S/N, BR 020. Bairro Bezerra e Sousa, Tauá, Ceará, Brasil. Tel./Fax:
+55-88-34371772; b Laboratório de Bioquímica Humana, Universidade Estadual do Ceará, Centro de Ciências da
Saúde, CEP 60740-000, Av. Paranjana 1700, Fortaleza, Ceará, Brasil. Tel./Fax: +55-85-31019822.
Recebido para publicação em 23/07/2012 – Aprovado em 12/08/2012
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synthesis of drugs. Given this context, this study aimed to conduct bioprospecting alcohol
dehydrogenase (ADH) activity of airborne fungi isolated of Vocational Tecnhological Center
(VTC) of the Tauá town. Initially seven fungal species identified like Aspergillus niger, Aspergillus
glaucus, Alternaria sp., Cladosporium cladosporioides, Cladosporium sphaerospermum, Phoma
sp., Aureobasidium pullulans, and two strains not identified anemophilous FA6-CVT and FA12-
CVT, filed in the Laboratório de Bioprospecção de Produtos Naturais e Biotecnolgia - LBPNB were
transferred into culture medium potato-dextrose-agar (PDA) for seven days. Subsequently, they
were tested for ADH activity by gel diffusion method in a Petri dish, using two different culture
media: Medium I for the characterization of substrates and reduction of Medium II to characterize
the oxidation substrate enzyme. The growth was carried out until the 15th day in both media and the
absence of light for the Environment (II), both at room temperature (30 ± 2 º C). Assays were
performed in triplicate and Fusarium oxysporum was used as positive control. As a result of this
work, nine fungal species tested, five (55%) had positive ADH activity by expressing the enzyme
via substrate oxidation (Medium II). The fungal species that were active and showed: Aspergillus
glaucus, Cladosporium cladosporioides, Phoma sp. and two unidentified strains FA6-CVT and
FA12-CVT.
Uniterms: Aspergillus glaucus, Cladosporium cladosporioides, Phoma sp.
INTRODUÇÃO O desenvolvimento econômico e sua conseqüente demanda por recursos naturais, seguida do
aumento de resíduos de atividades humanas no meio ambiente é um problema crescente nos dias
atuais. Portanto, procuram-se desenvolver técnicas para tratar esses resíduos ou mesmo minimizar
sua produção por meio de “tecnologias limpas” ou “bioprocessos”. Dentre essas, destacam-se a
biocatálise, onde enzimas são extraídas de plantas, bactérias ou fungos e catalisam processos como
fitorremediação, biorredução de cetonas, lactonização, reações de hidrólise, hidroxilação e oxidação
(Utsunomiya, 2008). Neste contexto, se enquadram as enzimas álcool desidrogenases, empregadas
na indústria química sintética por suas famosas resoluções de centro quirais, através de biorreduções
de cetonas empregando-se micro-organismos como fontes da enzima para síntese de fármacos
quirais (Magalhães, 2011).
A bioprospecção enzimática de micro-organismos surgiu para o desenvolvimento de
bioprocessos e/ou obtenção de moléculas de importância medicinal e/ou biotecnológica (Casas et
al., 2007). Assim, a busca por novas fontes de microrganismos produtores de diferentes classes de
enzimas se torna um desafio.
A biocatálise ou biotransformação (conversões químicas catalisadas por enzimas de micro-
organismos, plantas, animais, dentre outros, sobre substratos não naturais) é importante ferramenta
em síntese orgânica para a produção de moléculas quirais (fármacos quirais) em que reações
químicas clássicas são impossíveis ou ineficientes. A substituição de catalizadores químicos por
enzimas deve-se principalmente às condições brandas de pH e temperatura em que estas
macromoléculas geralmente atuam (Magalhães, 2011).
Tem sido um desafio para a indústria farmacêutica a obtenção de fármacos
enantiomericamete puros, visto que a ação estereosseletiva dos receptores protéicos no organismo
induz diferentes comportamentos biológicos: um enantiômero produz a atividade desejada enquanto
o outro é inativo; os enantiômeros produzem atividades idênticas, qualitativa e quantitativamente; a
atividade dos enantiômeros é qualitativamente idêntica, mas quantitativamente diferente; as
atividades dos isômeros são qualitativamente diferentes (Lima, 1997; Barreiro et al., 1997).
A resolução cinética enzimática consiste na transformação química preferencial de um dos
enantiômeros de uma mistura racêmica, catalisada por uma enzima. Devido à quiralidade da
enzima, um dos enantiômeros acomoda-se melhor em seu sítio ativo e então, este é convertido
numa velocidade maior, resultando numa resolução (Utsunomiya, 2008).
Álcoois quirais são precursores importantes, pois servem como intermediários na síntese de
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diversos compostos quirais de importância biológica. Entre vários exemplos, o (S)-(-)-3-hidróxi-
butanoato de etila, é um dos alcoóis quirais mais utilizados como precursor quiral em síntese
orgânica: o (S)-(+)-recifeioídeo, importante aditivo na indústria de perfumes; (R)-lavandulol,
macrolídeo de atividade antibiótica reconhecida (Utsunomiya, 2008).
A enzima álcool desidrogenase (ADH, EC 1.1.1.1) é uma haloenzima (enzima dependente
do cofator NADH), pertencente à subclasse das oxirredutases, envolvida no catabolismo da glicose
(Figura 01), que catalisa a oxidação reversível de álcoois aos correspondentes compostos
carbonilados (aldeídos e cetonas) (Figura 02). Compostos opticamente ativos como os alcoóis
quirais têm sido amplamente reconhecidos como importantes intermediários sintéticos para
produtos farmacêuticos e agroquímicos (Magalhães, 2011). Esta classe de enzimas é empregada na
redução assimétrica de compostos opticamente ativos para síntese de agentes antimicrobianos
(Kizaki et al., 2008).
Figura 01- Metabolismo da glicose
Figura 02- Reação catalisada por álcool desidrogenase (ADH)
Nos últimos anos, observou-se um aumento significativo de pesquisas focalizando
screenings de atividades enzimáticas de micro-organismos e posterior emprego de cepas ativas na
bioprospecção de atividade biocatalítica através de trabalhos cooperativos. Exemplos desses
trabalhos são as transformações de compostos orgânicos com micro-organismos em biocatálise
enfocando as reduções assimétricas de cetonas. Essas reações são importantes e fundamentais para a
produção de alcoóis enantiomericamente puros, que podem ser transformadas em várias outras
funcionalidades com aplicações para a síntese química com escala industrial (Magalhães, 2011).
Biocatalizadores de origem microbiana merecem destaque por serem abundantes na
natureza, expressarem grande diversidade de processos metabólicos com o envolvimento de
enzimas. Além do curto tempo de geração e a independência de intempéries climáticas, podendo ser
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cultivadas nos mais diversos meios de pH e temperatura (devido á sua diversidade e adaptação aos
substratos onde são encontrados) (Magalhães, 2011).
Na busca pelo biocatalisador ideal, inúmeros estudos de triagem de microrganismos vêm
sendo realizados através do screening de atividade metabólica de enzimas desidrogenases. Dados
reportados na literatura apontam fungos filamentosos isolados de diversos ambientes como novas
fontes de enzimas ADHs (Brasilino et al., 2010; Magalhães, 2011; Nobre, 2011).
Diante desses relatos e dando continuidade às pesquisas enfocando prospecção de ADHs de
fungos anemófilos, o presente trabalho teve como objetivo a bioprospecção de atividade ADH dos
fungos anemófilos isolados do Centro Vocacional Tecnológico do Município de Tauá-CE.
MATERIAIS E MÉTODOS
Fungos anemófilos Os fungos utilizados neste trabalho foram isolados do ar do Centro Vocacional Tecnológico
do Município de Tauá (CVT) (6º0’20”S; 40º17’1”W) (de Oliveira et al., 2012). Os mesmos foram
identificados pelo Prof. Dr. Francisco das Chagas de Oliveira Freire (Embrapa-CE) de acordo com
suas características morfológicas, utilizando-se chaves taxonômicas. Dos fungos isolados do CVT
de Tauá, foram identificados os fungos filamentosos Aspergillus niger (FA1 - CVT), Aspergillus
glaucus (FA11 - CVT), Alternaria sp. (FA14 - CVT), Cladosporium cladosporioides (FA10 -
CVT), Cladosporium sphaerospermum (FA2 - CVT), Phoma sp. (FA3 - CVT). E o fungo
leveduriforme Aureobasidium pullulans (FA8 – CVT). Outros fungos não puderam ser
identificados, aos quais foram atribuídos os códigos FA6 - CVT e FA12 - CVT.
Preparação de meios de culturas
Meio para caracterização do substrato de redução da ADH (Meio I)
O meio de cultura para caracterização do substrato de redução da ADH (Meio I) dos
isolados foi preparado baseando-se em metodologias propostas por Magalhães (2011), com
adaptações. Foram dissolvidos 50 mg de fucsina básica em 1 L de meio de cultura sintético Batata-
Dextrose-Agar (BDA). O meio foi esterilizado em autoclave durante 15 minutos a 121°C e 1 atm.
Posteriormente, sob condições assépticas, placas de Petri (80 x 15 mm), esterilizadas, foram
vertidas com 15 mL de meio, resfriadas até solidificação e estocadas em geladeira (5ºC) por 24h.
Para controle negativo do ensaio foi preparado meio BDA, sem fucsina básica.
Meio para caracterização do substrato de oxidação da ADH (Meio II)
O meio de cultura para caracterização do substrato de oxidação da ADH (Meio II) dos
isolados foi preparado baseando-se em metodologias propostas por Zanon; Perez; Gattas (2007),
com adaptações. O meio utilizado foi Czapek-Agar (CzA), preparado com água destilada. O mesmo
foi composto de Agar-Agar (15 g/L), di-hodrogenofosfato monobásico, 1,0 g/L (KH2PO4), sulfato
de magnésio heptahidratado, 0,5 g/L (MgSO4.7H2O), nitrito de sódio, 2,0 g/L (NaNO2), cloreto de
potássio, 0,5 g/L (KCl) e sulfato ferroso heptahidratado, 0,01 g/L (FeSO4.7H2O). O meio foi
transferido para Erlenmeyers de 250 mL e esterilizado em autoclave durante 15 minutos a 121°C e
1 atm. Após resfriamento até 40ºC, foram adicionados etanol PA (5 mL/L) e solução do reagente
colorimétrico 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT, 50 mg/L). O etanol e a
solução MTT foram esterilizados, sob condições assépticas, com filtro de membrana Millipore
(0,22 μm), separadamente, e acondicionados em frascos ampolas estéreis. Posteriormente, foram
vertidas placas de Petri (80 x15 mm) com 15 mL de meio, resfriadas até solidificação e estocadas
em geladeira (5ºC) por 24h. Para controle negativo do ensaio foi preparado meio Agar-Czapeck sem
etanol PA.
Bioprospecção de atividade álcool desidrogenase
Estes ensaios foram realizados baseando-se em metodologias propostas por Zanon; Perez;
Gattas (2007) e Magalhães et al. (2010). Estes ensaios foram realizados através do método de
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difusão em gel, em placas de Petri, utilizando-se dois meios de culturas distintos para caracterização
dos substratos de redução (Meio I) e oxidação da enzima (Meio II) preparados como descritos
anteriormente. Inicialmente os fungos foram repicados em placas de Petri, contendo meio BDA por
um período de sete dias. Posteriormente, as cepas foram repicadas nos meios enzimáticos e o
crescimento vegetativo ocorreu até o 15º dia nos dois meios e na ausência de luz para o ME2,
ambos a temperatura ambiente (30±2ºC). Os ensaios foram realizados em triplicata e o fungo
Fusarium oxysporum foi utilizado como controle positivo (Hillocks, 1985). Como controles
negativos dos ensaios, os fungos foram repicados nos meios não enzimáticos, preparados como
descritos anteriormente, nas mesmas condições dos experimentos. A atividade ADH dos isolados
foi confirmada através de mudança de coloração das cepas para rosa, no meio de caracterização do
substrato de redução da enzima (Meio I), e para púrpura, no meio de caracterização do substrato de
oxidação da enzima (Meio II).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Diversas pesquisas vêm sendo desenvolvidas enfocando práticas de identificação de micro-
organismos, isolados de diferentes ambientes, através de métodos qualitativos de caracterização de
expressão de enzimas desidrogenases, utilizando-se várias fontes de carbono e diferentes reagentes
colorimétricos (Magalhães, 2011). Nesse trabalho foi adotado o método qualitativo empregando-se
a dextrose e o etanol como fontes de carbono indutores, bem como a fucsina básica e o MTT como
reagentes colorimétricos, para detectar a expressão de enzimas álcool desidrogenases de fungos
anemófilos isolados no CVT do Município de Tauá-CE. Como resultado deste trabalho, das nove
cepas testadas, foi possível detectar a expressão de ADHs em 5 (55,5%), sendo quatro delas
(44,4%) apenas através dos substratos de oxidação da enzima (Meio II) e uma (11,1%) se mostrou
ativa nos dois meios (Meio I e Meio II) (Tabela 1).
Tabela 1 - Resultado dos ensaios de atividade ADHs de fungos anemófilos isolados do Município
de Tauá - CE
Cepas Fúngicas Meios de Culturas para
Expressão de ADHs
Código Espécie Meio I Meio II
FA1-CVT Aspergillus niger - -
FA2-CVT Cladosporium sphaerospermum - -
FA3-CVT Phoma sp. - +
FA8-CVT Aureobasidium pullulans - -
FA10-CVT Cladosporium cladosporioides - +
FA11-CVT Aspergillus glaucus - +
FA14-CVT Alternaria sp. - -
FA6-CVT Não identificado - +
FA12-CVT Não identificado + +
Fo Fusarium oxysporum + +
Legenda: FA- Fungo anemófilo; Meio I - meio de caracterização do substrato de redução da enzima (BDA, suplementado com fucsina básica, 50
mg/L); Meio II- meio de caracterização do substrato de oxidação da enzima [CzA, suplementado com etanol (4 mL/L) e MTT (50 mg/L)]; (+)
presença de atividade ADH; (-) ausência de atividade ADH.
Os resultados obtidos nos experimentos para avaliar a expressão de ADHs dos isolados,
através do meio de cultura específico para caracterização do substrato de redução da enzima (Meio
I), empregando-se a glicose como fonte de carbono indutor estão ilustrados na Tabela 2. Dos nove
isolados testados, oito (88,9%) não se mostraram ativos até o décimo quinto dia de cultivo, pois não
apresentaram mudanças de colorações para rósea, apenas o fungo FA12-CVT expressou a enzima
álcool desidrogenase e assim como o controle positivo, Fusarium oxysporum, apresentou mudança
de coloração para rosa.
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Tabela 2 - Fotos dos ensaios de atividade ADH dos isolados através do Meio I
Fungos Meio I Meio I (CN)
FA6-CVT
5 dias 5 dias
FA12-CVT
5 dias 5 dias
Alternaria sp.
FA14-CVT
5 dias 5 dias Aspergillus
glaucus
FA11-CVT
5 dias 5 dias
Aspergillus niger
FA1-CVT
5 dias 5 dias Aureobasidium
pullulans
FA8-CVT
5 dias 5 dias
Cladosporium
cladosporioides
FA10-CVT
5 dias 5 dias
Cladosporium
sphaerospermum
FA2-CVT
5 dias 5 dias
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Phoma sp.
FA3-CVT
5 dias 5 dias
Fusarium
oxysporum (Fo)
5 dias 5 dias Legenda: Meio I= BDA-Fucsina; Meio I (CN)= Meio I controle negativo, BDA.
Nos ensaios empregando-se o Meio I, o piruvato formado a partir do metabolismo da
glicose, seguiu a rota da fermentação alcoólica produzindo acetaldeído, que logo em seguida foi
reduzido a etanol pela ação da ADH. A fucsina básica reagiu com o acetaldeído mudando a
coloração das colônias do fungo controle positivo (Fusarium oxysporum) para rósea (Wu et al.,
2007).
Os resultados obtidos nos experimentos para avaliar a expressão de ADHs dos isolados,
através do meio de cultura específico para caracterização do substrato de oxidação da enzima (Meio
II), empregando-se o etanol como fonte de carbono indutor estão ilustrados na Tabela 3.
Tabela 3 - Fotos dos ensaios de atividade ADH dos isolados através do Meio II
Fungos Meio I (CN) Meio II (CN) Meio II (Enz)
FA6-CVT
5 dias
15 dias
15 dias
FA12-CVT
5 dias
15 dias
15 dias
Alternaria sp.
FA14-CVT
5 dias
15 dias
15 dias
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Aspergillus niger
FA1-CVT
5 dias
15 dias
15 dias
Aspergillus
glaucus
FA11-CVT
5 dias
15 dias
15 dias
Aureobasidium
pullulans
FA8-CVT
5 dias
15 dias
15 dias
Cladosporium
cladosporioides
FA10-CVT
5 dias
15 dias
15 dias
Cladosporium
sphaerospermum
FA2-CVT
5 dias
15 dias
15 dias
Phoma sp.
FA3-CVT
5 dias
15 dias
15 dias
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Fusarium
oxysporum
5 dias
15 dias
15 dias
Legenda: Meio I (CN): Meio I controle negativo, BDA; Meio II (CN): Meio II controle negativo, CzA-MTT; Meio II (Enz): Meio II enzimático,
CzA-MTT-EtOH;
Dos nove isolados testados neste Meio II, 5 (55%): FA6-CVT, FA12-CVT, Aspergillus
glaucus (FA11-CVT), Cladosporium cladosporioides (FA10-CVT) e Phoma sp (FA3-CVT), se
mostraram ativos, pois apresentaram mudanças de colorações das colônias para púrpura, assim
como aconteceu com o fungo controle positivo, Fusarium oxysporum. Os resultados foram
analisados no décimo quinto dia de cultivo, e mostraram que estes fungos citados apresentaram
atividade ADH positiva (Tabela 3). Os outros isolados não apresentaram atividade ADH positiva
empregando-se este meio de cultura.
Nestes ensaios com o Meio II (Enzimático), o etanol foi oxidado a acetaldeído pela ação das
ADHs, e o hidreto do NADH formado foi incorporado na molécula do MTT, reduzindo-o a
formazan, mudando a coloração das colônias para púrpura (Zanon; Perez; Gattas, 2007) (Figura 3).
Figura 3 - Reação de redução do MTT por ADHs
No Meio II (CN) (Tabela 03) não houve crescimento das cepas FA6 – CVT, FA12 – CVT,
Alternaria sp. (FA14-CVT), Aspergillus niger (FA1-CVT), Aureobasidium pullulans (FA8-CVT),
Cladosporium sphaerospermum (FA2-CVT) e Phoma sp. (FA3-CVT), pois este meio não continha
o etanol, a fonte de carbono indutor da enzima. Já para os isolados Aspergillus glaucus (FA11-
CVT) e Cladosporium cladosporioides (FA10-CVT) houve crescimento microbiano e as colônias
não cresceram de cor púrpura, dando a entender que este crescimento no meio não enzimático se
deu através de outro processo, sem o uso da enzima ADH e, tendo como fonte de nutrientes, os sais
contidos no meio.
Dados reportados anteriormente, empregando-se os mesmos meios de cultura para detecção
da expressão de ADHs de cepas fúngicas isoladas de variados ambientes, apontam fungos
filamentosos e leveduriformes como novas fontes de enzimas álcool desidrogenases (Brasilino et
al., 2010; Magalhães et al., 2010; Nobre, 2011).
Brasilino et al. (2010), desenvolveu um estudo semelhante ao presente, reportando fungos
anemófilos como produtores de ADHs. Isolaram-se fungos filamentosos do ar do Laboratório de
Bioquímica Humana- LBH/UECE/Fortaleza e realizaram bioprospecção de atividade ADH dos
isolados, empregando-se os mesmos ensaios qualitativos. Das cepas testadas: Fusarium solani,
Phaecilomyces sp., Trichoderma sp. e Aspergillus terreus. Desses, Phaecilomyces sp.,
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Biofar, Rev. Biol. Farm. Campina Grande/PB, v. 9, n. 1, p. 1-6, março/maio, 2013
Trichoderma sp. e Aspergillus terreus apresentaram atividade ADH positiva através do Meio II,
utilizando-se o etanol como indutor enzimático e o MTT como reagente colorimétrico. Já o fungo
anemófilo Fusarium solani se mostrou ativo nos dois meios enzimáticos (Meio I e Meio II). No
presente estudo os fungos isolados do ar foram de espécies diferentes, apenas o gênero Aspergillus
que ocorreu no ar do CVT de Tauá, foi semelhante ao isolado do mesmo gênero no LBH de
Fortaleza e ambos, Aspergillus glaucus (CVT) e Aspergillus terreus (LBH), se mostraram ativos
para ADH através do Meio II.
Fungos do gênero Aspergillus, também foram reportados com ativos para atividade ADH
por Magalhães (2011). Nesse trabalho foi usada a mesma metodologia de preparo para o Meio I,
para caracterizar o substrato de redução das ADHs de fungos isolados do molusco Pugilina morio,
coletado na praia Barra do Ceará/ Fortaleza-CE. Foram testados três fungos isolados do molusco,
identificados como: família Bionectriaceae (PM3), Aspergillus aculeatus (PM6) e Penicillium sp
(PM9). Como resultado, os três fungos se mostraram ativos para ADH, mudando a coloração das
colônias para rósea.
Neste trabalho, foram testados fungos filamentos e um leveduriforme, o Aureobasidium
Pullulans, o qual foi reportado por Nobre (2011) num trabalho de bioprospecção de atividade ADH
de quatro leveduras isoladas de mosquitos Aedes aegypti, coletados no Município de Fortaleza-
Ceará, através dos mesmos ensaios utilizados neste trabalho. Como resultado, das quatro cepas
testadas, três (duas não identificadas e o Aureobasidium Pullulans) apresentaram atividade ADH
positiva no Meio I, pois mudaram a coloração das cepas para rósea, assim como aconteceu com o
fungo utilizado como controle positivo, Fusarium oxysporum. Divergindo do presente estudo, onde
o Aureobasidium Pullulans, não se mostrou ativo em nenhum dos meios (Meio I e Meio II).
É importante que esses trabalhos sejam citados, por terem sido utilizadas as mesmas
metologias, meios de cultura contendo como fonte de carbono indutor a dextrose (Meio I) e o etanol
(Meio II) e como reagentes colorimétricos fucsina (Meio I) e MTT (Meio II), e por mostrarem ainda
que fungos isolados de diferentes ambientes podem ser fontes de enzimas de interesse
biotecnológico, mais especificamente, da enzima álcool desidrogenase (ADH).
Outros estudos de prospecção dessas enzimas apontam que fungos do gênero Aspergillus,
obtidos de culturas de microrganismos brasileiros, são considerados excelentes fontes de enzimas
álcool desidrogenases. Andrade et al. (2004) realizou indução de ADHs dos fungos Aspergillus
terreus SSP 1498, Aspergillus niger SSP 1078 e Aspergillus foetidus CCT 2683, em diferentes
meios de cultura e posterior biorredução da acetofenona. Essas cepas fúngicas apresentaram de
baixa a elevada enantiosseletividade, produzindo os álcoois R e S-1-feniletanol, com excessos
enantioméricos variando de 50 a 89% e 7 a 53% de conversões.
Os resultados apresentados neste trabalho são considerados importantes, visto que não existe
investigação prévia sobre a atividade álcool desidrogenase das estirpes de fungos Phoma sp.,
Cladosporium cladosporioides e Aspergillus glaucus.
CONCLUSÃO Os resultados apresentados neste trabalho mostraram que os fungos Aspergillus glaucus
(FA11 - CVT), Cladosporium cladosporioides (FA10 - CVT), Phoma sp. (FA3 – CVT), e as cepas
não identificadas FA6 - CVT e FA12 - CVT se mostraram ativos para atividade álcool
desidrogenase, confirmando a importância destas espécies fúngicas como produtoras de enzimas de
interesse biotecnológico. Acreditamos que estes fungos anemófilos são ótimos candidatos para
futuros estudos de caracterização da enzima, bem como emprego de células ativas como fontes de
ADHs para o desenvolvimento de bioprocessos.
AGRADECIMENTOS
A todos os integrantes e colaboradores do Grupo de Estudo em Bioprospecção de Produtos
Naturais de Microrganismos (GEBIOPRONM-CECITEC-TAUÁ-CE). Aos funcionários e
Coordenador do CVT-Tauá-CE, Prof. Ms. Emilson Costa Moreira Filho. Ao Prof. Dr. Francisco das
11 Ana Raquel Carneiro Ribeiro et al.
Biofar, Rev. Biol. Farm. Campina Grande/PB, v. 9, n. 1, p. 1-6, março/maio, 2013
Chagas de Oliveira Freire (EMBRAPA-CE). A todos que fazem o Laboratório de Bioquímica
Humana-CCS-UECE, em especial a Profa. Dra. Maria Izabel Florindo Guedes, Profa. Dra. Lia
Magalhães de Almeida, Profa. Dra. Márcia Maria Mendes Marques e Emanuele Silva de Sousa. Ao
CENTEC, URCA, EMBRAPA e UECE, bem como a FUNCAP e BNB.
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