BLOQUE I: SECUENCIACIÓN GENÓMICA

TEMA 1. Secuenciación de genomas completos

El origen de los Proyectos Genoma

• 1986: DOE propone secuenciar genoma humano para evaluación sistemática efecto radiaciones

• 1987: se une NIH

• 1988: nace HUGO para coordinar los esfuerzos

• 1990: inicio PGH, planificado a 15 años

1. Elaboración de mapas genéticos y físicos de alta resolución

2. Secuenciación del genoma humano completo

1. CARTOGRAFÍA GENÓMICA

1.1. CARTOGRAFÍA GENÉTICA DE LIGAMIENTO

Cálculo de la frecuencia a la que se co-heredan formas alternativas (alelos) de dos loci genéticos que están ligados formando parte de un mismo cromosoma

Análisis de STRs por PCR

PGH 1994: resolución 0,7-1 cM

Cartografía genómica

1.2. CARTOGRAFÍA FÍSICA E INTEGRACIÓN DE MAPAS

Contig: conjunto de fragmentos de un genoma que se han clonado por separado, pero que son contiguos y que están parcialmente solapados

Mapeo por restricción

STS (sequenced tagged sites): marcadores universales

PGH 1997: resolución 100 Kb (~ 0,1 cM)

Cartografía genómica

2. SECUENCIACIÓN Y ENSAMBLAJE

2.1. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN

2.1.1. MÉTODO DE LOS ddNTPs FLUORESCENTES

Secuenciación

2.1.2. PIROSECUENCIACIÓN

Secuenciación

Unión de cada fragmentoa una bolita

Adición de componentesde PCR en gota de aceite

Se cargan en reactores(picolitros)

Pirosecuenciación y Detección por cámara CCD

Secuenciación masiva en paralelo

Secuenciación

2.1.3. OTRAS PLATAFORMAS DE SECUENCIACIÓN

SOLID

Secuenciación

2.1.3. OTRAS PLATAFORMAS DE SECUENCIACIÓN

Illumina

Secuenciación

2.1.5. SECUENCIACIÓN CON NANOPOROS

• Molécula embebida en una matriz forma un canal de 1-1.5 nm por donde pasa DNA/RNA de simple cadena

• Sistema de detección acoplado que permita detectar los diferentes nucleótidos

Secuenciación

2.1.6. NUEVAS TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN DE MOLÉCULAS INDIVIDUALES

- Secuenciación por síntesis

- FRET: Fluorencence resonance energy transfer

- Secuenciación nanomecánica

- Nano-knife edge probes

- Nanoporos por bloques

Secuenciación

Genoteca

Purificación clones

Secuenciación

Ensamblaje

DNA genómico

Selección fragmentos

Rotura aleatoria

HydroShear Sonicador

2.2. ESTRATEGIAS DE SECUENCIACIÓN

Técnica de shotgun, basada en mapas físicos previos

1. El DNA fragmentado se utiliza para fabricar genotecas en YACs (100-2000 Kb)

2. Elaboración de mapas de baja resolución con YACs solapantes

3. Fragmentación de los YACs y subclonación en cósmidos (~ 40 Kb)

4. Elaboración de mapas de alta resolución con cósmidos

5. Selección de cósmidos con solapamientos mínimos

6. Fragmentación de cósmidos seleccionados y subclonación en plásmidos (~ 1,5 Kb)

7. Secuenciación completa de los plásmidos

8. Ensamblaje computacional

2.2.1. ESTRATEGIA CLÁSICA

YACs

Cósmidos

Plásmidos

Secuenciación

Shotgun clásico

2.2.2 ESTRATEGIA GLOBAL

Whole genome shotgun (WGS), sin mapas físicos previos

Secuenciación

1. Secuenciación de 19.687 clones (~1.500 pb) en los dos sentidos,

El ensamblado sólo necesitó 30 horas, generándose 140 contigs y una redundancia de ~ 6.

2. Se completó la secuencia de los clones cuyas secuencias aparecían en contigs diferentes:

quedaban 42 contigs.

3. Genoteca en el fago (para evitar problemas de clonación).

Rastreo con sondas de los extremos de los contigs no unidos.

Secuenciación de los clones positivos: quedan 19 contigs.

4. Diseño de cebadores específicos de las secuencias de los contigs no unidos.

Amplificación por PCR con cada par de cebadores: cromosoma circular.

Secuenciación del genoma de Haemophilus influenzae(Fleischmann et al., 1995)

Secuenciación

Contigs no ensamblados con clones de la genoteca en pUC18

1. Diseño de oligonucleótidos correspondientes a los extremos

2. Hibridación genoteca en el fago .

Buscar clones con los dos extremos de contigs diferentes

PCR

Secuenciación

“Shotgun” global aplicado a genomas complejos(Venter et al., 1996)

1. DNA genómico clonado en BACs (insertos ~ 150 Kb):

300.000 clones cubren el genoma 10 veces

2. Secuenciar ~ 500 b de cada extremo de los clones STCs (conectores)

600.000 secuencias (10% genoma)

cada STC puede conectar 30 BACs

3. Seleccionar un BAC semilla Secuenciar identificar los STCs que contiene.

4. Secuenciar los BACs más informativos que contienen los STCs detectados.

PASEO CROMOSÓMICO CON BACs

Secuenciación

Venter et al., 2001

Secuenciación

2.3. ENSAMBLAJE COMPUTACIONAL

PHRED/PHRAP/CONSED (Ewing et al., 1998; Green, 1994; Gordon et al., 1998)

Staden Package (Staden, 1996)

1. Lectura de los resultados de la secuenciación

2. Ensamblaje: reconocen secuencias de homología y las alinean

3. Edición manual de secuencias

4. Asistencia para la finalización de la secuencia completa

Celera assembler (Myers et al., 2000)

CAP3 (Huang and Madan, 1999)

ARACHNE (Batzoglou et al., 2002)

PCAP (Huang et al., 2003) …

Staden Package

Ensamblaje

Ensamblaje

Ensamblaje

Ensamblaje

Ensamblaje

Ensamblaje

Ensamblaje

Ensamblaje

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Ensamblaje