botulismo - diagnóstico laboratorial. procedimentos de coleta e técnicas para detecção da toxina...
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BOTULISMOBOTULISMO- Diagnóstico Laboratorial. Procedimentos - Diagnóstico Laboratorial. Procedimentos de Coleta e Técnicas para Detecção da de Coleta e Técnicas para Detecção da Toxina em Pacientes e Alimentos -Toxina em Pacientes e Alimentos -
Miyoko Jakabi
Instituto Adolfo Lutz - SES/SP
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INTRODUÇÃO
BOTULISMO: doença que se manifesta pela ação de uma potente toxina produzida pelo Clostridium botulinum
Descrito pela primeira vez em 1879, por Ermengen, na Bélgica
Botulismo - “botulus”: salsicha
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BOTULISMO
Botulismo alimentar: ingestão de alimentos contaminados com a toxina pré-formada
Botulismo Ferimento: causado pela multiplicação do microrganismo com produção de toxina em feridas contaminadas
Botulismo infantil:produção endógena de toxina pela germinação de esporos do C. botulinum no intestino (< 1 ano)
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C. botulinum - características
Bacilos retos ou ligeiramente curvos, Gram-positivos, imóveis, anaeróbios,0,5-2,0 m de largura e 1,6-22,0 m
de comprimento, esporos ovais e subterminais
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C. botulinum
7 tipos de C. botulinum: A, B, C, D, E, F e G diferentes antigenicamente
A, B, E e raramente F: humanosC e D: pássaros e bovinosG (1970): não confirmado como
causador de doença - (Argentina)
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Esporos
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Esporos
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C. botulinum
Toxina botulínica: proteína de 150 kdacadeia pesada de 100 kda e cadeia leve
de 50 kda ligadas por pontes de sulfeto
Toxina C2: 1 cadeia de 55 kda e 1 cadeia de 105 kda não são ligados covalentemente
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Síntese da toxina
Presente em pequena quantidade na fase logarítmica
liberada durante a autólisebacteriófagos: tipos C e Dplasmídeos
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Ação da toxina botulínica
Neurotoxinaresistente ao ácido estomacalabsorvida intacta pelo trato
gastrointestinal e entra na corrente sangüínea
se liga as células nervosas via gangliosídeos
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Cont.
1- ligação da cadeia leve aos receptores na membrana
2- Internalização da toxina ativa3- translocação da toxina p/ o interior
da célula (pinocitose)4- fase lítica - bloqueio da liberação da
acetilcolina
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Ação da toxina
O neurotransmissor envia impulsos elétricos p/contrair o músculo
terminações nervosas secretam a acetilcolina responsável pela contração muscular
pacientes com botulismo: neurotoxina liga-se aos terminais nervosos inibindo a liberação da acetilcolina, o músculo não contrai, ocorrendo a paralisia
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C. botulinum no ambienteLargamente distribuído no ambientetrato intestinal de animais, pássaros e
peixescadáveres de animais silvestres e
pássaros contém > quantidadetipos A, B e F: terrestrestipo E: ambientes aquáticostipo A: oeste dos EUA; tipo B leste dos EUA e Europa; tipo G: restrito a Argentina
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Alimentos associados com botulismo
Alimentos enlatados ou envasados em vidros
industrializados: subprocessamento ou contaminação pós-processo
conservas caseiras: subprocessamento e acidez
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Alimento Infantil
Mel: fonte significativa de C. botulinum
Cereal de arroz e xarope de milho: números baixos de esporos
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Botulismo
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Diagnóstico laboratorial
Presença da toxina circulante, lavado gástrico ou conteúdo intestinal na fase inicial da doença
Análise do alimento epidemiologicamente implicado
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Método: Bioensaio
Sorocentrifugação refrigerada Inoculação em 2 camundongos de
20-25g (0,5ml por animal) -IP
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BIOENSAIO
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Extração da toxina de alimentos, lavado gástrico e fezes
solução de gel fosfato (1:1 p/v, homogeneização, manutenção por uma noite, geladeira)
Centrífuga refrigerada (4ºC/ 2.500 a 3.000 rpm/20 min.)
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Tratamento do sobrenadante
Separado em 2 porções: tratada térmicamente: água ebulição/10 min. tripsinizada: acertar o pH p/ 6,2; para cada
1,8 ml do sobrenadante, acrescente 0,2 ml de sol. Tripsina; incubar a 37ºC/1h
OBS: toxina botulínica é termolábil se na amostra está presente só a pré toxina, é
necessária a tripsinização para liberar a parte tóxica
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Triagem da presença de toxina por bioensaio
Selecionar no mínimo 8 camundongos (20-25g)
2 animais: inoculados com porção fervida já resfriada
2 animais: inoculados com porção tripsinizada
2 animais: inoculados c/ a porção extraída, não tratada termicamente e não tripsinizada
2 animais são controle do ensaio
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Sintomatologia - camundongos
OBS constantemente por 6 hapós este período, os animais são
observados a cada 6 h, até um período máximo de 72h
sintomas: respiração difícil, e elaborada, acinturamento tipo “cintura de vespa”, por paralisia do diafragma em contração
morte
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Confirmação da toxina botulínica
Os animais inoculados com a porção fervida não morrerem
os animais inoculados com a porção tripsinizada morrerem
animais controle não morreremOBS: Os animais inoculados com a porção
não tratada podem ou não morrer. Caso morram, significa que a toxina ativa estava presente. Caso não morram, significa que a pré toxina estava presente.
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Identificação da toxina
Misturar amostra positiva com anti-soros monovalentes (A,B,E e F) e polivalentes
Inocular em camundongosos animais inoculados, deverão
apresentar os sintomas de botulismo, exceto aqueles que foram inoculados com a antitoxina que foi capaz de inativação
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Interpretação
Os animais que não apresentarem sintomas permitem a identificação do tipo presente
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Interpretação
Se os camundongos não forem protegidos por 1 dos monovalentes:
1- pode ter muita toxina no alimento2- pode ter mais de 2 tipos de toxinas3- mortes podem ser devidas a outras
causasSe ambos os sobrenadantes, aquecido e
não aquecido, forem letais, as mortes provavelmente não são devidas a toxina botulínica
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Aplicação da toxina botulínica
Tratamento de espasmos musculares de vários tipos: estrabismos, dores musculares de faces e pescoço
limitação da terapia: injeção deve ser repetida
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Botox
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Botox