capÍtulo 5 · 2012-11-26 · las fuentes de agua, las distancias de siembra y nutrición...

91ECOFISIOLOGÍA DEL CULTIVO DE LA GULUPA - (Passiflora edulis Sims)

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

CAPÍTULO 5

RESPUESTA FISIOLÓGICA DE LA GULUPA (Passiflora edulis Sims) FRENTE AL ATAQUE POR Fusarium spp.

marisol Cruz aguilar1, liliana Hoyos Carvajal2, luz marina melgarejo1,3

1laboratorio de Fisiología y Bioquímica vegetal, departamento de Biología, Facultad de Ciencias, universidad Nacional de Colombia2 laboratorio de fitopatología, Facultad de agronomía, universidad Nacional de Colombia3 autor para correspondencia: [email protected]

La gulupa es uno de los cultivos tropicales que por sus particulares propiedades organolépticas (Jiménez et al., 2011; Díaz et al., 2011) ha alcanzado en la última década gran aceptación en los mercados europeos. Dentro de los países que par-ticipan en la oferta de este producto, Colombia se destaca por su gran potencial productor; de hecho, durante el año 2010 Colombia exportó US$9,2 millones en gulupa, ocupando este producto el segundo renglón de exportación dentro de las frutas, después de la uchuva (Proexport Colombia, 2011).

A pesar de la creciente demanda la producción nacional no ha crecido al ritmo esperado, debido, entre otras causas, a los problemas fitosanitarios que afectan al cultivo, el cual es susceptible a diferentes microorganismos (virus, bac-terias, nemátodos y hongos) que han presentado aumento en su incidencia y severidad a medida que incrementa el área sembrada, y a que las prácticas agrícolas y culturales en campo no tienen un fundamento técnico adecuado (Guerrero-López y Hoyos-Carvajal, 2011). Dentro de las enfermedades más limi-tantes se presenta la secadera o fusariosis, la cual compromete la producción por su efecto devastador, pues no existen productos fungicidas que logren efi-cientemente el control del patógeno y la planta infectada irremediablemente muere (Castaño, 2009).

La marchitez por Fusarium, marchitez vascular o secadera en pasifloras, se co-noce desde hace más de medio siglo, cuando se reportó por primera vez en Aus-tralia (McKnight, 1951). Es una enfermedad producida por hongos del suelo del género Fusarium, específicamente por poblaciones del complejo de especies Fu-sarium oxysporum (Gardner, 1989). Este hongo es un habitante frecuente del suelo,

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que puede sobrevivir por largos períodos de tiempo en condiciones adversas por sus particulares estructuras de supervivencia conocidas como clamidosporas, las cuales pueden resistir por períodos prolongados (hasta por 30 años) en suelos des-cansados o en los cuales se lleven a cabo labores agrícolas con cultivos no suscep-tibles a Fusarium (Guerrero-López y Hoyos-Carvajal, 2011).

5.1. Patogénesis

Con la presencia de raíces en el lugar donde están las esporas de resistencia del hongo (clamidosporas), estas empiezan a germinar y se inicia el proceso de infección. Las hifas del hongo se adhieren a las raíces de la planta penetrándolas directamente, y una vez adentro, el micelio avanza hasta alcanzar el sistema vas-cular de la planta, específicamente el sistema xilemático, que es el conjunto de células leñosas por donde circula el agua y las sales minerales disueltas en ella. En este punto, el hongo utiliza el xilema como un sistema de avenidas por donde rápi-damente puede diseminarse, no solamente mediante el crecimiento rápido de sus hifas sino también produciendo pequeñas esporas, muy abundantes, conocidas como microconidias, las que fácilmente pueden circular en el flujo de agua e ir invadiendo toda la planta (Di Prieto et al., 2003).

Con el crecimiento y desarrollo del hongo la planta reacciona tratando de impedir su avance, para lo cual genera geles o gomas y tilosas (Figura 5.1), que funcionan como barreras físicas y químicas que pretenden detener la evolución de la infección (Sun y Matthews, 2008).

Figura 5.1. Tejido xilemático del cuello o corona (sitio entre la raíz e inicio del tallo) de una plántula de gulupa de 100 días de edad y posterior a 30 días de infección. se observa el hongo (flechas) y vasos del xilema de diferentes tamaños, unos sanos (vx s), otros infectados (vx i), otros con tilosas (T) y otros

con gomas (G). Tinción astra blue. microscopio óptico, 1.000 aumentos.

µm



Como consecuencia de la obstrucción del sistema hidráulico de la planta (pro-ducto tanto de la invasión del patógeno como del sistema de defensa de la plan-ta) por donde normalmente se mueve el flujo de agua y nutrientes necesarios para el normal crecimiento y desarrollo de la misma, empiezan a observarse progresiva-mente algunos síntomas de marchitez muy similares a los que presenta la planta cuando se somete a déficit hídrico (Roncero et al., 2003).

La sintomatología, inicialmente leve, cada vez va siendo más agresiva e inva-siva y finalmente conlleva a la muerte. Dependiendo de la edad de la planta, de la agresividad del hongo presente en el suelo y de las condiciones ambientales donde se desarrolla la interacción, el tiempo de incubación del patógeno puede ser mayor o menor; es decir, el tiempo transcurrido desde que el hongo ingresa a su hospedero hasta el momento en que aparecen los primeros síntomas de la enfermedad difiere (Agrios, 2005). El conocimiento de este período de incubación es muy importante para el manejo de la enfermedad, pues durante este tiempo aunque la planta se vea normal ya se encuentra infectada y por lo tanto, si se practican labores culturales como podas sin los adecuados procedimientos de desinfección de las herramientas, la enfermedad puede ser transmitida de plantas enfermas a plantas sanas, afectando inclusive el 100% del cultivo.

Por ello se recomienda “desinfectar las herramientas de trabajo con desinfec-tantes como yodo agrícola, hipoclorito de sodio o amonios cuaternarios y aplicar cicatrizantes en los cortes” (Guerrero-López y Hoyos-Carvajal, 2011).

5.2. Sintomatología

En plantas adultas, en estados iniciales de infección, empieza a observarse clorosis de las hojas jóvenes, mientras que las hojas más viejas presentan epinas-tia o decaimiento (Figura 5.2, izquierda); gradualmente, la deshidratación se va haciendo más severa, afectando cada vez un mayor número de hojas y ramas (Figura 5.2, derecha) hasta que toda la planta se observa totalmente marchita, sus frutos deshidratados no alcanzan la madurez, el número de flores disminuye consi-derablemente y en algunos casos es posible observar la formación de abundante micelio al interior del tallo (Agrios, 2005).

En plántulas jóvenes se produce amarillamiento de las hojas bajeras (Figura 5.3, izquierda) las cuales rápidamente caen produciéndose defoliación severa de la planta (Figura 5.3, centro); simultáneamente se observan tasas de crecimiento me-nores en las plántulas enfermas (Figura 5.3, derecha), y en menor tiempo, compa-rado con las plantas adultas, ocurre la muerte (Agrios, 2005).



Figura 5.3. sintomatología de la enfermedad en plántulas de gulupa. izquierda: amarillamiento de ho-jas bajeras. Centro: defoliación severa. derecha: disminución del crecimiento de la plántula enferma

en comparación con la sana. Plántulas de 100 días de edad crecidas en invernadero.

En cualquier caso, hay un síntoma bastante particular de la presencia de Fu-sarium en la planta, y es la coloración marrón o café-rojizo de los haces vasculares que se observa al realizar un corte transversal del tallo o de las ramas enfermas (Figura 5.4).

Figura 5.4. Corte transversal de tallo de plántulas de gulupa. izquierda: plántula sana. Centro: plántula enferma. derecha: adulto enfermo. Coloración marrón o café-rojizo de los haces

vasculares por la presencia del hongo (flechas). estereoscopio 4X.

Figura 5.2. sintomatología de la enfermedad en plantas adultas de gulupa. izquierda: síntomas iniciales. derecha: síntomas avanzados. Plantas de un año de edad observadas en campo.



5.3. Manejo

Debido a las reconocidas dificultades en el manejo de esta enfermedad, la primera recomendación es evitar sembrar en zonas donde previamente se haya presentado la infección por este patógeno, incluso si se presentó en otro tipo de cultivos, pues se ha comprobado que bajo ciertas circunstancias puede llegar tam-bién a afectar el cultivo de gulupa. Se recomienda el uso de plántulas de viveros reconocidos, los cuales certifiquen que el lote adquirido está libre de patógenos (Fischer y Rezende, 2008); pueden ser un poco más costosas, pero se puede estar más tranquilo en cuanto al material utilizado y a largo plazo se convierten en una inversión más segura.

Desafortunadamente aún no existe material resistente contra esta enferme-dad, pues el uso de injertos es una tecnología que aún no se ha adoptado por sus elevados costos (Castaño, 2009). Se recomienda tener cuidado con la pureza de las fuentes de agua, las distancias de siembra y nutrición adecuadas, y las demás labores culturales como no causar heridas, desinfectar herramientas de trabajo y aplicar cicatrizantes en los cortes (Guerrero-López y Hoyos-Carvajal, 2011).

Una vez que la enfermedad se presenta en el cultivo, la aplicación de fungici-das no es eficaz, por lo que se recomienda manejar con prontitud y rigurosidad el foco de infección antes de que se disemine a la totalidad de las plantas del cultivo. Debido a que es un patógeno del suelo que se confina al interior de la planta, su dispersión dentro de la planta es rápida, pero entre plantas es más limitada, por lo que se sugiere erradicar cuidadosamente las plantas efectivamente diagnos-ticadas con la enfermedad en las cuales se haya comprobado la aparición de coloraciones café-rojizas en tejidos de ramas o tallos. Es muy importante sacar las plantas enfermas del lote e incinerarlas, porque dentro de ellas va el agente causal de nuevas infecciones. Finalmente, debe demarcarse de manera apropiada, ais-lando el sitio donde se presentó el foco de infección, pues no debe olvidarse que el patógeno ha quedado en el suelo y que, de no cuidarse el tránsito por este lugar, se puede llevar en las botas o con el paso de animales, aumentando la afección en el lote (Guerrero-López y Hoyos-Carvajal, 2011).

5.4. Respuesta fisiológica de las plántulas de gulupa frente al Fusarium

Numerosos estudios (Lanoue et al., 2010; Pascual et al., 2010; Gould et al., 2009; Parimala et al., 2009 y Ribeiro et al., 2003) han determinado que en condiciones de



estrés producidas por patógenos se afectan las tasas de crecimiento de la planta, lo cual conlleva a disminuciones en la producción y, por lo tanto, esto incide en la rentabilidad de los cultivos (Fischer y Rezende, 2008). No obstante, las plantas presentan respuestas fisiológicas tendientes a mitigar los efectos nocivos de la con-dición estresante, los cuales incluyen cambios en las tasas de intercambio de gases y cambios en los mecanismos de disipación del exceso de radiación fotosintética. Estas respuestas diferenciales tienen estrecha relación con el período de duración y la intensidad del factor estresante (Lushchak, 2011), así como con las potenciali-dades mismas de la especie, que aún son desconocidas para el cultivo de gulupa (Passiflora edulis Sims).

La fusariosis es una enfermedad común en este cultivo, cuyo factor etiológico, así como la sintomatología que expresa la planta, están bien caracterizados (Fis-cher y Rezende, 2008; Guerrero-López y Hoyos-Carvajal, 2011; Roncero et al., 2003); sin embargo, no existen estudios en los que se realice seguimiento de la respuesta fisiológica del hospedero durante el período de incubación del hongo. El propósito del presente trabajo es avanzar en el reconocimiento de la respuesta fisiológica de plántulas de gulupa inoculadas con Fusarium oxysporum, con el fin de poder desarrollar indicadores de monitoreo frente al estrés producido y detectar tempra-namente la enfermedad, para desarrollar un paquete de manejo fitosanitario y fisiológico del cultivo.

El montaje del experimento se llevó a cabo en el invernadero del Departamen-to de Biología de la Universidad Nacional de Colombia, en el cual se utilizaron 100 plántulas de gulupa de 100 días de edad, dispuestas cada una en un vaso plástico de 400 cc, con tierra estéril como sustrato y fertilización apropiada. 50 plántulas fueron inoculadas aleatoriamente con agua estéril y 50 con el inóculo de Fusarium oxysporum de concentración ajustada a 1,14 x 106conidias/ml mediante la meto-dología de inmersión en el medio, sin causar heridas (Gardner, 1989; Vakalouonakis, 1996; Haglund, 1989). De esta manera, al tener plántulas con y sin la enfermedad se compara entre las sanas y las enfermas, las cuales por encontrarse en las mismas condiciones ambientales y con las mismas prácticas culturales permitirán conocer cuál es el efecto del hongo.

Las plántulas fueron estudiadas y analizadas desde el día del montaje del ex-perimento hasta el día de la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad (amarillamiento de las hojas y caída de las mismas), lo que –como ya se ha explica-do anteriormente– corresponde al período de incubación del patógeno, que para el caso de este experimento corresponde a un lapso de 28 días. Las mediciones se realizaron antes de la inoculación (0 días después de inoculación, DPI) y después



de inocular el patógeno, en intervalos de cuatro días hasta el fin del experimento (4, 8, 12, 16, 20, 24 y 28 DPI).

De cada grupo (plantas inoculadas con agua e inoculadas con F. oxyspo-rum) se seleccionaron en forma aleatoria 4 plántulas, para un total de 8, las que se mantuvieron durante todo el experimento y a las que se les realizó el segui-miento del comportamiento de las variables relacionadas con el intercambio de gases (tasas de fotosíntesis, conductancia estomática, concentración subesto-mática de CO2 y temperatura foliar) y medidas de la fluorescencia de la clorofila a (Fv/Fm, ΦPSII). Estas mediciones se realizaron en 3 hojas por cada plántula y 4 plántulas por tratamiento, de manera que con los resultados obtenidos se pu-diera tener una aproximación al estado y efecto del patógeno en el aparato fotosintético de la planta.

Las restantes 92 plántulas fueron usadas en muestreos destructivos; en cada día de medición se seleccionaron aleatoriamente 4 plántulas sanas y 4 plántulas enfermas, con el fin de determinar en ellas el estado del sistema radicular, por ser el órgano de contacto con el patógeno, de manera que se midió la tasa de res-piración de raíces, el área, longitud, grosor y peso fresco promedio de las mismas.

Simultáneamente, con otras plántulas de la misma edad y en condiciones muy similares, se hizo un estudio histológico comparativo entre plántulas sanas y enfer-mas para reconocer la presencia del patógeno y su efecto en el hospedero.

En general, el sometimiento de las plantas a cualquier tipo de estrés está aso-ciado con profundos cambios en la respuesta fisiológica de las mismas (Gang et al., 2007). Para el caso de enfermedades producidas por patógenos, los cambios en la fisiología limitan el crecimiento y desarrollo de la planta, así como la calidad y cantidad de fruto producido, afectando la producción (Pascual et al., 2010). Cada especie responde al estrés, lo cual está condicionado genéticamente (Larcher, 2003); sin embargo, cuando se trata de estrés abiótico y biótico no pueden ex-trapolarse resultados obtenidos en plantas similares, así sean de la misma familia, ni puede concluirse que diversos tipos de estrés vayan a tener el mismo efecto en una planta, tal como se demostró en plantas de ají sometidas a estrés hídrico com-paradas con plantas infectadas con verticillium dahliae Kleb (Pascual et al., 2010), un hongo del suelo que, al igual que F. oxysporum, obstruye los vasos del xilema impidiendo el flujo normal de agua.

Para el caso de marchitez por Fusarium en gulupa, no existen reportes de cómo se afecta la respuesta fisiológica de la planta durante el proceso de infección, lo



cual permite ofrecer estos resultados como una primera aproximación a los me-canismos de respuesta de la planta frente al estrés biótico causado por el hongo.

5.4.1. Variables climáticas bajo condiciones de invernadero El experimento fue efectuado entre el 13 de julio y el 10 de agosto de 2011 en

plántulas sanas (inoculadas con agua destilada estéril) y plántulas con la enfer-medad, aunque sin síntomas visibles (inoculadas con F. oxysporum). Se registraron los valores de humedad relativa (HR), radiación fotosintéticamente activa (PAR) y temperatura del ambiente (T). Se presentan los datos registrados en el día, entre las 6:00 y las 18:00 horas (Figura 5.5); los de la noche presentaron poca alteración, tanto dentro de la misma noche como entre noches (valores promedio para la no-che durante el experimento: HR: 82,66%, PAR: 14,48 µmol fotones/m2s y T: 23,15 ºC).

El parámetro más estable en su comportamiento es la humedad relativa (Fi-gura 5.5), la cual se mantiene oscilando en valores cercanos a 65% y cuya escasa variabilidad está relacionada con las condiciones propias del invernadero, el cual tiene pocas posibilidades de aireación, siendo este estado de confinamiento favo-rable para el crecimiento del patógeno.

Figura 5.5. variables microclimáticas monitoreadas en el invernadero de biología de la universidad Nacional de Colombia. Cada punto representa el promedio de los valores registrados para cada día

durante el período de duración del experimento.

La PAR y la temperatura del ambiente se encuentran estrechamente correla-cionadas, observando tendencias similares en su comportamiento (Figura 5.5). Los valores alcanzados, tanto en los días de muestreo como en los días previos, permite explicar la variación de las variables relacionadas con el aparato fotosintético en-tre puntos de muestreo.



5.4.2. Tasa de asimilación neta (Tasa de fotosíntesis)Como puede observarse en la Figura 5.6, la única medición en la cual los valo-

res de fotosíntesis máxima son iguales tanto para las plantas enfermas como para las sanas es en el día 0; en los días siguientes, siempre es mayor la tasa de fotosín-tesis en las plántulas sanas comparadas con las enfermas. La presencia del hongo dentro de las plántulas de gulupa reduce la tasa de fotosíntesis hasta en un 70% para el día 24 DPI.

También se advierte que el día 0 es el día donde hay mayores tasas de asimila-ción (10,5 y 11,0 para plántulas sanas y enfermas, respectivamente), mientras que el día 12 DPI y 24 DPI igualmente tienen valores altos para las plántulas sanas, pero estos valores son aproximadamente la mitad del valor que se presenta en el día 0, probablemente debido a las condiciones del experimento, a la manipulación que se hace al sistema radical, a las condiciones del sustrato en que se sembraron las plántulas y a las condiciones ambientales de los días en que se realizó el expe-rimento; sin embargo, la tasa de fotosíntesis siempre fue mayor en plántulas sanas que en enfermas.

Figura 5.6. Tasa de asimilación fotosintética máxima para cada día de muestreo en plántulas sanas (columnas blancas) y plántulas enfermas (columnas oscuras). valores promedios para cada día. las

barras representan el error estándar (n=4).

La disminución de la tasa de asimilación neta, principalmente en las plantas en-fermas, puede ser explicada por diferentes razones: razones temporales relaciona-das con respuestas al ambiente y a la disponibilidad de agua (procesos de respues-ta rápida como cierre estomático, disminución del CO2 subestomático, disminución de la transpiración o cambios en la temperatura de la hoja), o daños irreversibles de los diferentes componentes del aparato fotosintético (daños de la integridad de



membranas o destrucción de elementos importantes del aparato fotosintético), e incluso problemas en las vías metabólicas (que el NADPH y ATP no se generen apro-piadamente en la fase de transducción de energía y que se necesitan en el ciclo de Calvin, o a disminución de la actividad enzimática <Rubisco> o del sustrato <RuBP>, necesarios para la fotosíntesis) (Ribeiro et al., 2003 y Massacci et al., 2008).

Teniendo en cuenta lo anterior, se presentan resultados de cada uno de los

parámetros medidos para determinar cómo se explica el efecto del patógeno en la disminución de la tasa de asimilación fotosintética.

5.4.3. Conductancia estomáticaEn cuanto a la conductancia estomática (Figura 5.7), se puede observar un

comportamiento muy similar al que se observa en la tasa de asimilación neta.

Figura 5.7. Conductancia estomática para cada día de muestreo en plántulas sanas (columnas blancas) y plántulas enfermas (columnas oscuras). valores promedios

para cada día. las barras representan el error estándar (n=4).

Para este parámetro, en tanto sean mayores los valores de conductancia es-tomática quiere decir que mayor número de estomas están abiertos o que hay mayor apertura estomática. Los estomas son los orificios presentes en el envés de la hoja, por los que se realiza el intercambio de gases; por allí entra y sale oxígeno, el dióxido de carbono (CO2) y el vapor de agua, de ahí que sea importante confirmar su participación en la reducción de las tasas fotosintéticas.

En la Figura 5.7 se aprecia que para las plántulas enfermas siempre hay una reducida conductancia estomática, lo que se puede interpretar como una res-puesta típica de la planta ante el déficit hídrico, en la cual la planta puede censar



las limitaciones hídricas y como respuesta a este factor estresante inducir el cierre estomático, que a su vez no permite el suministro adecuado de dióxido de carbo-no necesario para el proceso fotosintético.

5.4.4. Concentración subestomática de CO2

Como se observa en la Figura 5.8, la cantidad de CO2 disponible para utilizar en la fotosíntesis, la cual se mide con la concentración subestomática de CO2, perma-nece muy similar tanto para las plantas sanas como para las enfermas, a pesar del claro cierre estomático que experimentan las enfermas (Figura 5.7).

Se deduce que la disminución de la tasa fotosintética en las plantas enfermas no está explicada por la disponibilidad de CO2, pues el comportamiento de estas variables comparadas no es congruente. En otras palabras, los días en los que hay mayores diferencias en la tasa de asimilación neta máxima no coinciden con los días en los que hay mayor diferencia en la disponibilidad de CO2.

Figura 5.8. Concentración subestomática de Co2 para cada día de muestreo en plántulas sanas (co-lumnas blancas) y plántulas enfermas (columnas oscuras). valores promedios para cada día.

las barras representan el error estándar (n=4).

La temperatura de la hoja es un parámetro importante, puesto que cambios en la temperatura inducen cambios en la actividad de enzimas fundamentales dentro del ciclo de Calvin, en el que se da la fijación de carbono de la fotosíntesis. Como puede apreciarse en la Figura 5.9, este tampoco es un factor que esté afec-tando el proceso fotosintético, pues las variaciones en este parámetro son mínimas entre tratamientos y entre puntos de muestreo. De esto se deriva que el hongo no tiene mayor influencia sobre la temperatura de la hoja, a pesar de que con el cierre estomático podría causar aumentos de temperatura en las hojas enfermas.



La apertura o cierre estomático, medido mediante el parámetro ‘conduc-tancia estomática’ (gs), es un mecanismo de la planta a partir del cual la planta mantiene una adecuada disponibilidad de CO2 para utilizar en fotosíntesis, a costa de eliminar vapor de agua, con lo que a la vez mantiene niveles adecuados de temperatura foliar. Por esta razón, sorprende observar que aunque las plántulas enfermas tienen una apertura estomática disminuida hasta en un 85% para el día 24 DPI en comparación con las plántulas sanas (Figura 5.7), la temperatura de la hoja sea tan similar (Figura 5.9).

Esta evidencia puede sugerir que la plántula está utilizando otros mecanismos de disipación de calor, diferentes a la refrigeración mediante eliminación de vapor de agua.

Figura 5.9. Temperatura foliar para cada día de muestreo en plántulas sanas (columnas blancas) y plántulas enfermas (columnas oscuras). valores promedios para cada día.


5.4.5. Fluorescencia de la clorofila aDe acuerdo con los resultados anteriores, y para conocer y dilucidar el posible

motivo que afecta la tasa de fotosíntesis, se realizaron mediciones paralelas de parámetros relacionados con el aparato fotosintético mediante la metodología de fluorescencia de la clorofila a. Esta técnica es actualmente una de las más utiliza-das para evaluar el efecto del estrés sobre la actividad fisiológica de la planta, ya que es rápida, no invasiva y de bajo costo (Del y Toivonen, 2003).

Mediante la evaluación del parámetro ΦPSII (Figura 5.10), conocido como efi-ciencia fotoquímica del fotosistema II, se mide la proporción de luz absorbida por la planta que puede utilizarse en procesos fotosintéticos.



Figura 5.10. eficiencia fotoquímica del Psii (ΦPSII) en plántulas sanas (columnas blancas) y plántulas enfermas (columnas oscuras). valores promedios para cada día.


Como puede observarse (Figura 5.10), los valores obtenidos son bastante altos y similares para todos los puntos y para los dos grupos de plántulas (sanas y enfer-mas), lo cual llama la atención, pues ya se ha concluido que la fotosíntesis efecti-vamente es menor en plántulas enfermas comparadas con las sanas.

Estos resultados permiten deducir que todas las plántulas tienen en perfecto estado sus sistemas de captura de luz, es decir, las clorofilas asociadas a las an-tenas cosechadoras de luz. La Figura 5.10 muestra que todas las plántulas tienen la capacidad de absorber entre un 65% y un 75% de la energía lumínica recibida, pero lo que probablemente sucede es que por la presencia del patógeno toda esa energía absorbida no puede invertirse en fotosíntesis.

En referencia a los resultados de la Figura 5.11 sobre la eficiencia máxima po-tencial de la fotosíntesis (Fv/Fm), esta medida se toma en horas del amanecer y sir-ve como indicador de procesos de estrés, de modo que valores por debajo de 0,83 revelan que el aparato fotosintético no pudo recuperarse suficientemente después de mantenerse en oscuridad durante la noche, debido al efecto que produce el factor estresante (Maxwell y Johnson, 2000).

En la Figura 5.11 se observa cómo a partir del día 12 después de inoculación con F. oxysporum, el aparato fotosintético de las plántulas afectadas por la enfer-medad se encuentra claramente bajo estrés, sin poder recuperar los valores origi-nales de los primeros días del período de incubación cuando alcanzaba valores entre 0,82 y 0,84.



Figura 5.11. eficiencia máxima potencial del Psii en plántulas sanas (columnas blancas) y plántulas enfermas (columnas oscuras). valores promedios para cada día.


Tomando en consideración todo lo anteriormente expuesto, se puede concluir en cuanto al comportamiento del aparato fotosintético que la plántula de gulu-pa durante el período de incubación de F. oxysporum reduce dramáticamente su tasa de asimilación fotosintética neta máxima hasta en un 73% para el día 24 DPI, a la vez que reduce su conductancia estomática hasta en un 85% para el mismo día de medición, pero no se reduce la concentración subestomática de CO2 ni se aumenta la temperatura en la hoja, siendo estas condiciones no explicativas de la limitación de la tasa de fotosíntesis.

Por otra parte, a partir de las mediciones de fluorescencia de la clorofila a se deduce que aunque las plántulas de gulupa afectadas por la enfermedad absor-ben la misma energía lumínica que las plántulas sanas, esta energía no logra llevar-se a procesos fotosintéticos porque el aparato fotosintético no puede recuperarse debido al factor estresante ante el cual está expuesto, y es bastante probable que esta energía se esté direccionando a procesos de fotorrespiración, con lo cual se explicaría por qué no se reduce la concentración de CO2 y por qué se observa una marcada disminución en las tasas de crecimiento de las plántulas en esta situación (Figura 5.3, derecha).

La fotorrespiración es un proceso que constituye un mecanismo de protección para reducir el daño que pueden causar las especies reactivas de oxígeno gene-radas en condiciones de estrés y que es causado o por cambios en la temperatura que afecten la afinidad de la enzima Rubisco por el oxígeno o por cambios en la concentración de dióxido de carbono (CO2) y oxígeno (O2), de modo que se haga más favorable la actividad oxigenasa sobre la carboxilasa (Taiz y Zeiger, 2006).



A partir de estas consideraciones, se plantea que la presencia de F. oxysporum en plántulas de gulupa obstruye el flujo normal de agua, como se ha reportado ampliamente en la literatura (McKnight, 1951; Agrios, 2005; Fischer y Rezende, 2008; Roncero et al., 2003) y como se comprueba con las observaciones histológicas (figuras 5.1, 5.16, 5.17 y 5.18) es censado por la planta, ante lo cual responde produ-ciendo el cierre estomático característico del estrés por falta de agua.

Este cierre estomático produce un desbalance en la concentración de gases, aumentando probablemente la presión del oxígeno por el sitio activo de la enzima Rubisco, con lo que se propician procesos alternativos de fotorrespiración a par-tir de los cuales se disipa la energía recibida por los complejos cosechadores de energía lumínica. Probablemente el balance entre fotorrespiración y fotosíntesis se inclina hacia el primero de estos procesos, produciendo dióxido de carbono que no sale al exterior debido al cierre estomático, explicando de esta manera que su concentración subestomática no se vea modificada; finalmente, dado que la foto-rrespiración es un proceso en el que se consume energía sin que se produzcan los compuestos derivados de la fotosíntesis, las tasas de crecimiento entre plántulas sa-nas y enfermas se van haciendo evidentes en todos los órganos (Taiz y Zeiger, 2006).

5.4.6. Sistema radicalDado que en la interacción entre el hongo y la planta el primer punto de con-

tacto es el sistema de raíces, resultó interesante analizar el efecto que podría obser-varse en este órgano durante el período de incubación del patógeno estudiando el mayor número posible de variables (área, longitud, grosor, número, peso fresco y tasas de respiración) con el fin de reunir información sobre el efecto del proceso de infección de F. oxysporum en el sistema radical de plántulas de gulupa. Para ello fue necesario realizar muestreos destructivos y tuvo que usarse una plántula diferente en cada medición; esta puede ser la razón por la cual, en general, para ninguno de los parámetros evaluados se presenta una tendencia claramente dife-renciada entre plántulas sanas y enfermas.

Para el caso del número de raíces promedio, como puede observarse en la Figura 5.12 durante la mayor parte del período de incubación del patógeno no se encuentran diferencias entre ninguno de los dos grupos; solamente en el último punto de muestreo es claro que las plántulas sanas presentan aproximadamente el doble del número de raíces que las plántulas afectadas con fusariosis.

A partir del comportamiento de esta variable, puede advertirse que aunque el patógeno ingrese por este órgano su crecimiento continúa principalmente hacia el interior de la planta, permitiendo, de este modo, que el sistema radical siga man-



teniendo el mismo tamaño y características durante la mayor parte del período de incubación. No obstante, llega un momento en el cual el conjunto de procesos al-ternativos que enfrenta la planta (disminución de la tasa fotosintética, obstrucción de vasos xilemáticos, toxinas elicitadas por el hongo, fotorrespiración aumentada, presencia de especies reactivas de oxígeno, etc.) terminan por afectarla por com-pleto, incluyendo también el sistema de raíces, ante lo cual hay que resaltar que esto sucede en etapas tardías del proceso de patogénesis.

Lo anterior puede corroborarse con los resultados obtenidos previamente en un experimento, en el que también se encontraron diferencias significativas úni-camente hacia el final del experimento, cuando ya son evidentes los efectos del patógeno en toda la planta (Figura 5.13).

Figura 5.13. sistema radical de plántulas de gulupa de 100 días de edad. día 24 dPi.

Figura 5.12. Número de raíces promedio en plántulas sanas (línea gris) y plántulas enfermas (línea negra). valores promedios para cada día. las barras representan el error estándar (n=4).



De igual forma, y en concordancia con lo anterior, para el caso del peso fres-co se observa que aunque durante los días de muestreo 4, 8, 12, 16, 20 y 24 DPI, las diferencias son mínimas; inclusive en el día 24 DPI los valores de peso fresco son prácticamente iguales, y en el último día de muestreo hay una diferencia marca-da, casi triplicando el peso de las raíces de plántulas sanas, el peso de las raíces de las plántulas enfermas (Figura 5.14).

El patógeno no afecta de manera directa el desarrollo del sistema radical, pero mediante su efecto en la fotosíntesis sí afecta las tasas de crecimiento normal.

Figura 5.14. Peso fresco promedio de raíces en plántulas sanas (línea gris) y plántulas enfermas (línea negra). valores promedios para cada día. las barras representan el error estándar (n=4).

Para los demás parámetros (área, longitud y grosor) que se encuentran resu-midos en la Tabla 5.1, puede observarse y corroborarse lo anteriormente, expues-to con variaciones sin tendencia para la mayor parte del muestreo y variaciones considerables en el último punto, con excepción del grosor, el cual no presentó diferencias en ninguno de los puntos ni en ninguno de los grupos.

De manera simultánea, se evaluó la funcionalidad del sistema radical duran-te el período de incubación del patógeno mediante la medición de la tasa de respiración en raíces (Figura 5.15). En esta figura puede apreciarse que aunque el tamaño del sistema radical de las plántulas sanas y enfermas fue bastante similar durante todo el experimento con excepción del día 28 DPI, las tasas de respiración de las mismas tuvieron un comportamiento bastante contrastante, lo cual es un in-dicador de que el hongo produce un efecto en el proceso respiratorio de las raíces de las plántulas.



Tabla 5.1. Parámetros medidos en el sistema radical de plántulas de gulupa.

DPIÁrea Longitud Grosor

Sanas Enfermas Sanas Enfermas Sanas Enfermas

4 2.398,93 3.788,45 1.933,03 2.471,95 1,23 1,51

8 3.513,15 3.071,00 2.332,70 2.355,83 1,54 1,32

12 3.639,43 2.304,45 2.568,63 1.875,10 1,34 1,26

16 2.951,15 2.458,25 1.693,91 1.230,40 1,75 1,92

20 3.211,28 3.759,43 1.852,90 2.697,60 1,77 1,38

24 3.825,48 3.267,75 2.907,63 2.460,85 1,27 1,28

28 4.523,45 2.273,15 3.303,15 1.758,38 1,36 1,24

Figura 5.15. Tasas de respiración en plántulas sanas (línea gris) y plántulas enfermas (línea negra). valores promedios para cada día. las barras representan el error estándar (n=4).

Como se aprecia en la primera medición, las plántulas sanas tienen una tasa de respiración menor que la de las plántulas enfermas, y aunque se produjo algún tipo de estrés probablemente debido a la manipulación durante el montaje del experimento, las plántulas enfermas respondieron al ataque del patógeno aumen-tando su metabolismo; en un intento por defenderse, en ellas se observa que la disminución de la tasa respiratoria persiste hasta el día 16 DPI, día después del cual se inicia un proceso de recuperación que termina en tasas similares entre sanas y enfermas, a pesar de que en este último día de medición el tamaño en el sistema radical de las plántulas sanas es casi el doble en comparación con las plántulas enfermas.



5.4.7. Análisis histológicoPara contribuir con el reconocimiento de la respuesta fisiológica de gulupa con

fusariosis vascular, se presentan fotografías comparativas de tejidos afectados por la enfermedad en contraste con tejidos sanos.

En la Figura 5.16 se observa que en las plantas sanas (imagen derecha) el te-jido está compuesto por células muertas por las cuales circula el agua, las que son grandes y no tienen contenido citoplasmático, denominadas vasos de xilema (Vx); junto a ellas células vivas más pequeñas, con pequeños amiloplastos dentro del citoplasma, organizadas de manera radial entre los vasos xilemáticos, denomi-nadas células del parénquima xilemático (Px). Además se observa que las células tienen paredes gruesas y consistentes (color rosado) y tejido de sostén (color azul), que permiten mantener la correcta arquitectura de la planta.

Figura 5.16. Tejido xilemático de tallo de plántulas de 100 días de edad, día 30 dPi. a la derecha, tejido sano; a la izquierda, tejido enfermo. se observa el hongo (flechas), vasos de xilema (vx), tilosas (T) y

células de parénquima xilemático (Px). Tinción astrablue. microscopio óptico, 1.000 aumentos.

En contraste, en el tejido de plántulas enfermas (Figura 5.16, imagen izquierda) no se observan células vivas, ni la presencia de amiloplastos. Todas las células han perdido su contenido citoplasmático y además los vasos de xilema presentan pa-redes delgadas, y dentro de todas las células la presencia del hongo (color azul, indicado con flechas) o presencia de gomas y tilosas (color rojo).

En la siguiente figura (Figura 5.17) se puede apreciar un vaso completamente obstruido por la presencia de microconidias de F. oxysporum (esporas pequeñas) del hongo y también la deformación de las células adyacentes del floema, las cua-les en tejidos sanos generalmente son bien definidas e isodiamétricas.

µm

µm



Figura 5.17. Tejido xilemático y floemático de tallo de una plántula enferma de 100 días de edad, día 30 dPi. se observa el hongo (F. ox), células de floema (Floema) y vasos de xilema (vx). Tinción astra-

blue. microscopio óptico, 1.000 aumentos.

Por su parte, en la Figura 5.18 se observa una panorámica de la invasión del hongo en gran parte del tejido xilemático de la planta. A la derecha se aprecia cómo se ve el tejido sano y a la izquierda la proliferación de estructuras del hongo que en 30 días dominan el interior de la corona (sitio entre la raíz e inicio del tallo) de la plántula de gulupa.

Figura 5.18. Tejido xilemático de corona (sitio entre la raíz e inicio del tallo) de plántulas de 100 días de edad, día 30 dPi. a la derecha, tejido sano; a la izquierda, tejido enfermo. se observa el hongo (fle-

chas), vasos de xilema (vx), células de esclerénquima (e) y células de parénquima xilemático distribui-das radialmente (línea interrumpida). Tinción astra blue. microscopio óptico, 400 aumentos.

Según los resultados obtenidos en este trabajo, se concluye que los efectos del patógeno en cada uno de los órganos a través del tiempo son muy particulares. En una etapa inicial del proceso de patogénesis el hongo ingresa por el sistema radical, aumentando su tasa respiratoria sin afectar el tamaño, longitud, peso o

µm

µm

µm



grosor de las raíces. Posteriormente, cuando el hongo alcanza su tejido objetivo (el sistema vascular), se presenta la obstrucción de los haces vasculares y por tanto del flujo de agua y nutrientes; la plántula sensa este déficit hídrico y produce cierre estomático para evitar la pérdida de agua por transpiración, y como consecuen-cia de ello, se presenta un desbalance en las concentraciones parciales de O2 y CO2 lo cual, sumado a la presumible presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) causadas por el estrés biótico y déficit hídrico y de nutrientes que produce Fusarium, provoca un aumento en el proceso de fotorrespiración, en detrimento del proceso fotosintético. Mientras que ocurren estos cambios a nivel del vástago de la planta, el sistema radical siendo solamente el punto de ingreso del hongo continúa manteniendo su tamaño y metabolismo. Aproximadamente después de 15 días de iniciada la enfermedad la plántula presenta un proceso de deterioro irreversible, en el cual se presentan las tasas más bajas de fotosíntesis, eficiencias máximas potenciales del fotosistema II bajas (Fv/Fm) y como consecuencia de ello, se observan los primeros síntomas de clorosis y disminución en la aparición de nue-vas hojas, mientras que en la raíz aún no se presentan cambios considerables. En la última etapa del proceso de patogénesis la plántula enferma es de menor tamaño en comparación con la sana, y tanto a nivel foliar como a nivel del sistema radical presenta menor número de hojas, que se tornan de color amarillo y menor tamaño de raíces debido al escaso suministro de nutrientes; finalmente, se da aumento del proceso fotorrespiratorio, lo cual en definitiva lleva a la muerte.



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