生理的条件下で作用する 高温溶解型高分子 - jst...生理的条件下で作用する...
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生理的条件下で作用する
高温溶解型高分子
バイオマテリアルへの応用を目指した
感温性高分子の設計
九州大学 先導物質化学研究所
嶋田直彦 丸山厚
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九州大学, 2012
Stimuli Responsive Polymer : 刺激応答性高分子
刺激 応答
光照射 pH変化
溶媒、塩の添加
温度変化 磁場変化
化学物質の添加
力学的負荷 化学的変化
相変化
表面物性変化
力学的変化
電気化学的変化
光化学的変化
D. Schmaljohann, Adv. Drug Deliv. Rev.,58, 1655-1670 (2006)
刺激に応答してその物理化学的性質を変化させる高分子
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九州大学, 2012
温度応答性高分子（相変化）
LCST型高分子 LCST: 下限臨界溶液温度 (Lower Critical Solution Temperature)
UCST型高分子 UCST: 上限臨界溶液温度 (Upper Critical Solution Temperature)
加熱
冷却
溶媒分子
高分子
液体（溶解） 沈殿（不溶）
加熱
冷却
液体（溶解） 沈殿（不溶）
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九州大学, 2012
温度応答性高分子を使ったバイオテクノロジー
加熱
冷却
Z. Ding, A. S. Hoffman et al.
Nature 411, 2001, 59-62
M. Nakayama,T.Okano et al. Material Matters (Sigma Aldrich) 5,2010 56-58
N. Yamada; T. Okano et al Makromol. Chem. Rapid Commun. 11,1990, 571-576.
CH2 CH
C
NH
nO
CH
H3C CH3
PNIPAM
M. Heskins et al.,
J. Macromol. Sci.Chem.,
2, 1968, 1441
Y-Z. You, D.Oupicky et al.
Chem Mater. 20, 2008, 3354-3359
Cell-sheet technology
Drug Release
Polymer shield
Heat
PNIPAM
生理的条件下で相転移
LCSTが体温付近(32 ºC)
親水性 疎水性
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九州大学, 2012
生理的条件下でUCST型挙動を示す合成高分子
Seuring, J.; Agarwal, S.
Macromol. Chem. Phys. 2010, 211, 2109.
Glatzel, S.; Laschewsky,A., Luｔ, J.-
F. Macromolecules 2011, 44, 413
OOHN
NH2
O
HN
O
poly(N-acryloylasparaginamide)
poly(N-acryloylglycinamide)-co-poly(N-acetylacrylamide)
OHN
NH2
O
H2N
O
生理的条件下において、水素結合を駆動力にＵＣＳＴ挙動を示すが、相転移温度は体温以下。
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九州大学, 2012
poly(allylamine)-co-poly(allylurea)
PAU
Ureido group
ウレイド高分子
+
+
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九州大学, 2012
5mm
Microscopic
observation
O/N incubation
Two liquid phase Coacervate formation
0 mM NaCl 150 mM NaCl
Heating
Cooling
NaCl
10 ˚C 10 ˚C 50 ˚C
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.5) containing blue dye
生理的条件下におけるPAUの相変化
PAUは生理的条件下において、UCST挙動を示した。
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九州大学, 2012
ウレイド基の導入率の上昇にともなって、相分離温度は高くなった。
主鎖ポリアリルアミンが高分子量であるほど、相分離温度は高くなった。
ウレイド導入率と主鎖分子量が相分離温度に与える影響
A15K90
Mw of PAA Ureido content
(%)
A15K84
A15K88
A15K90
A15K93
[PAU] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5) containing 150 mM NaCl
Scanning rate: 1 ˚C / min
100
80
60
40
20
0 Tra
nsm
itta
nce
at
50
0 n
m / %
100 80 60 40 20 0
Temperature / ºC
A15K64
DTp
~ 30˚C
A15K90
A150K91
A5K91
100
80
60
40
20
0 Tra
nsm
itta
nce a
t 500
nm
/ %
100 80 60 40 20 0
Temperature / ºC
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九州大学, 2012
A150K
A15K
A5K
70
60
50
40
30
20
10
0
T p
/ º
C
94 92 90 88 86 84 82 80
Ureido content / %
ウレイド基の増加にともなって、 PAUの相分離温度は直線的に上昇した。
生理的条件下において、65 ºCまでの相分離温度をもつPAUを設計可能であった。
[PAU] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5)
containing 150 mM NaCl
Scanning rate: 1 ˚C / min
ウレイド導入率と主鎖分子量が相分離温度に与える影響
体温
PNIPAMのLCST
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九州大学, 2012
Ureido group
NaCl
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Heating
Cooling
NaClによる静電的反発の抑制 アミノ基間の静電的反発
PAUのUCST挙動の予想メカニズム
Amino group
+
10 ˚C 10 ˚C 10 ˚C 10 ˚C 50 ˚C
PAUのUCST挙動はアミノ基も重要な役割を果たしていると考えられる。 塩濃度・種類及び、pHがPAUの相転移挙動に与える影響を調べる。
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九州大学, 2012
水溶液のpHが相分離温度に与える影響
60
50
40
30
20
10
0
10 9 8 7 6
pH
Tp
/
ºC
A15K84
A15K90
A15K93
A15K88
NH2
NH2
10 mM buffer
containing 150 mM NaCl
Lower pH Higher pH
NH3
NH3
+
+
アミノ基の脱プロトネーションにより、
カチオン基間の静電反発が抑制され相転移温度が上昇。
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九州大学, 2012
60
50
40
30
20
10
0
Tp
/
ºC
1000 800 600 400 200 0
[NaCl] / mM
A15K84
A15K90
A15K93
A15K88
塩添加の効果
Chaotropic effect? Reducing of the
repulsion by NaCl
[PAU15K] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5)
NaCl濃度の上昇に伴って、相分離温度が上昇したことから、
塩(Clアニオン)の添加によってアミノ基間の静電的反発が抑制されたと考えられる。
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九州大学, 2012
[A15K88] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5)
塩の種類が相分離温度に与える影響
NaNO3
NaCl
NaBr
NaI
60
50
40
30
20
10
0
Tp
/ º
C
1000 800 600 400 200 0
[Salt] / mM
effect of ANION species
NaCl
CsCl
NH4Cl
LiCl
GdmCl
60
50
40
30
20
10
0
1000 800 600 400 200 0
[Salt] / mM
Tp
/ º
C
effect of CATION species
Urea + 150 mM NaCl
相分離温度はアニオン種に強く依存していた。 カオトロピック剤であるグアニジン塩酸塩や尿素は濃度依存的に相分離温度
を減少させたことから、PAUのUCST挙動は水素結合によって引き起こされている。
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九州大学, 2012
置換基の効果（サクシニル化の影響）
10 mM buffer containing 150 mM NaCl
pH 4.5 ~ 8.5
Tp = ~ 24 ˚C 100
80
60
40
20
0
T / %
70 60 50 40 30 20 10 Temperature / ºC
pH 9.5
Tp = 30 ˚C
pH 10.5
Tp = 36 ˚C
A15K87
CH
CH20.13NH2
CH2CH
CH2
0.87NH
CH2
C O
NH2
100
80
60
40
20
0
70 60 50 40 30 20 10 Temperature / ºC
T / %
pH 5.0
Tp = 8 ˚C pH 4.5
Tp = 30 ˚C
pH 5.5 ~ 10.5
Tp < 5˚C
Suc-A15K87
CH
CH20.13
NH
CH2CH
CH20.87
NH
CH2
C O
NH2
C
CH2
CH2
O
C
OH
O
Succinylation
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hydrogen boding
group
pH and/or salt
responsive
group
○生理的条件下においてUCST挙動を発現
○任意の温度のUCSTを設定可能
ウレイド基によるUCST挙動の一般性の確認
バイオマテリアルとしての応用を考え、
生分解性の高分子へのウレイド基の導入を検討
PAU derivatives
R = NH2
= NH(C=O)CH2CH2COOH
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HN CH C
CH2
O
CH2
CH2
NH2
HN CH C
CH2
O
CH2
CH2
NH
C O
NH2
1-n n
C150K93
C30K88
C150K73
C150K84
C30K93
100
80
60
40
20
0
Tra
nsm
itta
nc
e /
%
40 35 30 25 20 15 10 5
Temperature / ºC
C150K93
Mw of PLO Citrulline content
(%)
[POC] = 1mg / mL
Buffer: 10 mM Hepes-NaOH (pH 7.5), 150 mM NaCl
POCも生理的条件下において、UCST型の挙動が示された。
PAUの時と同様、相分離温度の分子量およびウレイド導入率依存性も示された。
生理的条件下におけるPOCのUCST挙動
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プロテアーゼによるPOC分解が相分離挙動に与える影響
100
80
60
40
20
0
Tra
nsm
itta
nce
/ %
60 50 40 30 20 10 0 Temperature / ºC
POC150K93
Proteinase K
+ NH3
+ NH3
+ NH3
0h 0.5h
1h
POCはプロテアーゼにより分解され、相分離温度が低下したことが示唆された。
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九州大学, 2012
まとめ
CH
CH2 1-nNH2
CH2CH
CH2 nNH
CH2
C O
NH2
HN CH C
CH2
O
CH2
CH2
NH2
HN CH C
CH2
O
CH2
CH2
NH
C O
NH2
1-nn
PAU
POC
150 mM NaCl
Heating
Cooling 10 ˚C 50 ˚C
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)
100
80
60
40
20
0
Tra
nsm
itta
nce / %
80 60 40 20 0
Temperature / ºC
ウレイド基が導入されたPAUやPOCは生理的条件下においてUCST挙動を示した。
ウレイド基の導入率、主鎖分子量を変えることで相分離温度を制御できた。
Shimada, N., et al. Biomacromolecules 2011, 12, 3418−3422
本技術に関する知的財産権
発明の名称：感温性ポリアミノ酸またはその塩 出願番号 ：特願2011-118869 出願人 ：国立大学法人 九州大学 発明者 ：嶋田直彦、丸山厚
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お問い合わせ先
九州大学知的財産本部
技術移転グループ
ＴＥＬ 092－642 －4361
ＦＡＸ 092－642 －4365
e-mail [email protected]
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