細胞内分解性ポリロタキサンを基盤とした ニーマン...
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東京医科歯科大学生体材料工学研究所 有機生体材料学分野
助教 田村 篤志教授 由井 伸彦
細胞内分解性ポリロタキサンを基盤としたニーマンピック病C型治療薬の開発
ライソゾーム病
分解酵素等の変異によりリソソームに脂質・糖質等が蓄積する疾患の総称（50種類以上の疾患群、日本では約30種類
が特定疾患に指定）
進行性神経後退、運動機能障害、骨形成不全など示す難治性疾患
常染色体劣性遺伝症、X連鎖劣勢遺伝症のため患者数は少ない （数万人に１人程度）
有効な治療法、診断法が確立されていない Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 554 (2004)より抜粋
ニーマンピック病C型 （NPC病）
原因： リソソーム上の膜タンパク質NPC1の変異による輸送障害→ リソソームにコレステロールが蓄積
症状： 進行性神経後退、肝脾腫 → 幼児期より発症する致死的疾患
治療法： 有効な治療法は確立されていない
Filipin
コレステロールのFilipin染色
20 m
正常細胞 NPC病細胞
従来技術とその問題点
Hydroxypropyl--cyclodextrin (HP--CD)高水溶性・低毒性の-CD誘導体
NPC病治療における-CD誘導体の問題点
・ 投与後速やかに腎排泄
・ 血中成分、細胞膜と作用
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2377 (2009), PLoS One 4, e6951 (2009), Sci. Transl. Med. 7, 276ra26 (2015)
・ 高濃度では組織障害性、急性毒性、聴力低下を示す （高濃度化には限界といったジレンマ）
極端に高濃度での投与が必要 (約100 gのHP--CDを点滴)
コレステロール 包接・可溶化
コレステロール除去作用 (Filipin染色)NPC1 fibroblast NPC1 fibroblast
+ 10 mM HP--CD
NPC病モデルマウスの生存期間延長
Npc1-/- Npc1-/-
+HP--CD
WT
ポリロタキサン
環状分子シクロデキストリン
線状高分子
嵩高いキャッピング分子
A. Harada et al. Nature 356, 325 (1992)rota（回転） + axis = polyrotaxane
A. Tamura, N. Yui Chem. Commun. 50, 13433 (2014)
分解性結合分子可動性特定の反応による分解
新技術の特徴
ポリロタキサンの利点1. CD空洞部がポリマー鎖で占有、血中・細胞膜のコレステロールとの作用や障害性を回避2. ポリロタキサンはCDと比較して高分子量となるため、腎排泄を回避
3. 細胞内で分解し、リソソーム内のコレステロールと作用
Hydrophilicfunctional group
Cleavable linker
酸分解性PRXの設計
N-Trt基の酸分解反応
HEE-PRXaxle polymer： Pluronic P123(Mn,PPG: 4000, Mn,PEG: 1100×2)-CD貫通数： 14.2HEE基修飾数: 90Mn: 35,000
N-triphenylmethyl（N-Trt）基
弱酸性環境でN-Trt基が分解、ポリロタキサン骨格が崩壊し、-CDを放出
HEE-PRX
2-hydroxyethoxyethyl(HEE)基（水溶性の付与）
各pHにおけるPRXの分解挙動
HEE-PRX HEE--CDPRXからのN-Trt基の脱離速度
pH 4~9、37oCで所定時間静置後、N-Trt基の脱離量をHPLCで定量(pH 4~5.5: acetate buffer, pH 6~9: phosphate buffer, PRX conc.: 10 mg/mL)
0 12 24 36 480
20
40
60
80
100
pH 7.4
pH 6
pH 5
Cle
aved
N-T
rt gr
oup
(%)
Time (h)
pH 4
10 11 12 13 14 15
pH 9
Elution volume (mL)
pH 6
pH 5.5
pH 7
pH 6.5
pH 8
pH 7.4
pH 5
pH 4
24時間後のSECクロマトグラム
生理pHでは長時間安定であるが、酸性pHではTrt基が脱離し超分子構造が崩壊
コレステロールの包接能
各pHで過剰量のコレステロールと混合、37oCで24時間振とう後の溶解度をHPLCで定量
生理条件ではPRX構造により包接が阻害、酸性pHでは-CD放出による包接作用
0 10 20 30 40 500.0
0.5
1.0
1.5
2.0
pH 5
HP--CD, pH 7.4 HP--CD, pH 5
HEE-PRX, pH 7.4 HEE-PRX, pH 5
Sol
ubilit
y of
cho
lest
erol
(mM
)
Concentraion of -CD (mM)
pH 7.4
pH 5
pH 7.4
PRX構造によるCDの障害性回避
赤血球の溶血 細胞生存率
Incubation: 2 h at 37oC Incubation: 24 h at 37oC
PRXはCD空洞部を塞いだ構造のため細胞膜中のコレステロールを引き抜かず-CDの溶血・細胞毒性を回避
細胞膜からのコレステロール抽出
Incubation: 2 h at 37oC
0.1 1 100
20
40
60
80
100
Hem
olys
is (%
)
Concentration of -CD (mM)0.1 1 10
0
20
40
60
80
100
Cel
l via
bilit
y (%
)
Concentration of -CD (mM)0.01 0.1 1 10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Cho
lest
erol
effl
ux (n
mol
/105 c
ells
)
Concentration of -CD (mM)
PRX
HP--CD
PRX
HP--CD
PRX
HP--CD
A. Tamura, N. Yui Sci. Rep. 4, 4356 (2014)
PRXの細胞内局在
HP--CDは細胞膜上へ集積するのに対し、PRXは後期エンドソームへ局在→ PRXは細胞膜成分と相互作用しないため、CDよりも取り込み効率が高い
Phase contrast Early endosome Late endosome Lysosomeanti-EEA1DAPI
anti-CD63DAPI
anti-LAMP1DAPI
FITC-HP--CD
FITC-PRX
NPC病患者由来皮膚線維芽細胞 （NPC1にP237S, I1061Tの変異）Incubation: 24 h at 37oC
20 m
A. Tamura, N. Yui Sci. Rep. 4, 4356 (2014)
NPC病由来細胞におけるコレステロール量変化
コレステロールのFilipin染色 細胞内総コレステロール量の変化
・NPC病患者由来皮膚線維芽細胞（NPC1）（P237S, I1061T）、健常者由来皮膚線維芽細胞（NHF）・24時間接触後に染色、あるいは細胞溶解液中のコレステロール量を酵素法で定量
treatment: 24 h
normallevel
NPC1level
0
120
140
160
180
200
220
240
Tota
l cho
lest
erol
(nm
ol/m
g of
pro
tein
)
－－
－－
0.1－
1－
10－
－0.01
－0.1
－1
untreated untreated
HP--CD (10 mM) HEE-SS-PRX (1 mM)
normal fibroblasts NPC1 fibroblasts
NPC1 fibroblasts
normal NPC1
20 m
HP--CD (mM)PRX (mM -CD)
A. Tamura, N. Yui J. Biol. Chem. 290, 9442-9454 (2015)
NPC病におけるオートファジー機能異常
オートファジー：不良タンパク質やオルガネラをオートファゴソームに取り込み、リソソームで分解する機能
通常培地 貧栄養培地 2hGFP-LC3-HeLa
GFP-LC3
基底状態： 細胞機能維持のため一定レベルで発生誘導： 栄養飢餓などのストレスによって誘導
NPC病患者由来
皮膚線維芽細胞正常皮膚線維芽細胞
anti-LC3DAPINPC病では、オートリソソーム形成不全により基底
状態で細胞質にオートファゴソームが蓄積（NPC病におけるオートファジー機能の低下は病態の原因と指摘）
M. J. Elrick et al. Hum. Mol. Genet. 21, 4876 (2012)S. Sarkar et al. Cell Rep. 5, 1302 (2013)
通常培地
オートファゴソームの形成評価
WBによる定量的評価
0
100
200
300
400
500
600 LC3-II/-actin p62/-actin
Rel
ativ
e ex
pres
sion
leve
l
normal NPC1
－－
HP--CDHEE-SS-PRX
－－
＋－
－＋
免疫染色によるオートファゴソームの蓄積評価treatment: 24 h
untreated untreated
HP--CD (10 mM) HEE-SS-PRX (1 mM)
normal fibroblasts NPC1 fibroblasts
NPC1 fibroblasts
HP--CDとHEE-SS-PRXはオートファジーに対して正反対の作用、PRXはオートファジーによるタンパク質分解機能を正常レベルまで改善
anti-LC3DAPI
0
10
20
30
40
50
Num
ber o
f mR
FP+ -E
GFP
- pun
cta/
cell
0
20
40
60
80
100
Num
ber o
f mR
FP+ -E
GFP
+ pun
cta/
cell
autophagic fluxの評価
untreated untreated
HP--CD (10 mM) HEE-SS-PRX (1 mM)
normal fibroblasts NPC1 fibroblasts
mRFP-EGFP-LC3DAPI
オートリソソーム数オートファゴソーム数transfection for 24 h, treatment with samples for 24 h
NPC1 fibroblasts
untre
ated
untre
ated
HP--
CD
HE
E-S
S-P
RX
normal NPC1
10 m
****
* **** ****
NS NS
NS
untre
ated
untre
ated
HP--
CD
HE
E-S
S-P
RX
normal NPC1
PRXはオートリソソーム形成を促進、正常細胞と同程度までオートファジー機能を改善
A. Tamura, N. Yui. J. Biol. Chem. 290, 9442 (2015)
NPC病モデルマウスを用いた治療効果評価
S. K. Loftus et al. Science 277, 232 (1997)
-3 w 0 w 2 w 3 w
交配 出生
皮下投与（週１回）
Genotyping 離乳
20 w
NPC1欠損モデル （BALB/cNctr-Npcm1N）
実験スケジュール
・ 生存期間
・ 体重変化
・ 運動機能 歩行失調等よりスコア化
NPC病モデルマウスの表現型
20 40 60 80 100 1200
5
10
15
20
25
30
Bod
y w
eigh
t (g)
Age in days20 40 60 80 100 120
0
2
4
6
8
10
12
Ata
xia
scor
e
Age in days
0 60 80 100 1200
102030405060708090
100
Sur
viva
l rat
e (%
)
Age in days
体重変化 運動失調スコア 生存期間
WT mice WT mice
WT mice
Npc1-/- mice
Npc1-/- mice
Npc1-/- mice
NPC病モデルマウスは6週齢より体重減少と運動機能の低下、平均生存期間は71.3日
皮下投与後の薬物動態
Hilyte Fluor 680（Ex: 688 nm, Em: 700 nm）を修飾した試料をWTマウス（5w, ♂）に皮下投与所定時間経過後の蛍光強度をIVIS Lumina XRMS Series IIIで測定 （n=5）
1 h 2 h 5 h 24 h
Hily
teFl
uor 6
80-
HP--
CD
Hily
teFl
uor 6
80-
HEE
-PR
X
1 2 3 4×1010 ([p/sec/cm2/sr]/[W/cm2])
48 h
HEE-PRXはHP--CDよりも投与部位からの消失が遅く、体内に長くとどまる
0 12 24 36 480.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Rad
iatio
n ef
ficie
ncy
(x10
12 [p
/sec
/cm
2 /sr]/
[W
/cm
2 ])
Time (h)
Hilyte680-HP--CD Hilyte680-HEE-PRX
24時間後の組織分布
brain heart lung spleen
liver kidney
Hilyte Fluor 680-HP--CD
Hilyte Fluor 680-HEE-PRX
brain heart lung spleen
liver kidney
PRXは-CDと比較して肺、腎臓への集積が低下（PRXも腎排泄を受けるが、-CDよりも程度が低い）
治療に重要な能や肝臓への集積は-CDと同程度
組織重量あたりの蛍光強度 （24h）
brain heart lung spleen liver kidney0
5
10
15
20
25
30
35
40 HP--CD HEE-PRX
Rad
iatio
n ef
ficie
ncy/
gram
of t
issu
e
NPC病モデルマウスに対するPRXの効果
•PRXはNPC病モデルマウスの体重減少、運動機能の低下を遅延
•PRXはシクロデキストリン単体よりも低濃度でNPC病モデルマウスの生存期間を有意に延長
想定される用途
•シクロデキストリン単体よりも低濃度で作用するニーマンピック病C型治療のための医薬品
•他のライソゾーム病に対する医薬品
•コレステロールなど脂質に関連した研究用試薬 （細胞内部特異的にシクロデキストリンを作用させることが可能）
実用化に向けた課題
•現在、マウスモデルでの治療効果を確認済みであるが、その作用機序は未解決である。今後、動物実験のデータをさらに取得し、作用機序の解明と分子設計の最適化を行っていく。
•医薬品としての実用化に向けた大量スケール、GMPグ
レードの製造技術についても確立する必要がある。
本技術に関する知的財産権
発明の名称
出願番号
出願人
発明者
： ポリロタキサン、及び医薬組成物
： PCT/JP2014/071553
： 国立大学法人 東京医科歯科大学
： 田村篤志、由井伸彦
お問い合わせ先
東京医科歯科大学
研究・産学連携推進機構
産学連携研究センター 渡辺 公義
ＴＥＬ ０３－５８０３ － ４７３６
ＦＡＸ ０３－５８０３ － ０２８６
e-mail ｔｌｏ＠ｔｍｄ.ａｃ.ｊｐ