Chapter 6. 효소 (enzyme)

이 순간에도 수천개의 생화학반응이 생체 내에서 일어나며 효소는 이 반응들의 생화학적 촉매이다.

효소는 대부분 단백질이나 RNA (ribozymes)인 경우도 있다. RNA 효소는 ribosome (peptidyl transfer)과 splicesome (splicing of intron)이 있다.

효소는 대사기능의 주요 요소이다. 효소는 세포내에서 반응의 속도조절, 반응의 coupling, 그리고 순간적으로 세포의 대사적 필요성을 감

지한다.

효소반응속도론( Enzyme Kinetics)

화학 반응속도론(Kinetics) 은 화학반응의 속도를 다룬다. 효소반응속도론(Enzyme kinetics) 은 촉매로서의 효소의 생화학적 기능을 논하고 생체효소의 기능에 대하여 정량적인 접근을 한다.

효소 반응속도론의 정보는 대사과정을 조절하며 통제하는데 사용될 수 있다. 치료제나 약품들은 많은 경우에 특정효소의 저해제(inhibitors)인 경우가 많다. 따라서 신약의 개발은 효소에 관한 연구결과와 밀접한 연관이 있다.

Ligands

Trypsin

Target

Structure based drug design

속도상수와 활성화 에너지

DG‡ (non catalyzed)

DG‡ (catalyzed)

DG

P A X‡

Arrhenius Equation: 속도상수,

효소는 반응의 포텐셜 (자유에너지)를 변화시키지 않지만 반응의 속도를 증가시킨다. 즉 효소는 반응의 활성화에너지를 낮추어 생체반응의 속도를 증가시킨다.

효소는 기질에 대해 특이적 결합을 한다 (high specificity for substrates) 효소반응 :

효소 + 기질 생성물 + 효소

RT

G

Aek

D

효소반응과 비효소반응

H2 O2 H2 O + O2

No catalyst

Platinum surface

Catalase

75.2 18.0

48.9 11.7

23.0 5.5

Activation e nergy

(kJ/mol) (kcal/mol)

Relativerate*

1

2.77 x 104

6.51 x 108

ReactionConditions

* Rate s are give n in arbitrary units relative to a value of 1 for the uncatalyzed reaction at 37캜

효소는 반응속도를 최대 1016 만큼 가속시킨다.

- 단백질 자체만으로 활성 (대부분 효소) - 단백질 자체만으로 비활성 + cofactor --> active enzyme (apoenzyme) holoenzyme cofactors (조효소) @metal ions: Zn2+, Fe2+, Cu2+.., 예) metallo-enzyme (alcohol dehydrogenase-Zn2+)

@유기물 (coenzyme) : loosely bound (반투막 투과 기준)

예) 비타민 C : proline hydroxylase의 조효소 tightly bound : 주로 공유 결합(prosthetic group)

Enzyme, apoenzyme, holoenzyme, cofactor

-1835 Jons Berzelins : starch + potato ---> starch의 분해 -1850 ~ 60 Louis pasteur : sugar + living cell(yeast)--> EtOH + CO2 - 1897 Eduard Buchner : yeast cell 을 grind + filter(sand) 한 Juice 발효속도증가 확인 Harden & young : yeast Juice = heat unstable(enzyme) + heat stable (inorganic)

- 1927 James summer : urease 효소의 결정화에 성공 (X-ray 구조), 효소=단백질 논란 시작...

- 1930 John Northrup : trypsin, pepsin 발견, 효소=단백질 결론

History of Enzyme Discovery

Enzyme Kinetics

A + B P

Rate =D[A]

Dt

D[B]

Dt

D[P]

Dt_ _= =

Rate = k[A] f[B]g

다음 반응에서

반응속도는,

k : 반응 속도상수 f + g : 반응차수

반응속도(rate, v)는 단위시간 당

생성물 P의 생성속도 혹은 반응물 A나 B의 소멸속도이다.

A + B C + D

Rate = k[A]1[B]1다음 반응에서

만약 반응 속도가 다음과 같으면,

A와 B에 대해 각각 1차 반응이다.

반응속도(rate, v)는 단위시간 당

생성물C나D의 생성속도 혹은 반응물 A나 B의 소멸속도이다.

1차 반응 (the first order reaction)의 예 비가역적 방사능 붕괴의 예: k(정반응 속도상수) A ---------------> P (reactant) (product)

v= - d[A]/dt = k[A] = d[P]/dt (k : S-1) k[A] = -d[A]/dt;

kdt = -d[A]/[A]; d[A]/[A]= -kdt; 양변 적분하면, ln [A]t - ln[A]o = - kt ; ln ( [A]t /[A]o) =-kt [A]t /[A]o = exp (-kt)이고, [A]t =[A]o exp (-kt)이다.

at t = 1/k 에서 A의 잔여량 계산; [A]1/k =[A]o exp (-k(1/k)) = . [A]o exp (-1) = 0.37 [A]o @at t = 1/k 에서 A의 잔여량은 초기량의 37%

Enzyme Kinetics : warming up

이분자반응의 속도식

다음 반응식에서,

반응속도(rate, v)는 단위시간 당 생성물 P나 Q의 생성속도 혹은 반응물 A나 B의 소멸속도이다: :

반응속도는:

k 는 2차 속도상수, v 는 [A][B]의 2차식이다.

dt

Bd

dt

Advor

dt

Qd

dt

Pdv

][][][][

QPBA

]][[][

BAkdt

Adv

기질-효소 결합의 두 모델: lock and key & Induced fit models

induced-fit model : The shape of the active site changes when

the substrate binds to the enzyme, creating a shape into which the substrate fits.

효소-기질 복합체 형성과 반응에너지 변화

효소 동력학(Enzyme Kinetics)

단분자 반응의 속도는 반응물의 농도 [A]에 직선적으로 비례.

하지만 만약 위 반응을 효소가 촉매인 경우 포화 현상을 보임

PA ][][

Akdt

Adv

v

[A]

PA Enzyme v

[A]

For enzyme-catalyzed reactions

The substrate, S, and enzyme, E, combine to form a complex, ES

E + S ES E + P

Leonor Michaelis

Maude Menten

S P

The Michaelis-Menten Equation

Michaelis-Menten식의 유도 배경:

E는 효소, S는 기질, P는 생성물 Michaelis-Menten식은 기질의 농도와 속도의 관계를 규정.

Michaelis-Menten의 가정:

1) 초기속도 가정 (Initial velocity assumption) * Initial velocity assumption: measure activity before appreciable P accumulates, ignore k-2, vR

2)정상상태 가정(State steady assumption, approximation);

* 문제를 쉽게 하기 위해 Steady-state assumption(평형-상태 가설)을 도입. 이는 평성 상태에서는 반응물과 생성물의 농도들이 변하고 있다고 하더라도 중간체의 농도는 변하지 않는다는 것. 즉, 이 경우에서는 [ES]는 불변이 된다. [ES]의 농도가 불변이려면 ES의 형성속도와 분해속도가 같다.

What about the reverse reaction?

Initial velocity assumption: measure activity before appreciable P accumulates, ignore vR

v0 = k2 [ES]

E + S ES E + P k2 k1

k-1 k-2

vR = k-2 [E][P]

[ ]

정상(류)상태 가정 (Steady State Approximation)

정상상태는 효소-기질 결합물 [ES]의 농도가 일정한 상태를 말한다:

정상상태 이전은 (Pre-steady state) [ES]가 (주로) 매우 빠르게 쌓이는 상태이다;

MM식은 반응계가 정상상태에 도달했을 때의 반응동력학을 나타낸다.

생성물 (P)의 생성속도는 전 단계보다 느리므로 이 과정이 전체 속도 결정

0][

dt

ESd

반응초기에는 생성물([P])이 거의 없으므로 E+P에서 ES가 다시 생성되는

양은 거의 무시해도 된다.

따라서 MM식은 다음과 같이 간략히 표현될 수 있다:

K-1

PEESSE k1

K-1

k2

PEESSE k1 k2

K-2

반응속도식을 적용하면,

정반응의 속도 vf 은 (혹은 ES의 생성속도),

역반응 (혹은 ES의 소멸)의 속도 vd 는,

정상상태에서는 [ES]의 변화가 없으므로:

([E]<<[S] : saturation)

PEESSE k1

K-1

k2

SEkv f 1

ESkkESkESkvd )( 2121

df vv

Michaelis-Menten식의 유도

반응계의 총 효소농도, [Et] 는 효소-기질 복합체 농도( [ES]) 더하기 자유효소(비결합 효소) 농도([E])이므로:

정상상태(at steady state)에서는 이므로

생성물의 생성속도 (속도법칙), v = k2[ES] 이므로:

m

tkkk

Ktt

tt

tt

KS

SEES

kkk

S

SE

kkSk

SEkES

kkSkESSEkESkkSESkEk

ESkkSESkSEkESkkSESEk

m

1

21 )(

1

21211

1

21112111

2111211

)())((

))(()(

)()()(

EESEt SESEkSEkv tf )(11

m

t

KS

SEkv

2

Michaelis-Menten식의 유도

df vv

MM Equation의 고찰

생성물의 생성속도는 주로 생성물이 점차 생기는 것을 측정하여

실험적으로 결정할 수 있다.

반응의 최대속도는 기질의 농도[S]가 포화상태 혹은 최대로 존재 시

도달하므로 ([s] ),

MM식은 다음과 같이도

표시할 수 있다:

여기서 Km 은 Michaelis 상수라고 함.

mKS

Svv

max

max2

][

2

][1

vEkEk

v t

SK

tS

m

Michaelis Menten 상수 Km

Km 은 속도상수들로 표시:

Km 은 k-1>>k2일때 ES의 해리상수이다 :

Km 이 작으면 기질과 강한 결합을 크면 기질과 약한 결합을 나타 냄.

Km 은 또한 최대속도의 ½ 에서의 기질농도이다.

1

21

k

kkKm

ESSE k1

k-1

1

1

][

][

k

k

ES

SEKd

][][ 11 ESkSEk

만약 [S]= KM 이면 다음이 된다,

Vmax [S]V =

KM + [S]=

Vmax [S]

[S] + [S]=

Vmax

2

기질농도, [S]

Init

ial

vel

oci

ty

V max

2

K M

V max

Michaelis-Menten Model

Km (KM)의 의미

최대 속도의 1/2에서의 기질농도

최대속도 vmax 란?

Vmax는 기질농도가 최대로 증가 시 접근하는 최대속도이나 진짜로 최대치는 얻지 못함 (효소가 100% 기질에 결합하지는 못하므로…)

전환수( Turnover number): 효소가 기질에 포화되어 있거나 혹은 기질의 농도가 효소에 비해 매우

높을 때 ([S]>>[Et]), 단위시간 (초), 단위 효소 농도(몰) 당 생성물로 전환되는 기질 의 몰 수이다: (기질 mol) // (s* mol enzyme)

ESSE k1

k-1

][

max

t

catE

vk

cat

t

kE

vk

][

max

2

1.5 ug of enzyme (Mr 30,000 gives a Vmax of 3 umol product produced per minute. 1. What is the turnover number for this enzyme? 2. What is the turnover number if the enzyme is trimeric with 3 identical subunits? 3. What is the turnover number if the enzyme is dimeric with 2 nonidentical subunits? What is the turnover number if 3 ug enzyme gave a Vmax of 3 umol/min.?

Question on turnover number. 5

Turnover Numbers and KM

Enzyme Function

Catalase Conversion of

H2O2 to H2O + O2

4 x 107 25

Carbonicanhydrase

Hydration of CO 2 1 x 106 12

Acetylcholin-es terase

Regeneration of ace tylcholine

1.4 x 104 9.5 x 10-2

Chymotryps in Proteolytic enzyme 1.9.x 102 6.6 x 10-1

Lysozyme Hydrolysis of bacterial ce ll wallpolysaccharides

0.5 6 x 10-3

KM

(mmol뷿 iter -1)

Turnover numbr

[(mol S)?mol E) -1븉 -1]

Table 5.2 Values for some typical enzymes

MM식의 반응차수 :2nd, 1st, 0th orders

기질의 농도가 낮을 떄, [S], 의 일차식

이 때 [Et] [E]이고 반응식은 [E] 와 [S]의 2차식이다. kcat/Km은 유사 2차 속도상수이다:

기질의 농도가 높을 때, MM식은 [S]의 0th 차식이다:

m

t

m

t

K

Ek

KS

SEkv

][S][

][

]][[ 22

][][

]][[max

max

t

m

t EvKS

SEvv

mm

t

K

Ek

K

Ekv

][S][][S][ 22

촉매의 효율(Catalytic Efficiency): kcat/Km

kcat/Km 값은 효소가 얼마나 완벽한가의 척도이다:

kcat/Km 값의 최대치는 확산한계(diffusion limit)이다. (효소(E)와 기질(S)이 서로 확산해서 만나는 속도)

MM Equation의 plot 방법 (쌍곡선 vs 직선 )

MM 공식은 다음과 같이 쌍곡선으로 그릴 수 있다:

여기서 Km 은 ½ vmax 값일 때의 기질농도

mKS

Svv

][

][max

[S]

v

vmax

Km

Lineweaver-Burk Plot of MM Equation (double reciprocal Plot)

MM식은 다음과 같이 직선형으로 그려질 수도 있다 (원하는 변수 쉽게 얻을 수 있음 (양변의 역수를 취하여…) :

][

11

][

][1

][

][

maxmaxmax

max

Sv

K

vSv

KS

vKS

Svv mm

m

V1

[S]1

x intercept =

y interce pt =1

Vmax

-1

KM

slope =KM

Vmax

V

1 =Vmax

+ 1

Vmax [S]

1

y m x + b

V

1 =KM

•

= •

효소 저해 (Enzyme Inhibition)

효소는 저해제에 의해서 활성이 억제될 수 있다. 저해제와 효소의 활성관계는 연구는 질병을 제어하는 약품개발로서의 의미도 있다;

저해제는 효소에 결합함으로써 효소활성을 억제한다. 효소와의 결합은 가역적 혹은 비가역적이다;

가역적 저해제(Reversible inhibitors)는 효소와 비공유성 결합형태로 서로 작용한다. 가역적 저해제에는 3가지가 있다: Competitive inhibitors; (경쟁적 저해) Non-competitive inhibitors; (무경쟁적 저해) Un-competitive inhibitors (비경쟁적 저해)

비가역적 저해제(Irreversible inhibitors)는 효소와 공유결합을 통해서 결합한다. 비가역적 저해제의 효소결합은 결과적으로 유효효소농도의 감소를 초래한다.

예) penicllin covalently react with an essential serine residue in the active site of glycoprotein peptidase,an enzyme that acts to cross-link the peptidyglycan chains during synthesis of bacterial cell walls.

• Reversible inhibitor:

– (a)competitive inhibitor: binds to the active (catalytic) site and blocks access to it by substrate

– (b)noncompetitive inhibitor: binds to a site other than the active site; inhibits the enzyme by changing its conformation. Active site 기질결합에 상관

없이 결합.

-- (c)uncompetitive inhibition

오직 ES complex에만 "I"결합

• Irreversible inhibitor: a substance that causes inhibition that cannot be reversed. Usually involves formation or breaking of covalent bonds to or on the enzyme.

Reversible inhibition

효소 저해 (Enzyme Inhibition)

)

][1(][

][max

I

mK

IKS

Svv

v

[S]

vmax

Km 1/[S]

1/v

1/vmax -1/Km

Slope=Km/vmax

PEESSE k1

K-1

k2

EI

I

KI

Km increases vmax unchanged

+inhibitor

Km(1 +[I]/KI)

-1/(Km(1+[I]/KI))

Slope= Km(1+[I]/KI)/vmax

Competitive Reversible Inhibitors

기질과 inhibitor가 경쟁 (농도 경쟁)

기질과 inhibitor가 경쟁 (농도 경쟁)

KI

E + I <----> EI ; Ki (해리상수)

KI-1

Ki = [E][I] / [EI] = KI-1/KI

[EI] = [E][I] / Ki ---(1)

PEESSE k1

K-1

k2

EI

I

KI

Steady-state 에서 d[ES]/dt = 0 = k1[E][S] - k-1[ES] - k2[ES]이고,-(2)

효소총량은, [E] = [Et] - [ES] - [EI]-- (3) 이다.

(1)-->(3)으로 대입, [E] = [Et] - [ES] - [E][I] / Ki

[E] + [E][I] / Ki= [Et] - [ES] ;

Competitive Reversible Inhibitors

KI-1

앞에서, [E] + [E][I] / Ki= [Et] - [ES] ;

[E]로 묶으면, [E] {1 + [I]/Ki} = [Et] - [ES] [E] = ([Et] - [ES])/(1 +[I]/Ki) ---(4) (4)-->(2)로 대입, d[ES]/dt = 0 = k1*(([Et] - [ES])/(1 +[I]/Ki))*[S] - k-1[ES] - k2[ES] [ES]로 정리하면, [ES] = k1 [S] [Et] / k1*{[S] + (1+[I]/Ki)*(k-1 + k2)}, k1으로나누면, [ES] = [S] [Et] / {[S] + (1+[I]/Ki)*(k-1 + k2)} = [S] [Et] / {[S] + (1+[I]/Ki)*(k-1 + k2)/k1}

여기서, km = (k-1 + k2)/k1이고, v = k2[ES]이므로, 경쟁적 저해제(competitive inhibitor) 존재시의 효소반응 속도, v는

v= k2*[S] [Et] / {[S] + (1+[I]/Ki)*km}이다.

Competitive Reversible Inhibitors

다시 쓰면, v = K2*[Et][S] / {[S] + KM'} = Vmax[S] / {[S] + KM'} ---(5)

(KM' = (1+[I]/Ki)*km)

(Michaelis-Menten 식과 거의 유사함 ) 여기서, [I] = 0 --> KM' = Km [I] > 0 ---> KM' > Km; [I] < 0 --> KM' < Km (x).

Competitive Reversible Inhibitors

)][

1(][

][max

I

mK

IKS

Svv

V

1 =KM

Vmax Vmax

+ 1

No inhibition

S

1•

y = m • b+x

y =

In the prese nce of a competitive inhibitor

V1 =

KM

Vmax Vmax

+ 11 +[I]

KIS1

+ bm x•

(5) 식을 double reciprocal plot으로 표시하면, 1/v = 1/vmax + (KM'/vmax)*(1/[S])

(KM' = km(1+[I]/kdi) = (km/kdi)*[I] + km )

Competitive Reversible Inhibitors

)][

1(][

][max

I

mK

IKS

Svv

V1

[S]1

x interceptsy interce pt =

1Vmax

slope =KM

Vmax

No inhibition

Competitiveinhibition

-1

KM

-1

KM 1 +[I]

KI

KM

Vmax

1 +[I]

KI

slope =

KM 변화; Vmax 불변

Competitive Reversible Inhibitors

Noncompetitive Reversible Inhibitors

)][

1(][

][ max

I

m

K

I

v

KS

Sv

PEESSE k1

k-1

k2

EI

I

KI

Km unchanged vmax decreases

I

EIS

KI’

+inhibitor

1/[S]

1/v

1/vmax -1/Km

Slope=Km/vmax (1+[I]/KI)/Vmax Slope= Km(1+[I]/KI)/vmax

v

[S]

vmax

Km

Km

Vmax/(1+[I]/KI)

S

because the inhibitor does not interfere with binding of substrate to the active site, KM is unchanged

increasing substrate concentration cannot overcome noncompetitive inhibition

y = m x

In the prese nce of a noncompetitive inhibitor

V1 =

KM

Vmax Vmax

+ 11 +[I]

KIS1

+ b

1 +[I]

KI

•

V

1 =KM

Vmax Vmax

+ 1

No inhibition

S

1

y = m • b+x

•

Noncompetitive Reversible Inhibitors

)][

1(][

][ max

I

m

K

I

v

KS

Sv

V1

[S]1

x intercept y intercept =1

Vmax

slope =KM

Vmax

No inhibition

Noncompetitiveinhibition

-1

KM

KM

Vmax

1 +[I]

KI

slope =

y intercept =1

Vmax

1 +[I]

KI

km은 불변,

vmax는 Vmax'(=vmax/(1+[I]/kdi))으로 감소

Noncompetitive Reversible Inhibitors

Uncompetitive Reversible Inhibitors

)

][1(

)][

1(

][

][ max

I

K

v

I

K

KS

Sv

I

I

m

PEESSE k1

k-1

k2

Km decreases vmax decreases Slope unchanged

+inhibitor

I

EIS

KI’

1/[S]

1/v

1/vmax -1/Km

Slope=Km/vmax (1+ KI/[I])/Vmax Slope= Km/vmax

v

[S]

vmax

Km Km/(1+ KI/[I])

Vmax/(1+KI/[I])

- (1+ KI/[I])/Km

Mixed Inhibitions

+inhibitor

1/[S]

1/v

1/vmax -1/Km

Slope=Km/vmax

+inhibitor

1/[S]

1/v

1/vmax -1/Km

Slope=Km/vmax

Summary : Inhibitors

Competitive inhibition - 저해제 (I)는 ES가 아니라 E에 결합

Noncompetitive inhibition – 저해제 (I)는 E 와/혹은 ES에 결합

Uncompetitive inhibition - 저해제 (I)는 E가 아니라 ES에 결합.

(이 것은 가상적 상황으로 실제 관측되지는 않지만 경쟁적 저해와 대조해서 비교하기는 효과적이다.)

Mixed inhibition-저해제 (I)의 E 와 ES에 대한 해리상수가 다름. 저해방법이 서로 섞임.

Exercise 1

What is the v/Vmax ratio when [S]=5Km?

Draw a Lineweaver-Burk plot if Vmax=100 mmol/mL, Km=2mM.

Draw the new lineweaver-Burk plot on the same plot as above if a competitive inhibitor is added. [I]=0.5 mM, KI=1mM.

6

5

5

5

][

][

][

][

max

max

mm

m

mm KK

K

KS

S

v

v

KS

vSv

)][

1(][

][max

I

mK

IKS

Svv

y =

In the prese nce of a competitive inhibitor

V1 =

KM

Vmax Vmax

+ 11 +[I]

KIS1

+ bm x•

다음 반응에 대하여 답하시오. k1 k2 E + S ----> ES -----> E + P <---- <---- k-1 k-2

k1 = 109 M-1s-1, k-1 = 105s-1, k2 = 102s-1; k-2 = 107M-1s-1 , [E]t=0.1nM a) Km ? b) Vmax ? c) kcat :?

d) initial velocity ([S]o = 20 μM) : e) km = kd인가 설명해 보시오.

Exercise 2

1

21

k

kkKm

max2

][

2

][1

vEkEk

v t

SK

tS

m

mKS

Svv

max

-Michaelis-Menten 식을 유도하고 double-reciprocal plot을 그려보라. -Hyperbolically 반응하는 효소에서 10% Vmax (S0.1)일떄와 90% Vmax (S0.9)일때의 기질의 농도([S])를 Km으로 표시하고 S0.9/S0.1을 구하라. (b) (5점) Hill coefficient가 2일 때 (n=2)는 S0.9/S0.1 값은 얼마인가?

(c) (10점) 이 두 값의 차를 allosteric 효소의 조절 관점에서 설명해 보라 (이 문제는 6장을 배운 후 풀 것!) -다음의 초기 효소반응속도 자료를 참고해서 대답하시오. [S](μmol/L) V(μmol/L)min-1 5 22 10 39 20 65 50 102 100 120 200 135 500 147

) Lineweaver-Burk 그래프를 그려서 Vmax와 Km을 추정하시오. b) 만약 효소의 총농도가 1nmol/L이면, Kcat값은? Specificity constant 값은? d) 이 효소는 꽤 효율적이라 할 수 있나? 설명하라.

Exercise 3

저해제 A의 존재 시 다음의 효소반응 자료를 참고해서 답하시오. V (mmolL-1min-1)

------------------------------------------- [S](mmol/L) no inhibitor inhibitor A 1.25 1.72 0.98 1.67 2.04 1.17 2.50 2.63 1.47 5.00 3.33 1.96 10.00 4.17 2.38

a) 저해의 종류는? 그래프를 그려서 이유를 설명하시오. b) 저해제가 있을 때와 없을 때 각각의 KM과 VMAX 값들을 구하시오.

Exercise 4

y =

In the prese nce of a competitive inhibitor

V1 =

KM

Vmax Vmax

+ 11 +[I]

KIS1

+ bm x•

1.5 ug of enzyme (Mr 30,000) gives a Vmax of 3 umol product produced per minute. 1. What is the turnover number for this enzyme? 2. What is the turnover number if the enzyme is trimeric with 3 identical subunits? 3. What is the turnover number if the enzyme is dimeric with 2 nonidentical subunits? What is the turnover number if 3 ug enzyme gave a Vmax of 3 umol/min.?

Question on turnover number. 5

1. 1.5 ug = 5 x 10-5 umol enzyme = Et. Vmax = 3 umol/min ; Vmax = Kcat x Et and kcat = Vmax / Et = turnover number = 3 / 5 x 10-5 = 0.6 x 105 umol/min/umol = 1000 umol/sec/umol turnover number = 1000 sec-1 2. if trimeric, 1 mol of enzyme = 3 mol of catalytic site therefore turnover number per catlaytic site = 1000 / 3 = 333 sec-1 3. if dimeric with nonidentical subunits Mr per catalytic site = 30,000 and turnover number/catalytic site = 1000 sec-1 4. 3 ug enzyme gives Vmax = 3 umol/min. -twice as much enzyme gives same Vmax therefore: Vmax per mol of enzyme is half that of the original question and turnover number = 500 sec-1

Answer

Calculate the kcat of Enzyme, given the following data. Vmax = 40,000 μmoles/sec, in an assay mixture of 1 mL Amount of enzyme used in one assay (1 mL) = 5 μL of a 1 mg/mL solution of enzyme MW of the enzyme = 50,000 gm/mol Km of the substrate = 3 mM Kcat= Vmax/Et

Et is the concentration of enzyme in moles/L. You start with 5µL of a 1mg/mL solution of enzyme, and dilute this in 1mL. What is the concentration now in terms of mg/mL? What is that concentration when you convert it to moles/L?

다음 자료를 보고 물음에 답하시오. 단 저해제의 농도는 5mM이다. 단위 명시!!!.

a) V vs [S], 1/V vs 1/[S] 그림을 그리시오.

b)저해제가 없는 경우의 Km과 Vmax를 구하시오. c)A, B의 경우 저해의 종류는? 이유는?

d)A, B의 각 경우 저해제의 Ki값을 구하시오.

[S] Vo A:Vo B: Vo mM (Ms-1)*107 (Ms-1)*107 (Ms-1)*107

0.33 1.65 1.05 0.80 0.40 1.86 1.21 0.89 0.50 2.13 1.43 1.02 0.66 2.49 1.74 1.19 1.0 2.99 2.22 1.43 2.0 3.72 3.08 1.79

y =

In the prese nce of a competitive inhibitor

V1 =

KM

Vmax Vmax

+ 11 +[I]

KIS1

+ bm x•

다음 자료를 보고 물음에 답하시오. 단 저해제의 농도는 5mM이다. 단위 명시!!!.

a) V vs [S], 1/V vs 1/[S] 그림을 그리시오.

b)저해제가 없는 경우의 Km과 Vmax를 구하시오. c)A, B의 경우 저해의 종류는? 이유는?

d)A(경쟁), B(비경쟁)의 각 경우 저해제의 Ki값을 구하시오.

[1/S] 1/Vo A:1/Vo B: 1/Vo mM-1 (M-1s)*10-7 (M-1s)*10-7 (M-1s)*10-7

3.0 0.606 0.952 1.26 2.5 0.538 0.826 1.12 2.0 0.469 0.699 0.980 1.5 0.400 0.575 0.840 1.0 0.334 0.450 0.699 0.5 0.269 0.325 0.559

Km = 0.67mM, Vmax = 5.0*10-7Ms-1, x: 교점 : 1/(Km(1+[I]/ki)) = 0.67mM m [I]=5uM- ki = 11uM

Y intercept : 0.42*107Ms-1 = (1 + I/ki)/Vmax ki = 9.1uM