CHONDROGENIC DIFERENSIASI SEL STEM pluripotent

DARI kondrosit osteoarthritic DI MATRIX ALGINAT

Sel induk pluripoten diinduksi (iPSCs) memiliki potensi

untuk merevolusi terapi sel, namun tetap

jelas apakah iPSCs dapat dihasilkan dari manusia

osteoarthritic kondrosit (kontrasepsi oral) dan kemudian

diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi kondrosit. Pada saat

studi, kami meneliti potensi diferensiasi

Kontrasepsi oral menjadi iPSCs menggunakan faktor transkripsi didefinisikan

dan menjelajahi kemungkinan menggunakan OC-diturunkan

iPSCs untuk kondrogenesis. Penelitian kami menunjukkan bahwa

iPSCs dapat dihasilkan dari kontrasepsi oral dan bahwa iPSCs

bisa dibedakan dari manusia sel induk embrionik

(hESCs). Untuk mempromosikan diferensiasi chondrogenic, kita

Lentivirus digunakan untuk mentransduksi iPSCs unggulan dalam matriks alginat

dengan mengubah faktor pertumbuhan-β1 (TGF-β1) dan kemudian di

vitro co-kultur ini iPSCs dengan kondrosit. Gene

analisis ekspresi menunjukkan bahwa strategi combinational

mempromosikan diferensiasi iPSCs ditetapkan dalam

kondrosit dalam matriks alginat. Peningkatan ekspresi

tulang rawan-gen terkait, termasuk kolagen II, aggrecan, dan

tulang rawan oligomer matriks protein (COMP), dan penurunan

ekspresi gen dari penanda tulang rawan degeneratif,

faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF), yang diamati.

Hasil histologis mengungkapkan sulfat padat

ekstraseluler matriks dalam budaya co-TGF-β1-transfected

iPSCs dengan kondrosit dalam matriks alginat. Selain itu,

dalam kegiatan chondroinductive vivo juga dievaluasi.

Pemeriksaan histologi menunjukkan bahwa lebih baru tulang rawan

dibentuk dalam budaya co-TGF-β1-transfected iPSCs

dengan kondrosit dalam matriks alginat. Secara keseluruhan, kami

Data menunjukkan bahwa iPSCs dapat dihasilkan dari kontrasepsi oral oleh

defi ned faktor dan hasil strategi combinational di

secara signifikan meningkatkan kondrogenesis dari OC-diturunkan

iPSCs. Karya ini menambah pemahaman kita tentang potensi

solusi untuk masalah penggantian sel osteoarthritic.

Kata kunci: kondrosit, kondrogenesis, diferensiasi,

co-budaya.

pengantar

Artikular tulang rawan (AC) merupakan jaringan avaskular terdiri

kondrosit, bertanggung jawab untuk sintesis matriks berlimpah

dan pemeliharaan (Merceron et al., 2011). ketika rusak

karena kondisi traumatik atau patologis, AC tidak

sembuh secara spontan dalam keadaan fisiologis

yang menghasilkan Osteoarthritis (OA). OA adalah yang paling umum

muskuloskeletal penyakit pada orang tua, dan bisa menjadi

penyebab utama keempat kecacatan pada tahun 2020

(Reginster, 2002; Woolf dan PFL Eger, 2003; Koelling et

al, 2009.). Strategi pengobatan saat ini dibatasi

untuk bantuan jangka pendek gejala dengan farmasi

intervensi dan prosedur bedah (Lohmander dan

Roos, 2007). Dengan demikian, pengobatan kerusakan tulang rawan

menimbulkan tantangan klinis signifikan bisa. kemajuan terbaru

dalam kedokteran regeneratif menunjukkan bahwa menggunakan jaringan

rekayasa berbasis konstruksi untuk meningkatkan OA-tulang rawan

perbaikan dengan memobilisasi sel chondrogenic adalah menjanjikan

Pendekatan untuk restorasi struktur dan fungsi AC

(Dehne et al, 2009;. Hattori dan Ohgushi, 2009; Ahmed

et al, 2011.).

Sejumlah strategi telah digunakan untuk mengidentifikasi

potensial sel sumber untuk AC regenerasi. Hal ini secara luas

sepakat bahwa regenerasi jaringan dari sel-sel autologous dapat

dicapai dengan mengambil keuntungan dari program alami

embrio pengembangan (DeLise et al, 2000;. Tuan, 2004;

Ingber et al, 2006;. Goepfert et al, 2010).. Oleh karena itu,

sel induk autologous akan menjadi pilihan yang ideal (Yoshida

dan Yamanaka, 2010). Sel induk terutama klasifi ed

menjadi dua jenis sel: sel induk somatik dan pluripotent

stem sel. Somatik sel induk berada di berbagai organ

dan menunjukkan multipotency untuk menumbuhkan jaringan yang rusak,

tetapi terbatas pada potensi vitro proliferasi (Yoshida

dan Yamanaka, 2010). Oleh karena itu, sel-sel induk pluripotent berpotensi majemuk

mungkin menjadi sumber baik untuk regenerasi jaringan. hESCs, yang

sel pluripoten fi rst diisolasi dari embrio, memiliki tinggi

proliferasi potensial dan dapat menghasilkan dibedakan

keturunan dari semua tiga lapisan kuman embrio. Namun,

derivasi dari hESCs dari embrio awal menimbulkan

teknis dan etika keterbatasan untuk mereka gunakan dalam penelitian

dan klinik (Gaspar-Maia et al., 2011). direkayasa

sel induk, yang dikenal sebagai iPSCs, dihasilkan dari sel somatik

oleh transduksi defi ned pemrograman ulang transkripsi

faktor, biasanya Oct4, Sox2, KLF4, dan c-MYC, terbuka

baru jalan untuk menghindari kontroversi menggunakan hESCs

(Takahashi dan Yamanaka, 2006;. Takahashi et al, 2007).

Karena iPSCs memiliki tinggi proliferasi dan diferensiasi

kemampuan mirip dengan hESCs, mereka terus besar

potensi regeneratif obat (Itoh et al., 2011).

Bukti terbaru menunjukkan bahwa OC-larut disekresikan

morphogens dapat menginduksi diferensiasi dari chondrogenic

manusia sel induk mesenchymal (MSC) dalam 3-dimensi

(3D) lingkungan sementara mencegah mereka hipertrofik

diferensiasi (Aung et al., 2011). Selain itu, manusia kontrasepsi oral

menanggapi sama non-sakit terdiferensiasi passaged

kondrosit oleh strategi co-budaya (Ahmed et al.,

2010). Selain itu, sebuah laporan baru-baru ini menyarankan bahwa tulang

morphogenetic protein 4-mengekspresikan dedifferentiated

kondrosit pulih fenotipe chondrocytic in vitro

dan bahwa beberapa kondrosit terdiferensiasi dalam

situs cacat bisa menjalani redifferentiation dan bentuk

matriks yang ditampilkan pewarnaan toluidin biru untuk positif

glycosaminoglycans setelah transplantasi ke dalam sendi

(Lin et al, 2008.). Berdasarkan hal diatas ndings fi, kami percaya bahwa

Kontrasepsi oral cenderung untuk melayani sebagai sumber sel untuk generasi

dari iPSCs untuk digunakan dalam rekonstruksi AC rusak.

Dalam penelitian ini, kami menyelidiki apakah iPSCs dapat

dihasilkan dari kontrasepsi oral oleh ekspresi didefinisikan

transkripsi faktor dan apakah OC yang diturunkan iPSCs

dapat diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi kondrosit melalui

kombinasi lentivirus-dimediasi TGF-β1 transduksi

dan co-budaya AC dalam alginat perancah.

Bahan dan Metode

Tissue sumber dan persiapan

Jaringan tulang rawan fragmen Normal dan osteoarthritic

(Ruijin Rumah Sakit, Shanghai, Cina) dikumpulkan

menurut sebuah Institutional Review Board disetujui

protokol. Osteoarthritic tulang rawan sampel, tanpa tanda-tanda

keterlibatan arthritis, diperoleh dari lutut

sendi pasien didiagnosa menurut kriteria

American College of Rheumatology (Altman et al.,

Dengan OA setelah penggantian lutut total) 1990. kontrol yang normal

sampel tulang rawan yang diperoleh dari sendi lutut

pasien diamputasi dengan cedera parah. tissue sampel

yang fi xed dalam paraformaldehyde 4%, decalcifi ed dengan 10

% Asam ethylenediaminetetraacetic (EDTA, pH 7,4, Sigma-

Aldrich, St Louis, MO, USA), dan tertanam dalam paraffi n.

Paraffi n bagian diwarnai dengan hematoksilin / Eosin

(H & E) dan toluidin biru.

Kondrosit isolasi dan budaya

Kondrosit dari tulang rawan osteoarthritic dan sehat

dipanen setelah pencernaan selama 6 jam pada 37 ° C dengan

kolagenase I (152 U / mL; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),

kolagenase II (280 U / mL; Invitrogen), dan dispase (15

U / mL; Invitrogen) dan menjalani ltration berikutnya fi

melalui jala 40 pM sieve (BD Falcon, Franklin Lakes,

NJ, USA) (Koelling et al., 2009). Kontrasepsi oral dikultur

dalam medium Dulbecco yang dimodifikasi Eagle / Ham 's F-12

(DMEM/F-12, Invitrogen) medium dengan

10% janin bovine serum (FBS, Invitrogen). untuk mempertahankan

fenotipe chondrogenic, kondrosit yang normal adalah

dikultur dalam medium chondrogenic mengandung glukosa tinggi

DMEM, 20% FBS, deksametason 100 nM (Sigma-

Aldrich), 50 mg / mL askorbat-2-fosfat (Sigma-

Aldrich), (ITS insulin, transferin, dan asam selenous, BD),

dan 1% penisilin / streptomisin (Invitrogen). Sel yang diunggulkan di coverslips, fi xed dalam

paraformaldehyde 4% dan

diwarnai dengan toluidine biru.

lentiviral produksi

Vektor lentiviral dibangun dan dikemas, dan

titer virus diukur menurut laporan sebelumnya

(Honda et al., 2010). Manusia Oct4, Sox2, KLF4, c-MYC

dan TGF-β1 cDNA (Shanghai Bioteknologi Co, Ltd,

Shanghai, Cina) yang dimasukkan ke dalam pENTR / D-TOPO

entri vektor plasmid (Invitrogen). CDNA di pENTR /

D-TOPO kemudian ditransfer ke pCSII-EF-MCSIRES2-

Venus lentiviral Gateway vektor menggunakan plasmid

LR Clonase (Invitrogen). Vektor lentiviral pseudotyped

dengan virus stomatitis vesikuler glikoprotein G (VSV-G)

diproduksi oleh transfeksi transien dari tiga plasmid

ke sel 293T: kemasan plasmid (pCAG-HIVgp),

glikoprotein-dan VSV-G Rev-mengekspresikan plasmid

(pCMV-VSV-G-RSV-Rev), dan vektor lentiviral

plasmid. Supernatan kultur dipekatkan dengan menggunakan

ultrasentrifugasi, dan pelet virus itu resuspended dalam

Hanks 'seimbang garam solusi. Titer vektor ditentukan

oleh infeksi sel 293T dengan pengenceran seri dari virus

konsentrat ditambah dengan 1 mg / mL Polybrene

(Sigma-Aldrich) dan diikuti oleh fl uorescence-diaktifkan

sel menyortir analisis ditransduksi sel mengekspresikan

EGFP (manusia Oct4, Sox2, KLF4 dan c-MYC). titer

dinyatakan sebagai 293T-pentransduksi unit per mL.

iPSC induksi dan budaya

Sekitar 3 × 105 kontrasepsi oral yang ditransduksi selama 24 jam dengan

koktail lentiviral membawa GFP dan reprogramming

faktor (Oct4, Sox2, KLF4, dan c-MYC), dan berbudaya

selama 6 hari di DMEM (Invitrogen) mengandung FBS 10%.

Kemudian, sel-sel passaged ke feeder layer manusia

ketuban sel epitel (HAmEpiC) dan berbudaya selama 24 jam

di DMEM yang mengandung 10% FBS. Satu hari kemudian, media

diubah menggunakan media ESCs-mendukung dengan

tinggi glukosa DMEM, 15% FBS, 4 ng / mL dasar fi broblast

faktor pertumbuhan (R & D, Minneapolis, MN, USA), 2mm

L-Gin (Sigma-Aldrich), 1 × 10-4 M asam amino nonesensial

(Sigma-Aldrich), 1 × 10-4 M 2-mercaptoethanol (Sigma-

Aldrich) dan 1% penisilin / streptomisin (Invitrogen).

Setelah tiga minggu, iPSC manusia koloni dijemput,

dipisahkan dengan 0,05% tripsin-EDTA (Sigma-Aldrich)

pencernaan, berlapis ke piring budaya baru dan diidentifi kasi.

Semua ESC-seperti koloni dijemput dengan tangan dan klonal

diperluas.

Disutradarai diferensiasi iPSCs manusia ke spesifik c

sel keturunan in vitro

Selama 2-3 hari sebelum pengobatan, EBS yang diselenggarakan dalam

tiga media diferensiasi yang berbeda pada ultra-rendah piring.

Setelah langkah ini prakondisi, yang EBS dipindahkan

untuk gelatin-dilapisi 6-baik piring, berbudaya dalam diferensiasi

Media selama 14 hari dengan media berubah setiap lain

hari dan selanjutnya diproses untuk ekspresi gen

analisis dan histologi. 6-baik piring (Corning) adalah

dilapisi untuk setidaknya 30 menit pada suhu kamar dengan 0,1

% Gelatin (Sigma-Aldrich) di dH2O (1 mL per sumur).

Protokol diferensiasi dilakukan menurut

laporan sebelumnya (Miki et al., 2005). standar budaya

Media adalah DMEM dilengkapi dengan FBS 10%, 2 mM

L-glutamine (Sigma-Aldrich), nonesensial amino 1%

Asam (Sigma-Aldrich), 55 mM 2-mercaptoethanol (Sigma-

Aldrich), 1 mM natrium piruvat (Sigma-Aldrich), dan

1% antibiotik-antimycotic (Invitrogen). untuk pankreas

diferensiasi (endoderm), kami menggunakan standar

medium dengan nikotinamida (10 mM), karena

diferensiasi kardiomiosit (mesoderm), kami menggunakan

media standar dilengkapi dengan 1 mM asam askorbat

2-phosphate (Sigma-Aldrich), dan untuk diferensiasi saraf

(ektoderm), kami menggunakan media standar ditambah

dengan 5 × 10-5 M all-trans retinoic acid (Sigma-Aldrich) dan

fi broblast faktor pertumbuhan-4 pada 10 (R & D) ng / mL.

Sitokimia dan immunofl uji uorescence

Pewarnaan fosfatase alkali dilakukan menurut

dengan instruksi produsen menggunakan Alkaline

Fosfatase Deteksi Kit (Millipore, Billerica, MA,

USA). Untuk uji immunofl uorescence (Miki et al.,

2005), iPSCs dibedakan dan dibedakan mereka

derivatif adalah fi xed dalam aseton dingin selama 30 menit pada 4 ° C,

maka sel dibilas dengan PBS tiga kali dan diinkubasi

di agen protein memblokir selama 20 menit. sampel yang

diinkubasi dengan antibodi primer (Tabel 1) semalam

pada 4 ° C, kemudian dibilas dengan PBS tiga kali dan diinkubasi dengan Cy3-terkonjugasi

antibodi sekunder (R & D) untuk 2

jam pada suhu kamar. Dalam beberapa percobaan, sel-sel

dibilas dengan PBS dan dipasang pada pemasangan air

media yang mengandung counterstain DAPI nuklir (4,6

diamidino-2-phenylindole, Sigma-Aldrich). gambar yang

ditangkap menggunakan mikroskop Axio Observer A1 (Carl

Zeiss MicroImaging, Goettingen, Jerman).

teratoma pembentukan

IPSCs manusia disuntikkan intramuskuler ke obes

diabetes / berat gabungan kekebalan defi sien (NOD /

SCID) tikus (4 × 106 sel per situs). Setelah 4-6 minggu, semua tikus

(n = 3) dikembangkan teratoma, yang dihapus dan

diproses untuk pewarnaan H & E. Semua hewan percobaan yang

dilakukan sesuai dengan Panduan untuk Perawatan dan

Penggunaan Hewan untuk Tujuan Penelitian dan disetujui

oleh Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Perawatan Hewan Komite.

Transfeksi iPSCs dengan Lentivirus-TGF-β1

IPSCs manusia terinfeksi dengan lentivirus membawa RFP

dan TGF-β1 di hadapan polybrene (8 mg / mL) dan

berlapis ke feeder layer dari HamEpiC selama 5 hari, setelah

yang merah-fl iPSCs manusia uorescing dijemput dan

ditransfer ke gelatin-dilapisi 6-baik piring, di mana mereka

dikultur dalam medium DMEM yang mengandung FBS 20%.

Tingkat transfeksi diamati adalah sekitar 70% untuk iPSCs.

Co-budaya iPSCs transfected dengan kondrosit di

alginat matriks

The iPSCs transfected (iPSCs/TGF-β1) dibebaskan dari

substratum budaya dan resuspended pada konsentrasi

dari 0,417 × 106 sel / mL. Kemudian iPSCs/TGF-β1 yang diunggulkan

ke matriks alginat (Invitrogen) oleh pipetting yang

iPSCs/TGF-β1 suspensi (300 uL) ke matriks.

iPSCs/TGF-β1/alginate matriks (iPSCs/TGF-β1/Alginate)

konstruksi diinkubasi untuk 20 menit tambahan untuk memungkinkan

sel lampiran in vitro, dan kemudian komposit yang

unggulan ke piring budaya 24-baik dan dibudidayakan selama 12 jam.

Kondrosit normal dicerna, dihitung dan berlapis

dalam piring budaya 24-baik dengan kepadatan 1,25 × 105 sel dan

dikultur dalam medium chondrogenic selama 12 jam.

Setelah prosedur tersebut dilakukan, yang

Transwell insert (0,4 pM ukuran pori, Corning) yang berisi membangun iPSCs/TGF-β1/Alginate

itu dipasang ke

yang mengandung kondrosit dengan baik, yang digunakan

sebagai kelompok eksperimen (iPSCs/TGF-β1 / Alginat /

kondrosit). The co-kultur tumbuh di chondrogenic

media selama 14 hari.

Selain itu, kelompok paralel berikut adalah

dibudidayakan di media chondrogenic selama 14 hari: nontransfected

iPSCs / matriks alginat group (iPSCs / Alginat),

non-transfected iPSCs / matriks alginat / kondrosit group

(iPSCs / Alginat / kondrosit) dan iPSCs transfected /

alginat matriks kelompok (iPSCs / TGF-β1/Alginate) sesuai

sama prosedur (skematis tersedia dari

penulis atas permintaan).

Western blotting untuk TGF-β1 

Untuk confi rm Kehadiran dari TGF-β1 dalam lentivirus-dimediasi 

TGF-β1 ditransduksi iPSCs, western blotting dilakukan 

menggunakan kelinci antibodi anti-TGF-β1 poliklonal (ab53169, 

Abcam, Cambridge, Inggris). Protein diekstraksi dari 

non-transfected dan transfected iPSCs, dan protein 

konsentrasi ekstrak dinilai menggunakan Bradford 

assay kit. Kepadatan optik pada 595 nm diukur 

menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi protein 

adalah kurva standar yang diperoleh dari pengenceran serial 

bovine serum albumin. Ekstrak sel, dinormalisasi untuk 

total protein, diselesaikan dengan menggunakan polyacrylamide 

elektroforesis gel dan elektroforesis ditransfer 

ke membran nitroselulosa didukung. Setelah itu, 

membran tersebut diblokir di 5% non-lemak susu di 

Tris-buffered saline dengan Tween 0,1% (TBST) selama 3 jam 

dan diinkubasi dengan antibodi primer (1:500) pada 4 ° C 

semalam. Membran kemudian dicuci dengan TBST 

tiga kali selama 10 menit masing-masing, diikuti dengan penambahan anti-

kelinci IgG (1:5000) dan chemiluminescence ditingkatkan 

(ECL) visualisasi dari band.

Histologis analisis iPSCs-chondrogenic 

diferensiasi 

Semua sampel dikultur selama 14 hari dan fi xed di 4% 

paraformaldehida (pH 7,4, Sigma-Aldrich) semalam di 

suhu kamar, dan bagian yang diwarnai dengan toluidine 

biru. 

Analisis ekspresi mRNA menggunakan reverse 

transkripsi-polymerase chain reaction (RT-PCR) 

dan kuantitatif real-time PCR 

RNA total diisolasi menggunakan Trizol (Invitrogen). 

Konsentrasi RNA ditentukan dengan mengukur 

absorbansi pada 260 nm dengan spektrofotometer. 

Konvensional RT-PCR dilakukan dengan menggunakan superscript 

Satu-Langkah RT-PCR system (Invitrogen). Kuantitatif 

real-time PCR dilakukan dengan menggunakan SYBR hijau qPCR 

Supermix UDG (Invitrogen) dan dianalisis dengan 7300 

real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, 

CA, USA). Amplifi kation gen spesifik c dilakukan 

menggunakan primer ditunjukkan pada Tabel 2

Ektopik tulang rawan pembentukan

Lima-minggu-tua BALB / c tikus telanjang (Shanghai Jiaotong

University School of Medicine) yang dibius

menggunakan Sumianxin (2 mL / kg, Pertanian Universitas,

Changchun, Cina) secara intraperitoneal. itu

kelompok berikut dikultur dalam media chondrogenic untuk

14 hari in vitro: iPSCs / group Alginat, iPSCs / Alginat /

kondrosit kelompok, kelompok iPSCs/TGF-β1/Alginate dan

iPSCs/TGF-β1/Alginate / kondrosit kelompok sesuai dengan prosedur di atas.

Kemudian, empat kelompok ditanamkan

subkutan ke daerah dorsal dari tikus. semua

hewan percobaan dilakukan sesuai dengan

pedoman hewan institusional. spesimen dari

masing-masing kelompok dipanen 6 minggu setelah implantasi.

Eksplan dipanen dari tikus fi xed, dehidrasi,

dan tertanam dalam paraffi n. Bagian yang mengalami

imunohistokimia analisis kolagen tipe II (diencerkan

pada 1:100, 53047, Abcam).

analisis statistik

Hasil dilaporkan sebagai mean ± SD. Nilai dengan P <0,05

dianggap tidak bisa statistik signifikan.

hasil

Histologis analisis normal dan osteoarthritic

tulang rawan yang diturunkan sel

AC Sehat dipamerkan biasanya empat lapisan sel utuh

termasuk, dangkal transisi, radial dalam, dan

dalam calcifi ed zona (Gambar 1AA), dan seragam-didistribusikan

proteoglikan sebagai komponen matriks ekstraseluler utama

(Gbr. 1Ab). Tulang rawan osteoarthritic menunjukkan hilangnya

organel sel dan adanya garis sel dalam beberapa sel, dan beberapa sel

nekrotik (Gambar 1BA) serta

hilangnya proteoglikan (Gbr. 1BB). kondrosit terisolasi

dari sehat AC dipamerkan putaran khas, poligonal

bentuk (Gambar 1CA) dan memiliki kelimpahan proteoglycan,

matriks ekstraseluler komponen utama dari kondrosit

(Gbr. 1Cb). Kebanyakan kontrasepsi oral memiliki bentuk memanjang (Gbr.

1DA)

dan dipamerkan kehilangan proteoglikan (Gbr. 1dB).

Karakterisasi kontrasepsi oral manusia memprogram

Tujuh hari setelah transduksi dengan pemrograman ulang empat

faktor, koloni dengan morfologi ESC-seperti yang terlihat.

Setelah dua minggu, koloni dengan morfologi ESC-seperti

yang besar dan bulat, dengan batas-batas yang jelas. Untuk rm confi

bahwa pemrograman ulang dari kontrasepsi oral pasien telah terjadi dan

bahwa iPSCs diduga adalah pluripotent, kita diuji dengan

ekspresi penanda ESC dibedakan oleh RT-PCR

dan imunositokimia. RT-PCR hasil terungkap

bahwa dua dari iPSCs manusia diduga menyatakan banyak

diperkirakan penanda dari hESCs dibeda-bedakan, termasuk

OCT-4, SOX-2, REX-1 dan NANOG, yang tidak

dinyatakan dalam iPSCs diduga lainnya (Gbr. 2A). dua dari

tiga koloni dipamerkan fosfatase alkali yang kuat

kegiatan dan ESC-spesifik diekspresikan c penanda permukaan

termasuk NANOG, SSEA-1, SSEA-4, TRA1-60, dan TRA1-81 (Gambar 2B,

gambar yang ditampilkan adalah koloni C1.

Sebuah gambar dari koloni C2 tersedia dari penulis

atas permintaan). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa manusia

iPSCs mengungkapkan penanda pluripotent dan berbagi serupa

ekspresi gen profi le dengan hESCs.

Multipotency kontrasepsi oral manusia memprogram

Selanjutnya, kami mengevaluasi apakah iPSCs manusia bisa

berdiferensiasi menjadi jenis sel dari semua tiga lapisan kuman in vitro

melalui EB-dimediasi diferensiasi. Para iPSCs dari

pasien osteoarthritic dibentuk bola-berbentuk EBS dengan tinggi

efisiensi siensi (Gambar 3AA) dan kemudian mudah dibedakan menjadi

sel dengan morfologi yang beragam. immunocytochemical

analisis dari confi EBS rmed bahwa iPSCs manusia bisa

berdiferensiasi menjadi sel-sel dari semua tiga lapisan kuman, seperti

dibuktikan dengan ekspresi α-foetoprotein (AFP,

endoderm penanda), nestin (penanda ektoderm), dan desmin

(mesoderm marker) (Gambar 3AB, c, d).

Untuk menginduksi keturunan-diarahkan diferensiasi manusia

iPSCs in vitro, sebelumnya dilaporkan protokol diikuti

untuk diferensiasi endoderm, mesoderm dan ektoderm,

dan penanda diferensiasi terkait diuji oleh

konvensional RT-PCR (Miki et al., 2005) (Gambar 3B). manusia

iPSCs diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi pankreas yang

(endodermal) keturunan, dan sel dibedakan menyatakan PDX-1, PAX-6,

NKX2.2, dan insulin. manusia iPSCs

diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi jantung (mesodermal)

silsilah, dan sel dibedakan menyatakan gata-4,

NKX2.5, MLC-2A, dan MLC-2V. Akhirnya, manusia iPSCs

diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi saraf (ectodermal)

silsilah, dan dibedakan sel yang dikemukakan neuralrelated

spidol, seperti NSE, NF-M, MBP, GAD, dan

nestin. Data ini menunjukkan bahwa iPSCs manusia dapat

diinduksi langsung untuk berdiferensiasi menjadi jenis sel ketiga

kuman lapisan.

Pengamatan histologi (Gambar 3C, gambar yang ditampilkan adalah

dari koloni C1, gambar koloni C2 tersedia

dari penulis atas permintaan) menunjukkan bahwa teratoma

memiliki jaringan dari tiga lapisan kuman, termasuk gutlike

dan pernapasan seperti epitel (endoderm), tulang dan

otot jaringan (mesoderm), dan jaringan saraf (ektoderm).

Dalam diferensiasi vitro chondrogenic dari

memprogram kontrasepsi oral manusia

Mikroskop fluoresensi menunjukkan bahwa iPSCs muncul

hijau pada hari ke-5 (Gambar 4AA), sedangkan lentivirus-dimediasi

TGF-β1 iPSCs ditransduksi muncul merah (Gambar 4AB) pada hari

5 dan 14 hari (Gbr. 4ac). Peningkatan TGF-β1 ekspresi

para iPSCs ditransduksi itu confi rmed menggunakan western blotting

(Gbr. 4AD).

Analisis histologi menunjukkan bahwa iPSCs/TGF-β1 /

Alginat / kondrosit memiliki morfologi bulat, suatu

jelas rawan kekosongan dan ekstraseluler sulfat padat

matriks yang ternoda kuat untuk toluidin biru dibandingkan dengan

kelompok yang lain (Gambar 4B).

Real-time PCR dilakukan untuk menentukan status

diferensiasi iPSC pada tingkat transkripsi. Seperti yang bisa

terlihat pada Gambar. 4C, pada hari ke 14, ekspresi tulang rawan

spidol kolagen II, dan aggrecan COMP adalah signifi kan

lebih tinggi di iPSCs / TGF-β1/Alginate/chondrocytes dibandingkan

mereka kontrol budaya masing-masing termasuk iPSCs / Alginat,

iPSCs / Alginat / kondrosit dan iPSCs/TGF-β1/Alginate

(P <0,05), sementara itu kurang dari itu dalam positif

kelompok kontrol (kondrosit) (P> 0,05). ekspresi

faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF), penanda

kondrosit degeneratif, tinggi pada iPSCs / Alginat

dan iPSCs/TGF-β1/Alginate, sementara itu hampir nol

untuk iPSCs / Alginat / kondrosit dan iPSCs/TGF-β1 /

Alginat / kondrosit.

Dalam kondrogenesis vivo kontrasepsi oral manusia memprogram

Imunohistokimia pada 6 minggu mengungkapkan bahwa iPSCs

dalam kelompok berikut termasuk iPSCs / Alginat /

kondrosit, iPSCs/TGF-β1/Alginate dan iPSCs/TGF-β1 /

Alginat / kondrosit yang jelas dikelilingi oleh kolagen II-positif matriks

ekstraseluler, dan iPSCs bernoda

kuat untuk kolagen II di Alginat iPSCs/TGF-β1 / /

kondrosit kelompok dibandingkan dengan kelompok lain (Gbr. 5).

diskusi

The avascularity bawaan, cellularity rendah dan sel yang rendah

omset jaringan AC merupakan rintangan utama untuk

regenerasi alami menyusul cedera, karena itu,

pengembangan pengobatan yang memungkinkan sukses

regenerasi lesi tulang rawan untuk menghindari lanjut

degenerasi cacat artikular fokus utama merupakan

Tantangan (Giovannini et al., 2010). Banyak penelitian telah

meneliti kemampuan berbagai isyarat untuk mengganti atau

memperbaiki jaringan tulang rawan yang sakit atau rusak (Lin et al.,

2008; Goepfert et al, 2010;. Ahmed et al, 2011).. baru

Perkembangan dalam kedokteran regeneratif telah didorong

oleh penemuan iPSCs, yang didasarkan pada kapasitas mereka

berkembang biak dalam keadaan dibeda-bedakan, potensi mereka

untuk berdiferensiasi menjadi berbagai garis keturunan yang berbeda, dan

kemungkinan mereka menjadi terapi pribadi, memberikan

alternatif menarik untuk penggunaan sel induk dalam jaringan

engineering (Kusuma dan Gerecht, 2010). Dalam studi ini,

kami telah berhasil memprogram kontrasepsi oral manusia menjadi penuh

fungsional iPSCs oleh lentivirus-dimediasi transduksi dari empat faktor,

transkripsi Oct4 Sox2, KLF4, dan c-MYC. The iPSCs manusia dari

kontrasepsi oral ditampilkan hESC seperti

morfologi, mengungkapkan gen hESC penanda dan dimiliki

kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi semua tiga lapisan kuman in vitro

dan in vivo. Namun, masih belum jelas apakah OCderived

iPSCs dapat digunakan sebagai sumber sel tulang rawan rekayasa jaringan.

Saat ini, dua metode yang efektif digunakan untuk menginduksi

diferensiasi sel induk menjadi kondrosit:

penerapan faktor pertumbuhan dan co-budaya. Itu

Strategi tradisional telah menambah pertumbuhan spesifik

Faktor langsung ke media sel induk dibudidayakan dalam

3D lingkungan. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa hESCderived

EBS dalam hidrogel 3D mungkin membedakan

terhadap keturunan chondrogenic dalam ned defi kimia

media chondrogenic ditambah dengan TGF-β1 (Hwang

et al, 2006.). Baru-baru ini, hESCs dikultur dalam medium dengan

TGF-β1 menghasilkan tulang rawan-spesifik c matriks dan menunjukkan

Bukti potensi chondrogenic tanpa pembentukan EB

(Nakagawa et al, 2009.). Baru-baru ini, Gong et al. (2010)

menunjukkan bahwa micromass budaya hESCs pluripotent

mengalami langsung, cepat, progresif, dan secara substansial seragam

chondrogenic diferensiasi dalam medium yang mengandung BMP-2

ditambah TGF-β1. Semua ndings fi menunjukkan bahwa TGF-β1 memiliki

cant signifikan berpengaruh pada diferensiasi chondrogenic

dari ESCs manusia dan tikus. Namun, karena TGF-β1

protein tidak stabil karena pendek paruh in vitro, gen

pengiriman mungkin diperlukan untuk memberikan ekspresi protein

untuk waktu yang lama pada konsentrasi yang efektif (Chen et al.,

2011). Dalam penelitian kami, lentiviral-dimediasi TGF-β1 digunakan

untuk menginduksi diferensiasi iPSCs ke kondrosit.

RT-PCR Hasil penelitian menunjukkan ekspresi tulang rawan yang terkait

gen, termasuk kolagen II, aggrecan, dan COMP, dalam

TGF-β1-ditransduksi OC-berasal iPSCs, menunjukkan bahwa

mereka memperoleh potensi chondrogenic. Namun, VEGF

Ekspresi juga terdeteksi dalam TGF-β1-ditransduksi

OC-berasal iPSCs, menunjukkan bahwa TGF-β1-ditransduksi

IPSCs OC-diturunkan memiliki kecenderungan degeneratif. Pasien /

penyakit-spesifik c iPSCs menunjukkan beberapa fitur penyakit

rekapitulasi dalam kultur jaringan setelah diferensiasi diarahkan

dari iPSCs (Saha dan Jaenisch, 2009, Ye et al, 2009;. Liu et

al, 2010.), dan adalah mungkin bahwa proses serupa terjadi

dalam penelitian ini. VEGF ditemukan di zona hipertrofik

tulang rawan di lempeng pertumbuhan dan memainkan peran integral

dalam

endokhondral ossifi kation dan pertumbuhan longitudinal

Kerangka (Gerber et al, 1999;.. Pufe et al, 2004). VEGF adalah

sebagian besar menurunkan regulasi pada orang dewasa AC, tapi ini

angiogenik

Faktor diungkapkan oleh kondrosit sakit, seperti yang

di OA (Pufe et al., 2001). Oleh karena itu, penghambatan VEGF

Ekspresi kemungkinan besar akan berkontribusi pada diferensiasi

OC-berasal iPSCs ke kondrosit.

Co-budaya adalah metode lain yang digunakan untuk

diferensiasi sel induk menjadi kondrosit. Itu

Keuntungan utama dari co-budaya adalah bahwa autokrin

dan parakrin faktor disekresikan oleh satu jenis sel mudah

berinteraksi dengan jenis lain dari sel tanpa langsung sel-sel

kontak, sehingga meniru, sampai batas tertentu, secara in vivo

tulang rawan lingkungan di mana sel-sel yang ditransplantasikan adalah

dikelilingi oleh kondrosit pribumi yang berada dalam

jaringan (Mo et al, 2009;.. Aung et al, 2011). Selain itu,

memungkinkan untuk crosstalk seluler, instruksi, dan stabilisasi fenotipe

selular melalui kontak fisik langsung antara

reseptor permukaan sel yang berbeda, yang dapat menyebabkan

untuk transduksi lebih efisien dari sinyal molekul

koordinasi chondrogenic diferensiasi (Heng et al.,

2004). Co-kultur manusia MSC dengan manusia ACS memiliki

telah ditunjukkan untuk meningkatkan sifat mekanik dan

tulang rawan khusus ECM konten jaringan-rekayasa

tulang rawan terbentuk dari MSC unggulan dalam asam hyaluronic

(HA) dan hidrogel untuk mengurangi ekspresi kolagen

Tipe X oleh MSC, sebuah penanda penting hipertrofi MSC

(Bian et al., 2011). Co-kultur kuda MSC dengan matang

ACS meningkatkan ekspresi gen spesifik tulang rawan-c dan

menghasilkan produksi yang lebih homogen dalam ECM

tulang rawan co-kultur yang baru terbentuk (Lettry et al., 2010).

Selain itu, potensi chondrogenic dari hESCs bisa

ditingkatkan dalam kepadatan tinggi micromass pelet co-kultur

dengan kondrosit manusia iradiasi, dan co-budaya

mengakibatkan penurunan signifi kan potensi osteogenik

(Bigdeli et al., 2009). Dalam penelitian kami, diferensiasi OCderived

iPSCs diinduksi oleh co-kultur dengan ACS,

seperti yang ditunjukkan oleh ekspresi tulang rawan-spesifik c

gen. Meskipun tingkat tulang rawan-spesifik gen c di

co-budaya sistem lebih rendah daripada di transfected

OC-berasal iPSCs, VEGF ekspresi tidak terdeteksi,

mungkin karena penghambatan angiogenesis endogen

oleh faktor-faktor, termasuk metastatin, hadir dalam tulang rawan dewasa

jaringan (Musa et al, 1999;.. Liu et al, 2001).

Salah satu pendekatan yang mungkin untuk mengatasi individu

kekurangan dari sistem gen-transfer dan co-budaya di

diferensiasi OC-berasal iPSCs ke kondrosit

akan mencampur kondrosit manusia dengan TGF-β1-

ditransduksi OC-berasal iPSCs dalam sistem co-budaya.

Dalam co-budaya sistem kami, co-kultur yang TGF-β1-

iPSCs ditransduksi OC-diturunkan dengan ACs mempromosikan

diferensiasi OC-berasal iPSCs ke kondrosit oleh

meningkatkan ekspresi gen spesifik tulang rawan-c, menghambat

VEGF berekspresi dan mencegah degenerasi

kondrosit.

Untuk lebih memvalidasi kapasitas chondrogenic dari

memprogram kontrasepsi oral manusia, dalam studi in vivo dilakukan. di

Pembentukan tulang rawan ektopik bukti, langsung chondrogenic

diferensiasi dikumpulkan oleh imunohistokimia

studi kolagen II. Kolagen II, yang merupakan karakteristik

dari matriks tulang rawan, hadir pada tingkat yang lebih tinggi dalam

iPSCs/TGF-β1/Alginate/chondrocytes kelompok, dibandingkan

dengan yang di iPSCs / Alginat / group kondrosit dan

iPSCs/TGF-β1/Alginate kelompok. pemeriksaan histologis

dari iPSCs mengungkapkan pembentukan tulang rawan jelas tissue

dihasilkan dalam budaya co-TGF-β1-transfected OCderived

iPSCs dengan ACS dalam matriks alginat pada 6 minggu.

kesimpulan

Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahwa iPSCs dapat

dihasilkan dari kontrasepsi oral menggunakan defi faktor ned dan bahwa

in vitro co-budaya TGF-β1-transfected OC-diturunkan

iPSCs dengan ACS dalam hasil matriks alginat di signifi kan

peningkatan kondrogenesis dari iPSCs seperti yang ditunjukkan oleh

ekspresi gen profi les dan pewarnaan histologis.

Selain itu, dalam penelitian in vivo juga mengungkapkan jelas

jaringan tulang rawan yang terbentuk dalam budaya co-TGF-β1-transfected

iPSCs OC-diturunkan dengan ACs dalam matriks alginat.

Strategi combinational akan mempromosikan penggunaan iPSCderived

jaringan dalam rekayasa jaringan.

Ucapan Terima Kasih

Karya ini didukung oleh Program Inovasi

Shanghai Komisi Pendidikan Kota (No.

09YZ107) dan Program Penelitian Intramural dari

National Institutes of Health, National Cancer Institute.

Alginat adalah polimer linier organik polisakarida yang terdiri dari monomer α-L asam guluronat

(G) dan β-D asam manuronat (M), atau dapat berupa kombinasi dari kedua monomer tersebut.

[1] Alginat dapat diperoleh dari ganggang coklat yang berasal dari

genus Ascophyllum, Ecklonia, Durvillaea,Laminaria, Lessonia, Macrocystis, Sargassum,

dan Turbinaria.[1]

Lentivirus adalah salah satu genus virus dari famili Retroviridae yang dapat menyebabkan

penyakit pada manusia dan hewan mamalia.[1][2] Istilah Lentivirus berasal dari bahasa Latin "lenti"

yang berarti "lambat". Pemberian nama Lentivirus dikarenakan virus-virus tersebut dapat

menyebabkan infeksi secara lambat pada inang tertentu.[3] Yang dimaksud dengan infeksi lambat

adalah virus memerlukan waktu inkubasi yang lama (dalam hitungan bulanan atau tahunan)

untuk menyebabkan penyakit dan hal ini diikuti dengan kerusakan pada organ atau jaringan

tertentu hingga menyebabkan efek yang mematikan.[3] Genus ini memiliki beberapa ciri khusus

yaitu bersifat non-onkogenik (tidak menyebabkan kanker), memiliki selubung (envelope),

berukuran 100-130 nm, dan mempunyai materi genetik (genom) berbentuk RNA utas tunggal.[2] Salah satu anggota dari genus Lentivirus yang paling banyak dikenal adalah HIV.[2]

[sunting]Ciri-ciri

Dari segi biologis, Lentivirus hanya menginfeksi inang yang spesifik dan pada sebagain sel

tertentu dapat menyebabkan peleburan dan perbesaran sel yang disebut efek sitofatik. Infeksi

yang ditimbulkan dapat berupa infeksi laten atau persisten. Pada sel yang terinfeksi, terjadi

akumulasi atau penumpukan DNA komplemen (cDNA) virus yang berbentuk linear dan sirkuler.

Proliferasi adalah pertumbuhan atau berkembangbiakan pesat untuk menghasilkan jaringan baru, bagian, sel, atau keturunan

Teratoma adalah sebuah tumor jinak yang terbentuk dari sel germinal yangabnormal.

Teratoma juga dapat terbentuk dari sel-sel pluripoten normal seperti sel

induk embrionik ketika sel-sel itu disuntikkan ke tikus imunodefisiensi.

JARINGAN PENGUAT

Jaringan penguat disebut juga jaringan penyokong atau jaringan penunjang.

Yang termasuk jaringan penguat adalah :

1. Jaringan Ikat

Jaringan ikat terdiri dari serabut, sel-sel dan cairan ekstra seluler.Cairan ekstra seluler dan serabut disebut matriks.Fungsi jaringan ikat adalah mengikat atau mempersatukan jaringan-jaringan menjadi organ dan berbagai organ menjadi sistem organ, menjadi selubung organ dan melindungi jaringan atau organ tubuh.

Berdasarkan struktur dan fungsinya jaringan ikat dibedakan menjadi dua:

a. Jaringan ikat longgar

Ciri-ciri : sel-selnya jarang dan sebagian jaringannya tersusun atas matriks yang mengandung serabut kolagen dan serabut elastis.Jaringan ikat longgar terdapat di sekitar organ-organ, pembuluh darah dan saraf. 

Fungsinya untuk membungkus organ-organ tubuh, pembuluh darah dan saraf.

b. Jaringan ikat padat

Nama lainnya jaringan ikat serabut putih, karena terbuat dari serabut kolagen yang berwarna putih. Jaringan ini terdapat pada selaput urat, selaput pembungkus otot, fasia, ligamen dan tendon. 

Fasia adalah jaringan ikat berbentuk lembaran yang menyelimuti otot.Ligamen adalah jaringan ikat yang berperan sebagai penghubung antar tulang.Tendon adalah ujung otot yang melekat pada tulang. Fungsinya untuk menghubungkan berbagai organ tubuh seperti otot dengan tulang-tulang, tulang dengan tulang, juga memberikan perlindungan terhadap organ tubuh.

2. Jaringan Tulang Rawan (Kartilago)

Jaringan tulang rawan pada anak-anak berasal dari jaringan embrional yang disebut mesenkim, pada orang dewasa berasal dari selaput tulang rawan atau perikondrium yang banyak mengandung kondroblas atau pembentuk sel-sel tulang rawan. Fungsinya untuk menyokong kerangka tubuh.

Ada 3 macam jaringan tulang rawan :

a.Kartilago hialin

Matriksnya bening kebiruan. Terdapat pada permukaan tulang sendi, cincin tulang rawan pada batang tenggorok dan cabang batang tenggorok, ujung tulang rusuk yang melekat pada tulang dada dan pada ujung tulang panjang.Kartilago hialin merupakan bagian terbesar dari kerangka embrio juga membantu pergerakan persendian, menguatkan saluran pernafasan, memberi kemungkinan pertumbuhan memanjang tulang pipa dan memberi kemungkinan tulang rusuk bergerak saat bernafas.

Gbr. Kartilago hialin (dari embrio babi).

b.Kartilago fibrosa

Matriksnya berwarna gelap dan keruh. Jaringan ini terdapat pada perekatan ligamen-ligamen tertentu pada tulang, persendian tulang pinggang, pada calmam antar ruas tulang belakang dan pada pertautan antar tulang kemaluan kiri dan kanan. Fungsi utama untuk memberikan proteksi dan penyokong.

 

Gbr. Kartilago fibrosa (dari tulang lutut manusia).

c.Kartilago elastik

Matriksnya berwarna keruh kekuning-kuningan. Jaringan ini terdapat pada dawn telinga, epiglottis, pembuluh eustakius dan laring.

3. J aringan Tulang

Jaringan tulang terdiri dari sel-sel tulang atau osteon yang tersimpan di dalam matriks, matriksnya terdiri dari zat perekat kolagen dan endapan garam-garam mineral terutama garam kalsium (kapur). Tulangmerupakan komponen utama dari kerangka tubuh dan berperan untuk melindungi alat-alat tubuh dan tempat melekatnya otot kerangka.

Tulang dapat dibagi menjadi 2 macam :

a. Tulang keras, bila matriks tulang rapat dan padat.Contoh : tulang pipa. 

b. Tulang spons, bila matriksnya berongga.Contoh : tulang pendek. 

Blot Western adalah sebuah metode untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Imunoblot

menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli atau perubahan oleh jarak

polipeptida atau oleh struktur 3-D protein. Protein tersebut dikirim ke membran, di mana mereka

dideteksi menggunakan antibodi untuk menargetkan protein.