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C.I. MEDICINA DI LABORATORIOMicrobiologia ClinicaCL Medicina e Chirurgia – AA 2014-2015

Modulo 2: FASE ANALITICA – PRINCIPI DI TECNICHE DIAGNOSTICHE

Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-PescaraNuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)E-mail: [email protected]

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Diagnostica microbiologica

La diagnosi microbiologica è finalizzata alla ricerca ed alla identificazione dell’agente eziologico (ossia responsabile di una malattia infettiva). Tre tipologie:

DIAGNOSI DIRETTA, finalizzata a stabilire la presenza dell’agente patogeno, la sua identità e la sua sensibilità agli antibiotici, direttamente nel campione mediante:

1. esame microscopico

2. esame colturale (isolamento)

3. identificazione (a livello di specie)

4. antibiogramma

DIAGNOSI RAPIDA, per la identificazione rapida dell’agente patogeno, direttamente da campione oppure da coltura, mediante:

– ricerca di antigeni

– ricerca di sequenze geniche

DIAGNOSI INDIRETTA, tesa a rilevare la risposta immunitaria (anticorpale) dell’ospite all’agente infettivo.

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Diagnostica microbiologica

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Diagnosi DIRETTA

Esame microscopico

L’esame microscopico fornisce informazioni utili per:

– porre diagnosi presuntiva, a seguito della evidenziazione di microrganismi e delle loro caratteristiche (tintoriali, morfologia, disposizione);

– guidare le decisioni del Microbiologo (scelta di idonei presìdi diagnostici) e del Clinico (rapida formulazione della terapia “empirica”);

– stabilire la idoneità del campione (es. Bartlett’s score per espettorato).

Il campione può essere osservato:

– “a fresco”, ossia non fissato; adatto per la ricerca di microrganismi difficilmente colorabili/coltivabili e per lo studio di alcune proprietà biologiche (forma, organizzazione, motilità, reattività chimica e/o sierologica);

– previa fissazione (fisica o chimica) e successiva colorazione, per la ricerca “mirata” di specifici gruppi microbici/patogeni (colorazione Gram, Ziehl-Neelsen).

La scelta della tecnica microscopica da impiegare dipende dal patogeno di cui si sospetta la presenza:

– microscopia in campo chiaro

– microscopia in campo oscuro

– microscopia a contrasto di fase

– microscopia in fluorescenza

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Diagnosi DIRETTA

Esame microscopico: tecniche di osservazione

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da: Sherris et al, Microbiologia Medica

Esame microscopico

Microscopia in campo chiaro previa colorazione

Si esegue su campioni “fissati” (al calore o chimicamente).

La fissazione garantisce che: i) il materiale venga disteso ed essiccato, in modo che non venga rimosso dal vetrino nel corso dei successivi lavaggi; ii) le cellule vengano uccise per coagulazione (sicurezza biologica e maggiore penetrazione ai coloranti).

Tipologia delle colorazioni:

– semplici: prevedono l’impiego di un solo colorante (cristalvioletto, fucsina basica, blu di metilene). Forniscono informazioni limitate a morfologia e organizzazione cellulare.

– differenziali, prevedono l’impiego di più coloranti (Gram, Ziehl-Neelsen). Forniscono indicazioni riguardo alla:

• morfologia (cocchi, bastoncelli, cocco-bacilli, lanceolata)

• disposizione (catenelle, clusters, diplococchi)

• localizzazione intra/extra-cellulare del microrganismo

• presenza di microrganismi con particolari caratteristiche tintoriali (Gram+, Gram-, bacilli alcool-acido resistenti)

– speciali, in grado di fornire informazioni aggiuntive:

• verde malachite (endospore batteriche in Bacillus spp. e Clostridium spp.)

• colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina in Corynebacterium spp.)

• colorazione di Leifson (flagelli)

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Colorazione di Gram

Tecnica e principio

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1. cristalvioletto, per 1-2 min

2. lavare con acqua

3. soluzione iodio-iodurata di Lugol per 1-2 min

4. lavare con acqua

5. alcool-acetone per 10 sec (decolorazione)

6. lavare con acqua

7. safranina per 1-2 min

8. lavare con acqua e lasciare asciugare

9. osservazione

Colorazione di Gram: colorazione regressiva e differenziale

Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio (mordenzante) si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all’interno della cellula. Il decolorante condensa, per disidratazione, la struttura peptidoglicanica, che in tal modo «cattura» il complesso.

Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solvente lipidico, dissolvendo la membrana esterna della parete cellulare, permettendo così il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

Gram-variabilità: a volte, i batteri Gram+ possono divenire Gram- (non è possibile il contrario) a seguito di danno/modifica/riduzione/perdita della parete cellulare (esposizione ad antibiotici, età avanzata della coltura).

Colorazione di Gram

Osservazione microscopica

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Staphylococcus epidermidis(Gram-positivo)

Escherichia coli(Gram-negativo)

Bacillus spp.(Gram-variabile)

Enterococcus + Escherichia coli(Gram-positivo + Gram-negativo)

Colorazione di Gram

Utilità clinica

Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva)

– sulla base della morfologia ed organizzazione cellulare: in campioni fisiologicamente sterili (meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria) o quando il patogeno ha una morfologia caratteristica (gonorrea, spirochete, Borrelia vincentii, Fusobacterium fusiformis)

Indirizza le scelte terapeutiche

– rapida adozione di una terapia antibiotica empirica (ragionata)

Indirizza l’iter diagnostico, aiutando nella selezione dei presidi per l’isolamento colturale

– soprattutto nel caso di infezioni polimicrobiche

– suggerisce la necessità di adottare tecniche di coltivazione “non routinarie” (anaerobi, funghi)

Ausilio alla interpretazione dell’esame colturale

– angina di Vincent (spirochete, Borrelia vincentii, Fusobacterium fusiformis)

– nel paziente antibiotizzato

Idoneità del campione da sottoporre a coltura (es. espettorato)

– differenziazione delle cellule epiteliali da quelle infiammatorie

Informazioni sulla complessità eziologia dell’infezione

– infezioni poli/mono-microbiche

La informazione derivante dalla osservazione di un Gram, associata al quadro clinico, può orientare il comportamento del Clinico in attesa che sia noto l’esito dell’indagine colturale.

In alcuni casi (es. meningite, polmonite) questo può consentire di salvare la vita al paziente !9

non fornisce alcuna indicazione in campioni clinici in cui il patogeno non può essere differenziato dalla flora commensale autoctona (es. feci, escreato).

non è utile per la ricerca di:

– Mycoplasma spp. (per assenza di parete)

– Chlamydia spp., Rickettsia spp. (dimensioni troppo piccole)

– Mycobacterium spp. (M. tuberculosis, M. leprae) (incapacità dei coloranti a penetrare la parete cellulare a natura “cerosa” (acido micolico, lipidi-arabinogalattani, lipoarabinomannani)

I Micobatteri possono essere elettivamente colorati mediante:

Ziehl-Neelsen

Kinyoun (colorazione “a freddo”)

auramina od auramina-rodamina (colorazione con fluorocromi)

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Colorazione di Gram

Limiti

1. versare la fucsina fenicata (fucsina basica in acqua, alcool e fenolo)

2. fare evaporare il colorante alla fiamma per 5 min

3. lavare con acqua

4. decolorare (2 min, circa) con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante

5. lavare con acqua

6. contrastare con blu di metilene per 1-2 min

7. lavare con acqua

Osservare al microscopio

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Colorazione di Ziehl-Neelsen

Tecnica e principio

L’alcool-acido resistenza è la capacità di trattenere il colore anche a seguito di esposizione a decoloranti forti (acidi minerali forti, alcool).

Questa caratteristica è legata alla formazione aryl-metano-micolati tra la fucsina e gli acidi micoliciparietali, nonché alla formazione di altri complessi tra colorante ed altre strutture cellulari.

Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso

Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

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Colorazione di Ziehl-Neelsen

Osservazione microscopica

Il condensatore esclude la luce direttamente trasmessa, consentendo l’illuminazione del campione con luce obliqua o scattered. Solo la luce riflessa dalla cellula raggiungerà l’oculare.

I microrganismi appaiono circondati da un alone luminoso contro uno sfondo scuro.

Questa tecnica consente di aumentare il potere di risoluzione del microscopio ottico (passando da 0.20 a 0.10 µm), permettendo in tal modo la visualizzazione di microrganismi di più piccole dimensioni.

Infatti, essa viene utilizzata soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente colorabili o di piccole dimensioni:

– spirochete (Borrelia spp., Treponema spp.)

– leptospire

oppure per osservare strutture accessorie alla cellula:

– capsula (Cryptococcus neoformans)

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Esame microscopico

Microscopia in campo scuro

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Esame microscopico

Microscopia in campo scuro

Borrelia burgdorferi

Leptospira

Treponema pallidum

Cryptococcus neoformans. L’alone rifrangente indica la presenza di una capsula

Un’onda luminosa subisce un rallentamento in dipendenza della densità delle strutture attraversate. Le differenze nell’indice di rifrazione nei campioni sono convertite, nella immagine, in segnali luminosi di differente intensità. Ciò consente un maggiore contrasto e, quindi, una migliore visualizzazione di strutture non colorate (es. strutture intracellulari).

Usata soprattutto per protozoi e funghi, ma anche per batteri.

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Esame microscopico

Microscopia a contrasto di fase

lieviti batteri

Utilizza la luce UV: ad una pari a 200-400 nm le strutture sono analizzate in base alla fluorescenza che emettono nello spettro visibile.

Fluorescenza: capacità di alcuni composti (fluorocromi) di assorbire radiazioni elettromagnetiche di una certa e di emettere una frazione dell’energia assorbita con radiazione elettromagnetiche a superiore a quella assorbita.

I fluorocromi sono coniugati a Ab, per la ricerca di Ag (immunofluorescenza).

Tecnica impiegata soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente coltivabili:

– patogeni della alte vie respiratorie: virus influenzali (A e B) e parainfluenzali (1,2 e 3), Virus Respiratorio Sinciziale, Adenovirus, Coronavirus

– Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi

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Esame microscopico

Microscopia in fluorescenza

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Esame microscopico

Microscopia in fluorescenza

CoronavirusAdenovirusGiardia intestinalis

Mycobacterium tuberculosis Candida albicans

La colorazione negativa consiste nella colorazione di sottofondo con un colorante acido (nero nigrosina, inchiostrodi china). Viene generalmente usata per evidenziare la presenza della capsula in Cryptococcus neoformans (diagnosiliquorale differenziale).

La colorazione delle spore richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante (verde di malachite, fucsinafenicata) attraverso gli involucri sporali. Impiegata per la ricerca di Clostridium spp., Bacillus spp.

La colorazione dei flagelli impiega un mordenzante(precipitazione dei sali dell’acido tannico) per evidenziare la struttura flagellare, altrimenti invisibile (d: 12-30 nm).

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Esame microscopico

Colorazioni “speciali”

L’esame microscopico può fornire precise indicazioni diagnostiche (diagnosi presuntiva) qualora si esamini un materiale:

normalmente sterile o comunque proveniente da zone non comunicanti con l’esterno (liquido cefalo-rachidiano, essudato pleurico o peritoneale, materiale purulento proveniente da raccolte chiuse);

nella cui popolazione batterica “normale” non siano compresi batteri con i caratteri morfologici e/o tintoriali del batterio osservato.

Le informazioni desunte dall’esame microscopico sono inoltre importanti per orientare l’iter diagnostico:

restringere il campo di indagine (ricerca “mirata”);

scelta di adeguati presìdi diagnostici (es. terreni di coltura, temperatura ed atmosfera di incubazione);

stabilire la idoneità del campione (es. Bartlett’s score per espettorato).

Tuttavia:

L’esame microscopico è caratterizzato da scarsa sensibilità (104 cellule/ml di campione). Pertanto, un risultato negativo non esclude la presenza del patogeno.

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Esame microscopico

Significato diagnostico

I miceti ed i parassiti hanno dimensioni maggiori rispetto ai batteri. Pertanto, la loro osservazione non richiede generalmente la colorazione del campione ma una osservazione “a fresco”.

Tuttavia, si può ricorrere all’impiego di colorazioni per aumentare la sensibilità dell’osservazione:

– Calcofluor white (fluorescenza)

– KOH + blue cotone in lattofenolo (chiarificante e colorante per evidenziare le ife)

– iodio-ioduro di Lugol (per i protozoi, colora i nuclei e le strutture intracitoplasmatiche, ma inibisce motilità cellulare)

Nel caso della ricerca di miceti in campioni cheratinizzati (unghia, capelli), la componente cheratinosa deve essere dissolta previo trattamento del campione con una soluzione di KOH.

Nel caso dei protozoi, la ricerca microscopica:

– richiede la concentrazione del campione causa scarsa concentrazione dei protozoi (soprattutto quelli fecali) vengono di norma concentrati;

– è fortemente influenzata dalle modalità di raccolta del campione.

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Diagnosi DIRETTA

Esame microscopico per miceti e protozoi

Candida albicans

Giardia intestinalis

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Diagnosi DIRETTA

L’isolamento colturale è solitamente la tecnica di maggiore impiego nella diagnostica microbiologica.

Buona sensibilità:

– teoricamente, la presenza di una sola cellula vitale può portare ad un isolamento;

– la maggior parte dei batteri, nonchè miceti e protozoi, è in grado di crescere in adeguati terreni di coltura; di contro, i patogeni intracellulari (Chlamydia, Rickettsiae, virus) possono essere isolati soltanto in colture di cellule eucariotiche.

Massima specificità (100%)

L’isolamento colturale si articola nelle seguenti fasi (sequenziali):

1. scelta e preparazione dei terreni di coltura

2. semina del microrganismo

3. incubazione

4. lettura ed interpretazione dei risultati

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Diagnosi DIRETTA

Esame colturale (isolamento)

I terreni di coltura possono essere suddivisi in base allo stato fisico, chimico od in base alla tipologia di informazione che essi forniscono.

Sulla base dello stato fisico:

LIQUIDI (“brodi”), utilizzati soprattutto nei casi di campioni per i quali si prevede una bassa carica microbica (liquidi biologici, aspirati, etc.)

– Terreno liquido “classico“ (brodo normale o nutritivo)

• peptone (derivato dalla digestione parziale di proteine animali) 0,5%

• estratto di carne 0,3%

• NaCl (per rendere isotonico il terreno)

• tampone fosfato (PBS; pH 7,0)

• H2O

SOLIDI (“agarizzati”) in cui il brodo normale viene solidificato con agar (1.5-2%), polisaccaride acido estratto da alghe rosse tropicali del genere Gelidium.

Vantaggi:

– l’agar non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri;

– liquidi a temperature 80 °C, vengono aliquotati in contenitori sterili (capsule Petri) dove gelificano a temperature di 42-47 °C;

– consentono un esame qualitativo (aspetti coloniali macroscopici) e quantitativo (stima della carica batterica) dell’isolamento.

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Diagnosi DIRETTA

Isolamento di batteri e miceti: terreni

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Diagnosi DIRETTA

Isolamento di batteri e miceti: terreni liquidi e solidi

Terreni liquidi (brodi)

Terreni semi-solidi (agar)

Terreni in forma disidratata

I terreni di coltura possono essere suddivisi in base allo stato fisico, chimico od in base alla tipologia di informazione che essi forniscono.

Sulla base dello stato chimico:

– Terreni a composizione chimicamente definita: molto costosi, utilizzati esclusivamente per l’identificazione di batteri con particolari esigenze nutrizionali.

– Terreni a composizione chimicamente indefinita: di frequente utilizzo, contengono sostanze naturali (peptone, siero, sangue, estratto di lievito etc.).

– Terreni minimi: utilizzati di rado, contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto forma di sali inorganici, aggiunti a concentrazione nota.

– Terreni di arricchimento: più frequentemente utilizzati, contengono sangue, siero, estratto di lievito, infuso di cuore e cervello, carboidrati e amminoacidi per facilitare la crescita di microrganismi patogeni particolarmente “esigenti” dal punto di vista nutritivo.

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Diagnosi DIRETTA


Sulla base della tipologia di informazioni che forniscono, i terreni si suddividono in:

Terreni NON SELETTIVI: consentono la crescita batterica di gran parte delle specie note.

Terreni SELETTIVI: consentono la crescita di una (alcune) specie batteriche, inibendo la crescita delle rimanenti.

Terreni ELETTIVI: favoriscono la crescita di una o alcune specie batteriche, sebbene non inibiscano la crescita di altre.

Terreni DIFFERENZIALI: consentono di differenziare le specie batteriche sulla base delle loro caratteristiche biochimiche. Possono essere anche selettivi.

Alcuni terreni possono essere sia SELETTIVI che DIFFERENZIALI

Diagnosi DIRETTA


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Privi di inibitori, consentono la crescita della maggior parte delle specie microbiche. Tra i più frequentemente impiegati ricordiamo:

Agar sangue: contiene il 5% sangue montone/cavallo, evidenzia la attività emolitica:

– α-emolisi = emolisi parziale, dà luogo alla formazione di un alone verde intorno alla colonia per degradazione della bilirubina a biliverdina (streptococchi viridanti; S. pneumoniae, E. faecalis);

– β-emolisi = emolisi completa, dà luogo alla formazione di un alone trasparente intorno alla colonia (S. pyogenes, S. agalactiae, S. aureus);

– γ-emolisi = mancanza di emolisi (streptococchi viridanti, E. faecalis).

Agar cioccolato: contiene emoglobina (emina o fattore X), NAD (fattore V) e vitamine, per l’isolamento di germi “esigenti” dal punto di vista nutritivo (Haemophilus spp., Neisseriaspp., S. pneumoniae). Il caratteristico color cioccolato deriva dal trattamento termico del sangue che ne causa la emolisi e, quindi, il rilascio dei fattori di crescita.

Brodi nutrienti: a composizione chimica ricca, consente la crescita della maggior parte dei batteri (es. brodo di soia-caseina, infusione cuore-cervello, etc.)


Terreni NON SELETTIVI

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Esame colturale (isolamento)Terreni NON SELETTIVI

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Agar cioccolato

Questi terreni consentono la crescita di particolari specie microbiche grazie alla presenza di agenti selettivi, tra cui:

coloranti: cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica

antibiotici: con attività batteriostatica/battericida vs “contaminanti”

Vengono utilizzati per l’isolamento di microrganismi patogeni presenti in campioni prelevati da siti caratterizzati da una da flora microbica residente (ossia «contaminati»: cute, faringe, naso, intestino, vagina). Tra i più frequentemente utilizzati:

Cetrimide agar: contiene cetrimide, composto dell’ammonio quaternario, che inibisce la crescita di tutti i microrganismi eccetto P. aeruginosa.

Thayer-Martin agar (agar cioccolato addizionato di vancomicina, colistina, trimethoprimlattato e nistatina): selettivo per Neisseriaceae patogene.

MacConkey agar: contiene sali biliari e cristalvioletto, che inibiscono la crescita dei Gram-positivi; selettivo per Enterobacteriaceae.

Mannitol Salt agar: elevata concentrazione NaCl (7.5%), selettivo per stafilococchi.

SS agar (sodio citrato, sali biliari, verde brillante): selettivo per Salmonella e Shigella spp.

Terreni riducenti: solidi o liquidi, contengono composti chimici che si combinano chimicamente con O2 atmosferico fino ad esaurirlo (agenti riducenti: tioglicolato di sodio, acido ascorbico, etc.). Selettivi per gli anaerobi.


Terreni SELETTIVI

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Terreni SELETTIVI

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Contengono ingredienti in grado di differenziare particolari specie (o gruppi) microbiche sulla base della capacità di fermentare specifici carboidrati:

carboidrati (zuccheri);

indicatori di pH (rosso fenolo, rosso neutro, blu di bromofenolo).

La fermentazione del carboidrato causa il rilascio di prodotti acidi della via fermentativa causando una acidificazione del terreno, prontamente indicata dal viraggio dell’indicatore di pH (e della colorazione delle colonie).

Esempi:

Agar sangue (5% di montone oppure cavallo) per evidenziare la capacità di emolisi dei batteri: α-emolisi, β-emolisi, γ-emolisi.

MacConkey agar (cristalvioletto, lattosio, rosso neutro), differenzia specie lattosio-fermentanti (E. coli) da quelle non fermentanti (P. mirabilis, Salmonella spp, Shigellaspp.).

Mannitol Salt agar (mannitolo, rosso fenolo), differenzia specie mannitolo-fermentanti (S. aureus) dalle non fermentanti (stafilococchi coagulasi-negativi).

SS agar: i) tiosolfato di sodio e citrato ferrico consentono di evidenziare la produzione di solfuro di idrogeno da parte delle colonie di Salmonella con aree centrali nere; ii) lattosio, per evidenziare capacità fermentanti.


Terreni DIFFERENZIALI

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Esame colturale (isolamento)Terreni DIFFERENZIALI

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La semina del campione è finalizzata all’ottenimento di colonie isolate, ossia sufficientemente distinguibili, necessarie per la successiva caratterizzazione del ceppo (es. identificazione, antibiogramma). Pertanto, soltanto i terreni agarizzati possono essere utilizzati a tal fine. Il terreno da impiegare viene adeguatamente scelto sulla base della tipologia del campione prelevato e del sospetto diagnostico.

Esame colturale (isolamento)Semina del campione

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Tecnica di semina per isolamento:

1. deporre una piccola quantità di materiale patologico da esaminare al margine della piastra (se il materiale è molto denso, prima stemperarlo con soluzione fisiologica o brodo sterile).

2. mediante l’utilizzo di una spatola o di un’ansa, distribuire il materiale sulla superficie del terreno in modo da avere la formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di semina e colonie isolate nell’ultimo tratto.

Al fine di ulteriormente caratterizzare l’isolato (identificazione, testsantibiotico-sensibilità), una singola colonia verrà prelevata in sterilità, quindi coltivata nuovamente (sub-coltura) in adeguato terreno al fine di ottenere una coltura pura del microrganismo, ossia formata da cellule “clonali” (derivanti tutte dalla stessa cellula madre “progenitrice”).

Esame colturale (isolamento)Semina «per isolamento»

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Crescita polimicrobica: 3 tipi coloniali Crescita monomicrobica (coltura pura): 1 tipo coloniale

A seguito della semina del campione su opportuno terreno, esso verrà posto in un incubatore, in condizioni ottimali - in termini di temperatura, tensione di O2 e tempo - per la crescita del microrganismo.

TEMPERATURA

Psicrofili: da -10 a +20°C (optimum a 10-12°C; es. L. monocytogenes, 5-8°C).

Mesofili: da +10 a +50°C (optimum a 37°C; la quasi totalità dei batteri patogeni).

Termofili: da +40 a +70°C (optimum a 60°C).

Ipertermofili: da +65 a +110°C (optimum a 95°C).

Esame colturale (isolamento)Incubazione

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OSSIGENO

Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di O2 atmosferico (Micrococcus spp.).

Aerobi facoltativi: crescono meglio in condizioni aerobie che anaerobie (Staphylococcusspp., Bacillus spp., Escherichia coli, Enterococcus spp.).

Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di O2 atmosferico (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Fusobacterium spp., Bacteroides spp.).

Anaerobi facoltativi: crescono meglio in condizioni anaerobie che aerobie(Corynebacterium spp., Streptococcus spp.).

Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta tensione di O2, in atmosfera addizionata diCO2 (2-5%, H. pylori, H. influenzae, Neisseria spp.).

Il pattern di crescita osservato in terreno liquido è suggestivo per la richiesta di O2.


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Cappa (camera) per anaerobiosi

Giara per anaerobiosi

Per la ricerca di batteri anaerobi si ricorre all’utilizzo di sistemi «dedicati» in grado di assicurare l’ottenimento di una atmosfera anaerobica: incubatore (o cappa), in cui l’aria viene sostituita da

una miscela di H2, CO2 e N2. giara: contenitore in cui la presenza di un

catalizzatore (bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) favorisce, una volta umidificato, la reazione di H2 e O2 con formazione di H2O.

La giara può essere utilizzata anche per generare ambienti arricchiti per CO2 (microaerofilia).

Esame colturale (isolamento)Incubazione in anaerobiosi o microaerofilia

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pH

Acidofili: crescono a 2 < pH < 6; funghi e lieviti (pH 5 - 6).

Neutrofili: crescono a 6 < pH < 8 (la maggior parte dei batteri).

Alcalofili: crescono a 8 < pH > 9.5.

Ogni terreno di coltura è caratterizzato da un adeguato valore di pH. In alcuni casi è presenteanche un “sistema tampone” atto a contenere eventuali variazioni di pH.

Il pH è uno dei fattori che possono influenzare anche la attività in vitro di farmaci antimicrobici(antibiogramma).

La preparazione di un terreno viene effettuata secondo linee-guida che tengano contodell’opportuno valore di pH.


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TEMPO

La velocità di crescita media è una caratteristica peculiare della specie batterica considerata:

– Escherichia coli (e gran parte dei patogeni) 20-30 min

– Mycobacterium tuberculosis 18 h

– Treponema pallidum 33 h


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Gran parte dei batteri patogeni ha un tempo di duplicazione di circa 40-60 min.

Pertanto, la crescita di gran parte dei microrganismi “non esigenti” (a crescita rapida) si manifesta a seguito di almeno 10-12 h di incubazione in condizioni ottimali.

Tuttavia, esistono microrganismi di rilevanza clinica a crescita lenta (es. gruppo HACEK, M. tuberculosis, T. pallidum)

L’approccio metodologico diagnostico si basa sul sospetto diagnostico

Nella richiesta di esame diagnostico, il Clinico deve notificare al Microbiologo, per quanto possibile, l’eventuale sospetto per la presenza di patogeni “inusuali” per l’atmosfera richiesta (aerobiosi, anaerobiosi, carbossifilia, microaerofilia) o per una ridotta velocità di crescita.

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Ciò consente al Microbiologo di adottare un set di terreni “dedicati” e di prevedere adeguate condizioni di incubazione evitando, in tal modo, un risultato FALSAMENTE NEGATIVO.

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Diagnosi DIRETTA

Una volta ottenuta una coltura pura del microrganismo, si procede alla sua identificazione.

L’identificazione microbica prevede, generalmente, un approccio a due stadi.

ID PRESUNTIVA (preliminare). Si basa sulle caratteristiche macroscopiche e microscopiche principali del microrganismo.

I risultati della ID presuntiva vengono quindi confermati da prove secondarie (biochimica, sierologica, molecolari), quali quelle fornite dai sistemi d’identificazione commerciali (ID DEFINITIVA o FINALE).

Diagnosi DIRETTAPrincipi di identificazione

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La valutazione della probabile identificazione di un microrganismo deve, INOLTRE, sempre tener conto del sospetto diagnostico e dei rilievi clinici.

Identificazione PRESUNTIVA

Identificazione FINALE

ID PRESUNTIVA (preliminare). Si basa sulle caratteristiche principali del microrganismo:

– macroscopiche (colturali)

• tipo (aspetto) coloniale

• emolisi, motilità (sciamaggio), etc.

• crescita su terreni selettivi/differenziali

– microscopiche (morfologia, organizzazione)

• colorazione di Gram, Ziehl-Neelsen

– biochimiche:

• ossidasi, catalasi

La attendibilità delle prove primarie si basa principalmente sulla stabilità delle caratteristiche fenotipiche.

Diagnosi DIRETTAPrincipi di identificazione – ID PRESUNTIVA

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Identificazione “presuntiva”Aspetto macroscopico delle colonie

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irregolare, ramificata

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filamentoso

arricciato

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radiata

rugosa

concentrica

rilevata ondulata

anelli concentrici

raggrinzita

Identificazione “presuntiva”Aspetto macroscopico delle colonie

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Identificazione “presuntiva”Osservazione microscopica previa colorazione

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http://www.flickr.com/photos/albaraamehdar/4536

386236/in/photostream/

Identificazione “presuntiva”Attività emolitica

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da: Microbiologia e Microbiologia Clinica, R. Cevenini, V. Sambri, Piccin

Identificazione “presuntiva”Motilità cellulare

Fenomeno dello “sciamaggio” su agar sangue: tutte le specie del genere Proteus sono mobili per flagelli peritrichi.

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Identificazione “presuntiva”Prove biochimiche: catalasi ed ossidasi

Per l’identificazione dei microrganismi possono essere utilizzate numerose prove biochimiche. Alcune di loro, come la catalasi e l’ossidasi, sono rapide e di facile esecuzione e possono essere utilizzate per la differenziazione preliminare.

Catalasi. Il perossido di idrogeno si forma in alcuni batteri come prodotto finale del metabolismo ossidativo aerobico degli zuccheri ed è particolarmente tossico se ne si consente l’accumulo. L’enzima catalasi scinde il perossido d’idrogeno in acqua ed ossigeno gassoso.

Ossidasi. La prova dell’ossidasi è utilizzata per rilevare il sistema enzimatico citocromo-ossidasi intracellulare. Questo sistema è solitamente presente nei microrganismi aerobi che sono in grado di utilizzare l’ossigeno come accettare finale dell’idrogeno.

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Test della ossidasi:+ Pseudomonas- Shigella, Salmonella, Proteus

Test della catalasi:+ Staphylococcus- Streptococcus

Identificazione “presuntiva”Flow-chart diagnostica

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I risultati derivanti dalle prove primarie vengono quindi interpretati in maniera «integrata»- utilizzando «alberi» (flowcharts) diagnostici dicotomici – al fine di ottenere una ID PRESUNTIVA.

I risultati della ID presuntiva vengono, quindi, confermati da prove secondarie, quali quellefornite dai sistemi d’identificazione commerciali, al fine di ottenere una ID DEFINITIVA o FINALE.

I sistemi per la ID FINALE si basano su tests:

biochimici

sierologici

molecolari

Diagnosi DIRETTAPrincipi di identificazione – ID FINALE

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Nella identificazione biochimica, la determinazione di “specie” si basa sulla definizione delcorredo enzimatico del microrganismo in esame.

In particolare, si valuta la capacità di:

– metabolizzare specifici carboidrati, per via ossidativa (via aerobica) e/o per via fermentativa (viaanaerobica)

– produrre specifici enzimi

DNAsi (Proteus, Serratia)

citocromo-ossidasi (Pseudomonas)

ureasi (Proteus, Klebsiella, Enterobacter)

– produrre specifici prodotti metabolici

H2S (Salmonella, Proteus)

acetil-metilcarbinolo (Klebisella, Enterobacter, Serratia)

indolo (E. coli, Proteus vulgaris)

La valutazione dello spettro biochimico di un isolato viene effettuata mediante utilizzo di sistemi“manuali” od “automatizzati”.

Identificazione possibile in tempi rapidi (sistemi «automatizzati»: 4 - 6 h) oppure previaincubazione o/night (sistemi “manuali”: 16-20 h).

Identificazione “finale”Identificazione biochimica

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Identificazione biochimicaMetodo manuale: API (bioMérieux) Identification System

La avvenuta fermentazione degli zuccheri (glucosio, sorbitolo,mannitolo, saccarosio, etc.) e/o l’utilizzazione di altri substrati(urea, indolo, gelatina, citocromo-ox, etc.) viene rivelata dalviraggio di un indicatore di pH.

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incubazione

lettura risultati

interpretazione

L’interpretazione «integrata» dei tests genera un codicenumerico (biotipo) che verrà inserito in un database per ottenereuna identificazione a livello di specie corredata con il relativolivello di accuratezza.

semina

Identificazione biochimicaMetodo automatizzato: VITEK (bioMérieux)

Gram-positivi (GP)Gram-negativi (GN)Lieviti (YST) Bacillus spp. (BCL)Anaerobi, Corynebacterium (ANC)Neisseria, Haemophilus (NH)

Il sistema prevede l’utilizzo di una card su cui si trova una serie di pozzetti (30, circa) contenenti dei substrati biochimici (ID) od antibiotizzati (AST) in forma disidratata. Due tipologie di card: una per la identificazione (ID), l’altra per l’esecuzione dell’antibiogramma (AST). Non sono richiesti reagenti addizionali, riducendo così il rischio di errore. Il database del VITEK copre oltre 300 specie, di rilevanza sia clinica che industriale/alimentare. Possibilità di generare reports epidemiologici per monitorare trends relativi ad antibiotico-R ed eziologia.

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Identificazione “finale”Identificazione sierologica

Ha come obiettivo finale la ricerca di ANTIGENI specie-specifici, direttamente nel campione biologico esaminato o da coltura pura (previo isolamento), mediante l’impiego di anticorpi complementari.

Principali tecniche per l’identificazione sierologica:

Reazione di agglutinazione, reazione di rigonfiamento capsulare

Reazione di immunofluorescenza

Saggio immunoenzimatico (ELISA)

Saggio di immunocromatografia su membrana

Western blot

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Agglutinazione su vetrino

Prevede l’impiego di anticorpi specifici, ottenuti in un animale immunizzato, diretti verso il batterio, o suoi antigeni solubili, di interesse.

Reazione su vetrino per microscopia.

Ricerca di Salmonella, Shigella.

Agglutinazione al lattice

Si impiegano anticorpi legati (adsorbiti) a particelle di lattice (adsorbimento in fase solida). L’aggiunta dell’antigene provoca la agglutinazione delle particelle.

Utilizzata per ricercare gli antigeni polisaccaridici della capsula batterica. Costituiti da sequenze ripetitive di zuccheri, tali antigeni sono in grado di legare gli anticorpi in più punti (antigeni polivalenti).

Frequentemente utilizzata per:

– la ricerca di antigeni batterici (S. pneumoniae, H. influenzae, E. coli, N. meningitidis, C. neoformans) nel liquor ed urine (o relativi centrifugati);

– la identificazione degli streptococchi (S. pyogenes).

ID FINALE - Identificazione sierologicaReazione di agglutinazione

56negativo positivo

Ricerca di Haemophilus influenzae in un campione di liquor. Il campione viene cimentato con una sospensione diparticelle di lattice ricoperte di Abs specifici, diretti contro antigeni capsulari di H. influenzae. L’interazione tra Ag eAb causa un’immediata agglutinazione di particelle (epifenomeno) visibile ad occhio nudo.

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2: positivo1,3,4,5,6: negativi

Quellung reaction (reazione di Neufeld)

Alcuni batteri dotati di capsula possono essere identificati direttamente nel campione utilizzando siero immune contenente Abs anti-antigeni capsulari.

A seguito della formazione dell’immunocomplesso, si verifica un cambiamento conformazionale degli strati polisaccaridici capsulari e contestuale cambiamento dell’indice di rifrangenza e rigonfiamento capsulare visibile al batterioscopico diretto.

Impiegata per la ricerca di antigeni polisaccaridi capsulari di Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis (gruppi A, C), Haemophilus influenzae di tipo b.

ID FINALE - Identificazione sierologicaReazione di rigonfiamento capsulare

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L’esame diretto di materiali patologici - per la ricerca diretta di batteri, protozoi e virus – può essere eseguito mediante impiego di Abs marcati con fluorocromi.

Fluorocromo (es. Alexa Fluor, fluorescina): molecola in grado di essere eccitato da una luce ad una certa lunghezza d’onda (UV), quindi ri-emette una luce ad una lunghezza d’onda maggiore (nel visibile).

I fluorocromi sono legati ad Abs modificandone la capacità di legarsi ad uno specifico Ag.

L’impiego di Abs monoclonali aumenta la specificità dell’indagine:

– prodotti da cellule di ibridoma

– riconoscono un singolo epitopo

Tale tecnica è caratterizzata da:

– moderata sensibilità (falsa positività in presenza di muco o leucociti contenenti recettori Fc per legame con Abs marcati)

– costi elevati (attrezzatura)

– richiedere personale ad elevata qualifica

– rapidità di esecuzione

– elevata specificità (se si utilizzano Abs monoclonali)

Due tipi di immunofluorescenza: diretta vs indiretta

ID FINALE - Identificazione sierologicaReazione di immunofluorescenza

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IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA: Ab marcato con fluorocromo è applicato su una sezione di tessuto contenente Ag, quindi Ab in eccesso viene lavato e quello rimasto (legato all’Ag) viene visualizzato mediante microscopio a fluorescenza. Rapporto fluorocromo/Ag = 1. Sensibilità < IF indiretta.

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA: Ag viene inizialmente rilevato mediante aggiunta di Abprimario non marcato e, successivamente, con Absecondario anti-Abprimario marcato con fluorocromo. Poichè, Absecondario lega più epitopi siti nelle regioni costanti dell’Abprimario, questo porterà ad una amplificazione del segnale. Rapporto fluorocromo/Ag > 1. Sensibilità > IF diretta.

Identificazione sierologicaReazione di immunofluorescenza

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Immunofluorescenza DIRETTAApplicazioni diagnostiche

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Immunofluorescenza diretta: diagnosi di sifilide.

Immunofluorescenza INDIRETTAApplicazioni diagnostiche

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AA

C

B

D

Immunofluorescenza indiretta: A) Chlamydia trachomatis; B) Bordetella pertussis; C) Helicobacter pylori; D) Neisseria gonhorroeae.

La presenza di un Ag viene rivelata dall’utilizzo di un Ab legato ad un enzima in grado di catalizzare una reazione cromogenica.

1. si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con Abs specifici verso Ag da ricercare (immobilizzazione Ag su fase solida).

2. aggiunta di Ag (presente nel campione) che lega Ab immobilizzato.

3. lavaggio dei pozzetti (eliminazione eccesso Ab non legato).

4. aggiunta di un secondo Ab, diretto anch’esso contro Ag target, legato covalentementead un enzima (perossidasi, fosfatasi alcalina, -galattosidasi) (sandwich ELISA).

5. aggiunta di un substrato cromogeno.

La quantificazione avviene mediante tecniche spettrofotometriche, valutando l’intensità del viraggio, ossia del cambiamento di colore prodotto in risposta alla conversione enzimatica (perossidasi, fosfatasi alcalina, -galattosidasi) del relativo substrato cromogeno: [Ag] = k [intensità viraggio].

La reale concentrazione dell’Ag viene determinata per confronto con diluizioni standard dello stesso (curva di calibrazione).

L’utilizzo di Abs monoclonali ha enormemente aumentato la specificità del test ELISA.

Applicato nella ricerca di: virus respiratorio sinciziale umano, Rotavirus, Adenovirus enterici, Chlamydia trachomatis.

ID FINALE - Identificazione sierologicaSaggio immunoenzimatico (ELISA: enzyme-linked immunodsorbent assay)

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ID FINALE - Identificazione sierologicaELISA-test: diretto (sandwich) vs indiretto

La tecnica ELISA può essere applicata per la ricerca di : antigeni (ELISA diretta) anticorpi (ELISA indiretta)

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ID FINALE - Identificazione sierologicaWestern blot

1. Separazione degli Ags su gel di poliacrilammide in base al peso molecolare (elettroforesi).

2. Trasferimento degli Ags (bande elettroforetiche) su membrana di nitrocellulosa.

3. Incubazione Ags con Ab specifico.

4. Esposizione ad un Ab secondario (Ab primario) marcato con un enzima (perossidasi).

5. La formazione di immunocomplessi (e quindi la presenza dell’Ag ricercato) viene evidenziata dall’aggiunta di un substrato sul quale agisce l’enzima, che provoca la precipitazione di colorante.

Tra i tests sierologici più specifici, il Western blot consente la individuazione di una specifica proteina («target»). Le molecole antigeniche (proteine) presenti nel campione vengono dapprima separate, fissate su supporto solido («blotting») e, infine, incubate con Ab marcati per essere rivelate.

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Identificazione “finale”Identificazione molecolare

Un metodo molto specifico e sensibile per la identificazione dell’agente patogeno prevede la ricerca di caratteristiche (ossia specie-specifiche) sequenze di DNA o RNA, mediante:

– amplificazione genica

– ibridazione con una sonda

Tali tecniche di biologia molecolare rappresentano strumenti diagnostici molto potenti, in quanto ci consentono:

– la ricerca e la identificazione rapida di patogeni umani

– la ricerca di microrganismi a lenta crescita, difficilmente coltivabili, oppure non coltivabili

– la tipizzazione dei microrganismi a fini epidemiologici

– la ricerca di determinanti genici codificanti per la resistenza agli antibiotici,sebbene non possano sostituirsi ai saggi di antibiotico-sensibilità.

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Si basa sulla capacità della DNA-polimerasi di copiare un singolo filamento di DNA previo appaiamento dei primers, sequenze oligonucleotidiche fiancheggianti la sequenza “bersaglio”.

Ciascun ciclo consiste delle seguenti fasi:

1. denaturazione: separazione delle due eliche di DNA

2. annealing: appaiamento dei primers all’elica complementare

3. estensione: DNA-pol copia DNA bersaglio compreso tra primers

Al termine di ciascun ciclo, il numero delle sequenze di DNA bersaglio è raddoppiato.

25-40 cicli sono sufficienti per ottenere una quantità di DNA bersaglio evidenziabile mediante migrazione elettroforetica.

Principali svantaggi dell’indagine molecolare:

falsi-positivi: contaminazione “crociata” del campione con DNA controllo o proveniente da altri campioni;

falsi-negative: presenza di inibitori enzimatici;

non fornisce informazioni sulla vitalità microbica;

scarsa specificità: cross-reattività tra specie differenti;

necessità di una coppia di primers per ogni specie.

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Identificazione molecolarePolymerase Chain Reaction (PCR)

Multiplex-PCR: prevede l’utilizzo di diverse coppie di primers per la ricerca simultanea di più sequenze e, quindi, di diversi patogeni nello stesso campione.

Nested-PCR: permette di aumentare la specificità (e/o sensibilità) della reazione. Prevede l’esecuzione di due successive amplificazioni, di cui la seconda utilizza come stampo il DNA amplificato nella prima reazione e come primers degli oligonucleotidi che mappano regioni presenti all’interno del primo prodotto amplificato.

Ligase Chain Reaction (LCR): amplificazione della sondautilizzata per rivelare la sequenza genica di interesse.

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Identificazione molecolarePCR- based assays

Real-time PCR: consente di dosare il prodotto di amplificazione in tempo reale e nella fase esponenziale, quando non è ancora presente alcun fattore limitante la reazione.

Sensibile, ampio range dinamico (101 – 107; non richiede diluzioni del campione), limitate contaminazioni (no manipolazioni post-amplificazione)

Probe (5’ reporter dye; 3’ quencher dye) compreso tra due primers (sequenza complementare a target):

probe intatto: no amplificazione, no fluorescenza

probe tagliato da Taq-pol: amplificazione, emissione fluorescenza

intensità di fluorescenza = k (accumulo prodotto PCR)

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Strand Displacement Amplification (SDA): amplificazione isotermica (52.5°C), in cui al taglio (per

restrizione) del DNA segue la sintesi del filamento da parte di DNA-pol, rimuovendo lungo il percorso il filamento che viene trascritto, mentre il filamento restante serve successivamente da stampo per nuove amplificazioni. Le fasi di taglio e di polimerizzazione/rimozione si ripetono ciclicamente producendo copie complementari a singolo filamento del DNA target. Infine, la ibridizzazione del probe specifico con il prodotto di amplificazione ne modifica la conformazione sterica consentendo l’emissione di un segnale fluorescente.

Applicata per la identificazione di: Micobatteri, appartenenti ai complessi “tubercolare” e “avium-intracellulare” Legionella pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Chlamydiaceae

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Sonda molecolare: sequenza di acido nucleico a singolo filamento [RNA (rRNA) oppure DNA] complementare rispetto ad una sequenza caratteristica di uno specifico patogeno (reazione di ibridazione).

La sonda può essere marcata con enzimi, molecole chemiluminescenti, radioisotopi, consentendo in tal modo la rivelazione dell’ibrido «sonda-target» da parte di sistemi automatizzati.

Tre tipologie di ibridazione:

in fase solida: sonda adsorbita su substrato (dot-blot, northern-blot, southern-blot)

in fase liquida: sonda in soluzione (molto rapida vs fase solida)

in situ: utilizzo di sonde marcate con fluocromo

La reazione di ibridazione può essere applicata su diverse tipologie di campioni: colonie batteriche (dot), preparazioni di DNA purificato (southern, fase liquida), campioni clinici (in situ).

Elevata specificità

Buona sensibilità (sebbene minore vs tecniche di amplificazione): consente di rivelare la presenza di 104-106 copie della sequenza target. Più efficace se applicata alla coltura che non su campione clinico.

L’impiego di sonde molecolari è piuttosto diffuso per la ricerca di patogeni difficilmente coltivabili e/o identificabili con altre tecniche: Micobatteri, Chlamydia, Legionella, Mycoplasma; genotipizzazione di HPV (DNA-Hybrid Capture).

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Identificazione molecolareSonde molecolari

Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamente immobilizzato su un supporto solido (es. membrana di nitrocellulosa) ed ibridato con una specifica sonda a DNA a singolo filamento marcata, per facilitarne la successiva rivelazione (dot blot). In alternativa, differenti frammenti di DNA con diverso peso possono essere separati attraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti su membrane per l’ibridazione con sonda e rilevazione (Southern blot). Se si utilizzano molecole di RNA separate mediante elettroforesi, si parla di Northern blot.

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Identificazione molecolareTecniche di ibridazione molecolare

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Identificazione molecolareTecniche in fase solida – dot blot

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Identificazione molecolareTecniche in fase solida – southern blot

Identificazione molecolareTecniche in fase solida – northern blot

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Frequentemente utilizzate in sezioni incluse in formalina/paraffina.

DNA viene denaturato senza alterare la morfologia cellulare o tessutale.

Sensibilità influenzata dalla capacità della sonda di penetrare nella cellula (meglio se di piccole dimensioni, < 500 basi).

Particolare e frequente applicazione: Fluorescent In Situ Hybridization – FISH

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Identificazione molecolareTecniche di ibridazione in situ

<Restriction fragment length polymorphism (RFLP): la digestione del DNA per mezzo di enzimi di restrizione, seguita da ibridazione con differenti sonde geniche, genera patterns specie-specifici (ossia caratteristici di unaspecie microbica).

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Identificazione antigenica: LPSLimulus test

Il Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test («gel-clot test») consente di repertare, in tempi rapidi (15-20 minuti), la presenza nelle urine di basse concentrazioni di microrganismi Gram-negativi.

Questo test utilizza la peculiarità del lisato di amebociti (cellule circolanti nell’emolinfa) di gelificare in presenza di tracce (0.0001 ug/ml) di LPS

reazione enzimatica: attivazione LPS-indotta di una del lisato; coagulazione della proteina (coagulogeno) del lisato

specifico e sensibile (90-95%) per ricerca Gram-negativi

non in grado di evidenziare la presenza di batteri Gram-positivi

utilizzato su liquor, plasma, siero, liquido articolare, urine

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11692214Limulus polyphemus

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Diagnosi DIRETTA

NOTA BENE:Per la trattazione dell’antibiogramma, si rimanda al Modulo 3:«ANTIBIOGRAMMA: TECNICHE PER LA DETERMINAZIONE E INTERPRETAZIONE «CRITICA» DEL RISULTATO»

Diagnosi INDIRETTA

Finalizzata a rilevare una risposta immune umorale (anticorpale) specifica dell’ospiteall’agente infettivo, mediante:

A. Reazione di fissazione del Complemento

B. Reazione di agglutinazione

C. Test immunoenzimatico (ELISA)

D. Saggio in immunofluorescenza (IF)

E. Saggio radioimmunologico (RIA)

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La diagnosi INDIRETTA di una infezione microbica (batterica, virale, fungina, protozoaria) mira a rivelare una risposta immunitaria umorale specifica dell’ospite all’agente eziologico.

E’ più tardiva di quella DIRETTA, in quanto si può ricorrere ad essa soltanto quando si sia sviluppata la reattività immunitaria dell’ospite:

– IgM, normalmente transitorie ed indicative di una infezione primaria e recente. In alcuni casi possono persistere a lungo (fino a 6-12 mesi).

– IgG, compaiono più tardivamente, raggiungendo un picco dopo 3-6 settimane dall’infezione. Per questo è buona norma ricercarle in campioni successivi (primo: entro 5-10 giorni dall’infezione; secondo: 3-4 settimane dopo). Spesso persistono per tempi prolungati. Sono indicative di una infezione pregressa od attiva (se titolo anticorpale è aumentato di almeno 4 volte nei due campioni successivi).

Non è sempre possibile porre diagnosi indiretta (es. in pazienti anergici).

Diagnosi INDIRETTA

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Pertanto, le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico soltanto quando sia impossibile ricercare l’agente eziologico con le tecniche dirette (es. isolamento colturale difficoltoso o non possibile).

L’accertamento indiretto, non comportando l’isolamento del germe, preclude la possibilità di saggiare la antibiotico-sensibilità dell’agente etiologico.

Diagnosi sierologicaCinetica della risposta anticorpale

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Diagnosi sierologica

La sierologia è utile per valutare il timing (recente o pregressa) ed il decorso dell’infezione (primaria vs reinfezione, acuta vs cronica).

SIEROCONVERSIONE: inizia quando si ha la produzione di anticorpi a seguito di infezione primaria. Consiste nella comparsa di anticorpi specifici (IgM o IgG) a seguito di un test precedente negativo.

Presenza di IgM specifiche°, nelle infezioni acute o nella fase acuta di infezioni persistenti.

Aumento di IgG in assenza o lieve aumento di IgM, nelle reinfezioni (risposta anamnestica).

Presenza di IgA sieriche specifiche, nelle infezioni subacute o croniche.

La positività per IgM deve essere associata a sintomi clinici compatibili e/o ad un test positivo per IgG specifiche a bassa avidità.

La sieroconversione e la reinfezione sono indicate da un aumento del titolo anticorpale di almeno 4 volte tra fase acuta e convalescenza:

– primo campione: prelevato entro 7-10 giorni dalla presunta esposizione (contatto con un soggetto infetto) o dalla comparsa della sintomatologia dell’infezione acuta (esantema) (fase acuta);

– secondo campione: prelevato dopo circa 2-3 settimane (fase convalescente).

I due campioni devono essere esaminati nel corso della stessa seduta analitica per dimostrare l’aumento del titolo anticorpale.

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PRINCIPIO: capacità del Complemento di legarsi agli immunocomplessi.

METODICA:

– il siero del paziente viene “scomplementato” (privato del Complemento) (30 min, 56°C);

– diluizioni del siero inattivato vengono cimentate con l’antigene, in presenza di Complemento “fresco” (di coniglio) aggiunto in quantità nota;

– se nel siero del paziente sono presenti anticorpi specifici questi si legano all’antigene ed il Complemento si lega all’immunocomplesso;

– si aggiunge un “sistema rivelatore ” (eritrociti di montone + anticorpi anti-eritrociti di montone):

• se il siero del paziente è positivo (cioè contiene anticorpi contro l’antigene) gli eritrociti rimarranno integri, in quanto il Complemento si è legato al primo immunocomplesso;

• se il siero del paziente è negativo (cioè non contiene anticorpi contro l’antigene) gli eritrociti verranno lisati, in quanto il Complemento si lega all’immunocomplesso eritrocita+anticorpo anti-eritrocita. La reazione si evidenzia con liberazione di emoglobina.

Diagnosi INDIRETTAA. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

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Un classico esempio applicativo della FC è la reazione di Wassermann, per la diagnosi di sifilide, in cui si ricercano Abs anti-Ag lipidico o cardiolipina.


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Nella reazione di Fissazione del Complemento (FC) la lisi del globulo rosso indica una reazione negativa, mentre l’assenza di lisi è indice di positività per la presenza di anticorpi. In figura è riportata una reazione FC per evidenziare anticorpi anti-Coxiella burnetii (agente eziologico della polmonite atipica). Nella linea superiore usando diluizioni di un siero in fase acuta, il Complemento è stato fissato solo nei primi 5 pozzetti (il titolo dell’anticorpo è 32), mentre con il siero convalescente nella seconda linea non c’è lisi dei globuli rossi per tutte le diluizioni di siero e quindi il titolo dell’anticorpo è maggiore di 512. In questo caso un aumento di 4 volte nel titolo del siero tra la fase acuta e di convalescenza è indicativo dell’infezione da Coxiella burnetii.


Titolo anticorpale = reciproco della più alta diluizione positiva alla fissazione

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Campione da fase ACUTA

Campione da fase CONVALESCENZA

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Diagnosi INDIRETTAB. TEST DI AGGLUTINAZIONE

Titolo anticorpale = reciproco della più altadiluizione positiva all’agglutinazione

L’antigene corpuscolato consiste di una sospensione di microrganismi, cellule (emazie) o particelle uniformi (lattice) sulle quali sono adsorbiti gli antigeni.

Diluzioni scalari (2-fold) del siero vengono cimentate con una quantità fissa di antigene.

In presenza di siero positivo, ossia contenente gli anticorpi specifici, la formazione di immunocomplessi si evidenzia con la formazione di aggregati (agglutinazione).

Classici esempi applicativi del test di agglutinazione sono le reazioni di Widal(diagnosi di salmonellosi) e di Wright (diagnosi di brucellosi)

IF DIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto marcato con un fluorocromo (isotiocianato di

fluorescina) ed il siero, opportunamente diluito, viene messo ad incubare con l’antigene.

IF INDIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto ed il siero, opportunamente diluito, viene

messo ad incubare con l’antigene. Successivamente si aggiungono anticorpi anti-immunoglobuline

umane, prodotti in animali e coniugati con isotiocianato di fluoresceina.

Se il campione è positivo, all’osservazione microscopica esso risulterà fluorescente grazie alla

formazione dell’immunocomplesso marcato (fluorocromo associato all’antigene).

Diagnosi INDIRETTA C. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

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Indirect fluorescent antibody (IFA) test. The fluorescence indicates that the patient serum being tested contains antibodies that are reacting with the antigen preparation (here, Plasmodium falciparum parasites).

Today, the indirect fluorescent antibody test (IFA) provides the only means by which an infection by Elrichiosis can be confirmed. The IFA is useful because it identifies the presence of host antibodies directed against the invading pathogen. However, false negatives may arise due to a prolonged delay of a host's immune response.

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Diagnosi INDIRETTA D. Test immunoenzimatico (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)

Si impiega l’antigene fissato su una superficie di plastica (piastra) per catturare e separare l’anticorpo specifico dagli altri anticorpi presenti nel siero del paziente.

L’anticorpo fissato viene quindi evidenziato dall’impiego di un anticorpo anti-IgG umanolegato covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasi alcalina, -galattosidasi).

La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso la valutazione dell’intensità del colore prodotto in risposta alla conversione enzimatica del relativo substrato cromogeno.

La reale concentrazione dell’anticorpo viene determinata per confronto con diluizioni standard dell’anticorpo stesso.

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Diagnosi INDIRETTA E. SAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO (Radioimmunoassay, RIA)

Marcatura dell’antigene (anticorpo) mediante radioisotopo (es. iodio-125)

Rivelazione del corrispondente anticorpo (antigene)

Può essere utilizzato come saggio di cattura (come ELISA), oppure di competizione.

Nel saggio di competizione, la quantità di un anticorpo viene misurata sulla base della sua capacita di competere con un un anticorpo-radiomarcato (in dotazione al kit) per il legame con l’antigene, spiazzandolo dai complessi antigene-anticorpo.

Misurazione della quantità di radioattività associata all’anticorpo.

Il rischio associato all’utilizzo di radioisotopi ne ha limitato la diffusione a vantaggio dei saggi ELISA.

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c.i. medicina di laboratorio microbiologia clinica · · 2015-05-04c.i. medicina di laboratorio...

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