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C.I. MEDICINA DI LABORATORIOMicrobiologia ClinicaCL Medicina e Chirurgia – AA 2014-2015
Modulo 1: FASE PRE-ANALITICA
Giovanni Di Bonaventura, PhD
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-PescaraDipartimento di Scienze Mediche, Orali e Biotecnologiche
Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)E-mail: [email protected]
Laboratorio di Microbiologia ClinicaObiettivi
Obiettivo principale del Laboratorio di Microbiologia Clinica è quello di fornire la diagnosi eziologica di una malattia infettiva, ossia di identificare l’agente patogeno responsabile della malattia, allo scopo principale di suggerire un appropriato trattamento terapeutico.
La attività del Laboratorio di Microbiologia Clinica è inoltre finalizzata alla:
valutazione della efficacia terapeutica (monitoraggio o follow-up)
sorveglianza dell’andamento dell’antibiotico-resistenza
individuazione di «portatori sani» (potenziale fonte di contagio)
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Il Laboratorio di Microbiologia Clinica fornisce, quindi, un sostanziale ed imprescindibile supporto alla diagnosi, al trattamento ed alla prevenzione delle malattie infettive, siano esse sostenute da patogeni franchi (in soggetti normoreattivi) che da patogeni opportunisti (in soggetti con difese compromesse).
Lo studio della Microbiologia Clinica deve pertanto essere finalizzato alla:
Conoscenza delle potenzialità diagnostiche del Laboratorio di Microbiologia per la individuazione/realizzazione di una terapia mirata (che si basi sulle evidenze di laboratorio) delle malattie da infezione e per la individuazione di adeguate strategie di prevenzione.
Acquisizione di informazioni epidemiologiche, su scala nazionale e locale, necessarie per ottenere utili indicazioni per la individuazione e l’avvio di una terapia ragionata (empirica) in attesa della refertazione definitiva:
– ruolo ed incidenza dei singoli microrganismi nella eziopatogenesi delle diverse malattie da infezione, sia in ambito comunitario che nosocomiale;
– livelli di antibiotico-resistenza dei microrganismi in differenti ambienti:
• circolazione (diffusione) dei determinanti genetici di resistenza.
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Medicina di LaboratorioPeculiarità della Microbiologia Clinica
La diagnostica di laboratorio delle malattie infettive presenta alcuni aspetti di peculiarità nell’ambito delle Discipline di laboratorio che possono essere così riassunti:
– forte influenza della fase pre-analitica sul risultato;
– individuazione dell’agente causa della malattia (patogeno);
– interazione tra due sistemi biologici (ospite vs microrganismo).
Nella Microbiologia Clinica ci si trova di fronte all’unico esempio diagnostico che ci consente di “isolare, coltivare e conservare” l’agente responsabile di una patologia, per poterlo poi eventualmente valutare a fini tassonomici, epidemiologici e terapeutici.
L’aspetto peculiare più rilevante della diagnostica microbiologica è che il risultato contenuto nel referto non è un numero, un valore, una quantità, ma assume un significato biologico derivante dal rapporto che si instaura tra due sistemi biologici: il microrganismo e l’uomo.
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Percorso diagnostico
L’isolamento, la identificazione e la caratterizzazione genotipica/fenotipica (es. antibiogramma) di un patogeno è il risultato di un percorso diagnostico che si articola in più fasi:
Fase PRE-ANALITICA:
– Richiesta di indagine
– Prelievo del campione
– Conservazione del campione
– Trasporto del campione
– Accettazione del campione
Fase ANALITICA:
– Esecuzione dell’esame
– Validazione del risultato
Fase POST-ANALITICA:
– Refertazione del risultato
– Elaborazione statistica
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Turn-Around Time (TAT)
Definizione “classica”: intervallo di tempo che intercorre tra il momento in cui il Clinico prescrive l’indagine ed il momento in cui egli prende visione del referto (risposta).
Definizione “laboratoristica”: intervallo di tempo che intercorre tra accettazione del campione e refertazione indagine (tempo analitico).
Più recentemente si è anche parlato di TTAT (Therapeutic Turn-Around Time): intervallo di tempo che intercorre tra il momento in cui il Clinico richiede un test e quello in cui il risultato di quest'ultimo gli consente di prendere una decisione di valore clinico.
Riferibile al singolo test diagnostico od alla tipologia di Laboratorio, il TAT viene utilizzato come indice di performance di un Laboratorio (es. TAT di “eccellenza” per il Laboratorio di urgenza = 1h).
La riduzione del valore del TAT – e, conseguentemente, l’aumento della qualità del servizio diagnostico - è un obbiettivo di non facile raggiungimento soprattutto a causa della complessità e della numerosità dei fattori che, nel loro insieme, lo determinano.
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Fase pre-analiticaDefinizione ed importanza
La Fase pre-analitica “… ha inizio, in ordine cronologico, con la richiesta dell’esame da parte del Clinico, prosegue con la preparazione del paziente, la raccolta del campione primario, il suo trasporto al Laboratorio e termina all’avvio delle procedure analitiche …”
In Microbiologia Clinica, la fase pre-analitica è un momento diagnostico di estrema importanza, in quanto:
– in questa fase si registra la maggior parte degli errori diagnostici (in particolare, campioni non rappresentativi dell’infezione oppure prelevati in maniera errata);
– rappresenta un fondamentale momento di interfaccia tra il Laboratorio e le altre «parti» interessate al processo (stakeholders: paziente, familiari, medico, fornitore, contribuente);
– indirizza la ricerca microbiologica, condizionandone le modalità (iter diagnostico, tecniche di analisi) utilizzate per la lavorazione del campione.
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Nella fase pre-analitica bisogna, quindi, (pre)occuparsi di come il Laboratorio sia in grado di rispondere ai bisogni di chi vi si rivolge
International Standard ISO 1518B9 2003 (E). «Medical laboratories - Particular requirements for quality and competence”.
Fase pre-analiticaProcesso analitico
1. Richiesta del Clinico (scelta degli esami; indicazione delle informazioni cliniche)
2. Informazione e Preparazione del Paziente
3. Raccolta del campione
4. Identificazione del campione
5. Trasporto del campione in laboratorio
6. Accettazione del campione (check-in)
FASE ANALITICA FASE POST-ANALITICA
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Il rapporto di interdipendenza tra la fase pre- e post-analitica collega, in una catena di qualità, chi fornisce il prodotto “in entrata” (le modalità di prelievo vanno definite in rapporto alla tipologia di campione ed alla sua conservazione) e chi lo fornisce “in uscita” verificandone il corretto utilizzo (l’interpretazione dei dati è influenzata non solo dalla correttezza della risposta ma anche dalla congruità della richiesta). Da ciò ne consegue una ottimizzazione del flusso di lavoro orientato ad una maggiore efficacia diagnostica.
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Processo analitico
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da: C. Gaccione, Azienda Ospedaliera di Cosenza, U.O.C. Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare
Fase pre-analiticaResponsabilità della Unità Operativa di degenza
La UO di degenza o la struttura che effettua il prelievo è direttamente responsabile della:
corretta raccolta del campione;
adeguata identificazione del campione;
corretta compilazione del modulo di richiesta di indagine;
invio (tempestivo) del campione al Laboratorio. Qualora ciò non fosse possibile, è anche responsabile della:
temporanea conservazione del campione, secondo modalità indicate nei protocolli redatti e forniti dal Laboratorio di Microbiologia.
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Necessità di disporre di un MANUALE DI RACCOLTA DEI CAMPIONI PRIMARI
Fase pre-analiticaResponsabilità del Laboratorio di Microbiologia
Redigere, per i Responsabili dei prelievi, un manuale di raccolta dei campioni primari contenente istruzioni scritte specifiche per la corretta raccolta:
– lista degli esami effettuabili
– modulo di consenso informato (dove richiesto)
– informazioni e istruzioni da fornire al paziente per la raccolta
– informazioni per gli utilizzatori sulle indicazioni cliniche e sulla appropriatezza nella scelta delle procedure analitiche disponibili
– PROCEDURE per:
• preparazione dei pazienti (istruzioni per infermieri e prelevatori)
• identificazione del campione primario
• raccolta del campione con descrizione di contenitori/additivi necessari
– ISTRUZIONI per:
• compilazione della richiesta cartacea o elettronica
• tipo e quantità del campione da prelevare
• timing di raccolta (se richiesto)
• tutte le manipolazioni necessarie tra il momento del prelievo e consegna in laboratorio (es. refrigerazione, riscaldamento, consegna immediata)
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Fase pre-analitica Responsabilità del Laboratorio di Microbiologia
– ISTRUZIONI su:
• etichettatura del campione
• registrazione dell’identità del prelevatore
• conservazione dei campioni esaminati
• limiti di tempo per richiesta di esami aggiuntivi
• possibili esami aggiuntivi
Monitorare la osservanza ed applicazione delle procedure/istruzioni.
Essere disponibili a fornire ulteriori chiarimenti o le indicazioni che, di volta in volta, si dovessero rendere necessarie. In particolare:
– indicazioni nella scelta delle indagini (favorendo quelli ad elevato potere predittivo)
– modalità di raccolta
– interpretazione dei risultati
– informazioni epidemiologiche
Il personale del Laboratorio è responsabile della segnalazione di “non conformità” relative al prelievo/campione.
Il Responsabile della Microbiologia:
– deve organizzare la formazione e l’aggiornamento del personale relativamente al Manuale, nonché la verifica e l’aggiornamento dello stesso.
– esegue una post-analisi accurata: meno microrganismi, più interpretazioni, eventualmente commentate.
– interagisce con il Clinico al fine di individuare la reale eziologia ed una terapia adeguata. 12
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Responsabilità del Laboratorio di MicrobiologiaEsami urgenti
Sebbene tutte le indagini di laboratorio dovrebbero rivestire carattere di urgenza vista la loro finalità, soltanto in alcuni casi gli esami possono essere considerati “urgenti” in senso stretto, in quanto critici per la sopravvivenza del paziente in tempi rapidi.
Campioni considerati “urgenze microbiologiche”:
– liquor cefalo-rachidiano (sospetta meningite)
– tamponi (sospetta difterite)
– infezioni di tessuti molli (sospetta mionecrosi, fascite necrotizzante)
– feci (sospetto colera)
– campioni aspirati, prelevati durante TAC od in sede operatoria
I campioni urgenti avranno la precedenza nell'iter diagnostico e saranno quindi processati PRIMA di quelli “routinari”.
Il Laboratorio deve predisporre una procedura scritta per le modalità di richiesta e di trasmissione al servizio degli esami urgenti, nel rispetto dei criteri di tracciabilità.
La procedura deve includere dettagli sulla specifica evidenza nel modulo di richiesta e sul campione primario, le modalità di trasferimento del campione all’area analitica del laboratorio, del processamento rapido e dei criteri particolari di refertazione da seguire.
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Fase pre-analiticaProcesso analitico
1. Richiesta degli esami di laboratorio
2. Informazione e Preparazione del Paziente
3. Raccolta del campione
4. Identificazione del campione
5. Trasporto del campione in laboratorio
6. Accettazione campioni (check-in)
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FASE PRE-ANALITICA1. Richiesta degli esami di laboratorio
Il ricorso alle prestazioni del Laboratorio deve essere sempre ragionato.
Nella preliminare formulazione del sospetto diagnostico e nella scelta del campione da prelevare, il Clinico deve:
– inquadrare clinicamente ed epidemiologicamente l’infezione,
– localizzare l’infezione sulla base della conoscenza del ciclo biologico del possibile patogeno
– conoscere l’algoritmo diagnostico per confermare il sospetto clinico;
– conoscere le metodologie diagnostiche in uso e la loro efficacia (sensibilità e specificità);
– ricordare che non è sempre possibile ricercare routinariamente tutti i microrganismi in un determinato materiale;
– è possibile limitare la spesa sanitaria (riduzione del numero di tests di laboratorio, minore ospedalizzazione);
– bisogna evitare la richiesta di esami con valore diagnostico improbabile o discutibile (ossia non confermato dalla letteratura).
– seguire un approccio diagnostico con il «dubbio del saggio», condividendo con il Microbiologo la correttezza di una scelta.
Considerata la limitata disponibilità di risorse economiche, la valutazione del rapporto costo-beneficio dovrà essere quindi tenuta in sempre maggiore considerazione dal Clinico in ogni sua scelta, inclusa quella di ricorrere all’ausilio del Laboratorio.
Pertanto, sono da evitare richieste generiche del tipo “esame colturale delle feci” o “esame del tampone faringeo” o “ricerca di germi comuni”, ossia prive del sospetto diagnostico. «POCO e MEGLIO» è spesso più vantaggioso che «DI PIU’». 15
FASE PRE-ANALITICA1. Richiesta degli esami di laboratorio
La richiesta (prescrizione) di accertamenti microbiologici è giustificata nei seguenti casi:
diagnosi di forme clinicamente atipiche od iniziali;
determinazione nella patologia infettiva ad etiologia definita,
valutazione della sensibilità ai farmaci;
nelle sindromi polieziologiche, per indicazioni terapeutiche (sempre, in assenza di specifiche informazioni epidemiologiche);
nel paziente immunocompromesso, per indicazioni terapeutiche (quasi sempre necessarie);
in ogni caso, per valutazioni epidemiologiche indispensabili per:
– lo studio della circolazione locale dei microrganismi;
– identificare i fattori di rischio;
– adottare idonee misure preventive;
– definire un corretto approccio diagnostico e terapeutico.
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FASE PRE-ANALITICA1. Richiesta degli esami di laboratorio
Principali informazioni da riportare nella richiesta (ISO 1518B9):
Nome del Medico richiedente
Nome, cognome, data di nascita, sesso del Paziente
Data e ora della raccolta del campione
Sospetto diagnostico
Tipologia di campione e sito anatomico di prelievo (ove sia necessaria la precisazione)
Esame(i) richiesto(i)
Eventuale pericolosità biologica del campione (epatite, HIV, pertosse, difetrite, etc.)
Informazioni cliniche rilevanti per il Microbiologo Clinico: terapia (antibiotica, immunosoppressiva) in atto, presenza di dispositivi protesici (es. cateteri)
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RICHIESTE VERBALI (ISO 1518B9)Il Laboratorio deve predisporre una procedura scritta per le richieste verbali di esami.Occorre definire se, in casi particolari, vengono accettate richieste telefoniche e con quali specifiche modalità, che possono essere giustificate dall’urgenza dell’esame o dalla necessità di ulteriori approfondimenti diagnostici. Dovrebbero comunque essere valutate ed accettate da un Dirigente del Laboratorio. La richiesta deve, in qualsiasi caso, essere documentata appena possibile.
FASE PRE-ANALITICA1. Richiesta degli esami di laboratorio
Un aspetto importante della richiesta è quella che ci permette di ottenere la tracciabilitàdel campione (ISO 1518B9), ossia poter disporre della documentazione che permetta di verificare la bontà dell'intero processo analitico.
A tal fine, tutti i campioni primari (ovvero aliquote di campione) devono essere accompagnati da una richiesta rispetto alla quale devono essere “rintracciabili”.
I campioni non correttamente identificati non debbono essere accettati o processati dal Laboratorio.
In casi particolari, quali quelli relativi a campioni di difficile prelievo o a facile deperimento (es. liquor, biopsie, etc.), il Laboratorio può processare il campione anche in assenza di richiesta, salvo poi a refertare soltanto dopo che il Clinico richiedente, od il prelevatore, si sia assunto la responsabilità dell’identificazione, apponendo la propria firma sulla richiesta (cartacea od elettronica).
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FASE PRE-ANALITICA
Richiesta del Clinico
Informazione e preparazione del Paziente
Raccolta del campione
Identificazione del campione
Trasporto del campione in laboratorio
Accettazione campioni (check-in)
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FASE PRE-ANALITICA2. Informazione e preparazione del Paziente
Il Paziente deve essere informato sulle procedure per la raccolta di un campione “appropriato”.
Bisogna garantire il rispetto della privacy del Paziente: solo così si otterrà il suo consenso e la sua collaborazione.
– nel caso in cui il Paziente è parte attiva nel prelievo (raccolta domiciliare, in assenza di personale sanitario), esso deve essere adeguatamente istruito non soltanto sulle corrette modalità di prelievo, ma anche sulla conservazione e trasporto del campione.
– esempi di raccolte domiciliari «critiche»:
• urine, tecnica del “mitto intermedio”
• urine, raccolta delle 24 h
• feci
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FASE PRE-ANALITICA
Richiesta del Clinico
Informazione e Preparazione del Paziente
Raccolta del campione
Identificazione del campione
Trasporto del campione in laboratorio
Accettazione campioni (check-in)
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FASE PRE-ANALITICA3. Raccolta del campione clinico
Modalità di raccolta (prelievo) e tipologia di campione:
A. Prelievo diretto: da siti normalmente sterili (ascessi profondi, polmone, fegato, sangue, liquor) mediante varie tecniche (agoaspirato, biopsia chirurgica, etc.). Invasivo, ma di più facile interpretazione; richiede assistenza medica.
B. Prelievo indiretto: essudati infiammatori (espettorato) o campioni (urine) che, prima di essere raccolti, attraversano siti contaminati da flora commensale. Solitamente più vantaggiosi per Clinico ed il Paziente (non invasivi), sono però di difficile interpretazione.
C. Prelievo da siti colonizzati da flora commensale: sito primario dell’infezione caratterizzato da flora autoctona (faringe, intestino crasso). Diagnosi microbiologica difficoltosa: ricerca “selettiva” di patogeni (es. Salmonella, Shigella, Campylobacter nelle feci; S. pyogenes nel tampone faringeo).
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La selezione del campione per porre diagnosi di infezione virale è più semplificata in quanto la contaminazione da altri virus è, solitamente, scarsa; inoltre, la tecnica solitamente utilizzata per la ricerca dei virus (amplificazione genica) è scarsamente influenzata dalla eventuale presenza di contaminanti.
Campione clinico: porzione di materiale biologico da sottoporre ad indagine per verificare la presenza/assenza di specifici microrganismi a rilevanza clinica.
FASE PRE-ANALITICA3. Raccolta del campione clinico
Ad ogni campione biologico è associato un potenziale rischio biologico per la salute degli operatori sanitari.
Le modalità attraverso cui un operatore può acquisire una infezione al momento del prelievo/trasporto sono:
inalazione (aerosol)
inoculazione percutanea (oggetti acuminati)
ingestione
contatto
Durante il prelievo è, quindi, necessario utilizzare i dispositivi per la protezione individuale (DPIs) atti a contenere il rischio biologico:
guanti
camice
occhiali
visiera
mascherina
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FASE PRE-ANALITICA3. Raccolta del campione clinico
Affinchè l’indagine microbiologica fornisca notizie clinicamente utili è innanzitutto necessario che il materiale biologico (campione), dal quale inizia l’iter diagnostico, sia appropriato, ossia rappresentativo della patologia sulla quale si indaga.
In particolare, il campione appropriato deve essere:
– di tipologia adeguata (QUALE);
– raccolto nel momento giusto (QUANDO);
– prelevato da un distretto corporeo rappresentativo della malattia (DOVE);
– prelevato in quantità sufficiente per l’esecuzione dell’indagine diagnostica (QUANTO);
– raccolto in asepsi, ossia in maniera da evitarne la contaminazione (COME).
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3. Raccolta del campione clinicoAPPROPRIATEZZA del campione: «quale»
Il campione deve essere di tipologia adeguata.
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3. Raccolta del campione clinicoAPPROPRIATEZZA del campione: «quando»
Il campione deve essere prelevato nel momento giusto, ossia quello in cui il patogeno è altamente concentrato e, quindi, più facilmente riscontrabile:
nella fase acuta della malattia, quando l’agente eziologico è presente in maggiori quantità:
– patogeni del circolo ematico (prelievo ematico al picco febbrile);
– Orthomyxovirus (primissimi giorni di infezione);
– leptospiremia (prima settimana di malattia).
le secrezioni mattutine (urine, escreato) sono più concentrate e, quindi, contengono un maggior numero, per unità di volume, di agente eziologico.
in caso di rilascio intermittente del microrganismo da parte dell’ospite (tubercolosi renale, giardiasi) è necessario un campionamento ripetuto.
prima dell’inizio di una terapia antimicrobica, quando possibile, oppure a seguito di interruzione della stessa da almeno 48-72 h. La terapia può, infatti, causare risultati «falsi negativi»:
– gli antibiotici interferiscono con la crescita microbica e, quindi, sull’esito dell’indagine diagnostica (isolamento colturale, in particolare);
– meningite “decapitata”: liquor negativo al microscopico e colturale causa terapia in atto;
Se il paziente è sottoposto a trattamento antibiotico per altra forma morbosa concomitante o nel caso di terapia empirica che non è possibile sospendere, è necessario avvertire il Laboratorio indicando nella richiesta lo schema terapeutico impiegato [tipologia antibiotico(i), posologia, modalità di somministrazione]. Il Microbiologo cercherà di limitare l’effetto antibatterico mediante l’adozione di accorgimenti tecnici (resine, carbone, etc.)
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3. Raccolta del campione clinicoAPPROPRIATEZZA del campione: «dove»
Il campione deve essere prelevato da un distretto corporeo rappresentativo dell’area infetta.
L’importanza della sede di prelievo:
– identifica l’esatto punto della sospetta infezione;
– consente la scelta più appropriata dei presidi diagnostici (es. tipologia dei terreni di coltura, atmosfera di incubazione);
– fornisce indicazioni sulla tipologia (specie) di microorganismi che possono avere, in quella sede, un ruolo eziopatogenetico;
– permette di decidere se eseguire indagini aggiuntive.
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3. Raccolta del campione clinicoAPPROPRIATEZZA del campione: «dove»
Per individuare il distretto corporeo rilevante è necessaria una adeguata conoscenza della biologia del microrganismo e della storia naturale della malattia infettiva in esame:
La febbre tifoide ha un caratteristico decorso “bimodale”: i) una fase precoce (I e II settimana), febbrile, con emocoltura positiva nel 90-100% dei casi, e coprocoltura frequentemente negativa; ii) una seconda fase (III settimana), spesso diarroica, in cui S. typhiviene isolata più frequentemente dalle feci che dal sangue. Pertanto, il sospetto clinico di febbre tifoide suggerisce la ricerca del microrganismo nel sangue in I e II settimana, mentre nelle feci (e nel sangue in III settimana, nel 30% dei casi) in III e IV settimana.
Chlamydia/gonococco vanno ricercati nel canale endocervicale, non in vagina.
Se l’infezione può dare manifestazioni sistemiche (es. meningite, infezioni bronco-polmonari, infezioni urinarie), è opportuno richiedere anche una emocoltura.
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3. Raccolta del campione clinicoAPPROPRIATEZZA del campione: «quanto»
Il campione deve essere prelevato in quantità sufficiente per poter effettuare un test diagnostico di qualità.
Infatti:
la sensibilità di un test diagnostico è generalmente dipendente dalla quantità di materiale esaminato; la raccolta di una scarsa quantità di campione può, pertanto, generare risultati “falsi-negativi”.
Molte infezioni sono caratterizzate da una bassa carica microbica al sito di infezione:
le batteriemie sono generalmente pauciparassitemiche. La sensibilità dell’esame emocolturale è, quindi, influenzata dalla quantità (volume) del campione prelevato.
M. tuberculosis viene rilasciato in maniera intermittente nelle urine. Pertanto, la sua ricerca viene effettuata su tre campioni di primo mitto mattutino oppure nelle «urine delle 24 h».
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3. Raccolta del campione clinicoAPPROPRIATEZZA del campione: «come»
Il campione deve essere raccolto in maniera da evitare contaminazioni con altri microrganismi.
Il prelievo del campione deve essere eseguito in asepsi (previa adozione di antisettici).
La presenza di microorganismi non responsabili della patologia (contaminanti) falsa il risultato dell’indagine microbiologica. Infatti, la loro crescita può:
- alterare il naturale rapporto quantitativo fra le componenti microbiche del campione (importante soprattutto quando un risultato viene interpretato su base «quantitativa», come nell’urinocoltura);
- ridurre/inibire la crescita del patogeno (micobatterio, enteritogeni nelle feci).
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3. Raccolta del campione clinicoAPPROPRIATEZZA del campione: «come»
Tipologie di contaminazione:
esogena (di origine ambientale)
endogena (da parte della flora “autoctona”)
– essudato bronchiale, da parte della flora oro-faringea nella fase di espettorazione;
– urina, dai batteri dei genitali esterni e dal terzo distale dell’uretra durante la minzione;
– sangue od essudati, dalla flora cutanea al momento del prelievo.
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Sito di infezione Sorgente di contaminazione
Vescica Uretra, perineo
Sangue Sito di venipuntura
Endometrio Vagina
Fistola Tratto gastrointestinale
Orecchio medio Orecchio esterno
Seno nasale Orofaringe
Faringe Orofaringe
Tuttavia, anche i contaminanti possono, talvolta, assumere significato eziologico. Tra questi patogeni “opportunisti”, Staphylococcus epidermidis in portatori di cateteri.
Flora contaminante «endogena» (microbiota commensale)
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Distretti anatomici “sterili” vs “non-sterili”: effetto sulla interpretazione del risultato analitico
Il campione biologico può essere prelevato da:
distretti “sterili” (non a diretto contatto con l’esterno e, quindi, fisiologicamente sterili):
– sistema cardiovascolare, sistema nervoso, vescica, ureteri, reni, fegato, milza, tessuti profondi, cavità chiuse, polmoni e bronchi terminali;
– ogni isolamento ha significato eziologico.
distretti “non sterili” (a diretto contatto con l’ambiente e, quindi, “contaminati” dallaflora microbica residente)
– cute, congiuntiva, naso-faringe, oro-faringe, orecchio esterno, intestino, retto, vagina, uretra terminale;
– difficile interpretazione dei risultati: richiede una approfondita conoscenza della eziologia dell’infezione e della flora potenzialmente contaminante;
– richiesta “mirata” del Clinico volta alla ricerca di uno o più specifici patogeni nel contesto dell’abbondante flora contaminante;
– alcuni “contaminanti” possono avere significato eziologico nel paziente immunocompromesso(S. epidermidis).
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FASE PRE-ANALITICA4. Identificazione del campione
Il campione deve essere opportunamente contrassegnato e confezionato prima del suotrasporto verso il Laboratorio.
Il contenitore inviato in Laboratorio deve essere identificato con l'etichetta riportante il relativo codice a barre ed accompagnato da un modulo di richiesta (in assenza di accettazione telematica) indicante:
– identificativo del paziente (nome, cognome, età, sesso)
– nominativo del prelevatore
– data ed ora di campionamento
– tipologia del campione
– diagnosi clinica presuntiva
– ricerca microbiologica “mirata” (soprattutto nel caso si sospetti la presenza di patogeni “infrequenti”)
– informazioni cliniche (precedenti esami microbiologici, terapia antibiotica pregressaod in atto, etc.)
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FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione
Il campione deve essere trasportato e consegnato in laboratorio:
in contenitori adeguati per tipologia di campione clinico e sospetto eziologico;
nell’intervallo di tempo appropriato alla natura dell’esame richiesto;
nel range di temperatura specificato nel manuale di prelievo e con gli idonei additivi per garantire l’integrità del campione;
con modalità che assicurino la massima recovery dei microrganismi patogeni (es: adozione di sistemi di trasporto nel caso di tamponi o ricerca anaerobi/»esigenti»);
con modalità che garantiscano la sicurezza di tutte le figure coinvolte nel trasporto verso il laboratorio ricevente. Le procedure devono aderire a norme nazionali o locali.
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FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione: contenitore
Per la raccolta di campioni biologici liquidi (urine, escreato, altri fluidi biologici) oppure solidi (catetere, biopsie di tessuto) è necessario utilizzare un contenitore le cui caratteristiche assicurino un trasporto ed una manipolazione ottimali del campione:
sterile e monouso, per evitare la contaminazione del campione; la sterilità è dichiarata dal produttore con certificato allegato dove è stabilita la data di scadenza ed il metodo utilizzato (irraggiamento, ossido di etilene);
dotato di sistema di chiusura a perfetta tenuta: chiusura a vite (“bicchiere”, preferibile perché riduce la formazione di aerosol all’apertura del contenitore) od a pressione (“provette”);
integro, per evitare perdite o contaminazioni del campione; verificare visivamente la integrità del contenitore prima del suo utilizzo.
La tipologia (capacità, forma) del contenitore viene scelta sulla base delle caratteristiche del campione e della indagine necessaria:
per facilitare la raccolta del materiale, in alcuni casi è preferibile l’utilizzo di contenitori ad apertura («bocca») larga.
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FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione: tempo
Il campione biologico deve essere inviato al Laboratorio il più rapidamente possibile affinchèpossa essere processato entro le 2 h dal prelievo.
Un trasporto “protratto” potrebbe infatti:
– ridurre la vitalità dei microrganismi (falsa negatività) (N. gonorrhoeae, virus respiratori);
– favorire la crescita dei “contaminanti” (falsa positività) (es. urine, ottimo terreno di coltura);
– favorire la crescita dei microrganismi patogeni, falsando l’interpretazione di tests diagnostici “quantitativi” (es. urinocoltura);
– esporre per lunghi periodi i microrganismi a sostanze che, utilizzate nelle procedure di raccolta, potrebbero avere attività antibatterica (es. anestetici locali).
In caso di necessità (es. ricerca di anaerobi, tamponi, etc.), possono essere utilizzati adeguatiterreni di trasporto, al fine di garantire la sopravvivenza del microrganismo patogeno duranteun trasporto ritardato.
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Durante un trasporto, a temperatura ambiente, della durata di 2h, la popolazione batterica aumenta di circa 64 (26) volte.
FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione: temperatura
Durante il trasporto, il campione viene generalmente refrigerato (2-8°C).
Tuttavia, nei seguenti casi è opportuno conservare il campione a temperatura ambiente:
– sangue (inoculato in sistema per emocoltura), che va incubato a 35-37°C, oppure mantenuto a temperatura ambiente;
– campioni (es. liquor; feci; campioni da vie genitali, occhio e orecchio) contenenti microrganismi termosensibili (S. pneumoniae, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae, Salmonella spp.);
– campioni per la ricerca di batteri anaerobi (utilizzare sempre un sistema di trasporto specifico);
– campioni di feci per l’esame parassitologico, conservati in adeguato conservante.
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FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione: conservazione
CAMPIONE CONSERVAZIONE
SANGUERT (inoculato in flaconi per emocoltura); se possibile,
incubare a 37°C in attesa di trasporto
ESSUDATI, DRENAGGI, LIQUIDI (pericardico, pleurico, asciti articolari, dialisi peritoneale)
Inoculare parte del materiale nei flaconi per emocoltura e conservare a RT.
Conservare la restante parte a +4°C
CATETERE +4°C
ESPETTORATO e/o BRONCOASPIRATO +4°C
TAMPONI (faringeo, nasale, auricolare, vaginale, congiuntivale, cutaneo,
etc.) in sistema di trasporto
RT(+4°C per ricerca Campylobacter, Shigella, Vibrio, Yersinia)
URINE +4°C
FECI +4°C
LIQUORRT
(+4°C per ricerca virale)
RICERCA MICOBATTERI +4°C
ESSUDATO (ulcere, piaghe, ferite chirurgiche)
+4°C
BIOPSIE, AGOASPIRATI +4°C, in fisiologica
RICERCA ANAEROBI in sistema di trasporto RT
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Qualora fosse impossibile inviare rapidamente (entro 2 h) il campione al Laboratorio, la sua conservazione (per max 24 h) deve avvenire secondo le indicazioni fornite dal Laboratorio:
+4°C: conservazione in frigo; RT: temperatura ambiente (20-25°C)
FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione: terreno di trasporto
La necessità di disporre di sistemi per il trasporto dei campioni è significativamente aumentata negli ultimi anni a causa di:
– maggior ricorso alle attività ambulatoriali;
– riduzione del numero dei giorni di degenza;
– progressiva centralizzazione dei laboratori (core lab) imposta da nuovi assetti organizzativi.
Sono disponibili diversi terreni di trasporto, liquidi o agarizzati, in grado di prolungare la sopravvivenza batterica al di fuori dell'organismo umano.
L’utilizzo di un terreno di trasporto è finalizzata a mantenere inalterata la facies del campione, ossia di preservarne le caratteristiche:
– chimico-fisiche: mantiene un adeguato pH, previene sia la disidratazione delle secrezioni durante il trasporto, sia l'ossidazione e l'autodigestione enzimatica dei microrganismi presenti.
– biologiche: garantisce la sopravvivenza dei microrganismi, ma non ne favorisce la crescita, in tal modo evitando di falsare la interpretazione di indagine diagnostiche “quantitative” (es. urinocoltura).
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Sistemi di trasporto per la ricerca di anaerobi
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Sistemi di trasporto per la ricerca di aerobi/carbossifili
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Sistemi di trasporto per tipologia di campione
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Il classico sistema di trasporto: “tampone-terreno di trasporto”
Sistema “ready-to-use” completi per il prelievo, trasporto e mantenimento dei campioni clinici per l’esame batteriologico.
Formato da un tampone (raccolta del materiale) e da una provetta, contenente un terreno di trasporto, dove viene inserito il tampone dopo il suo utilizzo.
Il tampone (swab) è costituito da un supporto (in plastica o metallico, in alcuni casi regolabile) dotato di fibre assorbenti naturali (cotone) o sintetiche (nylon, poliestere, dacron, rayon, calcio alginato), talvolta impregnate con carbone, siero o frazioni di albumina per migliorare la sopravvivenza dei microrganismi “esigenti” e per neutralizzare i metaboliti ad attività tossica.
La scelta della fibra è un elemento di criticità nella fase pre-analitica e dipende dalla tipologia di materiale o della ricerca da effettuare:
– tamponi in cotone, contengono acidi grassi ad azione tossica vs molti microrganismi;
– tamponi in calcio alginato, rilasciano prodotti che interferiscono con la crescita di vari microrganismi (Herpes simplex virus, C. trachomatis, U. urealyticum, N. gonorrhoeae) e risultano tossici per le colture cellulari. Non idonei per estrazione di acidi nucleici;
– dacron e rayon sono da considerarsi le fibre ideali.
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Il tampone generalmente richiede l’impiego di un terreno di trasporto.
– è possibile, tuttavia, utilizzare tamponi non dotati di terreno (tamponi «a secco») quando si esegue la coltura subito dopo la raccolta del materiale, oppure – nel caso di tamponi a secco impregnati con carbone, albumina o calcio-alginato - quando si effettua la coltura entro 4 h.
I terreni di trasporto proteggono i microrganismi da: essiccamento, acidi grassi tossici, condizioni sfavorevoli di pH, effetti letali dell’ossigeno atmosferico:
– terreno di Stuart o di Amies (liquido oppure in agar gel, con o senza carbone);
– terreno di Cary-Blair (in agar gel).
La loro formulazione permette di mantenere la vitalità batterica senza incrementarne la crescita e la moltiplicazione. Tuttavia è da considerare che:
– alcuni patogeni possono non sopravvivere in un terreno povero di elementi nutritivi;
– alcune specie batteriche possono duplicarsi in 1 h in presenza di fluidi corporei.
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Il classico sistema di trasporto: “tampone-terreno di trasporto”
Il sistema “tampone-terreno di trasporto”Principali terreni di trasporto
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Glicerofosfato sodico: potenzia la crescita dei coliformi.Sali di Ca e Mg: controllano la permeabilità cellulare batterica (osmosi), così contribuendo alla loro sopravvivenza.NaCl 0.3%: ottimale per la conservazione di Neisseria gonorrhoeae. Fosfato sodico: mantiene il pH.Tioglicolato sodico: riduce il potenziale redox, facilitando la crescita degli anaerobi.
Altri terreni di trasporto: acqua peptonata (V. cholera) quale arricchimento (meno efficace vs Cary-Blair).
Il sistema “tampone-terreno di trasporto”Principali tipologie
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FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto “in sicurezza” del campione
Ogni campione biologico deve essere considerato come potenzialmente a rischio biologico per la salute degli operatori sanitari.
Principali agenti causa di infezioni professionali:
– Batteri: Brucella spp., Burholderia (Pseudomonas) pseudomallei, Chlamydia spp., Francisellatularensis, Leptospira spp., Salmonella spp., Shigella spp. Raramente responsabili: Vibrio spp., Campylobacter spp., Escherichia coli, Treponema pallidum.
Mycobacterium tuberculosis: presente nell’escreato, liquido di lavaggio bronchiale, liquido di lavaggio gastrico, liquor, urine, materiale da lesioni caseose. Trasmissione per via aerea. Dose infettante: 1-10 cellule.
– Virus dell’epatite B: presente nel sangue saliva, sperma, secrezioni vaginali. Trasmissione mediante puntura accidentale. Quantità sangue infettante: una puntura accidentale con ago può contenere fino a 100 dosi infettanti.
– Virus dell’epatite C: presente nel sangue, saliva e sperma. Trasmissione mediante puntura accidentale. Dose infettante: non nota.
– Virus dell’immunodeficienza umana (HIV): presente nel sangue, saliva, sperma, latte materno, tessuti, liquido amniotico, liquor, liquido sinoviale, liquido peritoneale, liquido pleurico, liquido pericardico. Trasmissione mediante puntura accidentale. Quantità sangue infettante: 100 ul.
– Miceti: Criptococcus neoformans, Blastomyces dermatitis, Coccidioides immitis, Histoplasmacapsulatum
– Protozoi: Toxoplasma gondii, Plasmodium spp., Leishmania spp., Tripanosoma spp.
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FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto “in sicurezza” del campione
In accordo con la normativa (legge n. 21 del 20.07.94, circolare n. 3, 8 maggio 2003), le linee-guida del Ministero della Salute, OMS ed ISO, il trasferimento dei campioni biologici verso il Laboratorio deve avvenire “in sicurezza”, ossia evitando la dispersione del materiale biologico e la eventuale contaminazione di altri materiali, di attrezzature, dei pazienti e del personale che dovrà manipolare il campione stesso:
– campione singolo (provetta, tampone, flacone): in busta di plastica monouso a due scomparti: uno dotato di chiusura a pressione per alloggiare il campione biologico, l’altro per il modulo di richiesta debitamente compilato. Sul fronte del sacchetto sono stampati il simbolo di rischio biologico e le istruzioni.
– campioni multipli: in contenitori rigidi ed a chiusura ermetica.
L’invio dei campioni in orari “non ordinari” richiede una pianificazione, con il Laboratorio, della loro raccolta ed invio.
Il Laboratorio ha l’obbligo di monitorare le condizioni “di sicurezza” del trasporto (ISO 15189)
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FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto “in sicurezza” del campione: trasporto «locale»
CIRCOLARE n. 3, 8 maggio 2003 (Ministero della Salute) “Raccomandazioni per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni diagnostici”
Per “trasporto locale” si intende il trasporto di un campione da:
un reparto ospedaliero (o da una struttura periferica) ad un laboratorio dell’ospedale;
un laboratorio ad un altro, ovvero da una struttura ospedaliera ad un centro diagnostico esterno.
Se il campione è costituito da una piastra, essa deve essere opportunamente sigillata in busta; se il campione è contenuto in una provetta, essa deve essere chiusa e collocata in una rastrelliera in posizione verticale.
I contenitori dei campioni e le rastrelliere devono essere posti in scatole robuste (plastica o metallo) a tenuta stagna, etichettate in relazione al contenuto ed accompagnata dalle schede con i dati del campione.
In caso di trasporto a mezzo veicolo, la scatola deve essere sistemata in modo fermo e sicuro nel veicolo stesso e, a bordo, deve essere presente un kit fornito di materiale assorbente, disinfettante a base di cloro, contenitore per rifiuti, guanti da lavoro resistenti e riutilizzabili.
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FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto “in sicurezza” del campione: misure di contenimento*
Nei casi in cui si preveda (anche solo accidentalmente) il contatto con sangue o altri liquidi biologici provenienti da qualsiasi paziente, bisogna adottare delle precauzioni universali per prevenire l’esposizione cutanea, mucosa o parenterale.
Consistono:
– nell’adozione di misure di barriera o Dispositivi di Protezione Individuale (DPIs): guanti, camici, maschere, occhiali, schermi facciali protettivi, grembiuli, calzari;
– nel corretto uso e smaltimento di oggetti acuminati (es. aghi) e taglienti;
– nel corretto lavaggio delle mani;
– nell’immediata decontaminazione delle superfici sporche di materiali biologici potenzialmente infetti.
51* Queste misure sono valide anche per il contenimento del rischio durante il prelievo di un campione.
FASE PRE-ANALITICA6. Accettazione del campione: conformità
Tutti i campioni ricevuti devono essere registrati in una lista cartacea, nei fogli di lavoro o registrati mediante sistema informatico. Vanno segnate data e ora di ricevimento e l’identità del ricevente.
I campioni inviati al Laboratorio potrebbero essere stati prelevati, trasportati e/o conservati in maniera impropria.
La lavorazione di tali campioni potrebbe fornire risultati fuorvianti per il Clinico, in termini di diagnosi e terapia inappropriate.
Il Laboratorio è pertanto tenuto a definire e documentare i criteri di conformità/non conformità per l’accettazione/rifiuto dei campioni.
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3.
FASE PRE-ANALITICA6. Accettazione del campione: conformità
Ogni Laboratorio di Microbiologia dovrebbe avere un protocollo definito per la rilevazione delle non conformità e la non accettabilità dei campioni predisponendo misure di comportamento specifiche.
In alcuni casi (urgenza clinica, campioni prelevati mediante tecniche invasive) è necessario che il campione, anche se non conforme, venga analizzato.
In questi casi, il Microbiologo Clinico ha l’obbligo di annotare nel referto:
– un commento («i microrganismi isolati potrebbero non riflettere l’attuale microbiota a causa di procedura di raccolta/ trasporto/ conservazione non corretta»);
– la tipologia delle eventuali “non conformità” rilevate;
– le azioni correttive intraprese;
– le eventuali precauzioni da adottare nell’interpretazione del risultato analitico.
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3.
Principali “non conformità” di un campione per la diagnosi microbiologica
Contenitore:
– non conforme alle vigenti norme di sicurezza (es. siringhe con ago);
– non adatto (es. feci per coprocoltura in contenitore per la ricerca di parassiti);
– non sterile;
– aperto o danneggiato, con evidente fuoriuscita del materiale.
Campione:
– non identificabile, modulo di richiesta mancante od incompleto;
– assente o prelevato in quantità insufficiente (es. ricerca micobatteri o anaerobi);
– invio in giornata di 2 campioni con stesso materiale (eccetto: sangue, liquor, tessuti);
– contaminato da altro materiale (urine con feci o viceversa, espettorato con saliva).
Materiale non idoneo per la ricerca (o la cui richiesta non è scientificamente supportata):
– ricerca di gonococco/clamidia in tampone vaginale;
– prelievo in paziente antibiotizzato;
– campioni di tessuto (biopsie, linfonodi) in formalina per ricerca di microrganismi vitali;
– tipologia non adeguata (saliva vs escreato; raccolta urine “delle 24 h” per urinocoltura).
Impropria conservazione e/o trasporto:
– terreno di trasporto assente, ove raccomandato;
– trasporto prolungato;
– temperatura non adeguata.
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3.
Riassumendo … Quali strumenti ci possono aiutare a gestire la qualità nella fase pre-analitica?
Per una diagnosi accurata ed attendibile la richiesta deve essere congrua rispetto al quesito diagnostico ed il campione biologico deve essere appropriato rispetto alla richiesta di esami.
A causa della difficoltà di integrare le caratteristiche del campione e la congruità della richiesta, la scelta della prestazione in Microbiologia è condizionata dalla conformità del prodotto in entrata, definita in relazione a requisiti standard.
La conformità si realizza attraverso l’utilizzo di protocolli – redatti a seguito di stretta collaborazione tra Microbiologo e Clinico per definire, in relazione alla patologia: i) le modalità di prelievo, trasporto e conservazione del campione; ii) l’utilizzo di profili di esami per materiale; iii) l’impiego di protocolli diagnostici.
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«Appropriatezza» della fase pre-analitica
Appropriatezza: Il grado con cui una procedura, un test o servizio è efficace e fornito in qualunque situazione clinica risponde al meglio ai bisogni del paziente (College of American Pathologists, 1996).
L’appropriatezza di tutta la fase pre-analitica si traduce in maggiore qualità del servizio diagnostico e maggiore sicurezza dell’operatore.
Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure (Microbiologo, Clinico, Parasanitari) coinvolte a diverso titolo nell’indagine microbiologica (che ha inizio al letto del malato, per terminare con la visione del referto) ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure può garantire la piena valorizzazione di una indagine microbiologica.
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Un test è clinicamente efficace se contribuisce a: individuare o escludere una malattia; aiutare il processo decisionale: valutazione sulla possibilità di iniziare la terapia o sulla necessità di eseguire ulteriori indagini; valutare la prognosi; monitorare il decorso clinico; diagnosticare una patologia in fase pre-clinica (screening).
Distribuzione degli errori nella Medicina di Laboratorio
Fase pre-analitica : 70%
Fase analitica : 13%
Fase post-analitica : 17%
(Plebani et al. 2001)
Fase pre-analitica non Corretta: REFERTO ERRATO …. INUTILE o DANNOSO !!!
Cause di errore:
Criticità delle indagini microbiologiche:
– materia in continua evoluzione
– miglioramento tecnico (maggiore complessità)
– variabilità interpretativa
Necessità di continua formazione/aggiornamento sulle tecniche di prelievo, trasporto dei campioni biologici.
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PRE-analitica;
70%
analitica; 13%
POST-analitica;
17%
Riflessioni … sulla fase pre-analitica
Il contributo fornito da chi richiede e preleva i campioni alla qualità degli esami di Laboratorio dipende sia dalla conoscenza del fenomeno che dal rispetto delle norme che permettono di ridurre al minimo i fattori che possono modificare il risultato finale delle analisi.
Il risultato dell'esame microbiologico sarà qualitativamente valido e verrà ottenuto in tempi più rapidi.
Un campione “non idoneo” può infatti causare:
– il mancato isolamento del microorganismo responsabile dell’infezione
– una erronea attribuzione di eziologia microbica
– la "diffusione" di germi patogeni - in particolare di quelli antibiotico-resistenti (MRSA, Pseudomonas spp, Acinetobacter spp) – e conseguente aumento dell'incidenza delleinfezioni nosocomiali.
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In ultima analisi, TUTTI gli operatori coinvolti nella fase pre-analitica sono responsabili della qualità del percorso diagnostico del Paziente … almeno fino all’arrivo del campione in Laboratorio !
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(P Schreckenberger)
«Non tutti i cambiamenti significano miglioramento, ma tutti i miglioramenti sono dei cambiamenti» (DM Berwick)
«Tutti i miglioramenti avvengono progetto dopo progetto ed in nessun altro modo» (J Juran)