citometria brian
TRANSCRIPT
“La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o partículas microscópicas en suspensión que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz”
CITOMETRIA DE FLUJO
NIVELES DE ANALISISMOLECULAR(esferas fluorescentes)
SUBCELULAR CELULAR SUPRACELULAR
Proteínas extracelulares
Viriones individuales
Bacterias Hibridomas
Secuencias de ADN o ARN libres
Liposomas Hongos unicelulares
Fusiones celulares
Complejos inmunes circulantes
Cromosomas aislados
Células humanas y animales
Orgánulos aislados
Protoplastos vegetales
Núcleos aislados
EXTRACELULARES
DE SUPERFICIE
CITOPLASMATICO
NUCLEARES
PARAMETROS DE ANALISIS
A NIVEL CELULAR
Ploidía de ADN Regulación del ciclo
celular Acción de hormonas
Metabolismo celular Transducción de señales Lesión celular
Caracterización población celular
Interacciones célula-célula Resistencia a fármacos
Activación celular Interacciones célula-célula Diferenciación celular
¿COMO FUNCIONA EL CITOMETRO DE FLUJO?
IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell
¿Qué es un fluorocromo?
488 nm
LuzIncidente
HO O
CO2H
Molécula de
Fluoresceína
530 nm
LuzFluorescente
Emitida
• El fluorocromo absorbe la luz del láser
• El fluorocromo emite un rayo luminoso dediferente longitud de onda
PRINCIPALES FLUOROCROMOS UTILIZADOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO
DATOS OBTENIDOS
1. PARAMETROS ESTRUCTURALES• El tamaño relativo (Forward scatter-FSC)• La granularidad o complejidad citoplasmática. (Side scatter-SSC)
2. CD (antigenos de superficie): La intensidad de fluorescencia (Identidad)• Linaje• Recuento • Activación
4. ALTERACION EN EL INMUNOFENOTIPO• Inmunoproliferacion/inmunodeficiencia
5. ALTERACION EN EL GENOTIPO• Cambios en contenido DNA• Cambio en la expresion de genes
PRESENTACION DE LOS DATOS
• Histograma
• Gráfico de Puntos (Dot Plot)
• Gráfico de Contorno (Countour Plot)
• Gráfico de Densidad (Density Plot)
REGISTRO PRIMARIO
IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell
IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell
Granulocitos
DetritosLinfocitos
Monocitos
DISPERCION NORMAL
Countour Plot Density Plot
IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell
APLICACIONES CLINICASINMUNOFENOTIPIFICACIONi
PLAQUETASi TRANSPLANTES
CANCERi
o LEUCEMIAS Y LINFOMASo ENFERMEDAD MINIMA RESIDUALo SUBPOBLACIONES LINFOIDES
(INMUNODEFICIENCIAS)o RAZON LtCD4/CD8(VIH-SIDA)
o CONTENIDO DE DNA (ploidia DNA)o FASES DEL CICLO CELULARo PROTEINAS DEL CICLO CELULARo ONCOGENES (p53 y otros)
o GLICOPROTEINAS (TROMBASTENIA DE GLANZMANN)
o FISIOLOGIA PLAQUETARIAo Igs ASOCIADAS A PLAQUETAS
(PURPURA TROMBOCITOPENIA INMUNE)
o CELULAS PROGENITORAS(CD34, CD117)
o CROSS MATCH
ESTUDIOS FUNCIONALES
CUANTIFICACION DE MOLECULAS
DETECCION DE CITOQUINAS
SOLUBLES
• Citocinas Intracelulares• Fagocitosis• Estallido respiratorio• pH intracelular• Potencial de membrana
• En base a partículas cubiertas con Ig anticitocinas
• Recuento absoluto de células• CD 64 en granulocitos(infeccion)
APLICACIÓN DE LA CITOMETRIA EN HEMATOLOGIA
VENTAJAS EN HEMATOLOGIA Análisis multiparamétrico
Acceso mínimamente invasivo a parámetros celulares
Analiza grandes cantidades en poco tiempo. Aprox: 500-4000 cel/seg.
Resolución de heterogeneidad celular
Selección fenotípica de subpoblaciones
Selección manual de marcadores: Permite separar subpoblaciones celulares. (Clasificación de patologías).
INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS
“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”
RETENCION DE ANTIGENOS
Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados. Ejm:
CD10CD34CD8
HLA-DR
TIMOCITOLINFOCITOPRE B
CD10CD19CD34CD38
LINFOCITO BCD19CD20CD22IgM
LINFOCITO TCOOPERADOR
CD4 CD3CD28 TCRCD5
CD1 CD8CD2 CD71CD3 CD38CD4 TCR
LINFOCITO TCITOTOXICO
CD8CD3CD28CD5
NK MADUROCD2CD8+/-CD16CD56CD57
MADURACION DE LINEA LINFOIDE
BIBLIOGRAFIA1. BARRERA RAMÍREZ LOURDES MARÍA, DRAGO SERRANO MA. ELISA, PÉREZ RAMOS
JULIA, SAINZ ESPUÑES TERESITA DEL ROSARIO, ZAMORA ANA CECILIA, GÓMEZ ARROYO FABIOLA et al . CITOMETRÍA DE FLUJO: VÍNCULO ENTRE LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y LA APLICACIÓN CLÍNICA. Rev. Inst. Nal. Enf. Resp. Mex. [revista en la Internet]. 2004 Mar [citado 2012 Mar 12] ; 17(1): 42-55. Disponible en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-75852004000100007&lng=es
2. Statistical file matching of flow cytometry data, ELSEIVER, Journal and biomedical Informatics, Gyemin Lee a, William Finn, Clayton Scott
3. Maryalice Stetler-Stevenson. Flow cytometry in lymphoma diagnosis and prognosis: useful? Best Practice & Research Clinical Haematology Vol. 16, No. 4, pp. 583–597, 2003
4. Diagnosing PNH with FLAER and Multiparameter Flow Cytometry, D. Robert Sutherland,1 Nancy Kuek, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 72B:167–177 (2007)