ACTIVIDAD ENZIMTICA

Cuntos moles de sustrato son convertidos en producto por

unidad de tiempo?

setiembre 2012 1enzimas III

FACTORES QUE AFECTAN

Temperatura

pH

[sustrato]

[enzima]

Buffers (kits comerciales)

Efectores (activadores e inhibidores)

Agentes estabilizantes (detergentes,

sales, agentes reductores, etc)??

setiembre 2012 2enzimas III

ACTIVIDAD ENZIMTICA

UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMATICA (U): mol de sustrato transformado en un minuto

ACTIVIDAD ESPECIFICA: unidades de enzima por

miligramo de protena (U/mg protena o mol min-1

mg protena-1)

CONSTANTE CATALITICA O NUMERO DE

RECAMBIO (TURNOVER): unidades de actividad

enzimtica por mol de enzima ( mol min-1 mol de enzima-1). Catalasa y alfa amilasa 5x106 y 1.9 x 104

setiembre 2012 3enzimas III

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD

ENZIMTICA

setiembre 2012 4enzimas III

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

[E]constante y [S]

diferentes

La velocidad de

reaccin permanece

constante cuando la

enzima se satura

setiembre 2012 5enzimas III

Cmo se mide la velocidad de reaccin?

(sustrato producto en el tiempo)

Debemos hacer la reaccin in vitro ?

1. Determinar el sustrato y anlogos

2. Determinar los parametros cinticos de

reaccin (pH, T, [S], [E], [Ef])

3. Disear un ensayo para visualizar la reaccin

4. Medir la velocidad de reaccin

setiembre 2012 6enzimas III

Ejemplo de actividad enzimtica

-galactosidasa

-enlace

Nitrofenilglucosa nitrofenol + glucosa

(incoloro) (amarillo)

Medir la velocidad de aparicin de color amarillo

(sustrato) (productos)

setiembre 2012 7enzimas III

Alcohol Deshidrogenasa (ADH)

CH3CH2OH + NAD+ CH3CH2O + H

+ + NADH

Catalisa la conversin de etanol a

aldehido usando la co-enzima NAD+

NAD+ oxidado a NADH reducido

NADH SE LEE A 340 NM

setiembre 2012 8enzimas III

Efecto de la concentracin de enzima (relacin

lineal)

v

[E]

. . .. . .

. . .. .

setiembre 2012 9enzimas III

v[s]

Efecto de la concentracin de substrato

..

.. . . .

.

setiembre 2012 10enzimas III

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

Una cintica hiperblica implica un proceso

saturante:

nmero limitado de sitios en la enzima

para fijar substrato; una vez que estn ocupados

todos, por mucho que aumente la concentracin

de substrato, la velocidad permanecer constante

tendiendo un valor asinttico

setiembre 2012 11enzimas III

Se considera la reaccin en el equilibrio:

E + S ES E + P

setiembre 2012 12enzimas III

Velocidad inicial (Vo)

Iniciar con [S] bajas e incrementar

Mantener la [E] saturante

Medir la velocidad de reaccin Vo hasta que la

velocidad sea constante Vmax

Cuando la enzima se mezcla con altas [S]

estado estacionario no permite caracterizacin

setiembre 2012 13enzimas III

Velocidad inicial (Vo)

setiembre 2012 14enzimas III

E + S ES E + Pk1 k2

k-1k-2

1. Enzima y sustrato se combinan para formar el complejo ES

2. Las reacciones son reversibles k-2, es despreciable

3. Asume que [ES] esta constante, estado estacionario :

d[ES]/dt = 0

4. [E]

E + S ES E + Pk1 k2

k-1

V0 = K2 [ES]

K2 [Et] [S]

= ------------------

[S] + km

velocidad mxima (Vmax) ocurre cuando [ES] = [Et]

As, Vmax = K2 [Et]

Vmax [S]

V0 = ------------------ (Ecuacin Michaelis-Menten)

km + [S]

setiembre 2012 16enzimas III

E + S ES E + Pk1 k2

k-1

Vmax [S]

V0 = ------------------

km + [S]

Cuando V0 = 1/2 Vmax

Vmax Vmax [S]

--------------- = ------------------

2 km + [S]

Km = [S] cuando V0 = 1/2 Vmax

setiembre 2012 17enzimas III

E + S ES E + Pk1

k2k-1

Km = [S] a 1/2 Vmax

Concentracin de substrato a la cual se alcanza

la mitad de la velocidad mxima

El Km ms bajo (menor sustrato para alcanzar la 1/2 Vmax)

El Km mide la afinidad de la enzima por el sustrato. A

bajo Km alta afinidad.

Una enzima con un Km de 10-6 M tiene mayor afinidad

por su sustrato que otra que tiene Km de 10-4 M

setiembre 2012 18enzimas III

Cmo determinar Km y Vmax?

setiembre 2012 19enzimas III

La ecuacin de Michaelis-Menten genera una

parbola .- no permite extrapolar los valores de

Km y Vmax facilmente

Convertir la ecuacin de Michaelis-Menten a su

inversa.- grfico de Lineweaver-Burk

setiembre 2012 20enzimas III

Vmax [S]

V0 = ------------------ (ecuacin de Michaelis-Menten )

km + [S]

1 km + [S]

--------- = ------------------

V0 Vmax [S]

1 km [S]

---------- = ------------ + ------------

V0 Vmax [S] Vmax [S]

1 km 1 1

---------- = ------ ------ + ------ (ecuacin de Lineweaver-Burk)

V0 Vmax [S] Vmax

setiembre 2012 21enzimas III

En el caso de la ecuacin Lineweaver-Burk

y = mx + c 1 km 1 1---------- = ------ ------ + ------

V0 Vmax [S] Vmax

Variables: y = 1/ V0 , x = 1 / [S]

Constante: c = 1 / VmaxPendiente: m = km / Vmax

setiembre 2012 22enzimas III

Determinacin del Km

setiembre 2012 23enzimas III

Determinacin de la Km

setiembre 2012 24enzimas III

Determinacin de Vmax

setiembre 2012 25enzimas III

Representacin recproca doble(Lineweaver - Burk)

1/s

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

1 1 1

v

K

V s Vm

mx mx

-1/Km

1/Vmax

setiembre 2012 26enzimas III

Representacin s -s/v(Eadie - Hofstee)

s

-20 0 20 40 60 80 100 120

s/v

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

s

v Vs

K

Vmx

m

mx

1-Km

setiembre 2012 27enzimas III

Representacin v/s - v(Wong - Hanes)

v/s

0 2 4 6 8 10 12 14 16

v

0

20

40

60

80

100

v Kv

sVm mx

Vmax

setiembre 2012 28enzimas III

Km de algunas enzimas

setiembre 2012 29enzimas III

setiembre 2012 30enzimas III