APLICACIONES DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR II

“Identificación de la(s) hexocinasa(s) sensor(es) de carbohidratos en maíz”

Giovanna Paulina Aguilera Alvarado

Tutor: Dra. Sobeida Sánchez Nieto

Departamento de Bioquímica

Facultad de Química

2018-1

CLONACIÓN MOLECULAR

CLONACIÓN MOLECULAR. La clonación molecular se refiere a los procesos mediante los cuales moléculas de DNA recombinante son producidos y transferido a un organismo hospedero en el cual serán replicadas.

https://www.neb.com/~/media/NebUs/Files/Brochures/Cloning_Tech_Guide.pdf http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

Embrión de maíz

Se necesitaba un molde…

24h

RNA

Transcripción reversa

cDNA

TRIzol

5’UTR ORF 3’UTR

Mucha similitud

Diseño de primers

¡PCR!

Adenilación y ligación

Miles copias del cDNA de las

HXKs de maíz

Transformación y secuenciación HXKs

aisladas

TECNOLOGÍA GATEWAY®. Esta tecnología usa el sistema de recombinación del fago lamba para facilitar la transferencia de secuencias de DNA heterólogo (flanqueado por los sitios att) entre diferentes vectores. Se basa en dos reacciones de recombinación.

Reacción BP

BP clonasa®

KanR

KanR

Reacción LR

gen

gen

Vector donador

Clona de entrada

gen

Clona de entrada

KanR

AmpR

Vector destino

Clona de expresión

gen

AmpR

KanR

Subproducto

LR clonasa®

https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/cloning/gateway-cloning/gateway-technology.html

CARACTERIZACIÓN CINÉTICA I. Expresión heteróloga en E. coli.

INDUCCIÓN: Liberación de la represión de los genes.

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE.

BL21 (DE3) Codon Plus RIL (pET-DEST42 Gateway: V5, 6X His).

Inducción con IPTG

RNA pol E. coli

lacI

lacI

RNA pol T7 RNA pol T7

lacI

lacI

RNA pol T7

Gen de interés

Inducción con IPTG

pEXP42

Genoma de E. coli BL21 (DE3)

ptRNAR

ptRNAI

ptRNAL

Probar diferentes condiciones: o Temperatura o Tiempo de inducción o [IPTG] o Cepa o Tag

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE.

Resina

Proteína-6His

ZmHXK

75 kDa

50 kDa

4 5 6 7 8

X No se produjo ZmHXK9. X ZmHXK4, ZmHXK5 y ZmHXK6 insolubles, sin actividad de HXK.

AtHXK1 AtHXK2 OsHXK5 OsHXK6 OsHXK7 OsHXK8 ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9

MEM*

Citosol

¿Qué tienen en común?

*Membrana Externa Mitocondrial Balasubramanian et al., Plant Physiol (2007); Cheng et al., Biol Plantarum (2011); Cho et al., Plant Physiol (2009)

Templado en pGEM®-T Easy

ZmHXK5

ZmHXK5Δ30

Se produjo ZmHXK9Δ1-30 ZmHXK4Δ1-30, ZmHXK5Δ1-30, ZmHXK6Δ1-30 y ZmHXK9Δ1-30 solubles, con actividad de HXK.

75 kDa

50 kDa

4Δ30 5Δ30 6Δ30 7 8 9Δ30

ZmHXK

VARIANTES SIN N-TERMINAL.

Diseño de primer 5’

Eliminemos la región hidrofóbica, la PCR es nuestra amiga…

ZmHXK5 ZmHXK5 sin la región hidrofóbica

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Existen diversas maneras de medir la actividad de una enzima: cuantificando la desaparición del sustrato, la aparición del producto o mediante un ensayo acoplado.

y = 0.1435x + 0.2075

R² = 0.9998

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Abs

34

0n

m

Tiempo (min)

Curva temporal de actividad de HXK

X Hexosas o ATP marcados. Medición de NADH.

Substrate

Glucose Fructose Mannose ATP

ZmHXK4Δ30

Km (µM) 195.70 ± 31.96 19324.15 ± 3914.89 138.85 ± 22.42 134.90 ± 25.74

Vmax 5.65 ± 0.12

kcat

ZmHXK5Δ30

Km (µM) 136.65 ± 20.01 30216.8. ± 5708.76 119.55 ± 33.30 135.60 ± 11.46

Vmax 4.55 ± 0.34

kcat

ZmHXK6Δ30

Km (µM) 65.86 ± 15.19 4291.84 ± 1410.04 48.85 ± 1.06 198.85 ± 12.80

Vmax 3.60 ± 0.14

kcat

ZmHXK9Δ30

Km (µM) ND ND ND ND

Vmax ND

kcat ND

ZmHXK7

Km (µM) 108.10 ± 17.96 2701.85 ± 590.93 123.79 ± 11.61 28.74 ± 0.30

Vmax 27.19 ± 0.77

kcat

ZmHXK8

Km (µM) 4687 ± 299.53 ND 10396.50 ± 54.31 147.20 ± 62.08

Vmax 17.38 ± 0.24

kcat

OBTENCIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS.

OBTENCIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS.

Inhibitor

ADP NAG G6P

IC50 (mM)

ZmHXK4Δ30 0.71 ± 0.15 52.14 ± 16.42 47.49 ± 2.89

ZmHXK5Δ30 0.69 ± 0.15 46.80 ± 1.82 47.46 ± 1.44

ZmHXK6Δ30 0.72 ± 0.14 25.15 ± 2.25 53.54 ± 2.48

ZmHXK9Δ30 ND ND ND

ZmHXK7 6.47 ± 1.14 15.01 ± 3.24 NS

ZmHXK8 3.12 ± 1.14 37.54 ± 1.63 NS ND: Non detected NS: Non significance

Sin actividad. ¿Plegamiento incorrecto?

¿Sistema heterólogo inadecuado?

CARACTERIZACIÓN CINÉTICA II. Expresión heteróloga en S. cerevisiae.

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae. La genética inversa es una disciplina genética que, partiendo del conocimiento de un fragmento de ADN clonado o secuenciado, investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación, generalmente a nivel masivo. Dicha mutación puede ser puntual, por sustitución de nucleótidos, o más drástica, por ejemplo mediante silenciamiento de genes completos.

Eason, PNAS (2004); https://es.wikipedia.org/wiki/Gen%C3%A9tica_inversa

¿Cómo se obtiene una mutante de S. cerevisiae? Deleción

Ronda 1 PCR

Homología con el gen de interés

Homología con el gen de interés Primer de homología

Primer de homología

Templado 2

Ronda 2 PCR

Cassette de deleción

La levadura perdió un gen pero adquirió otro, en este caso uno que le permite crecer en presencia de Kan

Confirmación por PCR

Primer UPTAG

Homología con el gen de interés

Templado

Resistencia o prototrofía

Primer DNTAG

Homología con el gen de interés

Inserción del cassete por recombinación homóloga

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae. JT 20088: hxk1::HIS3 hxk2::LEU2 glk1::LEU2, fondo genético W303-1a: No es capaz de crecer en presencia de Glu ni en ausencia de uracilo. pDRf1-GW: Alto número de copias, prototrofía a uracilo, gen de interés bajo un promotor constitutivo.

Transformación de la mutante con las diferentes HXKs de maíz: Método LiAc/SS DNA/ PEG.

JT 20088 Crece en YPGal

Crecimiento hasta la fase

mid-log LiAC

SSDNA PEG

DNA de interés

Vórtex

42°C 40 min

Siembra en medio selectivo 29°C, 2-3 días

SGal-URA

Gietz, Yeast Protocols (2014); http://2011.igem.org/Team:WashU/Notebook/Transformation

Crecimiento en presencia de diferentes hexosas.

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae.

¿El extremo N-terminal estará

afectando la actividad in vivo?

Todas las versiones truncas crecieron

mejor que las versiones completas,

incluso

ZmHXK9Δ30.

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae.

CARACTERIZACIÓN CINÉTICA.

• ZmHXK4Δ30, ZmHXK5Δ30 and ZmHXK6Δ30: They have a smaller Km value for Man followed by the Glc Km value, but the lower Vmax found is displayed with Man.

• The enzyme with the smallest Km for Glc was ZmHXK6Δ30. In addition, ZmHXK7 showed the smallest Km for ATP and Fru, as opposed to ZmHXK8, whose Km for Fru was not possible to estimate.

• The 30 amino acids at N-terminal not only make the proteins insoluble in E. coli, but also modify their activity.

• ZmHXK9 has a minimal enzymatic activity sufficient to allow yeast growth in a medium supplemented with Glc or Fru as carbon source. Therefore, ZmHXK4-9 must be considered as true HXKs, even if ZmHXK9 shows a marginal enzymatic activity whose physiological relevance remains uncertain.

RECORDANDO EL OPERON LAC

lacI

lacI