clonage bactérien
TRANSCRIPT
Clonage bactérien
Plan
IntroductionDéfinitions Outils Technique Exemples d’utilisation
Conclusion
Introduction
Introduction
Le clonage désigne principalement deux processus:
la multiplication naturelle ou artificielle à l'identique d'un être vivant c'est-à-dire avec conservation exacte du même génome pour tous les descendants (les clones). C'est donc un synonyme de certaines formes de multiplication asexuée telles que le bouturage.
C'est aussi la multiplication provoquée d'un fragment d'ADN par l'intermédiaire d'un micro-organisme.
Définitions
LE clonage c’est :
• Une technique de biologie moléculaire qui consiste à isoler un fragment d'ADN et à le multiplier à l'identique en l'« insérant » dans une molécule d'ADN « porteuse » appelée vecteur permettant son amplification.
• Cette technique de biologie moléculaire peut-être utilisée pour un clonage partiel, ne portant que sur un fragment de matériel génétique (ADN), mais aussi pour le clonage d'un gène entier permettant la production de la protéine recombinante correspondante.
• L'« insertion » est souvent réalisée à l'aide d'un vecteur, le plus communément utilisé étant une molécule d'ADN appelée plasmide .
Outils
Enzymes
Vecteurs
Cellules
Enzymes:
Outils
o Couper de l ’ADN • DNase • Nucléase S1
o Ligaturer de l ’ADN • Ligase phage T4
o Eliminer ou ajouter de groupement phosphate • Phosphatase • Polynucléotide kinase
o Copier de l ’ADN en ADN • ADN polymérase Fragment de klenow
o Copier de l ’ARN en ADN • Transcriptase inverse
o Copier de l ’ADN en ARN • ARN polymérase spécifiques
Vecteurs:
Outils
PLASMIDES PHAGES
COSMIDES
YACPAC
BAC
Structure et rôle des PLASMIDES
Structure d ’un plasmide – Elément génétique dans le cytoplasme de la bactérie – ADN double brin circulaire - linéaire possible – Taille 1 à 1000 kb – En moyenne 0,2 à 4% de la taille du chromosome – Forme super-enroulée dans la cellule
Observation par microscopie électronique
Des milliers de plasmides différents
dans la nature – Isolement de 300 plasmides
naturels chez E. coli
Rôle des plasmides – Transfert de matériel génétique – Construction de diploïdes
partiels – Véhicule de clonage
Structure et rôle des PLASMIDES
PlasmideChromosome
Caractéristiques des PLASMIDES
Résistance • Antibiotiques • Métaux lourds (Cadmium, Cobalt, Mercure, Nickel,
Zinc)
Virulence Production de bactériocines Besoin de plasmides
• Facilement manipulables • Non self transmissibles • Nombre de résistance limité
Propriétés pour être un bon vecteur de clonage Origine de réplication indépendante de celle du chromosome Petite taille ADN circulaire Nombre de copies élevé
Réplication relâchée (relaxed)
Réplication stricte (stringent) Présence de marqueurs sélectionnables
Gènes de résistance aux antibiotiques Présence de sites uniques de coupure par des enzymes de restriction Transfert contrôlable vers l ’hôte
Modification pour empêcher le transfert naturel
Transfert par transformation choc thermique ou par électroporation
Caractéristiques des PLASMIDES
Quelques exemples des PLASMIDES
Quelques exemples des PLASMIDES
Cellules
Toute bactérie capable d’accepter notre vecteur de clonage et de le multiplier tout en permettant de
l’identifier facilement sans gêner notre marqueur sur le quel on va se baser pour sélectionner les bactéries
transformées.
Outils
Techniques
Extraction et purification de l’ADN génomique
Après extraction et purification il faut isoler le gène :
Techniques
Préparation du vecteur de clonage
Techniques
Transformation des Bactéries:
Techniques
Ligation:
Insert
ADN Plasmidique
Plasmide recombinant
Plasmide non recombinant
Techniques
Transformation des Bactéries:
Cette étape se fait selon 2 processus:Choc électrique ou électro-porationChoc thermique
Techniques
électroporateur
Criblage:
Il y as deux types de criblage :Un criblage négatifUn criblage positif
Techniques
Criblage:
Un criblage négatif
Techniques
Techniques
Un criblage positif
Criblage:
Techniques
Techniques
Criblage:
Un criblage positif
Techniques
Criblage:
Un criblage positif
Techniques
Exemple d’utilisation
Les bactéries méthanogènes, responsables de la méthanisation.
Elles se nourrissent de molécules organiques présentes dans leur environnement et transforment le gaz carbonique et l’hydrogène contenus dans ces molécules en méthane et en oxygène.
C’est donc grâce aux bactéries productrices du biogaz que nous sommes là aujourd’hui, puisque c’est à elles que nous devons l’apparition de l’oxygène sur Terre.
Méthanisation:
Exemple d’utilisation
En dehors de la production du biogaz, la méthanisation des déchets organiques va améliorer les caractéristiques des effluents résidus. La valorisation du biogaz en carburant permet de réduire l’émission de méthane dans l’atmosphère, phénomène particulièrement important au niveau des élevages.
le biogaz est avant tout une énergie renouvelable qui peut sensiblement diminuer les besoins en énergies fossiles.
Les avantages de la méthanisation:
Exemple d’utilisation
Méthanisation:
Exemple d’utilisation
Les enzymes qui viennent du froid:
Ces protéines qui catalysent les réactions biochimiques à la base du fonctionnement de toute cellule vivante, sont largement employées par l'industrie dans des applications aussi diverses que :
la préparation d'aliments, la formulation de lessives ou la détection de polluants par des biosenseurs. La plupart des organismes dont sont originaires les enzymes actuellement utilisées vivent dans des environnements compris entre 30 et 40°C et leur efficacité est très sensible à la température
Exemple d’utilisation
Les enzymes qui viennent du froid:
Quelques unes des activités enzymatiques étudiées dans le cadre de Coldzyme et leurs domaines possibles d'application
ALPHA-AMYLASE boulangerie, textile, brasserie, détergents
CELLULASE nettoyage des pierres, biopolissage
BÉTA-GALACTOSIDASE
élimination du lactose du lait
LIPASES additifs de détergents, aromes
PROTÉASES additifs de détergents, attendrissement des viandes
XYLANASES boulangerie
Conclusion
MERCI POUR VOTRE ATTENTION