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1. INTRODUCCIÓN
La superficie plantada con cerezos en Chile ha experimentado un fuerte
aumento en los últimos años, al variar de 2.653 hectáreas en 1994 a 6.020
hectáreas el 2001 y 7.200 hectáreas al 2004, con producciones que superan
las 32.000 toneladas (ODEPA, 2005).
Este crecimiento se ha ido generando debido al aumento en tierras
cultivadas con este frutal, las cuales se han realizado en algunas zonas que
anteriormente eran poco tradicionales para el desarrollo de este cultivo,
como la IV, VIII, IX y XI regiones, obteniéndose resultados promisorios en
cuanto a producción. Junto con esto, las regiones tradicionalmente
productoras como la VII región, han realizado notorios incrementos en
superficie (FIA, 2003).
El aumento de plantaciones se ha debido a diversos factores, dentro de los
que se destaca, un buen resultado obtenido en las exportaciones, y también
la introducción de nuevas variedades que permiten alcanzar mayor
precocidad, menor requerimiento de frío y resistencia a partidura de frutos
por lluvias, características que mejoran la calidad y cantidad de fruta para
cosecha, y una ampliación en el período de oferta de esta fruta (FIA, 2003).
Dentro de las principales regiones productoras, la VII es la región líder, con
una superficie de 3.184,5 hectáreas al 2002 (ODEPA, 2005).
Por esto, se ha debido incrementar el estudio en nuestro país de las plagas y
enfermedades que atacan a este frutal, los que afectan en forma directa la
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cantidad y la calidad de fruta cosechada, haciendo disminuir los ingresos a
los productores. Entre estas enfermedades, destacan los virus, los cuales no
siempre son fáciles de detectar, y que son una de las causales más
importantes de pérdida en la producción de cerezas tanto en Chile como en
el mundo (WEBSTER, 1996).
Existe una amplia variedad de virus descritos para cerezos y guindos en todo
el mundo, los cuales varían en su importancia económica sobre el
hospedero, así como también en sus características epidemiológicas, la
forma de transmisión (material de injertos, polen, semillas, inóculos
artificiales, nemátodos y otros vectores), propiedades físico-químicas y en su
especificidad serológica.
A nivel mundial, se han descrito variados reportes sobre huertos afectados
con virus, los que van desde zonas europeas (Gran Bretaña), Estados
Unidos (Idaho, Montana, Oregon, Washington, etc.), Canadá y Latinoamérica
(Argentina, Chile) (MINK, JONES; 1996), donde no solamente se han
descrito en cerezos, sino que también en durazneros, nectarinos, nogales y
ciruelos (WOOD, 1996; WOOD, TATE, MANKTELLOW, MORTON, KALE.,
1997;; DAL ZOTTO, NOME, Di RIENZO, DOCAMPO, 1999; HERRERA y
MADARIAGA, 2002).
En Chile, se han efectuado estudios a través de organizaciones tanto
estatales como privadas, donde se han desarrollado muestreos sobre la
incidencia de enfermedades provocadas por virus en viveros (HERRERA Y
MADARIAGA, 2002), con fuerte importancia de Prunus necrotic ringspot virus
y Prune dwarf virus y en huertos (MILLET, 1991; MATTÍA, 2001), realizando
diagnósticos y prospecciones de enfermedades virales en la VI y VII
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regiones, las cuales incluyen no sólo al cerezo, sino que a todos los Prunus,
especialmente en el caso de los virus anteriormente señalados. A través de
los años, se han desarrollado muchos estudios sobre la implicancia que los
virus poseen en la reducción de la producción que desarrollan plantas
infectadas, obteniéndose datos de entre un 10% y 75% de pérdida
productiva, esto acompañado de un menor tamaño de las plantas y de una
reducción del área foliar. Esta situación se complica cuando la infección es
mixta (SCOTT et al., 2001).
El método tradicionalmente empleado para la detección de virus es el uso de
pruebas biológicas, mediante el empleo de plantas herbáceas y/o leñosas,
en donde al inocular tejidos aparentemente contaminados en las plantas
indicadoras, éstas expresarán los síntomas de la enfermedad,
comprobándose la existencia del patógeno.
Otra forma de detectar la presencia de virus en cerezos, es mediante la
realización de pruebas serólogicas, específicamente con el método de
ELISA-DAS, con el cual se detecta el virus, si éste se encuentra en la planta.
La sintomatología que se muestra en plantas que ven su rendimiento
afectado en forma creciente, con anomalías tanto físicas como biológicas
visibles, y la necesidad de hallar los posibles causantes de estos problemas,
han hecho a la ciencia investigar de diferentes formas la incidencia de virus
en estas plantas. Actualmente, la forma más común de estudiar síntomas
asociados a virosis en plantas de cerezo, incluso en infecciones mixtas es la
realización de pruebas biológicas y no así de forma serológica, que puede
ser, si bien un poco más lenta, útil en demostrar fehacientemente la
presencia de un virus.
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La utilización de pruebas biológicas y serológicas conjuntamente en el
análisis de plantas de cerezo con síntomas asociados a virosis, puede
presentar una alta utilidad en el hallazgo de éstos patógenos, ya que se
obtiene una mayor seguridad y se disminuye la incertidumbre a la hora de
emitir un diagnóstico al contar con ambas técnicas en forma paralela.
Los objetivos principales de la investigación fueron: Analizar en diferentes
huertos de cerezos, plantas con síntomas de estar afectadas por virus,
determinando la presencia de éstos en las plantas, determinar la presencia
de virus en muestras seropositivas, mediante el empleo de prueba biológica
con porta injerto GF 305. Además, se contempló la conservación de éstos
aislados en plantas leñosas.
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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Antecedentes del cerezo: 2.1.1. Clasificación botánica
Prunus es un nombre nativo del ciruelo silvestre y avium proviene del latín
que significa "de los pájaros", aludiendo al consumo de sus frutos por éstos.
El cerezo (Prunus avium L. (P. silvestris Ray o Cerasus avium L. (Moench)))
pertenece al orden Rosales, familia de las Rosáceas, de la cual también
proceden la mayoría de los frutales de carozo. Presenta flores blancas, las
cuales se presentan en grupos de cuatro o cinco en yemas sobre madera de
un año de edad, y sobre dardos, en yemas agrupadas alrededor de una
yema vegetativa sobre madera de dos años o más. Los frutos formados son
drupas de colores rojos a negros, de forma redondeada y de tamaño
pequeño, llegando su diámetro a los dos centímetros aproximadamente. Las
hojas son largas, de borde aserrado y con glándulas aparentemente
nectarias, cercanas a la lámina (WEBSTER, 1996).
2.1.2. Ubicación geográfica de origen
Se dice que el cerezo es originario de la zona asiática, más específicamente
del norte de Irán, Ucrania, en el Mar Negro y Mar Caspio, y otros lugares
cercanos a las montañas caucásicas. Según WEBSTER (1996), también es
nativo de algunas zonas de Europa, en lugares cercanos a Suecia, Grecia,
España e Italia, lugares donde comenzó a dispersarse mediante el traslado
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de pájaros, que al comer sus frutos, depositaban las semillas en otros
lugares, junto a sus fecas, lo que le aportaba además una buena fertilización.
El hecho de que este frutal se encuentre en tantos lugares y climas distintos,
muestra su amplia adaptabilidad climática y edáfica, siendo siempre dentro
de los rangos de climas templados (MEDEL, 1998; WEBSTER, 1996).
2.1.3. Otras especies asociadas
Existen otras especies dentro del grupo “cherries”, entre las que destacan el
guindo ácido (Prunus cerasus L.), el cual también es utilizado para
producción de frutos, pero en menor medida que el cerezo dulce, el cerezo
de flor o Mahaleb (Prunus mahaleb L.), el cual se ha utilizado por su madera,
su aroma en flor y además por su popular función de portainjerto tanto de
cerezos como de guindos, Prunus tomentosa, Prunus pseudocerasus,
Prunus pumila, Prunus fruticosa, los cuales han sido multiplicados
principalmente por sus características ornamentales, entre otros (WEBSTER,
1996).
2.1.4. Enfermedades que afectan al cerezo presentes en Chile
El cerezo en Chile es hospedero de una amplia gama de patógenos, los
cuales causan distintas sintomatologías y problemas. Su importancia, radica
en el efecto que tengan sobre la producción y que se pueda traducir en
mermas económicas.
Los agentes infecciosos que causan enfermedades en el cultivo del cerezo
son: hongos, bacterias y virus. Dentro de las enfermedades fungosas
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destacan: tizón de la flor (Monilinia laxa), corazón negro (Verticillium dahliae,
Kled), pudrición gris (Botrytis cinerea), pudrición del cuello (Phythopthora
cactorum), plateado (Chondostereum purpureum), entre otras. Entre las de
origen bacterial destacan dos que son: Agallas del cuello (Agrobacterium
tumefaciens) y el cáncer bacterial (Pseudomonas syringae pv. syringae).
Todas estas enfermedades tienen algún grado de control, ya sea mediante el
uso de diversas prácticas culturales de manejo y/o productos químicos. En
cambio, los virus no se pueden controlar una vez establecidos en el huerto.
Entre los más citados que afectan a este frutal destacan: Prunus necrotic
ringspot virus (PNRSV) o anillado necrótico de los Prunus, Prune dwarf virus
(PDV) o enanismo de los Prunus, Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV),
Cherry leaf roll virus (CLRV) y Tomato ringspot virus (TomRSV), y otros
menos comunes como Cherry rasp leaf virus, Cherry necrotic rusty mottle
virus, Cherry short stem virus, Little cherry virus y Green ring mottle virus
(SÁNCHEZ, 2000, VALENZUELA, 1998).
Existen otras enfermedades que afectan al cerezo, pero que no han sido
descritas en Chile, como por ejemplo, el mildiú polvoriento (Podosphaera
clandestina L.), cloca del cerezo (Taphrina cerasi S.), Little cherry virus,
cáncer negro del cerezo, entre otros (GROVE, 1995; HANSEN, 1995;
PSCHEIDT, 1995; WATERWORTH, 1995).
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2.2. Prunus necrotic ringspot virus:
2.2.1. Características del agente causal
El virus del anillado clorótico, o mancha anular de los Prunus pertenece al
grupo de los Ilarvirus. Varía desde formas isométricas a otras baciliformes,
con radios axiales entre 1,0 a 1,5 nm. Algunos aislados tienen partículas
baciliformes de más de 70 nm de largo. Está compuesto por una hebra
simple de RNA de entre 0,3 a 1,3x106 Da (MINK, 1995). Esta enfermedad se
encuentra ampliamente distribuida entre las especies del género Prunus,
debido a su facilidad para dispersarse en condiciones de campo. En Chile,
este virus fue identificado mediante análisis serológico (ELISA) en el año
1987, en huertos comerciales de duraznos (ASCUI y ALVAREZ, 1988).
Es un virus extensamente distribuido y además uno de los virus
económicamente más importante de los Prunus. El daño depende de la
severidad de ataque en la planta, la variedad cultivada, la agresividad o
virulencia del virus, y de las condiciones ambientales.
Según un estudio realizado por HERRERA Y MADARIAGA (2002), en
viveros de la zona central, de un total de 1510 plantas sintomáticas testeadas
de cerezos, el 10,9% de ellas presentó el virus. Recientemente, HERRERA y
MADARIAGA (2002), demostraron que PNRSV es uno de los virus comunes
a nivel de viveros y sus rangos de infección en material de propagación
fluctuaron entre 3% y 29%. Aún mayores fueron los niveles de infección
encontrados por SANCHEZ, HEPP y VENEGAS (2000) en cerezos de la VII
región, donde en promedio se identificó el virus en el 48% de las muestras.
En ensayos realizados en Estados Unidos, las pérdidas por este virus incluso
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han llegado a ser del orden de 3,75 toneladas menos por hectárea
(HERRERA, 1993).
2.2.2. Sintomatología
El daño de la infección por PNRSV se puede manifestar como muerte de
brotes y raíces, crecimiento reducido en árboles jóvenes (DAL ZOTTO,
NOME, DI RENZO, DOCAMPO, 1999).
Los síntomas que genera este virus, se pueden comparar al producido por un
hongo, Wilsonomyces carpophillus (Coryneum beijerinckii), que produce tiro
de munición en los frutales de carozo. Se diferencian que en este caso las
manchas necróticas están rodeadas por un halo rojizo, y estas aparecen en
las hojas, en ramillas, flores y frutos. Este tejido necrosado cae y deja a la
lámina con signos de perforación (LATORRE, 2004). También debe
diferenciarse del ataque de una bacteria ausente en Chile, Pseudomonas
morsprunorum la cual induce síntomas parecidos a los causados por
PNRSV, pero las manchas que presenta la lámina son aún más irregulares
(INIA, 2005).
En general, PNRSV se manifiesta con clorosis, necrosis, deformaciones, y
cierto grado de enanismo. Los síntomas se expresan uno o dos años
después de la infección. En los años siguientes, la planta puede o no mostrar
la sintomatología. Se caracteriza por producir en las hojas recién emergidas
anillos o manchas cloróticas difusas o intenso anillado necrótico, que da un
aspecto aperdigonado, dejando a las hojas sólo con nervaduras. Causa un
retardo de la inducción de yemas, muerte de ramillas de la estación anterior y
cancros en la corteza.
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Según datos del INIA (2005), las pruebas biológicas realizadas a plantas
indicadoras del género Prunus muy susceptibles al virus, muestran dentro de
las cuatro a cinco semanas una excesiva cantidad de gomosis y muerte del
floema y xilema de las plantas.
2.2.3 Transmisión
El virus presenta a lo menos tres vías de diseminación en condiciones de
campo; polen, semillas y material de propagación. Esta característica la
constituye en una de las enfermedades virosas más comunes de los viveros
de frutales de carozo. En la mayoría de las especies de Prunus presentan un
grado de susceptibilidad a uno o más aislamientos. Se transmite
artificialmente mediante transmisión mecánica a plantas de las familias
Cucurbitáceas y Chenopodáceas.
La longevidad máxima que este virus puede tener in vitro es de seis a
dieciocho horas, y su punto de inactivación termal varía en un rango de 55°C
a 62°C (NEMETH, 1986).
Según STEIN et al. (1991), en trabajos realizados con Prunus domestica, la
mejor inhibición de PNRSV se obtiene con termoterapia, mediante la
aplicación por 18 días de temperaturas de 38°C por 16 horas a la luz
alternando con 28°C por ocho horas en oscuridad. Esta combinación fue
aplicada en la variedad Hermosa, obteniéndose un 90% de los brotes libres
de virus. MANGANARIS et al. (2003) se refiere a la eliminación de este virus
y de PPV utilizando termoterapia y cultivo de meristemas apicales en
nectarinos, aplicando durante tres semanas una temperatura máxima de
35ºC, lo que además facilita el crecimiento de los meristemas. Estos
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tratamientos también están siendo utilizados en la actualidad en cerezos y
guindos.
2.3. Prune dwarf virus:
2.3.1. Características del agente causal
El virus del enanismo del ciruelo, o simplemente enanismo, que es conocido
también en cerezos como "yellow leaf" o "physiological leaf drop”, pertenece
al grupo de los Ilarvirus. Son partículas isométricas de 19-20 nm de diámetro
hasta pequeños baciliformes de más de 73 nm de largo. Están compuestos
por RNA, el cual presumiblemente es de hebra simple (MINK, 1995). La
intensidad de esta enfermedad depende de la variedad, de la raza, de la
temperatura y de la edad de la planta (DAL ZOTTO, 1999). Según HERRERA (2002), un 9,0% de las plantas testeadas en distintos
viveros de Chile central presentaron esta enfermedad.
2.3.2. Sintomatología
Este virus genera una marcada diferencia en el crecimiento de plantas en
huertos comerciales, a diferencia de las plantas sanas, disminuyendo
además el rendimiento. Generalmente, presenta efectos sinérgicos con otros
virus, como los pertenecientes al grupo de los Nepovirus e Ilarvirus,
conformando una enfermedad denominada “Peach stunt disease” al
encontrarse junto a PNRSV, el cual tambén pertenece a éste último grupo
(INTA, 2005).
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Referencias del INIA (2005) en cerezos y guindos, indican que la enfermedad
se ha caracterizado por tener dos fases; en donde la primera es de infección
severa, ocurriendo uno o dos años después de la infección, y la segunda o
fase crónica, la cual se presenta en los años siguientes. En la infección
severa, las áreas cloróticas del tejido de las hojas son necrosadas dejando
posteriormente un orificio. En los años siguientes la enfermedad entra en su
fase crónica, mostrando síntomas sólo en algunos años y ellos son similares
a los de la fase severa.
DIEKMANN y PUTTER (FAO, 1996), señalan que Prune dwarf virus provoca
en cerezos una marca clorótica y anillos del follaje. Generalmente, las
variedades cultivadas de Prunus salicina y de híbridos de Prunus domestica
así como los portainjertos de cerezo "Mazzard" y Prunus mahaleb, y algunas
variedades de cerezo dulce, presentan la enfermedad, pero en forma
asintomática.
2.3.3. Transmisión
Junto a Prunus necrotic ringspot virus, conforman un grupo de presencia
común en los viveros, esto debido a que su forma de transmisión se produce
mediante el material de injertación, además de semillas y polen, lo que
convierte a los insectos polinizadores en vectores indirectos del virus, por el
hecho de transportar polen de plantas enfermas a otras sanas.
2.3.4. Efectos en diferentes portainjertos
Los portainjertos testeados en campo, dieron como resultado que tanto Colt,
Edabriz, Gisela 6, Gisela 5, Gisela 12, Damil, Maxma 14, Maxma 60, Maxma
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2, entre otros, poseen cierta tolerancia al PDV, PNRSV y/o su asociación.
Además de éstos, hoy en día existen nuevos patrones como Gisela 3, el cual
también ha sido descrito como tolerante a los Ilarvirus PNRSV y PDV
(FRANKEN-BEMBENEK, 2003; INTA, 2005).
Estudios realizados por LANKES (2003) demuestran que si existe una cierta
respuesta de algunos clones de portainjertos de Prunus, entre los que se
encontraron que: Colt, F 12/1, Gisela 5, Piku 1, Piku 3 y Piku 4, manifiestan
una mejor tolerancia que Gisela 6 y VVa-1, los que fueron clasificados como
parcialmente sensibles; y VSL-2, que fue catalogado como hipersensible al
virus, incluyendo la variación que se presenta entre el injerto y el patrón.
Las pérdidas por rendimiento pueden llegar a cifras de 30 a un 40% (SCOTT
et al., 2000).
2.4. Tomato ringspot virus: 2.4.1. Características del agente causal
Es el virus del anillo del tomate o conocido también como causante de la
enfermedad línea negra (LATORRE, 2004), el cual pertenece al grupo de los
Nepovirus. Posee un genoma bipartito de RNA con un peso molecular entre
2,05 a 2,17 x106 Da. Posee forma esférica con 28 nm de diámetro y una
coraza proteica compuesta por unidades polipéptidas simples (GONSALVES,
D., 1995).
En Chile se identificó por primera vez al ToRSV en 1987 (AUGER y
ESTEREO, 1987; INTA, 2005), aunque las plantas afectadas habían sido
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observadas desde 1984. Según HERRERA (2002), de las 1510 plantas de
cerezos analizadas en diferentes viveros de la zona central de Chile, de
forma al azar, un 8,7% de estas se encontraba infectada con este Nepovirus.
Se reconocen varios nombres de éste virus, dependiendo de la
sintomatología que las plantas presenten, y de la combinación de patrón y
variedad. Destacan: Brown line, Peach yellow bud mosaic y Prune stem
pitting, entre otros (GONSALVES, 1995).
2.4.2. Sintomatología
Los cerezos afectados se caracterizan por sus ramas con apariencia
desvestida, sin hojas, la cual comienza en las porciones mas bajas del árbol
avanzando lentamente hacia arriba. La enfermedad mata los ramilletes o
dardos, brindillas y pequeñas ramas. Las hojas sobre las ramas afectadas
son más pequeñas con nervaduras secundarias algo blanquecinas y lámina
clorótica. Según DAL ZOTTO (1999), el tamaño de los frutos tiende a ser
menor con adelantamiento de la madurez y bajo sabor, disminuyendo así la
producción.
Los rendimientos comienzan a disminuir considerablemente después del
tercer a quinto año de infección. Una misma rama infectada puede presentar
hojas sanas y enfermas. El ToRSV produce sobre cerezos síntomas iniciales
de estrés con una serie de manchas cloróticas sobre las hojas asociadas a
las nervaduras, junto con presencia de hojas con enrollamiento hacia arriba,
seguidas de necrosis marginal. Según NEMETH (1986), los cerezos sobre
Prunus mahaleb presentan los primeros síntomas a los tres-cinco años,
mientras que sobre P. avium no presenta síntomas por muchos años.
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2.4.2.1. Brown line
Los árboles del género Prunus al contraer ToRSV, poseen un crecimiento
bajo y follaje disperso. Ciruelos sobre mirobalán (Prunus ceracifera E.)
presentan una marcada disminución del crecimiento en el sector bajo la
unión, con zonas necróticas bajo la corteza, que dan el nombre a esta
enfermedad. Las plantas mueren por falta de transporte de nutrientes hacia
la parte aérea, ya que la respuesta hipersensible de la planta hace que la
zona tenga sólo células muertas.
2.4.2.2. Peach yellow bud mosaic
En cerezo, las hojas de las plantas infectadas presentan una severa
limitación de su crecimiento, muriendo al comienzo del aumento de las
temperaturas. Sus síntomas varían a través de los años, teniendo hojas
amarillas, anillos cloróticos y/o mosaicos al primer año, y yemas amarillas en
los brotes, que generalmente mueren durante la temporada de producción
frutal. Además se puede observar una producción menor a la normal.
2.4.2.3. Prunus stem pitting
Las plantas de cerezo afectadas por esta enfermedad, presentan una
coloración amarilla o rojiza en forma prematura, cayendo tempranamente. La
corteza se torna esponjosa bajo ella se generan acanaladuras, siendo más
notorio sobre y bajo el área cercana a la línea del suelo. P. mahaleb muestra
unas pequeñas y difusas punteaduras, mientras que en Stockton Morello (P.
cerasus) se muestra principalmente una necrosis en la zona cambial
(GONSALVES, 1995).
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2.4.3. Transmisión
La forma de transmisión de este virus es naturalmente mediante nemátodos
del género Xiphinema por medio de la alimentación de éstos en las raíces de
los hospederos. Por tanto, la dispersión en el huerto está limitada a la
capacidad migratoria de los vectores. Desde las raíces infectadas, el virus se
mueve hacia arriba por el tronco hasta ponerse en contacto con el tejido de
la unión patrón injerto. Debido a la alta susceptibilidad de las variedades se
produce la necrosis del tejido de unión, desencadenándose el proceso
denominado "Brown line", además de la transmisión mediante inoculación
mecánica e injertos de plantas enfermas (INTA, 2005).
2.5. Apple chlorotic leaf spot virus:
2.5.1. Características del agente causal
Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), es uno de los virus de mayor
distribución entre los frutales, afectando no sólo a frutales de carozo sino
también a pomáceas. Inicialmente el virus se identificó en Inglaterra
denominándolo "Platycarpa line pattern virus" y se le caracterizó como
latente en manzanos y perales. Posteriormente, se le detectó en especies de
frutales de carozo asociado a daños en los frutos e incompatibilidades en la
unión variedad portainjerto (DAL ZOTTO, 1999).
Pertenece al grupo de los Closterovirus. Es una hebra simple de RNA con un
peso molecular de 2,5 x106 Dalton (HANSEN, 1995). El peso molecular de la
sub unidad proteica cobertora es de 23,500 Kb. El ACLSV está ampliamente
distribuido en el ámbito mundial habiéndose reportado en Europa, África y
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América. En Chile, HERRERA (1993) lo ha detectado en durazneros pero no
se posee información sobre su diseminación a nivel de huertos comerciales y
viveros. Sin embargo, ACLSV se encuentra en huertos tanto de manzanos
como de perales.
Su importancia económica está dada por el daño directo que causa en las
plantas afectadas, el cual se muestra como daños en fruto y en la unión
variedad - portainjerto, y además otros daños que son indirectos, como
desórdenes escondidos, los cuales se pueden mostrar como alteraciones en
la traslocación de nutrientes entre las células de conducción y por acción
sinérgica con otros virus (INIA, 2005). La mayoría de los portainjertos
utilizados en Prunus son muy susceptibles a este virus de modo que las
partículas se multiplican abundantemente. En cerezos el virus es
asintomático.
2.5.2. Sintomatología
Los síntomas generalmente aparecen en las hojas, frutas y tronco, su
severidad depende mayoritariamente de la especie del cultivar y de la raza
del virus. Algunas razas pueden causar hendiduras en el tallo o
sintomatología semejante a “Pseudopox” en las frutas de durazno, damasco
y ciruela. En conjunto con un Ilarvirus como PNRSV, la infección puede
causar necrosis y manchas profundas en las frutas, tanto en cerezas dulces
como agrias. La mayoría de los cultivares se infecta latentemente por el virus
(INIA, 2005).
Algunas razas causan en el injerto una incompatibilidad o malformación de
frutas severa.
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2.5.3. Transmisión
DIEKMANN (1996), asegura que la transmisión de este virus se realiza por
injerto e inoculación artificial en la savia. Los indicadores leñosos principales
usados para el descubrimiento de ACLSV son GF 305, que reacciona con un
verde oscuro y un moteado en las hojas, y Prunus tomentosa .
2.6. Cherry leaf roll virus:
2.6.1. Características del agente causal
Pertenece al grupo de los Nepovirus. Este grupo se caracteriza comúnmente
por tener una morfología poliédrica particular, con un diámetro de 28 nm, y
una hebra simple de RNA con pesos que varían entre los 1,3-2,4 x106 , a 2,6
x106 Dalton. Es un virus raro en cerezos, pero mucho más común en nogales
(Juglans regia L.), en donde la enfermedad es conocida como línea negra o
“Black line” (INIA, 2005).
2.6.2. Sintomatología
Los síntomas aparecen generalmente en hojas y en troncos, en donde la
severidad depende generalmente de la especie cultivada y de la raza del
virus. Según NEMETH (1986), el virus puede inducir retraso en la floración,
pedicelos cortos, hojas enrolladas y muerte de la planta. En otras especies
puede producir anillos cloróticos, y amarillamiento de venas.
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En la mayoría de los casos, el virus causa la muerte de la planta a los cinco
años, pero en sinergia con otros virus, como PDV y PNRSV, el proceso de
deterioro se acelera (NEMETH, 1986).
2.6.3. Transmisión
El virus es transmitido por material de injertación, polen y semillas.
Xiphinema coxi, X. diversicaudatum y X. vuittenezi han sido reportados como
vectores transmisores de CLRV (DIEKMANN, 1996).
Tiene como hospedero a varias especies de nogal, a olivos (Olea europea),
ciruelos (Prunus cerasifera), durazneros (Prunus persica) y cerezos (Prunus
avium).
En nogal, que es la especie que más comúnmente presenta esta
enfermedad, la principal forma de transmisión es mediante la injertación de
material infectado, aunque su traslocación dentro de la planta suele ser
errática y muy lenta. Incluso existen reportes de que luego de tres años de
inoculado el virus, no se ha presentado uniformidad ni respuesta
(ARAMBURU, NINOT y ALETÀ, 1997).
En este caso, la detección de CLRV en nogal, que comúnmente se realiza en
hojas, también puede realizarse tomando muestras de semillas posiblemente
infectadas, debido a que se ha comprobado la existencia de virus en estas
estructuras (TOPCHIINKA, 1993).
Según LANKES (2003), los portainjertos Colt, F 12/1, Gisela 5 y los clones
Piku 1, 3 y 4 se presentarían como tolerantes a estos virus, y los portainjertos
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Gisela 6 y VVA – 1 fueron declarados medianamente sensibles, debido a una
reducción en el crecimiento de los brotes y en el tamaño de sus láminas
foliares.
Su translocación dentro de plantas nuevas de carozo es comparativamente
más lenta, puesto que conforme a estudios realizados por CAMBRA et al.
(1986) en durazneros, a los 15 días de inoculado, el virus no presentó
translocación en la planta, no así PNRSV, que a la misma fecha mostró una
traslocación casi total.
2.7. Plum pox virus: 2.7.1. Características del agente causal
El virus del “Plum pox” o Sharka, pertenece al género Potyvirus, y es uno de
los más diseminados a nivel mundial en frutales de carozo. Existen diferentes
razas, entre los que destaca el tipo C, que es agresivo principalmente para
cerezos y guindos ácidos (CAMBRA et al., 2005).
2.7.2. Sintomatología
El virus de la Sharka, fue descrito entre 1915 y 1918 en ciruelos, en Bulgaria.
Su sintomatología se basa en la aparición de anillos tanto cloróticos como
necróticos, al igual que bandas cloróticas en el hueso, piel del fruto, flores y
hojas. La severidad del daño causado a plantas varía de acuerdo a la
especie del cultivar, la raza del virus, la época y el lugar en que este se
encuentre (LEVY, 2000).
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Las hojas también pueden caer, o sólo presentar los síntomas durante la
etapa de crecimiento. Los frutos se pueden presentar deformes.
HERRERA y MADARIAGA (2002), realizaron un estudio en diversos viveros
de la zona central, y entre 1510 plantas de cerezo, no hubo ningún resultado
positivo. Tampoco existen muchos registros de PPV en cerezos.
2.7.3. Transmisión
Su transmisión se produce por injerto, multiplicación vegetativa y
diseminación de forma natural por pulgones de modo no persistente (LEVY,
2000).
22
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Ubicación del experimento:
Esta investigación se realizó en el Laboratorio y en el invernadero de
Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad
Católica de Valparaíso.
3.2. Obtención de muestras de cerezo: La obtención de las muestras de Prunus avium aparentemente infectadas
con virus, se realizó de forma dirigida, ya que se buscaban plantas con
síntomas virales en los huertos que se visitaron, para asegurar la
recopilación de material enfermo, y establecer también una relación entre los
síntomas que presenta la planta y la posible enfermedad que ella padezca.
Éstas plantas fueron obtenidas desde huertos productivos, con jardines de
variedades, los cuales se encuentran ubicados en Quillota, Los Andes, San
Francisco de Mostazal (región Metropolitana), Morza (VI región), y predios
ubicados en Curicó (VII región).
Además, se recolectó material asintomático de partes de plantas que
presentaban síntomas en otros sectores, y plantas que no presentaban
síntomas aparentes.
23
3.3. Análisis serológico:
Para la realización de los exámenes serológicos a las muestras recolectadas,
se debió conocer previamente qué virus son los que serían buscados, ya que
el género Prunus es atacado por muchos virus y enfermedades, por lo que la
decisión fue buscar los que se encuentran en mayor incidencia tanto en
literatura como en otros estudios realizados en Chile, y considerando la lista
que fijó el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) para producir material
certificado. Es por esto que se analizó en las muestras de cerezo los
siguientes virus:
- Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV).
- Prune dwarf virus (PDV).
- Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV).
- Cherry leaf roll virus (CLRV).
- Tomato ringspot virus (ToRSV).
Los anticuerpos con los que se realizaron los exámenes serológicos en el
laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Agronomía son de marca
Bioreba, y son específicos para los virus buscados.
La lectura de las placas con las muestras tratadas, fueron realizadas con un
espectrofotómetro con un filtro de 405 nm., marca Bio-rad modelo 550, el
cual también se encuentra en el laboratorio antes mencionado. Se consideró
como positivas a todas aquellas muestras que superaron el doble de la
media de los controles negativos, y se realizó una vez obtenido los valores
de densidad óptica (DO) que entregó el instrumento.
24
3.4. Análisis biológicos:
Las plantas indicadoras utilizadas para inocular material con posible
infección, fueron plantas GF 305, portainjerto franco de Prunus persica, el
cual es susceptible a todos los virus señalados (BARBA, 1998), este material
fue obtenido de semillas certificadas importadas desde Francia (Res. N° 350
de SAG, 1981).
Cabe destacar que con anterioridad, estos portainjertos GF 305
permanecieron en el invernadero ubicado en la misma Facultad, con
temperaturas oscilantes entre los 15ºC y los 25°C, por lo que posteriormente,
presentaron un problema de brotación, ya que no alcanzaron a acumular las
horas frío necesarias. Posteriormente, estas plantas se mantuvieron bajo
invernadero, ubicado en la Facultad de Agronomía.
Para el caso de la injertación de yemas de cerezos sobre GF 305, se utilizó
material obtenido desde el huerto de cerezos de la Facultad de Agronomía, a
los que previamente se les realizó test de ELISA-DAS con los seis diferentes
anticuerpos antes mencionados para verificar su sanidad, y también de las
plantas traídas de la estación experimental El Guindal, ubicada en la ciudad
de Los Andes.
Con el propósito de hacer análisis fitopatológicos, se obtuvieron cerezos
variedad Rainier, las cuales llegaron a la Universidad en estado de
dormancia, sin hojas.
25
3.5. Conservación de muestras y aislados: En cada prueba de ELISA-DAS que se realizó durante el período de
ensayos, se obtuvieron extractos de todas las plantas analizadas,
independientemente que luego de la lectura se comprobara que tenían o no
virus. Estos extractos, fueron almacenados a –20°C en el laboratorio de
Fitopatología de la Universidad, para efectos de estudios posteriores, o para
ser utilizados como futuros controles positivos (en caso de presentar virus) o
como controles negativos, si la planta se encontraba sana.
Para la conservación de aislados de virus presentes en plantas de cerezo, se
procedió a inocular plantas de GF 305, previamente analizados de estar
libres de virus, empleándose para este efecto un injerto parche (sin yema) de
la muestra a conservar, la que era introducida a la planta indicadora
mediante una incisión en forma de T, haciendo dos injertos en cada planta,
dejándose dos plantas por virus como repeticiones de cada material
infectado.
3.6. Análisis efectuados:
La inoculación de los portainjertos de GF 305, se realizó al igual que la toma
de muestras de los cerezos obtenidos en la estación experimental El Guindal
(Los Andes), en un invernadero ubicado en la Facultad de Agronomía.
Se realizaron siete análisis serológicos en laboratorio, comenzando el 11 de
marzo, y luego el día 1 de abril, 20 de mayo, 28 de octubre y 3 de noviembre
del año 2005, mientras que el año 2006 se realizaron los restantes el día 3
de enero y 19 de enero.
26
El primer examen de ELISA-DAS efectuado se realizó con plantas ubicadas
en el huerto de cerezos que se encuentra en la Facultad de Agronomía de la
Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, incluyendo variedades como
Van, Bing, Brooks y Lapins. Durante el segundo procedimiento, se utilizaron
muestras obtenidas de una colección de variedades y portainjertos de la
Estación Experimental El Guindal, de Los Andes, las que incluían variedades
como Bing, Van, Santina, y patrones como Maxma 14, Gisela 6, Prunus
mahaleb, entre otros.
Con las muestras de esta última experiencia, se inocularon seis plantas del
portainjerto franco GF 305, dos plantas por cada virus detectado. El material
injertado corresponde a corteza de árboles de cerezo testeados, de madera
de un año, realizando dos injertos en T en cada planta.
El tercer procedimiento de ELISA-DAS efectuado se realizó con muestras
obtenidas de cerezos var. Sunana, de un huerto ubicado en la zona de San
Francisco de Mostazal, VI región. Junto con esto, se realizó la inoculación a
las plantas indicadoras con este material.
El cuarto análisis efectuado se realizó con las plantas GF 305 que habían
sido inoculadas con parches de material infectado obtenido luego de realizar
el primer, segundo y tercer análisis. Para el quinto, se analizaron las plantas
de cerezo variedad Rainier, sobre portainjerto Prunus mahaleb, que habían
sido obtenidas desde El Guindal, en Los Andes, y que permanecían en un
invernadero acondicionado en la Facultad de Agronomía de la PUCV.
El sexto análisis, se hizo con la intención de encontrar plantas sanas y libres
de virus en el huerto que se encuentra en la Facultad, para poder injertar
27
yemas de éstas en las plantas indicadoras GF 305, y poder realizar estudios
en forma posterior. Las variedades utilizadas fueron Van, Cristalina, Rainier,
Garnet, Newstar, Bing, Lapins, Brooks y Tulare. El séptimo análisis, fue
realizado con las muestras de plantas GF 305 que fueron inoculadas con
plantas enfermas obtenidas del quinto examen, para verificar nuevamente el
traspaso de virus de plantas enfermas a otras sanas, más las muestras
obtenidas en huertos de la VI y VII regiones de variedades Sunana, Bing y
Van.
Todos los extractos que se obtuvieron de estos análisis, fueron guardados y
congelados a -20ºC en el Laboratorio de Fitopatología de la Facultad.
28
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Sintomatología observada: En los cuatro huertos en que fueron analizadas plantas de cerezo, pudieron
ser observados las siguientes sintomatologías.
4.1.1. Enanismo
Reducción en el tamaño total de las plantas, las que fueron identificadas a
simple vista por la clara diferencia de tamaño que presentaban con respecto
a otras plantas vecinas, existiendo asociación con PNRSV y PDV, los que
posteriormente fueron detectados en éstas plantas. 4.1.2. Mosaico La presencia de mosaico clorótico en láminas foliares, presente en forma
aleatoria dentro de las plantas sintomáticas, fueron identificadas por la
variación de colores que presentaban las láminas, las que mostraron una
directa asociación con PNRSV, el cual fue encontrado en ellas.
4.1.3. Anillos y deformaciones
Los anillos irregulares, similares al tiro de munición, se encontraron
presentes tanto en hojas adultas como jóvenes, en forma aleatoria dentro de
la planta, del mismo modo que el mosaico. Las plantas que presentaron ésta
sintomatología, dieron como resultado la presencia de PNRSV y PDV.
29
En cuanto a las hojas deformadas, éstas se encontraron principalmente en
brotes de la temporada, y, al igual que la sintomatología anterior, las plantas
que presentaron deformaciones estaban con presencia de los mismos virus
antes mencionados.
4.1.4. Brotes arrosetados.
Ésta sintomatología, que principalmente se encontró en forma apical en
plantas de cerezo, tiene una clara asociación con el virus del enanismo,
aunque las plantas analizadas dieron como resultado no sólo este virus, sino
que en sinergia con PNRSV.
4.2. Resultados obtenidos mediante ELISA-DAS: En total se recolectaron 137 muestras que incluyeron cerezos (65 muestras),
portainjertos GF 305 (71 muestras) y Prunus mahaleb (una muestra), las
cuales se encuentran ordenadas cronológicamente según la fecha en que se
les realizó el test ELISA (Cuadro 1), obteniéndose plantas con distintos virus,
y algunas plantas con la presencia de más de un virus.
30
CUADRO 1. Virus presentes en muestras de cerezo extraídas durante otoño y primavera 2005 y verano 2006, analizadas mediante test ELISA-DAS.
Muestras positivas Región Fecha
examen Especie/patrón
Total plantas
analizadas
Total plantas positiva PNRSV PDV CLRV ToRSV ACLSV
PNRSV+PDV
V 11-03-05
Cerezo (1)
8 2 2 0 0 0 0 0
V 01-04-05
Cerezo (2)
7 4 1 2 1* 0 0 0
VI 20-05-05
Cerezo (3)
3 0 0 0 0 0 0 0
V 28-10-05
Cerezo var.
rainier 23 22 21 12 0 0 0 11
V 03-01-06
Cerezo (5)
18 13 8 4 0 0 0 0
V 03-01-06
Prunus mahaleb
1 1 1 0 0 0 0 0
VI y VII 19-01-06
Cerezo (6)
5 0 0 0 0 0 0 0
TOTAL 65 42 33 18 1* 0 0 11
(1) Van, Bing, Brooks y Lapins, (2) Bing, Van y Santina, (3) Sunana, (4) Rainier, (5) Van, Cristalina, Rainier, Garnet, Newstar, Bing, Lapins, Brooks y Tulare, (6) Sunana, Bing y Van.
Del total de muestras analizadas, incluyendo aquellas que fueron inoculadas
con material infectado, el virus de mayor incidencia fue PNRSV, con un
50,76%, seguido por PDV, el cual se encontró en un 27,69% de las muestras
examinadas. CLRV fue encontrado en un 1,53% del material recolectado.
CLRV (con * en el cuadro) se encontró en una de las plantas inoculadas con
este virus, sin embargo; este resultado es dudoso, puesto que tanto en el
control positivo como el negativo, se encontraron problemas, ya que al
momento de la lectura no marcaron una diferencia notoria entre uno y otro, y
tampoco se pudo diferenciar el positivo de la muestra, la que fue mayor al
31
control, además de esto, se obtuvo un 42% de lectura de DO superior al
control negativo, por lo que técnicamente se confirma que es un resultado
negativo.
Para el caso de ToRSV y ACLSV, no se encontraron muestras que
presentaran ninguno de estos virus.
En el caso de los análisis realizados a plantas establecidas en huertos, el
virus predominante fue PNRSV, con una presencia en 33 de las 41 muestras
colectadas. A continuación se encuentra PDV (Figura 1), con 18 de las
muestras colectadas. Cabe destacar, que en un buen número de las
muestras en que se encontró PNRSV (11 de 18), estaba actuando
sinérgicamente con PDV, lo que se confirma con estudios realizados por
LANKES (2003); MANGANARIS et al.(2003); WOOD, TATE, MANKTELOW,
MORTON, KALE.(1997); ANDERSONE et al.(2002) y SILVA et al.(2003),
donde se señala que es común encontrarse con estos Ilarvirus afectando una
planta en forma conjunta.
32
05
10152025303540
Nº Muestras positivas
Muestras positivas
VIRUS
PNRSV
PDV
ACLSV
CLRV
ToRSV
PNRSV+PDV
FIGURA 1. Incidencia de cada virus por número de muestra positiva del total de análisis.
En este gráfico demuestra la dominancia del Ilarvirus Prunus necrotic
ringspot virus por sobre los demás, lo cual no debiera sorprender, ya que
este virus, junto a PDV, son unos de los más comunes de encontrar en
Prunus, tanto en viveros de frutales como en huertos establecidos, lo cual
concuerda con lo señalado por HERRERA y MADARIAGA (2002), sobre el
problema que existe con viveros de la zona central que, si bien traen material
varietal desde centros de producción europeos y que cuentan con
certificación, los portainjertos son formados en Chile. Es así como el ejemplar
analizado de P. mahaleb (Cuadro 1), que aunque pueda ser tolerante, la
partícula viral es transmitida a la variedad injertada, y una vez establecidas
en el huerto, diseminan el inóculo vía polen, teniendo como vector
secundario a abejas y otros agentes polinizadores.
33
4.3. Pruebas biológicas con GF 305: Las plantas utilizadas para la inoculación de los virus encontrados en plantas
de cerezos, fueron obtenidas a partir de semillas traídas de Francia, las
cuales eran certificadas, por lo que se asumió que éstas se encontraban
libres de virus. De todas formas, y a manera de asegurar su sanidad, se les
realizó un análisis mediante test de ELISA-DAS, el que arrojó resultados
negativos para todos los virus analizados.
El material inoculado provino de muestras de plantas de cerezo que
resultaron positivas en el análisis serológico con Prunus necrotic ringspot
virus y Prune dwarf virus. Además, se añadieron a éstas inoculaciones
muestras de cerezos que no presentaron resultados positivos en los análisis
serológicos, pero que se sospechaba de la presencia de alguno de los virus
estudiados, como ToRSV, ACLSV y CLRV.
En total, se inocularon 31 plantas GF 305, de las cuales siete fueron
inoculadas el día cuatro de Mayo del 2005, y 24 fueron inoculadas el día 11
de Noviembre del 2005. Las plantas indicadoras que resultaron positivas en
la detección de virus a través de ELISA-DAS, presentaron los siguientes
síntomas:
-Anillos en las hojas, presentes en plantas inoculadas con PNRSV ó PDV.
-Brotes arrosetados, los que se presenciaron el las plantas inoculadas con
PDV.
34
-Mosaicos cloróticos, que fueron encontrados en plantas indicadoras
inoculadas con PNRSV y PDV juntas, y en plantas inoculadas con PNRSV.
En ninguna ocasión se presentó una exudación de goma, lo que difiere de lo
expuesto por los datos obtenidos de INIA (2005), donde se hace mención a
esta exudación, más la muerte de floema y xilema, que hasta las últimas
revisiones de las plantas, en donde ya habían pasado cinco semanas de
inoculado el virus, no mostraron muerte de tejidos vasculares.
Tampoco se evidenciaron muertes de brotes, ni cancros en la corteza de las
plantas inoculadas con PNRSV, lo cual contrasta con lo expuesto por DAL
ZOTTO (1999) y referencias de INIA (2005).
Se obtuvo un nivel de eficiencia en la inoculación de un 19,35%, ya que de
las 31 plantas inoculadas, sólo seis de éstas presentaron virus al realizar
ELISA-DAS, de las cuales cinco se obtuvieron a partir de la primera
inoculación, y sólo una de la segunda. Si bien el material enfermo que se
inoculó a las plantas indicadoras tuvo un buen prendimiento, y se esperó el
tiempo mínimo dado por literatura, que corresponde de cuatro a cinco
semanas (INIA, 2005), 23 de las 24 plantas inoculadas no dieron positivo en
el examen realizado en laboratorio, esto dado posiblemente por las
temperaturas elevadas que se generaron dentro del invernadero en donde se
encontraban las plantas inoculadas, lo cual se confirmaría con lo mencionado
por STEIN et al. (1991), sobre la inhibición de PNRSV con termoterapia
aplicada a plantas de Prunus domestica.
35
FIGURA 2. Síntomas presentados por plantas de cerezo (Prunus avium L.) infectadas con Ilarvirus, en colección de variedades en la V región (PUCV). A: Intenso anillado necrótico, con necrosis en borde de las hojas de cerezo, naturalmente infectado con PNRSV, B: Hojas deformes, dañadas, con clorosis y con crecimiento arrosetado de sus brotes, C: Daño en hoja, con borde necrótico y fuerte mosaico clorótico, tras ella, hojas con anillos necróticos, asociado a PNRSV y PDV, D: Anillamiento y deformación en hojas de cerezo variedad Rainier, asociado a PNRSV.
36
Para las plantas GF 305 inoculadas con material infectado proveniente de
cerezos, la mayor incidencia de infección se obtuvo con la primera
inoculación, realizada en mayo del año 2005, en el cual se encontraron tres
de los cinco virus analizados. Nuevamente, en los análisis realizados, el
Ilarvirus PDV se encontró actuando en forma sinérgica con PNRSV.
Por otra parte, los análisis biológicos también mostraron evidencia de
síntomas asociados a virosis en las plantas indicadoras (Figura 3). Estos
síntomas consistieron en un menor crecimiento de las plantas inoculadas con
respecto a su testigo correspondiente, brotación desuniforme y arrosetada,
aparición de anillos en las hojas y mosaico clorótico.
Las plantas de cerezo variedad Rainier obtenidas en la estación experimental
El Guindal de Los Andes, presentaron en su brotación claros síntomas que
indicaban la presencia de virosis (mosaicos cloróticos, muerte de brotes,
arrosetamiento, perforaciones en las hojas), los cuales fueron ratificados una
vez realizado el análisis serológico (Figura 1, Figura 2).
37
FIGURA 3. Síntomas presentes en plantas indicadoras, inoculadas con
material vegetal infectado con virus. A. Diferencia de crecimiento luego de siete meses desde la inoculación de PNRSV en plantas GF 305 (izq.), con respecto de otro GF 305, pero sin inocular (der.), B. Anillos cloróticos en las hojas de GF 305 inoculadas con PNRSV y PDV. C. Formación de anillos en hojas nuevas, al inicio de la brotación, en plantas inoculadas con PNRSV. D. Brote de GF 305 con forma de roseta, por causa de PDV inoculado.
38
Las plantas de cerezo variedad Rainier, que llegaron en estado de dormancia
a la Facultad, no presentaban indicios de estar enfermas. Sin embargo, una
vez comenzada la brotación, los síntomas de posibles virosis fueron cada vez
más claros, ya que las hojas aparecieron con perforaciones (Figura 2 D) y los
brotes presentaron crecimientos limitados, coincidiendo con las descripciones
señaladas por MINK (1995), y por lo señalado por DAL ZOTTO (1999),
referido a la muerte de brotes, causado por PNRSV.
La idea central de la utilización de éstas plantas, radicaba en la necesidad de
realizar y comprobar los postulados de Koch, transfiriendo el virus obtenido
en plantas de cerezo de huertos a estas plantas de dos años variedad
Rainier, pero al obtener los resultados del test de ELISA-DAS, se desestimó
esta posibilidad, ya que la gran mayoría de las plantas estaban infectadas
con PNRSV, PDV e incluso en algunas plantas se encontraron ambos virus.
Debido a esto, sólo se pudo realizar inoculaciones a plantas indicadoras.
39
CUADRO 3. Infección viral presente en plantas GF 305 artificialmente
inoculadas con material infectado proveniente de cerezos.
Prueba biológica en GF 305
Región Fecha de
inoculación/ detección
Tipo de virus
inoculados
Virus detectadospor ELISA-
DAS Mosaico AnillosDeformación de hojas Arrosetado
Absición prematura de
hojas
V PNRSV PNRSV Pos Pos Neg Neg Neg V P+P PDV Pos Pos Neg Pos Pos V P+P P+P Pos Neg Neg Neg Neg V PNRSV PNRSV Pos Pos Neg Pos Pos V CLRV? Neg Neg Neg Neg Neg V
04/05/05 03/11/05
PNRSV PNRSV Neg Neg Neg Pos Neg V PDV PDV Neg Pos Neg Pos Neg V PDV Neg Neg Neg Neg Neg V PDV Neg Neg Neg Neg Neg V PDV Neg Neg Neg Pos Neg V Testigo Neg Neg Neg Neg Neg V Testigo Neg Neg Neg Neg Neg V Testigo Neg Neg Neg Neg Neg V Testigo Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 1 Neg Pos Neg Neg Neg V PNRSV 1 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 1 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 1 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 2 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 2 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 2 Neg Neg Neg Neg Neg V PNRSV 2 Neg Pos Neg Neg Neg V P+P 1 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 1 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 1 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 1 Neg Pos Neg Neg Neg V P+P 2 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 2 Neg Neg Neg Neg Neg V P+P 2 Neg Neg Neg Neg Neg V
11/11/05 19/01/06
P+P 2 Neg Neg Neg Neg Neg Neg: negativo; Pos: positivo; P+P PNRSV+PDV. Las abreviaciones en negrita, indican presencia del virus en la muestra, o síntomas vistos en plantas indicadoras.
40
4.4. Análisis global de los resultados obtenidos:
Queda de manifiesto que existen virus asociados a huertos de cerezos que
son capaces de atacar e infectar a plantas del género Prunus, sin haber cura
para ellas una vez que adquieren el patógeno. Las medidas culturales
preventivas pasan a ser de una importancia total a la hora de prevenir el
contagio de más plantas, ya que utilizando variedades comerciales sanas,
con material puro de injertación, herramientas limpias, suelos libres de
nemátodos vectores del género Xiphinema, y portainjertos testeados y libres
de virus, es posible mantener producciones estables, con altos rendimientos,
y en una planta capaz de llevar a cabo un ciclo de crecimiento completo y sin
problemas.
Uno de los lugares que mayor importancia adquiere a la hora de llevar a cabo
estas medidas, son los viveros, en donde se producen la gran mayoría de
plantas con destino a huertos comerciales, y donde los virus, en especial
PNRSV y PDV que son los más recurrentes, suelen contagiar a plantas
sanas, dispersándose en forma masiva.
En la región, el cultivo del cerezo se encuentra en una clara fase de
crecimiento, dado esto por los retornos monetarios que incentivan a los
agricultores a invertir en él, a variedades de bajo requerimiento de frío, o a la
posibilidad de utilizar productos químicos que sustituyan parcialmente las
horas de frío requeridas por mejores variedades. Es por esto que la
información sobre variedades y patrones que se encuentren libres de virus, y
los viveros que las ofrezcan, es crucial a la hora de pensar en instaurar un
nuevo huerto, y la comunicación con otros agricultores que tengan estos
41
cultivos aledaños para saber si es que han sido atacados por virus, para así
poder tomar medidas preventivas.
La cuantificación sobre la incidencia de virus en cerezo (Prunus avium L.), ya
sea en forma serológica como biológica, es factible en etapas del desarrollo
vegetativo de éstas, utilizando como material de muestra hojas nuevas y
adultas, obtenidas en forma aleatoria de las plantas analizadas.
42
5. CONCLUSIONES
En las muestras provenientes de cerezos con síntomas de estar afectadas
por virosis, se detectaron dos virus principalmente: Prunus necrotic ringspot
virus y Prune dwarf virus en plantas de cerezos, con una incidencia de
50,76% para el primero y un 27,69% de las muestras examinadas para el
segundo. Para el caso de CLRV, ToRSV y ACLSV, no se encontraron
muestras que presentaran ninguno de estos virus.
Los principales síntomas que se encontraron en las plantas tanto de cerezos
establecidos en huerto como en plantas indicadoras GF 305 inoculadas con
material infectado fueron: Anillos cloróticos, necrosis en borde de las hojas,
anillos necróticos y mosaico clorótico, para el caso de PNRSV, mientras que
para PDV, los síntomas encontrados fueron reducción de crecimiento en
plantas, mosaico clorótico en hojas, anillos cloróticos y presencia de brotes
arrosetados.
Se determinó la presencia de virus en muestras seropositivas, mediante el
uso de plantas indicadoras GF 305, las que en algunos casos mostraron
síntomas de presencia de virus en forma previa a la prueba serológica
empleada.
43
RESUMEN
Las plantaciones de cerezos (Prunus avium L.) han ido aumentando en nuestro país los últimos 12 años, con un crecimiento de más de 4.547 hectáreas desde el año 2001. El ingreso de nuevas variedades capaces de adaptarse a los diferentes climas del país, con características apropiadas para obtener más y mejores producciones, ha generado también el ingreso de virus, los cuales componen un punto importante en el segmento de enfermedades que atacan al cerezo, ya que su presencia en los campos y viveros ha sido muy difícil de erradicar, debido a que no existen herramientas para eliminarlos, sólo hay manejos culturales preventivos. Los objetivos que se plantearon en el presente estudio fueron analizar huertos de cerezos, buscando cuantificar serológica y biológicamente la incidencia de virus en plantas sintomáticas que pudieran estar afectadas por virus. De la misma forma, conservar estos aislados en plantas leñosas, para ser utilizadas en estudios posteriores. Esta investigación fue realizada en el invernadero y en el laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. La recolección de muestras fue en forma dirigida, en diferentes huertos y jardines de variedades de cerezos, ubicados en Quillota, Los Andes, San Francisco de Mostazal, Morza y huertos cercanos a Curicó. Se analizaron virus que comúnmente atacan al cerezo como son PNRSV, PDV, CLRV, ToRSV y ACLSV. Para esto se realizaron pruebas serológicas mediante el test ELISA-DAS, y pruebas biológicas, con inoculación de material infectado con virus en plantas indicadoras GF 305. En huertos muestreados, se obtuvo que la mayor incidencia viral estaba dada por PNRSV, con un 50,76% seguido de PDV 27,69%, encontrándose además en las inoculaciones a plantas indicadoras, en donde se obtuvo un notorio sinergismo entre ambos Ilarvirus.
44
ABSTRACT
The amount of land occupied by cherry (Prunus avium L.) orchards in Chile has been increasing for the last 12 years, with a growth of 4,547 hectares since 2001. This has caused an increase in the number of new varieties arriving in Chile that are able to adapt to different climatic zones, capable of obtaining higher quality and levels of production, earlier harvests, and higher post-harvest fruit quality, among other characteristics. There is no doubt that viruses constitute an important part of the diseases that attack cherry trees, and that once present in fields and nurseries they have been very difficult to eradicate, mainly because there are no existing tools for eliminating them except for preventative cultural management. The objectives proposed for this study were to analyze cherry orchards, with the aim of quantifying viruses, both biologically and serologically, on possibly- infected symptomatic trees. And in the same way, to preserve the isolates in woody plants for use in future studies. The research was done in the phytopathology greenhouse and laboratory of the Agronomy faculty of the Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Samples were collected with specific direction, from different cherry varieties in orchards and gardens located in Quillota, Los Andes, San Francisco de Mostazal, Morza and near Curicó. An analysis of viruses that commonly attack cherry trees such as PNRSV, PDV, CLRV, ToRSV and ACLSV was done. For this analysis, serological trials were done using an ELISA-DAS test, and biological trials using inoculation of GF 305 indicator plants with virus-infected material. In the orchards that were sampled, the highest viral incidence obtained was PNRSV at 50.76%, followed by PDV at 27.69%, the same was found for the inoculated indicator plants, where a notable synergism between both ilarviruses was also observed.
45
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53
ANEXO
54
ANEXO 1
El análisis serológico se realizó mediante test de ELISA-DAS, cuyo
procedimiento se describe a continuación:
1. Cobertura: Se aplicó el anticuerpo específico a la superficie, previa dilución
de 10 :l en 90 ul y de esta se extrajo dos ul y se agregó 200 ul de tampón,
por muestra (dos repeticiones), en donde se instaló el antígeno. Luego se
incubó en estufa a 30EC por cuatro horas.
2. Lavado: Se vaciaron los recipientes de los excesos, y se lavó tres veces
con el tampón de lavado (PBS con Tween 20), donde pasado esto se
esperaron tres minutos entre cada repetición, removiendo todo líquido de
este con toallas de papel.
3. Antígeno: el antígeno, o extracto de la planta a analizar, se debió
homogeneizar en el tampón de extracción a una relación 1:20 (un gramo en
20 ml de buffer), para luego aplicarlo sobre la cobertura en cantidades de 100
ul por celdilla, en la placa, e incubarlo a 4-6°C durante la noche.
4. Lavado: este lavado se realizó siempre de la misma forma que el realizado
en el punto número dos.
5. Conjugado: se diluyó el conjugado enzimático a una relación 1:1000 en el
buffer conjugado. El conjugado presenta tanto enzimas como anticuerpos,
dejando 100 ul de conjugado en cada celdilla, donde se debió incubar en
estufa a 30°C por cinco horas.
55
6. Lavado: al igual que los lavados anteriores, se eliminan los excesos de las
celdillas, y se lavan con un tampón especial para lavado, esperando 3
minutos entre cada repetición.
7. Sustrato: se disolvió el compuesto fosfatado (P-nitrofenil fosfato) en el
tampón de sustrato, en una relación de un miligramo de pNPP por mililitro de
búffer. Este fue el que reaccionó y entregó una lectura en color, la que se
debió medir fotométricamente a 405 nm luego de 45 minutos.