Colorimetric detection of cys using gold nanoparitlces aggregation

组会报告

2012 年 11 月 9 日 李世滋

1 手性相关文献2 近期 GNPs 检测 cys 的工作进展

具有磁核的纳米粒子在其表面同时有手性配体同时具有磁性和手性识别的能力，以此，建立一种通用的手性磁性材料。 纤维素 -2,3- 二（ 3 ， 5- 二甲基苯基氨基甲酸酯）（ CBDMPC ），作为HPLC 最有效的手性固定相，选择性固定在包硅磁球表面，形成手性磁微球 Fe3O4@SiO2@CBDMPC(CMM) 。之后，成功将 CBDMPC 固定在包硅微球的表面，用 IR 和 CD 谱表征。 最后，将磁性纳米材料直接手性分离领域中。分离结果证明 CMM 对不同消旋物聚有手性识别能力，证明了它作为手性分离的一种有潜力的材料的可行性。此外，外加磁场使得 CMM 的回收非常方便。

优势

三步合成过程：

首先，纤维素之后加入过量的三苯甲基氯，使仅与 6 位的初级羟基反应形成三苯甲基醚。 24h 后，加入过量的 3,5- 二甲基苯异氰酸，形成在 2- 和3- 位有羟基的氨基甲酸酯。该反应在 100℃ 继续反应 24h 。 中间物，纤维素 -2,3- 二（ 3,5-- 二甲基苯基氨基甲酸酯） -6-O- 三苯甲基因为在甲醇中不溶解而游离出来，在含有少量的盐酸的过量甲醇中再分散室温 24h ，除去三苯甲基氯，得到终产物 CBDMPC 。

在无水吡啶中溶胀 100℃ ， 5h ，活化羟基。

70nm

1 ， 6- 己二异氰酸为间隔臂：连接羟基和异氰酸→氨基甲酰基

CBDMPC

将磁球在含有 60mL 苯的烧瓶中超声分散。 为了在磁球表面固化 CBDMPC ，将合成的 CBDMPC 溶解于20mL 无水吡啶中，之后机械搅拌 90℃ 加入上述 MNPs 分散液。搅拌 1h 后，加入 100μL 的 1,6- 己二异氰酸酯，反应在 90℃ 进行 12h 。得到的溶液室温条件下冷却，通过磁性倾析手性手性磁性纳米粒子，用甲醇洗涤三次。最后产物 70℃ 真空干燥 12h 。

消旋样品制备：在 25mL 乙醇中分别，溶解 5 种不同的消旋物。之后再以上 5 种消旋溶液中分别加入 150mgMNPs 。室温涡旋震荡 5min ，加磁场 60s 内得到上清液，用自动数字旋光计分析，其他消旋样品同上。 为了研究分离过程，择 5 种消旋的安息香甲酯的一种，分离结果用 HPLC 分析。简单说，通过在乙醇中稀释得到浓度为 10μg/ml 的消旋样品。用 HPLC 分析，在试管中加入 1mL 的消旋样品（ 10μg/ml ），随后加入 100mg 合成的手性磁性微球。混合液在室温条件下涡旋震荡5min 。之后在磁场的帮助下，溶液与 CMM 在 60s 内得到分离，收集上清液进行 HPLC 分析。之后剩余溶液与 CMM 保持多余 15min ，上清液用 HPLC 分析。

回收： 用 CMM 分离 5 种消旋物后（总用量为 750mg ），收集所有的 CMM在磁场帮助下乙醇洗涤以除去吸附的消旋物。洗脱清液也用 HPLC 在相同条件下分析。发现洗脱 CMM 5 次后，消旋物完全释放。得到的回收CMM 在 70℃ 真空干燥 12h ，得到 738 mg CMM 。

表征：

热重分析评估了Fe3O4@SiO2@CBDMP 微球的有机层含量。

如 fig4 ，与 Fe3O4@SiO2 相比Fe3O4@SiO2@CBDMPC 微球在 230℃ 有明显失重。可以推出Fe3O4@SiO2@CBDMPC 微球在 230℃ 和500℃ 表现高有机质量释放大约 40% 。有机物在 500℃ 完全分解。

磁球磁性用振动样品磁强计（ VSM ）研究。

结果 fig5 ，磁饱和值（ Ms ）的下降是由于 TGA 中高有机物含量造成的。 即，厚的非磁性有机 CBDMPC层包覆在硅球表面，导致磁化强度降低。尽管 Fe3O 4@SiO2@CBDMPC 的 Ms降低，但是在外加磁场下仍有强的磁响应，在 60s 内能完全分离。

直接分离 5 种不同的消旋物研究 CMM 的手性识别能力，分离结果用自动数字旋光计分析。图 table1.五种消旋物没有任何光学旋转，因为（ + ）（ - ）异构体产生等量相反光学旋光，导致消旋物的消除效应。当与 CMM作用 5min 后，所有的 5 种消旋物表现正光学旋光。 可能原因是：纤维素衍生物具有三重螺旋的构型，因为其高度规律的螺旋结构导致其对消旋物的手性区分，还有氨基酸酯残基被认为是最重要的吸附位点。具有极性基团的消旋物可能主要通过氢键与氨基甲酸酯残基相互作用。消旋物和纤维素衍生物间的 π-π 相互作用在手性分离中也有重要作用。根据 table1 ，当 CMM 在乙醇中用于直接手性分离时，主要通过其螺旋凹槽，氢键或 π-π 相互作用。

用 NVM-GNPs 检测 cys 的试验： 之前的工作情况

检测的 cys 的浓度范围2——10 mg/L

这里， UV-vis图中没有给出不加 cys 的吸收谱

近来工作进展：

由于 NVM-GNPs稳定性的问题，如果 GNPs稳定性非常好，在PBS 中将对 cys 检测响应变差；而如果 GNPs 自身稳定性非常差，则在 PBS 中 GNPs本身的酒红色就会因发生自团聚而逐渐变成蓝紫色。 [这时已经发生团聚了的 GNPs 不能用于 cys 的检测 ]根据上次组会提出的问题，做了 cys 与 GNPs 反应随着时间变化的趋势：

检测加入 0.4 mg/L cys 后 1h 内 A/A 对时间的变化情况。由图可以看出在低浓度的 cys 检测时，变色反应比较缓慢。

200 300 400 500 600 700 8000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Abs

wavelength/nm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

在加入 cys 之后， GNPs 的溶液稍有颜色变化，从 UV-vis 谱上可以看出有些变宽，因此说明在此条件下， GNPs 自身的稳定性仍然不太好。

线性范围： 0.4 ——10 mg/L

线性范围： 0.4 ——10 mg/L

20121016

之前合成的 NVM-GNPs储备液稀释备用 有时候 NVM-GNPs稳定性非常好，如下情况：

20121018 线性

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 5 10 15 20 25

A/A-cys

cys (mg/L)

A/A

使用同一批的 GNPs （比较稳定，所以想试试把 GNPs 的浓度稍微降低些，看看对于 cys 的检测，）使用的新配置的 50 mM pH=4.30 PBS ，在这种情况下由于稀释了纳米粒子的浓度， NVM-GNPs自身的稳定性表现稍差，发现GNPs 自身有团聚现象，反应放置 1.5h 立即测定 UV-vis 。平行做了两组实验。

20121019 线性

干扰氨基酸试验： 20121025 干扰氨基酸

由于 GNPs 自身稳定性问题，有意注意合成条件。

2012 年 10 月31日

水浴和室温条件下在低浓度的 cys的检测线性都不好， NVM-GNPs稳定性较好的，可能需要更改 PBS的离子强度和 PH。

2012 年 11 月 1 日线性范围

2012 年 11 月 5 日 改变反应体系 PBS 做线性由于之前使用的都是 3mL 反应体系： 2 mL 50 mM pH=4.45 PBS + 1 mL NVM-

GNPs + 30 μL各级浓度的 cys ，室温条件下放置 2h 后测定 UV-vis 。但是，由于NVM-GNPs 自身稳定性不好，或者是在 50mM PBS 中过于稳定，因而对于 cys 的检测效果都不好。

因此，考虑在使用稳定的 NVM-GNPs 的条件下，改变反应体系 PBS 的 pH 和浓度，以得到 cys 的线性范围。尝试了稳定的 NVM-GNPs 在 100mM PBS 中稳定性较好。如下图所示，在室温条件下与实验随行的空白 NVM-GNPs 在 PBS 中稳定性很好。

200 300 400 500 600 700 8000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Abs

wavelength/nm

0 0.06

问题是最近做 cys 检测，在长波长处本来应该出现第二个吸收峰，现在变成了 GNPs 的吸收峰整体向长波长方向移动，而在做线性的图的时候，仍选择之前的几处波长的比值。

2012 年 11 月 6 日线性范围 100 mM 新 PBS pH=4.59

合成的 NVM-GNPs条件：16.3 mg NVM + 200μL NaOH + 1mL 1% HAuCl4 75℃油浴 2h。合成后 GNPs 在4℃保存老化一夜，然后离心浓缩保存，在 100mM PBS中稳定性良好。

可能是反应时间不够 2h ， GNPs在较低浓度的 cys 的响应不成线性。

选择线性范围比较好的一段： 范围 0.06——4 mg/L 相关系数： 0.9985

线性范围： 0.06——10 mg/L 相关系数 0.9939

针对实际样品检测问题

线性范围，不太稳定。

工作计划